專利名稱：：具有經(jīng)修飾的用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生aav的aav-rep78翻譯起始密碼子的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及昆蟲細(xì)胞中腺伴隨病毒的生產(chǎn)，以及病毒Rep蛋白表達(dá)和穩(wěn)定性提高的腺伴隨病毒，所述提高增加了昆蟲細(xì)胞中腺伴隨病毒載體的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
：腺伴隨病毒(AAV)被認(rèn)為是用于人類基因治療的最有前景的病毒載體之一。AAV具有有效感染人類分裂及非分裂細(xì)胞的能力，AAV病毒基因組整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的一個(gè)單染色體位點(diǎn)，而且最重要的是，即使很多人帶有AAV，但其跟任何疾病都無(wú)關(guān)。由于這些優(yōu)點(diǎn)，人們正在血友病B、惡性黑素瘤、嚢性纖維化和其他疾病的基因治療臨床試驗(yàn)中對(duì)重組腺伴隨病毒(rAAV)進(jìn)行評(píng)價(jià)。所有支持AAV體外復(fù)制的宿主細(xì)胞都源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。因此，用于基因治療的rAAV至今主要是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上生產(chǎn)的，例如293細(xì)胞、C0S細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、KB細(xì)胞和其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(參見(jiàn)如US6，156，303、US5，387，484、US5，741，683、US5，691，176、US5，688，676、US20020081721、WO00/47757、WO00/24916和WO96/17947)。rAAV載體通常在這種哺乳動(dòng)物培養(yǎng)系統(tǒng)中的生產(chǎn)是通過(guò)提供含有側(cè)翼帶有AAV復(fù)制原點(diǎn)(末端反向重復(fù)序列即ITR)的治療基因的DNA質(zhì)粒，AAV復(fù)制蛋白R(shí)ep78、Rep68、Rep52和Rep40的基因，以及病毒粒子或結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3的基因。另外，還提供一種含有腺病毒早期基因(E2A、E40RF6、VARNA)的質(zhì)粒以加強(qiáng)AAV基因的表達(dá)和提高載體的產(chǎn)量(參見(jiàn)如Grimmetal.，1998，Hum.GeneTher.2745-2760)。然而，在大多數(shù)這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的AAV顆粒的數(shù)量的數(shù)量級(jí)為104個(gè)顆粒(在Clark,2002，KidneyInt.^i(Supp1.1):9-15中有所綜述)。對(duì)于臨床研究，可能需要1015個(gè)以上的rAAV顆粒。為了產(chǎn)生此數(shù)量的rAAV顆粒，需要轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)大約1()H個(gè)培養(yǎng)的人類293細(xì)胞，相當(dāng)于5000個(gè)175cm2培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，這意味著要轉(zhuǎn)染多至10"個(gè)293細(xì)胞。因此，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模rAAV生產(chǎn)以獲得臨床試驗(yàn)的材料已被證明是非常麻煩的，商業(yè),的生產(chǎn)甚至是不可行的。另外總存在一種危險(xiǎn)，即在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)的用于臨床的載體會(huì)被哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中存在的不想要的(或許是致病的)材料所污染。為了克服這些哺乳動(dòng)物生產(chǎn)系統(tǒng)中的問(wèn)題，最近開發(fā)了一種使用昆蟲細(xì)胞的AAV生產(chǎn)系統(tǒng)(Urabeetal.,2002，Hum.GeneTher.U:19351943;US20030148506和US20040197895)。