專利名稱：：應用dkk2刺激血管生成的方法以及含有dkk2的組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種利用DKK2蛋白來刺激血管生成的方法以及含有DKK2蛋白的組合物。
背景技術：
：.血管生成是新的毛細血管形成的過程。該過程在正常的生物學條件下很少發(fā)生，而總是伴隨胚胎發(fā)生、黃體形成以及創(chuàng)傷愈合而發(fā)生。特別地，血管生成在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用(FolkmanJ和KlagsburnM,Sc/潔e,235(4787),pp.442-447,1987)。血管生成過程包括四個步驟，即，第一步是通過血管生成因子的刺激導致蛋白酶作用而使毛細血管基膜分離，第二步是血內皮細胞遷移和增殖，第三步是由于血內皮細胞的分化而形成毛細血管以及第四步是新毛細血管的重建。已經報道了血管生成過程受各種刺激因子和抑制因子的調控，例如生長因子、細胞因子、脂類代謝物質、止血蛋白(haemostaticprotein)的隱原'性片斷等(Folkman乂7VaAiW^/.,JXi)，pp.27-31，1995)。血管生成刺激因子可以分成若干類，例如，主要是細胞生長誘導因子、具有免疫活性的細胞因子、激素和脂類產物等(BussolinoF等，7ew血腸c/^附.Sc/.,22(7),pp.251-256,1997)。然而，由于刺激因子不^f又作用于血管內皮細胞上而且還作用于其他的相鄰細胞上，因此其在應用于臨床使用時具有各種問題(MaleckiM等，C7麼7te，Supple1，pp.S159-169，2005)。因此，最近的研究集中在找到只作用于血內皮細胞的重要基因、尤其是在血管生成中涉及的基因，以及利用該基因治療需要血管生成的各種疾病的新方法。但是，至今仍未得到令人滿意的結果。治療性血管生成是通過給予血管生成因子，如血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、發(fā)育調節(jié)內皮基因座-1(developmentallyregulatedendotheliallocus-1,Del-l)、肝細胞生長因子(HGF)、血小板源性內皮細胞生長因子(PD-EGF)、血管生成素、轉化生長因子(TGF)和表皮生長因子(EGF)等或編碼它們的基因以促進側支血管形成從而治療缺血性疾病的方法，該方法作為用于治療不能實施經皮冠4犬動^M空內血管成形術(PTCA)和冠狀動力永旁^各移才直術(CABG)方法的嚴重在夬血性疾病的一種新方法尤其突出(KimD.K.和KwonH.C.,772eyowva/o/e"ofocn.wo/ogy,蹈),pp.328-338，2001)。DDK2是Wnt蛋白的抑制蛋白，據才艮道其作為Wnt信號通^各的抑制因子或刺;敫因子起作用(WuW等，CwwAW.，10(24),pp.1611-1614,2000)。它具有兩個特異性的富含半胱氨酸的結構域，并分成各種長度的連接區(qū)域。特別地，屬于Dickkopf家族的該蛋白在家族成員之間具有高度保守的半胱氨酸-2區(qū)域(cystein-2)以及10個半胱氨S臾(KrupnikVE等，238(2),pp.301-313,1999)。據報道，DKK2與石皮骨細胞的分化密切相關(LiX等，A^f.C7g"gf.,37(9),pp.945畫952,2005)。然而，在上述引用的4壬<可文獻中者P沒有才艮道或4皮露關于DKK2對血管生成的刺激活性的作用，這些披露內容結合于此作為參考。
發(fā)明內容技術問題因此，本發(fā)明的發(fā)明人進行了深入研究以找到內皮細胞中的多個分化控制基因以及用于刺激血管生成的新的有效方法，最后，他們發(fā)現(xiàn)DKK2對于血管生成表現(xiàn)出潛在的刺激作用，因此該蛋白可用于治療和預防缺血性疾病。技術方案根據本發(fā)明，本發(fā)明提供了一種用于刺激哺乳動物血管生成的方法，該方法包括向哺乳動物的未形成血管的組織給予有效量的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA的步驟。本文中所-坡露的術語"哺乳動物的未形成血管的組織，，包括在哺乳動物中由缺血性疾病造成損傷后新形成的皮膚組織、肌肉組織和結締纟且織。