專利名稱：一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，屬于生物技術領域一種分離功能蛋白的技術。
背景技術：
蛋白是細菌和古細菌編碼的一種高度保守的蛋白，大腸桿菌的Dps于1992年首先被發(fā)現(xiàn)，目前在例如無害李斯特氏菌(Listeria innocua)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、恥垢分支桿菌(Mycobacterium smegmati s)等幾乎所有被檢測的細菌中均已發(fā)現(xiàn)Dps家族蛋白，超過一千種Dps類蛋白已經(jīng)被確定(http://www.uniprot.0rg)。它們當中接近97%在細菌中發(fā)現(xiàn)，剩余的3%在古細菌中，但不存在于動物和人中。Dps蛋白的結構信息也不斷增加(http://www.rcsb.0rg),揭示了整個蛋白家族的高度保守型。大腸桿菌Dps單體由167個氨基酸構成，分子量接近20KD，形成5個a -螺旋二級結構；活性結構為十二聚體，由12個單體形成了一個直徑9nm、內腔直徑4.5nm、近似球形中空的六面體結構顆粒(Nat Struct, Biol, 5:294-303,1998)。Dps蛋白每2個單體形成一個二聚體，一個二聚體形成一個面，形成二聚體的兩個單體作用界面處含有兩個鐵氧化酶活性位點，共計12個鐵結合位點。Fe(II)離子經(jīng)氧化后轉移到球體中空內腔，每個十二聚體的活性Dps能夠結合約450-500個鐵，形成Dps結合鐵，當細菌需要鐵時再以Fe(II)離子形式釋放到細胞質溶液中供細菌利用。在逆境脅迫條件如惡劣的生存環(huán)境、營養(yǎng)缺乏或藥物作用時，Dps蛋白大量表達，十二聚體的Dps將通過生物晶體化(biocrystallization)方式聚集，能夠在菌體內結合Fe(II)離子防止其通過芬東反應氧化產(chǎn)生自由基；能催化Fe (II)和Fe (III)的轉化，防止Fe(III)因沉淀導致的毒性；與0嫩非特異結合并保護DNA分子，防止DNA分子的氧化損傷。除此之外，Dps 一類的蛋白展示出除抗氧化保護作用和DNA結合功能能之外的多種活性，Dps家族的成員可以作為毒力因子保護細胞抵抗冷激熱激、金屬脅迫，甚至與炎癥過程有關(Rendiconti Lincei, 19:261-270,2008)。鑒于Dps蛋白的結構和功能特點，其在生物技術和納米技術領域將有廣泛的應用前景。納米材料是指在三維空間上至少有一維尺度小于IOOnm的材料。納米材料由于尺寸很小，結構特殊，具有與傳統(tǒng)材料不同的理化特性，如小尺寸效應，量子效應，巨大表面比效應，量子隧道效應等。這些特性使納米材料被廣泛應用到藥物載體，殺菌，食品保鮮，化妝品，涂料、服裝制造等眾多領域，這使人們有更多的機會直接接觸到納米材料。納米銀是由銀制備的納米材料，納米銀顆粒與生物大分子存在作用，特別是它巨大的表面比特性能吸附大量的蛋白質(Adv.Colloid Interface Sc1.167:134 - 135, 2007),而這種吸附又是造成蛋白活性改變，影響生理機能的重要機制。納米銀具有殺菌、抑菌作用，其機制可能是通過細菌DNA損傷、活性氧自由基的氧化損傷、脫氫酶失活、菌體內溶物泄漏和中斷細胞信號轉導等機制發(fā)揮的作用(食品科學，17:420-424，2010)，但還缺乏深入的實驗證據(jù)支持。
目前有關納米銀與Dps蛋白之間的相互作用尚未見有報道。但是對Dps蛋白的應用已有研究，國內相關專利有“用于疫苗和診斷學的Dps蛋白(專利申請?zhí)?01080060432.1)”，提供了一種新型Dps融合蛋白，其包含與Dps蛋白融合的蛋白或肽，可應用于疫苗、診斷試劑等領域。

發(fā)明內容