對(duì)昆蟲細(xì)胞中的AAV生產(chǎn)，必須做一些修飾以獲得正確比例的AAV衣殼蛋白(VP1、VP2和VP3)，其依靠?jī)煞N剪接受體位點(diǎn)的輪換使用和VP2起始密碼子ACG的次優(yōu)使用，該密碼子不能被昆蟲細(xì)胞準(zhǔn)確地復(fù)制。為了在昆蟲細(xì)胞中模擬衣殼蛋白的正確比例，Urabe等人(2002，見(jiàn)上文)使用了一個(gè)轉(zhuǎn)錄為單個(gè)多順?lè)醋有攀沟臉?gòu)建體，該多順?lè)醋有攀共恍枰艚蛹纯杀磉_(dá)所有三種VP蛋白，并且其中最上游的起始密碼子被替換為次優(yōu)起始密碼子ACG。在同時(shí)待決的申請(qǐng)(PCT/NL2005/050018)中，本發(fā)明人通過(guò)在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)一步優(yōu)化AAV衣殼蛋白的比例，還進(jìn)一步提高了桿狀病毒產(chǎn)生的rAAV載體的感染力。對(duì)于Urabe等人(2002，見(jiàn)上文)首先開發(fā)的AAV昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中AAVR印蛋白的表達(dá)，使用了含有兩個(gè)獨(dú)立Rep表達(dá)單元(一個(gè)用于Rep78，一個(gè)用于R印52)的重組桿狀病毒構(gòu)建體，每個(gè)單元都在單獨(dú)的昆蟲細(xì)胞啟動(dòng)子(分別為AIEl和PolH啟動(dòng)子)的控制之下。在這一系統(tǒng)中，因?yàn)橐阎诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中，與Rep52相比，R印78的表達(dá)豐度較低會(huì)有利于較高的載體產(chǎn)量(Lietal.，1997，JVirol.U:5236-43;Grimmetal.，1998,見(jiàn)上文)，因此選擇比PolH啟動(dòng)子弱;f艮多的啟動(dòng)子AIEl啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)Rep78表達(dá)。然而更近地，Kohlbrenner等人(2005，Mol.TherH:1217-25)報(bào)告了Urabe等人使用的表達(dá)所述兩種R印蛋白的桿狀病毒構(gòu)建體具有內(nèi)在的不穩(wěn)定性。通過(guò)在Urabe的原始載體中切開所述兩種Rep基因的回文取向(palindromicorientation),并設(shè)計(jì)兩個(gè)單獨(dú)的桿狀病毒載體表達(dá)Rep52和Rep78,Kohlbrenner等人(2005，見(jiàn)上文)提高了所述載體的傳代穩(wěn)定性。然而，盡管兩個(gè)獨(dú)立的桿狀病毒Rep構(gòu)建體可在昆蟲細(xì)胞中恒定地表達(dá)R印52和Rep78至少五代，但是rAAV載體的產(chǎn)量與Urabe等人(2002，見(jiàn)上文)設(shè)計(jì)的原始桿狀病毒R印構(gòu)建體相比要低5-10倍。因此仍然需要克服在昆蟲細(xì)胞中大規(guī)模(商業(yè)化)生產(chǎn)AAV載體的上述嚴(yán)重限制。因此提供在昆蟲細(xì)胞中穩(wěn)定和高產(chǎn)(大規(guī)模)地生產(chǎn)AAV載體的手段和方法是本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)
發(fā)明內(nèi)容定義本文使用的術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"是指多核苷酸(或多肽)元件功能關(guān)系的連接。當(dāng)使得一個(gè)核酸與另一個(gè)核#列有功能關(guān)系時(shí)，它就被"可操作地連接"。例如，如杲轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它可操作地連接至所述編碼序列。可操作地連接意味著相連接的DM序列通常是相鄰的，并且在必須連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)是相鄰的且在閱讀框中。"表達(dá)控制序列"是指調(diào)控與其可操作地連接的核苷酸序列表達(dá)的核酸序列。當(dāng)表達(dá)控制序列控制和調(diào)控核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯時(shí)，則所ii^達(dá)控制序列"可操作地連接"至所述核苷^列。因此，表達(dá)控制序列可包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白編碼基因前面的起始密碼子、內(nèi)含子剪接信號(hào)和終止密碼子。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)控制序列"旨在至少包括被設(shè)計(jì)以影響表達(dá)的序列，也可包括其他的有用元件。