本文中所披露的術語"缺血性疾病"包括燒傷、牛皮癬、潰瘍、局部缺血、心月幾梗塞、心絞痛、月離梗塞或腦出血。本文中所4皮露的術語"編碼DKK2蛋白的DNA"通過使用病毒載體或非病毒載體而給予哺乳動物。本文中所4皮露的術語"非病毒載體"包括能夠在動物細胞中表達的質粒。6本文中所披露的術語"病毒載體"包括腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉錄病毒載體、'隄病毒載體或單純性皰滲病毒載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種以有效量包含作為活性成分的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA以治療和預防缺血性疾病的藥物纟且合物。本發(fā)明的其他目的是提供DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA用于制造治療或預防缺血性疾病所采用的藥物的應用。本發(fā)明的其他的目的是才是供一種用于治療或預防在夾血性疾病的方法，其中所述方法包括向患有血管生成引起的疾病的哺乳動物中給予治療有效量的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA。而且，本發(fā)明的另一個目的是提供一種以有效量包含作為活性成分的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA以預防和緩解缺血性疾病的^f呆1"建食品組合物。本文中披露的術語"DKK2蛋白"包括由SEQIDNO:l表示的氨基酸。本文中披露的術語"編碼DKK2蛋白的DNA"包括由SEQIDNO:2表示的基因。上述DKK2序列不限于一種哺乳動物的DKK2序列，而是包括所有的哺乳動物中的DKK2。上述DKK2蛋白包括「乂人哺乳動物的組織中分離的DKK2蛋白或重組DKK2蛋白。本發(fā)明的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA可以才艮據以下^尤選實施例來制備。對本發(fā)明詳述如下。對于本發(fā)明，可以通過以下的步驟來制備上述DKK2蛋白和編碼該蛋白的基因。對從HUVEC中純化的總RNA進行反轉錄以得到互補DNA;用得到的互補DNA作為模板并使用DKK2引物，優(yōu)選由SEQIDNO:5和SEQIDNO:6表示的DKK2引物，進行PCR以獲得擴增的DKK2基因。通過以下方法可以得到上述DKK2蛋白，例如，用限制性內切酶處理由上述步驟制備的DKK2基因，將其克隆到質粒中以獲得可克隆并轉化表達細胞系的質粒；篩選轉化細胞并用柱純化培養(yǎng)基中的分泌的DKK2蛋白；或將通過上述步驟制備的DKK2基因引入載體、優(yōu)選慢病毒載體中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用柱純化培養(yǎng)基中的分泌的DKK2蛋白。通過上述步驟制備的引入DKK2的細胞系(DKK2-inducedcelllines)以及DKK2基因表現(xiàn)出在HUVEC上對血管形成的刺激活性、對動脈環(huán)組織出芽的促進活性以及對小鼠胚胎血管發(fā)育的促進活性。另外，全長DKK2，以及DKK2的片段，都表現(xiàn)出彼此類似的對血管生成的刺激活性。本發(fā)明的另一個目的是提供一種以有效量包含由上述方法制備的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA作為活性成分以治療和予貞防缺血性疾病的藥物《且合物。8本發(fā)明的其他目的是提供由上述方法制備的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA用于制造治療或預防缺血性疾病所采用的藥物的應用。本發(fā)明的其他目的是提供一種用于治療或預防缺血性疾病的方法，其中所述方法包括向患有缺血性疾病的哺乳動物給予治療有效量的由上述方法制備的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA。本發(fā)明的用于治療缺血性疾病的組合物可以包括基于該組合物總重量的以重量計0.1-50%的上述DKK2蛋白或編碼該蛋白的DNA。