本項發(fā)明專利的意義在于通過納米銀與Dps結合從菌體大量可溶性菌體蛋白成分中濃縮分離Dps蛋白，整個方法簡便快捷。一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其特征在于采取如下步驟:(I)菌體培養(yǎng)和破碎，獲得可溶性菌體蛋白溶液，(2)在菌體可溶性蛋白溶液中加納米銀，(3)將溶液進行高速離心，收集沉淀，Dps與納米銀結合后被離心到沉淀中。步驟(I)中，將菌體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至靜止期，然后將菌體進行超聲波破碎或反復凍融破碎，10 OOOrpm離心10-20分鐘，取上清，此為菌體可溶性蛋白溶液。步驟(2)中，在菌體可溶性蛋白溶液中加入納米銀，至納米銀濃度為5_500ppm。25-37 °C條件下震蕩30分鐘。步驟(3)中，將溶液10 000 rpm，離心10-20分鐘，收集沉淀。本發(fā)明所述Dps蛋白可以是通過一個或多個氨基酸的缺失、置換或插入而修飾的蛋白。本發(fā)明所述Dps可以是與其它蛋白質或多肽融合形成的Dps融合蛋白。

本發(fā)明所述菌體為細菌或古細菌。本發(fā)明所述DPS若是基因工程改造后的工程菌分泌表達，則步驟(2)在培養(yǎng)液中加納米銀。目前常用的Dps蛋白的分離純化方法一般是將菌體破碎后獲得菌體可溶性蛋白溶液，用硫酸銨沉淀方法分離Dps蛋白，或者用柱層析的方法分離純化蛋白，因為菌體中可溶性蛋白種類比較多且Dps蛋白含量較低，從中分離Dps蛋白比較困難。本專利所提供的方法首次發(fā)現(xiàn)并利用納米銀與Dps蛋白的結合作用分離Dps，通過納米銀的結合將Dps從菌體可溶性蛋白中離心沉淀出來、進行富集濃縮，使得Dps蛋白的分離更為高效，而且本方法成本較低，簡便易行。


圖1.在大腸桿菌菌體可溶性蛋白中加入IOppm和50ppm納米銀，SDS-PAGE電泳檢測圖。M.低分子量標準指示蛋白；1.大腸桿菌全菌可溶性蛋白；2.加入IOppm納米銀，離心后的上清組分；3.加入IOppm納米銀,離心后的沉淀組分；4.加入50ppm納米銀,離心后的上清組分；5.加入50ppm納米銀，離心后的沉淀組分。圖2.在大腸桿菌菌體可溶性蛋白加入200ppm納米銀，SDS-PAGE電泳圖。M.低分子量標準指示蛋白；1.加入200ppm納米銀,離心后的上清組分；2.加入200ppm納米銀,離心后的沉淀組分。
具體實施方式
實施例1用IOppm和50ppm納米銀從大腸桿菌菌體可溶性蛋白中分離Dps蛋白。(I)在50ml LB液體培養(yǎng)基中按1%接種量接種接種大腸桿菌(Escherichiacoli)，37°C震蕩培養(yǎng)14小時到穩(wěn)定期，8000rpm離心10 min,收集菌體，沉淀用IOml20mmol/L PBS (pH7.4)緩沖液懸起，菌懸液在冰浴中進行超聲波破碎，頻率20kHz，功率150W，每破碎15秒，間隔15秒，15個循環(huán)。4°C, 10 OOOrpm離心10分鐘取上清，此為菌體可溶性蛋白溶液。(2)分別取Iml菌體可溶性蛋白溶液加入容器I和容器2，然后加入納米銀至終濃度為IOppm和50ppm。37°C震蕩孵育3小時。(3)10 OOOrpm離心10分鐘,分別取上清和沉淀,十二燒基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )檢測。電泳檢測過程為:制備SDS-PAGE凝膠，上層膠的濃度4%，下層膠的濃度10% ;取全菌可溶性蛋白和上清各0.5ml、沉淀用0.5ml蒸餾水懸浮，然后分別加入等量加樣緩沖液，沸水浴5min，制成電泳樣品；將全菌可溶性蛋白樣品、上清樣品和沉淀樣品分別加樣10ul，同時在另一加樣孔加低分子量標準蛋白樣品5ul，200V恒壓電泳1.5小時；電泳后的膠板進行考馬斯亮藍R-250染色3小時，然后在脫色液中脫色至出現(xiàn)清晰條帶。電泳膠染色結果見圖1。沉淀樣品中在與大腸桿菌Dps蛋白分子量相符的18.7KD位置處有清晰的條帶，將該蛋白切膠純化后，用MALD1-TOF-MS(基質輔助激光解析電離飛行時間質譜)技術測定蛋白氨基酸序列，確定為大腸桿菌Dps蛋白。經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)中Gel-pro軟件分析,加入納米銀終濃度為IOppm和50ppm的兩組,Dps在樣品沉淀中的含量可達37%和27%。以上結果顯示菌體破碎后的可溶性蛋白溶液中含有Dps蛋白，而加入納米銀離心后Dps蛋白大量出現(xiàn)在沉淀組分中，上清組分中沒有發(fā)現(xiàn)Dps蛋白，因此利用納米銀可以從可溶性菌體蛋白中分離Dps蛋白。