例如，前導(dǎo)序列和融合伴隨序列是表達(dá)控制序列。該術(shù)語(yǔ)也可包括從序列中除去框內(nèi)或框外不想要的可能的起始密碼子的核酸序列設(shè)計(jì)。它也可包括除去不想要的可能的剪接位點(diǎn)的核酸序列設(shè)計(jì)。它包括指導(dǎo)添加polyA尾的序列或多腺苷酸化序列(pA)，polyA尾為mRNA3'末端的一串腺嘌呤殘基，即被稱為polyA序列的序列。它還可被設(shè)計(jì)用來(lái)增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性。已知昆蟲細(xì)胞中影響轉(zhuǎn)錄和翻^HI定性的表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子，以及實(shí)現(xiàn)翻譯的序列例如Kozak序列。表達(dá)控制序列具有調(diào)節(jié)與其可操作地連接的核苷酸序列從而得到更低或更高的表達(dá)水平的性質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"或"轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列"是指起到控制一個(gè)或多個(gè)編碼序列轉(zhuǎn)錄的功能的核酸片段，它位于編碼序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄方向的上游，其結(jié)構(gòu)特征在于存在依賴DNA的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其他DM序列，包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、抑制子和激活子蛋白結(jié)合位點(diǎn)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的直接或間接調(diào)控啟動(dòng)子7轉(zhuǎn)錄量的任何其他核苷酸序列。"構(gòu)成型"啟動(dòng)子是在絕大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在絕大多數(shù)組織中有活性的啟動(dòng)子。"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子是受生理或發(fā)育調(diào)控例如通過(guò)使用化學(xué)誘導(dǎo)物調(diào)控的啟動(dòng)子。"組織特異型，，啟動(dòng)子只在特定類型的組織或細(xì)胞中有活性。術(shù)語(yǔ)"基本上相同"、"基4^目同"、"基本上相似"和"基本相似"是指兩個(gè)肽或兩個(gè)核苷酸序列在最優(yōu)比對(duì)例如通過(guò)使用默認(rèn)參數(shù)的程序GAP或BESTFIT比對(duì)時(shí)，至少共有一定百分比的序列同一性(在本文其他地方定義的)。GAP使用Needleman和Wunsch總體比對(duì)算法來(lái)對(duì)兩個(gè)序列的全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)，使匹配數(shù)目最大并使空位數(shù)目最小。通常，GAP使用的默認(rèn)參數(shù)為空位形成罰分=50(核普酸)/8(蛋白)，空位延長(zhǎng)罰分=3(核苷酸)/2(蛋白)。對(duì)于核苷酸，使用的默認(rèn)分?jǐn)?shù)矩陣是nwsgapdna;對(duì)于蛋白，使用的默認(rèn)分?jǐn)?shù)矩陣是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。當(dāng)然，當(dāng)認(rèn)為RM序列與DNA序列基^目似或具有一定程度的序列同一性時(shí)，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認(rèn)為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。序列比對(duì)和序列同一性百分比得分可使用計(jì)算機(jī)程序確定，例如GCGWisconsinPackage10.3版，可從AccelrysInc.,9685ScrantonRoad，SanDiego，CA92121-3752，USA獲得；或開i文源碼軟件Emboss的Windows版(目前版本為2.7.1-07)?；蛘?，相似度或同一性百分比可通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)例如FASTA、BLAST等獲得。本發(fā)明的編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列也可按照它們分別與核苷酸序列SEQIDN0.10在溫和或優(yōu)選地在嚴(yán)格雜交條件下的雜交能力來(lái)定義。