本發(fā)明的組合物可以根據本領域公知的使用方法而另外含有常規(guī)的載體、佐劑或稀釋劑?？蓛?yōu)選的，所述載體根據其用途和使用方法作為適當物質而4吏用，^旦并不限于此。Remington'sPharmaceuticalScience(MackPublishingco，EastonPA)的著述中歹'j出了適宜的稀釋劑。在下文中，以下的配制方法和賦形劑僅僅是例示性的而決不是限制本發(fā)明。根據本發(fā)明的組合物可以作為含有藥用載體、佐劑或稀釋劑，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸4丐、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯曱酸曱酯、羥基苯曱酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油的藥物組合物而提供。該配制物可以另外包括^真并+、抗^疑劑、潤滑劑、潤濕劑、調p未劑、乳化劑、防腐劑等。可以這樣配制本發(fā)明的組合物，使得采用本領9域公知的任何方法將其給予患者后，能夠提供活性成分的快速、持續(xù)或延緩的釋放。例如，可以4吏本發(fā)明的組合物:容解在通常用于制造注射液的油、丙二醇或其他溶劑中。適宜的載體的實例包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、才直物油、豆蔻酸異丙酯等，^旦不限于此。為了局部給予，本發(fā)明的組合物可以制成軟膏和乳膏劑型。含有本組合物的藥物配制物可以以任何形式制備，例如口服劑型(粉劑、片劑、膠嚢劑、軟膠嚢劑、水溶性藥物、糖漿劑、酏劑、丸劑、粉劑、嚢劑、顆粒劑)，或局部制劑(乳膏劑、軟膏劑、洗劑、凝膠、膏劑(balm)、貼劑、糊劑、噴霧溶液、氣霧劑等)，或可注射的制劑(溶液、混懸液、乳液)。例如，可以將本發(fā)明的組合物溶解在通常用于制備注射液的油、丙二醇或其他溶劑中。注射液中適宜的基質或載體的實例包括各種鹽混合物，例如生理鹽水、無機鹽或它們的混合物；糖溶液，例如甘露糖醇、乳糖、葡聚糖等；氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸等；聚乙二醇、乙醇、才直物油、豆蔻酸異丙酯、有才幾酸溶液、鹽溶液、或它們的混合物等，但不限于此。本發(fā)明的可注射制劑可以通過在注射、液中向上述基質加入常夫見的添加劑，如;參透調節(jié)劑、pH調節(jié)劑、植物油、卵磷脂、表面活性劑(如非離子表面活性劑)以制成適宜的配制物，如溶液、混懸液、力交體溶液等，來進4于制備。在本發(fā)明的固體組合物的情況下，在遺傳治療原位4吏用之前，將該組合物溶解在已滅菌的基質中，而本發(fā)明的液體組合物可以直接使用而無需特別處理。為了局部給予，可以將本發(fā)明的組合物制成軟膏和乳膏劑型。10藥物劑型的本發(fā)明的組合物可以以它們的藥物學可接受的鹽的形式使用，并且也可以單獨使用或與其他藥學活性成分適當聯(lián)用及組合使用。提供到受損部位的本文中披露的編碼DKK2蛋白的DNA可以以插入載體，如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、單純性皰滲病毒載體或在哺乳動物細胞中表達的質粒的形式使用。本發(fā)明組合物的所需劑量才艮據受治療者的病況和體重、嚴重程度、藥物形式、給予的途徑和時期而不同，并可以由本領域技術人員來選擇。然而，為了得到所需的效果，通常建議以0.001-100mg/kg,重/天，優(yōu)選0.1-100mg/kg體重/天的用量范圍給予本發(fā)明的蛋白或DNA。該劑量可以每天給藥一次或分為幾次纟合藥。本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA作為活性成分用于預防和改善缺血性疾病的^f呆健食口口o可以將上述組合物加入食品、添加劑或々欠料中，其中，對于保健食品組合物，食品或飲料中上述蛋白或DNA的量通常為食品總重量的約0.01-95w%,優(yōu)選1-80w%。本發(fā)明提供了一種含有DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA用于預防和緩解哺乳動物中缺血性疾病的保健飲料組合物。