實施例2用200 ppm納米銀從大腸桿菌菌體可溶性蛋白中分離Dps蛋白。(I)在IOml LB液體培養(yǎng)基中按1%接種量接種將大腸桿菌，37°C震蕩培養(yǎng)14小時，8000rpm離心10 min，收集菌體，沉淀用2 ml 20mmol/L PBS(pH7.4)緩沖液懸起；將菌懸液在_80°C冰凍、室溫融解，反復凍融5次。10 000轉/分離心20分鐘取上清，此為菌體可溶性蛋白溶液。(2)菌體可溶性蛋白溶液中加入納米銀，終濃度濃度為200ppm。37°C震蕩孵育3小時。(3) 10 000 rpm離心20分鐘，收集沉淀，將加入蒸餾水洗兩次。(4)經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，Dps蛋白出現(xiàn)在沉淀中，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)中Gel-pix)軟件分析，在樣品沉淀中的含量可達25%。
權利要求
1.一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其特征在于采取如下步驟:(I)菌體培養(yǎng)和破碎，獲得可溶性菌體蛋白溶液，(2)在菌體可溶性蛋白溶液中加納米銀，(3)將溶液進行高速離心，收集沉淀，Dps與納米銀結合后被離心到沉淀中，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Dps。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其特征在于步驟(I)中，將菌體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至靜止期，8000rpm離心10 min收集菌體，用IOml20mmol/L PBS (pH7.4)緩沖液懸浮菌體，將菌懸液超聲波破碎或反復凍融破碎，4 0CUOOOOrpm離心10-20分鐘，取上清，此為菌體可溶性蛋白溶液。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中，在菌體可溶性蛋白溶液中加入納米銀，納米銀濃度為5-200ppm，25-37°C條件下震蕩孵育30分鐘。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其特征在于步驟(3)中，將溶液在4°C、10000 rpm條件下，離心10-20分鐘，收集沉淀，用濃縮膠為4%、分離膠為10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Dps。
5.權利要求1所述的一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其中所述Dps蛋白可以是通過一個或多個氨基酸的缺失、置換或插入而修飾的蛋白。
6.權利要求1所述的一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其所述Dps可以是與其它蛋白質或多肽融合形成的Dps融合蛋白。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其所述菌體為細菌或古細菌。`
8.權利要求1所述的一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，其中所述Dps若是基因工程改造后的工程菌分泌表達，則步驟(2)在培養(yǎng)液中加納米銀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用納米銀濃縮分離Dps蛋白的方法，屬于生物技術領域一種分離功能蛋白的技術。其特征在于采取如下步驟(1)菌體培養(yǎng)和破碎，獲得可溶性菌體蛋白溶液，(2)在菌體可溶性蛋白溶液中加納米銀，(3)將溶液進行高速離心，收集沉淀，Dps與納米銀結合后被離心到沉淀中，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Dps。本專利所提供的方法通過納米銀的結合將Dps從菌體可溶性蛋白中離心沉淀出來、進行富集濃縮，使得Dps蛋白的分離更為高效，而且本方法成本較低，簡便易行。
文檔編號C07K1/14GK103102398SQ20131005541
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權日2013年2月21日
發(fā)明者劉 文, 胡巍, 呂穎 申請人:山東理工大學