本文定義的嚴(yán)格雜交條件是使具有至少約25個(gè)核苷酸，優(yōu)選約50個(gè)核苷酸、75個(gè)核苷酸或100個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選約200個(gè)或更多核苷酸的核酸序列在約651C的溫度下和在含約1M鹽的溶液,優(yōu)選6xSSC溶液或任何其他含有相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶液中雜交；并且，在65匸下和含約0.1M或更少的鹽的溶液，優(yōu)選O.2xSSC溶液或任何其他含有相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶液中漂洗。優(yōu)選地，雜交過(guò)夜進(jìn)行，即進(jìn)行至少10小時(shí)，并優(yōu)選地進(jìn)行至少1小時(shí)的漂洗，其中至少換2次漂洗液。這些條件通常使具有約90。/?；蚋咝蛄型恍缘男蛄刑禺愋缘仉s交。本文定義的溫和條件是使至少有約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選約200個(gè)或更多核苷酸的核酸序列在約45C的溫度下和含約1M鹽的溶液，優(yōu)選6xSSC溶液或任何其他含有相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶液中雜交；并且，在室溫下和含約1M鹽的溶液，優(yōu)選6xSSC溶液或任何其他含有相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的溶液中漂洗。優(yōu)選地，雜交過(guò)夜進(jìn)行，即進(jìn)行至少10小時(shí)，并優(yōu)選地進(jìn)行至少1小時(shí)的漂洗，其中至少換2次漂洗液。這些條件通常使具有最高至50%序列同一性的序列特異性地雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠修改這些雜交條件，以特異性地識(shí)別同一性在50%和90%之間的序列。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)小病毒、特別是依賴病毒如感染性人類或猿AAV及其組分(如動(dòng)物細(xì)小病毒基因組)用作在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入和/或表達(dá)核酸的載體的用途。具體而言，本發(fā)明涉及這種細(xì)小病毒載體在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)其產(chǎn)量的提高。細(xì)小病毒科的病毒是小DNA動(dòng)物病毒。細(xì)小病毒科可被分為兩個(gè)亞科感染脊推動(dòng)物的細(xì)小病毒亞科和感染昆蟲的濃核病毒亞科。細(xì)小病毒亞科的成員在本文中被稱為細(xì)小病毒并包括依賴病毒屬。正如可從其屬名推斷的，依賴病毒的成員很特殊，因?yàn)樗鼈兺ǔＰ枰c輔助病毒如腺病毒或皰瘆病毒共感染以在細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)性感染。依賴病毒屬包括通常感染人類(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如血清型1和4)的AAV，和感染其他溫血?jiǎng)游锏南嚓P(guān)病毒(例如，牛、狗、馬和羊腺伴隨病毒)。關(guān)于細(xì)小病毒和細(xì)小病毒科的其他成員的更多信息在KennethI.Berns,"Parvoviridae:TheVirusesandTheirImplication,"FieldsVirology(3dEd.1996)第69章中有描述。為方便起見(jiàn)，本文將借助AAV進(jìn)一步例證和描述本發(fā)明。然而應(yīng)理解本發(fā)明不限于AAV，而是可同樣地應(yīng)用于其他細(xì)小病毒。所有已知的AAV血清型的基因組排列都非常相似。AAV的基因組是長(zhǎng)度小于約5000核苷酸(nt)的線性單鏈DNA分子。末端反向重復(fù)序列(ITR)位于非結(jié)構(gòu)復(fù)制蛋白(Rep)和結(jié)構(gòu)蛋白(VP)的獨(dú)特編碼核苷酸序列的側(cè)翼。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣殼。末端的145個(gè)nt是自身互補(bǔ)的并且具有可形成一個(gè)能量穩(wěn)定的形成T形發(fā)夾的分子內(nèi)雙鏈的結(jié)構(gòu)。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞DM聚合酶復(fù)合體的引物，具有病毒DM復(fù)制原點(diǎn)的功能。