為了開發(fā)保健食品，含有上述本發(fā)明的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA的可添加食品的實例是各種食品、飲料、口香糖、復合維生素、健康改善食品等，并且可以作為粉劑、顆粒劑、片劑、咀嚼片、膠嚢或飲料等使用。本發(fā)明的組合物無毒性和副作用，因此它們可以安全使用?？梢詫⒈疚闹猩鲜龅慕M合物加入食品、添加劑或飲料中，其中，在食品或飲料中的上述DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA的量，對于保健食品組合物通常為食品總重量的約0.01-80w/w%,優(yōu)選0.01-15w/w%，而對于100mH呆健々大^j"組合物的比例為0.02-5g，優(yōu)選0.3-lg。只要本發(fā)明的保健々欠料組合物含有所示比例的上述DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA作為基本成分即可，對其他液體成分沒有特別限制，其中其他成分可以是各種甜味劑(deodorant)或天然的碳水化合物等，就像傳統(tǒng)的飲料一樣。前述的天然碳水化合物的實例是單糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麥芽糖、蔗糖等；常頭見的糖(conventionalsugar),如糊4青、環(huán)糊精；以及糖醇，如木糖醇、和赤藻糖醇等。作為除前述甜味劑之外的其他甜味劑，天然甜味劑如奇異果甜蛋白(taumatin)、甜菊提取物(例如levaudiosideA)、甘草甜素等，以及合成甜p未劑如糖精、阿斯巴甜等可有利地應用。在100ml本飲料組合物中，上述天然碳水化合物的量的比例通常為約l-20g，優(yōu)選5-12g。除前述組合物之外的其他成分是各種營養(yǎng)素，維生素、礦物質或電解質、合成調味劑(或矯味劑)、在乳酪巧克力等情況中的染色劑和改良劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護膠體一'占合劑(protectivecolloidaladhesive)、pHi周節(jié)劑、牙急定劑、防腐劑、甘油、醇、用于碳酸飲料等中的碳酸化劑(carbonizingagent)等。除上述成分之外的其他成分可以是用于制備天然果汁、果汁飲料和蔬菜飲料的果汁，其中該成分可以單獨使用或組合使用。該成分的比例不太重要，但一般范圍是每IOOw/w。/。本組合物中約0-20w/w%。含有本文中前述提取物的可添加食品的實例是各種食品、飲料、口香糖、復合維生素、健康改善食品等。本發(fā)明的組合物可以另外包括有機酸，如檸檬酸、富馬酸、己二酸、乳酸、蘋果酸；^粦酸鹽，如^岸酸鹽、》粦酸鈉、^!酸鉀、酸式焦石奔酸鹽、多石癢酸鹽；天然抗氧化劑，如多酚、兒茶素、a-生育酚、迷迭香提取物、維生素C、綠茶提取物、甘草根提取物、殼聚糖、鞣酸、才直酸等中的一種或多于一種。上述本發(fā)明的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA可以是20-90%的高濃縮液體、^分末或顆4立形式。類似地，上述DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA可以另外含有乳糖、酪蛋白、右旋糖、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇中一種或多于一種。因此，本發(fā)明的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA無毒性和副作用；它們可以安全地^吏用。對于本領域技術人員來說顯而易見的是，在不背離本發(fā)明的精神或范圍的前提下，可以對本發(fā)明的組合物、使用和制備進行各種修改和改變。有利效果如本發(fā)明中所述，該DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA表現(xiàn)出對在HUVEC上血管形成的刺激活性、對動月永環(huán)組織出芽的促13進活性以及對小鼠胚胎中血管發(fā)育的促進活性。因此，它可以用作用于治療和預防缺血性疾病的治療性或功能性^f呆健食品。將以下詳細描述與附圖結合，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特征以及其他優(yōu)點，其中圖1示出了在基質膠(Matrigd)上HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)的分化特征。圖2表示在HUVEC分化中DKK2基因的表達，圖3表示使用慢病毒的DKK2表達細胞系和DKK2抑制細胞系的產生結果，圖4示出了在DKK2表達和抑制細胞系上血管形成的比較結果，圖5表示通過不同于Wnt信號的DKK2處理使|3-連環(huán)蛋白增加的結果，圖6表示用于產生DKK2轉基因小鼠的載體圖，圖7表示通過DNA擴增對DKK2轉基因小鼠的驗證，圖8表示誘導內皮細胞從DKK2轉基因小鼠的主動脈出芽，圖9示出了4吏用血管特異性蛋白vWF的抗體在正常小鼠和DKK2轉基因小鼠胚胎上的血管發(fā)育，圖10示出了在正常小鼠和DKK2轉基因小鼠胚胎的頭部區(qū)域上血管生成的比較結果，圖11表示正常小鼠和DKK2轉基因小鼠的胚胎上的降主動脈和節(jié)段血管的生長。具體實施例方式對于本領域的技術人員顯而易見的是，在不背離本發(fā)明的精神或范圍的前提下，在本發(fā)明的組合物、使用和制備中可以進行各種修改和改變。將通過以下實施例，更加具體地解釋本發(fā)明。然而，應該理解本發(fā)明并不限于這些實施例。;^發(fā)明的實施方式以下的參考例和實驗例旨在進一步闡述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。參考例1.HUVEC的培養(yǎng)才要照下面的方法乂人由延世大學醫(yī)院(YonseiUniversityHospital)婦科得到的臍帶中分離HUVEC(人臍帶靜脈內皮細胞)。用臍帶緩沖液(Cordbuffer,0.2%葡萄糖磷酸緩沖鹽水)清洗靜脈后，向靜脈加入5ml0.2%的I型膠原酶(Sigma-AldrichCo.,MO,USA)，并將該靜脈在37°C下放置5分鐘。在室溫下向靜脈加入20ml的臍帶緩沖液后，收集從相對端分離的靜脈細胞。再次向靜脈加入臍帶緩沖液以在37°C下反應。對收集的人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)進4亍清洗并倒入包一皮有0.1%明月交的T75組織i咅養(yǎng)曲頸瓶中。細胞在5%C02培養(yǎng)箱中在37。C下培養(yǎng)在EGM-2完全培養(yǎng)基(Cambrex,MD,USA)中，且當細胞達到致密生長(confluent)階段時，從胰蛋白酶-EDTA溶液中分離細胞。由上述過程得到的3-4次繼^細月包用于本實馬全中。參考例2.用'艮病毒載體制備DKK2調節(jié)細胞系DKK2重《且病毒購自Macrogenlnc(韓國)，通過利用'f曼病毒3夸克隆質粒轉化到病毒產生細胞系中以制備DKK2過表達和抑制細月包系/人而獲4尋DKK2重組病毒。在向參考例2中制備的HUVEC中加入DKK2病毒48小時后，如下對乂人細月包中分離的RNA進4亍反轉錄和聚合以一驗i正DKK2mRNA的表達狀態(tài)用TRIzol試劑(Invitrogen,USA)分離總RNA，用寡聚(dT)引物實施反轉錄并隨后用反轉錄酶(Stratagen，USA)重復PCR循環(huán)30次；使用聚合酶(Stratagen，USA)在94°C預變性5分鐘，在94°C變性30秒，在50。C用引物退火30秒，以及在72。C延伸30秒。如圖3中所示，結果表明DKK2過表達細胞系和抑制細胞系產生良好。參考例3.DKK2轉基因小鼠的制備使用僅在血管內皮細胞中激活的Tie2轉錄調控區(qū)來制備DKK2過表達d、鼠，以確定DKK2基因在體內對血管生成的影響(SchlaegerTM等，TVoc.A^/.JcadSc/.USA,94(7),pp.3058-3063,1997)。如圖6中所示，用Hindlll和NotI(NEB,英國)處理由SEQIDNO:4表示的小鼠DKK2基因并將其克隆到Psp載體(Clontech,USA)中。用Sail(NEB,英國)處理克隆的質粒以制備DNA片段并將制得的DNA片段注入分離自小鼠(C57BL6，OrientInc,韓國)的卵子中以16誘導轉導，其中該小鼠已通過促性腺激素釋放激素(Sigma,USA)刺激排卵，然后將該DKK2轉基因卵子在受精后植入代孕母鼠中。