wtAAV感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，R印基因(即Rep78和Rep52)分別通過(guò)P5啟動(dòng)子和P19啟動(dòng)子表達(dá)，并且兩個(gè)R印蛋白都在病毒基因組復(fù)制中起作用。R印ORF的剪接事件實(shí)際導(dǎo)致了四個(gè)R印蛋白(即Rep78、R印68、Rep52和Rep40)的表達(dá)。然而，已顯示哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編碼Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA對(duì)AAV載體生產(chǎn)U夠的。昆蟲細(xì)胞中的Rep78和R印52蛋白對(duì)AAV載體生產(chǎn)也是足夠的。本文中的"重組細(xì)小病毒或AAV載體"(或"rAVV載體")是指含有一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼有細(xì)小病毒或AAV的末端反向重復(fù)序列(ITR)的目的多核苷^列、目的基因或"轉(zhuǎn)基因"的載體。當(dāng)這種rAAV載體在表達(dá)AAVrep和cap基因產(chǎn)物(即AAVRep和Cap蛋白)的昆蟲宿主細(xì)胞中存在時(shí)，它們可被復(fù)制并裝配到感染性病毒顆粒中。當(dāng)rAAV載體被整合到更大的核酸構(gòu)建體(例如，染色體或另一用于克隆或轉(zhuǎn)染的載體如質(zhì)粒或桿狀病毒)中時(shí)，那么rAAV載體通常被稱為"前栽體"，它在存在AAV裝配功能和必要輔助功能的情況下可通過(guò)復(fù)制和殼體化被"挽救"。本發(fā)明的第一方面涉及含有開放閱讀框的核苷酸序列，所述開放閱讀框含有編碼動(dòng)物細(xì)小病毒R印蛋白的核苷酸序列，其中細(xì)小病毒Rep78蛋白的翻譯起始密碼子是次優(yōu)起始密碼子。次優(yōu)起始密碼子優(yōu)選地是實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍的起始密碼子。本文中的部分外顯子跳躍被理解為指至少部分核糖體不在Rep78蛋白的次優(yōu)起始密碼子而在一個(gè)更下游的起始密碼子起始翻譯，其中優(yōu)選地更下游的起始密碼子是R印52蛋白的起始密碼子。次優(yōu)起始密碼子優(yōu)選地在核苷酸序列在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)時(shí)實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍。優(yōu)選地，使用桿狀病毒表達(dá)，次優(yōu)起始密碼子在昆蟲細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍，從而優(yōu)選在感染后約20-40小時(shí)，更優(yōu)選在約30-40小時(shí)，在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的R印78和R印52的摩爾比范圍為1:10到10:1、1:5到5:1或1:3到3:1。R印78和Rep52的摩爾比可通過(guò)實(shí)施例1.1,3所述的蛋白質(zhì)印跡測(cè)定，優(yōu)選地使用識(shí)別Rep78和Rep52兩者的共有表位的單克隆抗體，或使用實(shí)施例1.1.3所描述的抗體。本文使用的術(shù)語(yǔ)"次優(yōu)起始密碼子"不僅指三核苷^始密碼子自身，還指它的背景。因此，次優(yōu)起始密碼子可由在次優(yōu)背景例如非Kozak背景中的"最優(yōu)"ATG密碼子組成。然而，更優(yōu)選三核苷^始密碼子自身是次優(yōu)(即不是ATG)的次優(yōu)起始密碼子。本文中的次優(yōu)被理解為指所述密碼子與在同樣背景中的正常ATG密碼子相比，在翻譯起始中的效率較低。10優(yōu)選地，次優(yōu)密碼子的效率比同樣背景下的正常ATG密碼子的效率低90%、80%、60%、40%或20%。技術(shù)人員清楚比較翻譯起始的相對(duì)效率的方法。優(yōu)選的次優(yōu)起始密碼子可從ACG、TTG、CTG和GTG中選擇。更優(yōu)選為ACG。編碼動(dòng)物細(xì)小病毒R印蛋白的核苷酸序列，在本文中被理解為編碼非結(jié)構(gòu)Rep蛋白例如Rep78和R印52的核苷^列，所述非結(jié)構(gòu)Rep蛋白對(duì)于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)小病毒栽體而言是必需的且很充足。動(dòng)物細(xì)小病毒核苷酸序列優(yōu)選地來(lái)自依賴病毒，更優(yōu)選地來(lái)自人類或猿腺伴隨病毒(AAV),最優(yōu)選地來(lái)自通常感染人類(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或靈長(zhǎng)類(如血清型1和4)的AAV。