將受精后21天出生的小鼠的尾部截去，用蛋白酶K(Sigma,USA)處理以分離DNA,并利用由SEQIDNO:7和SEQIDNO:8表示的DKK2引物，通過PCR對分離的DNA進行擴增[94。C預變性5分鐘，(94。C變性30秒，55。C退火30秒以及72。C延伸30秒)x30次循環(huán)，并在72°C下后延伸10分鐘](見圖7)。實驗例1.人臍帶靜脈內皮細胞分化過程中DKK2的表達i普將250pl基質膠(CollaborativeBiomedicalProducts,USA;濃度10mg蛋白/ml)力口入到直徑16mm的孔板中并在37°C聚合30分鐘。將在參考例1中制備的HUVEC培養(yǎng)在含有20%(v/v)胎牛血清(FBS，Hyclone,USA)、100單位/ml青霉素(Invitrogen,USA)、10(ag/ml鏈霉素(Invitrogen,USA)、3ng/mlbFGF(石咸性成纖維細胞生長因子；UpstateBiotechnology,USA)和5單^f立/ml肝素(Sigma,USA)的M199生長培養(yǎng)基(Invitrogen,USA)中，并向其中加入胰蛋白酶以獲得培養(yǎng)細胞。使細胞懸浮在生長培養(yǎng)基中并以2xl05細胞/孔的濃度涂布在基質膠層上從而誘導細胞分化(見圖1)。如圖1所示，分化由3個步驟組成；第一步是分化開始，用作對照組，第二步是由于細力包轉移形成血管樣結構以及第三步是完成血管樣結構的形成。用TRIZOL溶液(Invitrogen,USA)從每一步驟中的細胞中分離RNA后，用由SEQIDNO:5和SEQIDNO:6表示的引物對分離的RNA進行反轉錄，并按照參考例3中披露的方法進行擴增(見圖2)。如圖2所示，該結果表明在血管形成過程中DKK2基因的表達增加?？梢宰C實DKK2是血管形成的正調控因子。實驗例2.DKK2對AJ^帶靜脈內皮細胞的血管形成的影響將250fil基質膠(CollaborativeBiomedicalProducts,USA;濃度lOmg蛋白/ml)加入到直徑16mm的孔板中并在37。C下聚合30分鐘。將在參考例1中制備的HUVEC培養(yǎng)在含有20%(v/v)胎牛血清(FBS,Hyclone,USA)、100單位/ml青霉素(Invitrogen，USA),10ng/ml鏈霉素(Invitrogen,USA)、3ng/ml的bFGF(石威性成纖維細另包生長因子；UpstateBiotechnology,USA)和5單位/ml肝素(Sigma，USA)的M199生長培養(yǎng)基(Invitrogen,USA)中，并向其中加入胰蛋白酶以獲得培養(yǎng)細胞。使細胞懸浮在生長培養(yǎng)基中并以2xl05細月包/孔的濃度涂布在基質月交層上以_秀導細月包分化(見圖4)。將其用50ng/ml和100ng/ml的DKK2進行處理，然后將細胞培養(yǎng)20小時。用光學顯樣i鏡(ZEISS,德國)測量血管形成率并4尋沒有用DKK2處理的組作為陰性乂于照組。如圖4中所示，該結果表明在DKK2的表達細胞系上誘導了血管形成，而在DKK2承P制細月包系上血管形成減少。實驗例3.p-連環(huán)蛋白上DKK2的穩(wěn)定作用將在參考例2中制備的使用慢病毒系統(tǒng)的DKK2過表達細胞系培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)基換成含有20%(v/v)胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)、100單^立/ml青霉素(Invitrogen,USA)、10pg/ml鏈霉素(Invitrogen,USA)、3ng/ml的bFGF(石成性成纖維細月包生長因子；UpstateBiotechnology,USA)和5單4立/ml肝素(Sigma，USA)的Ml99生長i咅養(yǎng)基，并向其中力口入200ng/mlsFrizzle(BDbioscience,18USA)作為Wnt分泌抑制因子。培養(yǎng)24小時后，對其用胰蛋白酶處理以獲4尋i咅養(yǎng)細月包。用含有100mMTris/Cl、5mMEDTA、50mM(3-甘油碌酸鹽、50mMNaF、100jiMNa3V04、lmMPMSF、0.5%NP-40和1%TritonX-100的裂解緩沖液從細胞中分離DNA。