編碼動(dòng)物細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)例在SEQIDNo.10中給出，它描繪了AAV血清型2的序列基因組中編碼R印蛋白的一部分。R印78編碼序列包括核苷酸11-1876，R印52編碼序列包括核苷酸683-1876。應(yīng)理解R印78和Rep52蛋白的精確分子量，以及翻譯起始密碼子的精確位置，可能隨細(xì)小病毒的不同而有所不同。然而，技術(shù)人員懂得如何識(shí)別AAV-2以外的其他細(xì)小病毒核苷^列的相應(yīng)位置。因而，編碼動(dòng)物細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷^列也可是定義為如下的核苷酸序列a)編碼具有性質(zhì)如下的多肽的核普酸序列所述多肽含有與氨基^f列SEQIDNO.11具有至少50%、60%、70%、80%、88%、89%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的#^酸序列；b)與SEQIDNO.10的11-1876位核苷酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、81%、82%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷^列；c)其互補(bǔ)鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交的核苷酸序列；d)由于遺傳密碼的筒并性，與(c)的核酸分子序列不同的核苷酸序列。優(yōu)選地，編碼對(duì)在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)小病毒載體而言是必需的且很充足的動(dòng)物細(xì)小病毒R印蛋白的核苷^列。本發(fā)明的更優(yōu)選的核苷酸序列包括含有SEQ.IDNO:7的9核苷^f列或與SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列的表達(dá)控制序列，所ii^達(dá)調(diào)控序列位于編碼細(xì)小病毒Rep78蛋白的核苷酸序列的起始密碼子的上游，與SEQ.IDNO:7的核苷酸序列基本一致且可幫助增加細(xì)小病毒R印78蛋白表達(dá)的序列是例如與SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列具有至少60%、70%、80°/。或90%同一性的序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員非常理解在昆蟲細(xì)胞中可被識(shí)別的推定剪接位點(diǎn)的消除一樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還非常理解，其他細(xì)小病毒的R印蛋白編碼序列中除了R印78和Rep52翻譯起始位點(diǎn)之外的可能的餘溪的翻譯起始位點(diǎn)的消除。為野生型細(xì)小病毒序列在昆蟲細(xì)胞中正確表達(dá)的多種修飾可通過(guò)應(yīng)用熟知的遺傳工程技術(shù)達(dá)成，如SambrookandRussell(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork中所描述的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解能夠增加R印蛋白產(chǎn)量的多種Rep蛋白編碼區(qū)的各種進(jìn)一步修飾。這些修飾都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在另一方面，本發(fā)明涉及含有編碼上迷細(xì)小病毒R印蛋白的核苷i^列的核酸構(gòu)建體。優(yōu)選地，在該構(gòu)建體中，編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核普酸序列與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接。這些表達(dá)控制序列至少包括在昆蟲細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的在昆蟲宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的技術(shù)可用于實(shí)施本發(fā)明。