使用|3-連環(huán)蛋白的抗體(UpstateBiotechnology,USA)通過蛋白印記實-瞼i正實分離的DNA的表達7jc平。如圖5中所示，與對照組(eGFP)相比，DKK2使l3-連環(huán)蛋白的表達水平顯著4是高，并且盡管用Wnt抑制因子(sFz)進4亍處理，才是高的表達水平也沒有下降。因此，證實了DKK2通過控制不同于Wnt信號的P-連環(huán)蛋白的表達水平可刺激血管生成。實驗例4.DKK2對內皮細^9&^轉基因小鼠主動樂^出芽的影響將從參考例3中制備的DKK2轉基因小鼠和6周齡正常小鼠的背部區(qū)域分離的主動脈切成lmm的大小，并將動脈環(huán)組織置于包被有110(il基質膠的48孔板上。再用40pl的基質膠將孔密封并向每個孔中力口入HUVEC培養(yǎng)基(SFM,Invitrogen，USA)直至每個孔的終體積達到200W。5天后，計數/人每個環(huán)上出芽的數量并比4交對照小鼠組和DKK2轉基因小鼠組的出芽率(見圖8)。才艮據以下標準將出芽分成5部分以評價出芽率；5分是指所有5個部分都出芽，0分是指沒有出芽。如圖8中所示，結果表明，與正常小鼠相比，DKK2轉基因小鼠中的動脈環(huán)組織的出芽顯著增加。19實驗例5.DKK2對DKK2轉基因小鼠胚胎中血管發(fā)育的影響用4%低聚甲醛將來源于妊娠第9-10天的正常小鼠和DKK2轉基因小鼠的胚胎固定1天，并通過文獻中披露的方法(SadlerJ.E.，乂77zram6.7/"emo^.，pp1702-1709，2005)，用^f又在血管內皮細胞上特異性表達的血管假性血友病因子(vonWillebrandFactor,Vwf)的抗體(Chemicon,USA)染色，以觀察血管的發(fā)育。如圖9中所見，結果表明，與正常小鼠對照相比，DKK2轉基因小鼠的胚胎中血管生成和血管發(fā)育普遍增加。為了證實DKK2對胚胎血管生成的影響，通過高倍放大來確定由上述方法制備的胚胎中的頭部毛細血管叢、降主動脈和節(jié)段血管的發(fā)育。如圖10和11所示，結果表明，在DKK2轉基因小鼠的胚胎上促進了頭部毛細血管叢和節(jié),史血管生長的顯著增強以及降主動脈的擴大。以下，將描述配制方法和各種賦形劑，但本發(fā)明不限于此。代表性的制備實例描述如下。注射液的制備DKK2蛋白廳mg焦亞石克酉吏鈉3.0mg只于羥苯曱酸甲酯0.8mg^j"羥苯曱S交丙酯O.lmg用于注射液的蒸餾水最適量20通過常規(guī)的注射液制備方法，將活性成分溶解，將pH控制為約7.5然后將所有成分注入2ml安瓿瓶(ample)中并進4亍滅菌以制備注射、液制劑。粉劑的制備DKK2蛋白500mg玉米淀粉100mg乳糖100mg滑石10mg通過將上述成分混合并填充進密封包裝中以制備粉劑制劑。片劑的制備DKK2蛋白200mg玉米淀粉lOOmg乳糖100mg硬脂酸鎂最適量通過混合上述成分并壓制成片(entabletting)以制備片劑制劑。膠嚢的制備DKK2蛋白100mg乳糖50mg玉米淀粉50mg滑石2mg石更脂酸4美最適量通過常規(guī)的明膠制備方法，混合上述成分并填充明膠膠嚢以制備膠嚢制劑。、液體的制備DKK2蛋白訓0mg糖20g多糖20g檸檬香精20g通過常規(guī)的液體制備方法，將活性成分溶解，然后將所有成分注入1000ml安吾瓦弁瓦中并滅菌以制備液體制劑。保健食品的制備DKK2蛋白畫0mg維生素混合物最適量維生素A乙S臾酯70mg維生素El.Omg維生素B10.13mg維生素B20.15mg維生素B60.5mg維生素B120.2mg維生素C10mg生物素10mg煙酰胺1.7mg葉酸50mg泛酸4丐0.5mg-戶物質混合物最適量At酸亞4失1.75mg氧化鋅0.82mg碳酸鎂25.3mg石辟酸二氫鐘15mg石舜酉臾二4丐55mg檸檬酸鉀90mg碳酸釣100mg氯化4美24.8mg上述的維生素和石廣物質混合物可以以多種方式文變。應當注意，這樣的改變并不偏離本發(fā)明的精神和范圍。健康飲料的制備DKK2蛋白畫Omg斗寧4蒙酸1000mg低聚糖100g杏濃縮物2g牛磺酸lg蒸餾水900ml通過常規(guī)的健康々欠料制備方法，將活性成分溶解、混合、在85°C才覺拌1小時、過濾然后將所有成分注入1000ml安吾瓦并瓦中并滅菌以制備健康飲料制劑。