昆蟲細(xì)胞中分子工程和多肽表達(dá)的方法學(xué)在文獻(xiàn)中有所描述，如SummersandSmith.1986.AManualofMethodsforBaculovirusVectorsandInsectCultureProcedures,TexasAgriculturalExperimentalStationBull.No.7555，CollegeStation,Tex.;Luckow,1991.Prokopetal.,CloningandExpressionofHeterologousGenesinInsectCellswithBaculovirusVectors'RecombinantDMTechnologyandApplications,97—152;King:LA.andR.D.Possee，1992,Thebaculovirusexpressionsystem,ChapmanandHall,UnitedKingdom;O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow，1992，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual,NewYork;W.H.FreemanandRichardson,C.D.，1995，BaculovirusExpressionProtocols,MethodsinMolecularBiology,volume39;US4，745，051;US2003148506和W003/074714。對(duì)本發(fā)明編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷^列的轉(zhuǎn)錄特別合適的啟動(dòng)子為例如多角體啟動(dòng)子。然而，本領(lǐng)域也已知其他在昆蟲細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子，例如，p10、p35、IE-1或厶IE-1啟動(dòng)子，以及上面文獻(xiàn)中描述的其他啟動(dòng)子。12優(yōu)選地，用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)細(xì)小病毒R印蛋白的核酸構(gòu)建體是昆蟲細(xì)胞相容的載體。"昆蟲細(xì)胞相容的載體"或"載體"的含義是能夠多產(chǎn)地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染昆蟲或昆蟲細(xì)胞的核酸分子。示例性生物學(xué)載體包括質(zhì)粒、線性核酸分子和重組病毒。只要是昆蟲細(xì)胞相容的，任何栽體都可被使用。所述載體可能整合進(jìn)昆蟲細(xì)胞基因組，但所述載體在昆蟲細(xì)胞中的存在并不需要是永久的，瞬間游離栽體也包括在內(nèi)。所述載體可以用已知的任何方法例如細(xì)胞化學(xué)處理、電穿孔或感染來(lái)導(dǎo)入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是桿狀病毒、病毒載體或質(zhì)粒。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述栽體是桿狀病毒，即所述構(gòu)建體是桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及它們的使用方法在上面引用的昆蟲細(xì)胞分子工程學(xué)的參考文獻(xiàn)中有所描述。本發(fā)明的另一方面涉及含有不超過(guò)一種類型核苷酸序列的昆蟲細(xì)胞，所述核苷酸序列含有編碼細(xì)小病毒R印蛋白的單個(gè)開放閱讀框。優(yōu)選地，所述單個(gè)開放閱讀框編碼一種或多種細(xì)小病毒Rep蛋白，更優(yōu)選地，所述開放閱讀框編碼所有細(xì)小病毒Rep蛋白，最優(yōu)選地，所述開放閱讀框編碼全長(zhǎng)R印78蛋白，優(yōu)選地，至少R印52和R印78在昆蟲細(xì)胞中都可由此開放閱讀框表達(dá)。本文中可理解的是，所述昆蟲細(xì)胞可含有單一類型核苷酸序列一個(gè)以上的拷貝，例如在多拷貝游離載體中的單一類型核苷^列一個(gè)以上的拷貝，但是這些拷貝基本是同一個(gè)核酸分子的多個(gè)拷貝，或至少是編碼同一個(gè)Rep氨基酸序列的核酸分子，例如只是由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而相互不同的核酸分子。只存在單一類型編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核酸分子避免了可能存在于含有Rep序列的不同類型載體中的同源序列之間的重組，所述重組會(huì)產(chǎn)生影響昆蟲細(xì)胞中細(xì)小病毒的生產(chǎn)水平(的穩(wěn)定性)的缺陷型R印表ii^J建體。優(yōu)選地，在昆蟲細(xì)胞中，含有編碼一種或多種細(xì)小病毒R印蛋白的單個(gè)開放閱讀框的核苷酸序列是核酸構(gòu)建體的一部接。更優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞含有作為"第一"核苷酸序列的如上定:的編碼細(xì)小病毒R印蛋白的核苷酸序列，優(yōu)選為帶有如上定義的次優(yōu)起始密碼子的編碼序列，或如上定義的核酸構(gòu)建體；或所述昆蟲細(xì)胞含有作為"第一"核酸構(gòu)建體的如上定義的含有這類核苷酸序列的核酸構(gòu)建體。