23顯而易見的是，所描述的本發(fā)明可以以i午多方式改變。應當注意，這樣的改變并不偏離本發(fā)明的精神和范圍，并且對于本領域普通才支術人員來說，所有這些改變均應包括在所附權利要求的范圍中。工業(yè)適用性如本發(fā)明所述，DKK2表現(xiàn)出對在HUVEC上血管形成的刺激活性、對動脈環(huán)組織出芽的促進活性以及對小鼠胚胎中血管發(fā)育的促進活性。因at匕，它可以用作用于治療和預防擊夬血性疾病的治療性或功能性保健食品。序列表SEQIDNO:l是人DKK2的氨基酸序列，SEQIDNO:2是人DKK2的DNA序列，SEQIDNO:3是小鼠DKK2的氨基酸序列，SEQIDNO:4是小鼠DKK2的DNA序列，SEQIDNO:5是人DKK2的正向引物序列，SEQIDNO:6是人DKK2的反向引物序列，SEQIDNO:7是小鼠DKK2的正向引物序列，以及SEQIDNO:8是小鼠DKK2的反向引物序列。2權利要求1.一種用于在哺乳動物中刺激血管生成的方法，包括向所述哺乳動物未形成血管的組織給予有效量的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA的步驟。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述未形成血管的組織是由缺血性疾病造成損傷后新形成的皮膚組織、肌肉組織和結締組織。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述缺血性疾病是燒傷、牛皮癬、潰瘍、局部缺血、心月幾梗塞、心絞痛、腦梗塞或腦出血。4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述DNA通過使用病毒載體或非病毒載體而給予。5.4艮據權利要求4所述的方法，其中，所述病毒載體是腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體或單純性皰療病毒載體。6.根據權利要求4所述的方法，其中，所述非病毒載體是能夠在動物細胞中表達的質粒。7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述DKK2蛋白由SEQIDNO:l表示。8.根據權利要求1所述的方法，其中，所述DNA由SEQIDNO:2表示。9.DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA用于制造治療或預防缺血性疾病所采用的藥物的應用。10.—種用于治療和預防在夾血性疾病的藥物組合物，含有DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA作為活性成分。11.根據權利要求10所述的藥物組合物，其中，所述DKK2蛋白由SEQIDNO:l表示。12.#4居4又利要求10所述的藥物組合物，其中，所述DNA由SEQIDNO:2表示。13.根據權利要求10所述的藥物組合物，其中，所述缺血性疾病是燒傷、牛皮癬、潰瘍，局部缺血、心肌梗塞、心絞痛、腦梗塞或腦出血。14.一種用于治療或預防擊夾血性疾病的方法，其中，所述方法包括「向患有所述缺血性疾病的哺乳動物給予治療有效量的DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA。15.—種用于預防或改善缺血性疾病的保健食品，含有DKK2蛋白或編碼DKK2蛋白的DNA作為活性成分。16.根據權利要求15所述的保健食品，其中，所述保健食品以丸齊'J、粉劑、顆粒劑、片劑、咀嚼片劑、膠嚢劑或飲料形式提供。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過使用DKK2來刺激血管生成的方法以及含有DKK2的組合物。本發(fā)明的DKK2蛋白表現(xiàn)出對HUVEC上血管形成的刺激活性，對動脈環(huán)組織出芽的促進活性以及對小鼠胚胎中血管發(fā)育的促進活性。因此，它可以用作用于治療和預防缺血性疾病的治療性或功能性保健食品。文檔編號C12N15/12GK101490258SQ200780026545公開日2009年7月22日申請日期2007年5月23日優(yōu)先權日2006年5月24日發(fā)明者尹彩鈺,權寧根,金榮明,閔正基申請人:延世大學工業(yè)學術合作社