任何可復(fù)制重組細(xì)小病毒(rAVV)載體并可以在培養(yǎng)物中培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞都可按照本發(fā)明使用。例如，所用細(xì)胞系可來(lái)自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、果錄細(xì)胞系，或墳子細(xì)胞系，例如白故伊蚊(Aedesalbopictu)衍生細(xì)胞系。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞或細(xì)胞系是來(lái)自易被桿狀病毒感染的昆蟲種類的細(xì)胞，包括例如Se301、SelZD2109、SeUCRl、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5Bl-4、MG-1、Tn368、HzAml、Ha2302、Hz2E5、HighFive(Invitrogen，CA，USA)和ej^re5SF+(US6,103,526;ProteinSciencesCorp.,CT，USA)。本發(fā)明優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞，除了上述"第一"核苷酸序列或核酸構(gòu)建體，還含有a)含有至少一個(gè)細(xì)小病毒末端反向重復(fù)(ITR)核苷酸序列的笫二核苷酸序列；和b)含有與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接的細(xì)小病毒Cap蛋白編碼序列的第三核苷酸序列。在本發(fā)明的上下文中，"至少一個(gè)細(xì)小病毒ITR核苷酸序列"被理解為指回文序列，含有大部分互補(bǔ)、對(duì)稱排列的也被稱為"A"、"B"和"C"區(qū)的序列。ITR作為復(fù)制原點(diǎn)，即一個(gè)在復(fù)制中有"順式"作用的位點(diǎn)，亦即作為反式作用復(fù)制蛋白例如R印78(或Rep68)的識(shí)別位點(diǎn)，所述反式作用復(fù)制蛋白識(shí)別回文結(jié)構(gòu)和回文結(jié)構(gòu)內(nèi)部的特異序列。ITR序列對(duì)稱性的一個(gè)例外是ITR的"D"區(qū)。它是獨(dú)特的(在一個(gè)ITR內(nèi)部無(wú)互補(bǔ)序列)。單鏈DNA的切口出現(xiàn)在A區(qū)和D區(qū)的癡^處。它是新DNA合成起始的區(qū)域。D區(qū)一般位于回文結(jié)構(gòu)的一側(cè)并為核酸復(fù)制步驟提供方向性。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的細(xì)小病毒一般有兩個(gè)ITR序列。然而，可以設(shè)計(jì)一個(gè)ITR使結(jié)合位點(diǎn)位于A區(qū)的兩條鏈上，并且D區(qū)對(duì)稱分布，在回文結(jié)構(gòu)的每側(cè)各一個(gè)。隨后，在雙鏈環(huán)形DNA模板(如質(zhì)粒)上，Rep78或Rep68輔助的核酸復(fù)制在兩個(gè)方向上進(jìn)行，并且單個(gè)ITR即可滿足環(huán)形載體上的細(xì)小病毒復(fù)制。因此，一個(gè)ITR核苷酸序列可用于本發(fā)明的上下文中。然而，優(yōu)選地,使用兩個(gè)或另一偶數(shù)個(gè)規(guī)則的ITR。最優(yōu)選地，使用兩個(gè)ITR序列。一個(gè)優(yōu)選的細(xì)小病毒ITR是AAVITR。由于安全原因，可能需要構(gòu)建在初始導(dǎo)入細(xì)胞后不能再繁殖的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體。這種限制不想要的載體在受者中的繁殖的安全機(jī)制可通過(guò)使用如US2003148506所述的帶有嵌合ITR的rAAV提供。14在生產(chǎn)重組細(xì)小病毒(rAAV)栽體的昆蟲細(xì)胞中使用的核酸構(gòu)建體的數(shù)量在本發(fā)明中沒(méi)有限制。例如，l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立的構(gòu)建體可用于按照本發(fā)明的方法在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV。如果使用了5個(gè)構(gòu)建體，則一個(gè)構(gòu)建體編碼AAVVP1,另一個(gè)構(gòu)建體編碼AAVVP2，又一個(gè)構(gòu)建體編碼AAVVP3,再一個(gè)構(gòu)建體編碼如上定義的Rep蛋白，最后一個(gè)構(gòu)建體含有至少一個(gè)AAVITR。如果使用不到5個(gè)構(gòu)建體，則這些構(gòu)建體可含有至少一個(gè)AAVITR以及VP1、VP2、VP3和Rep蛋白編碼序列的各種組合。優(yōu)選地，使用兩個(gè)或三個(gè)構(gòu)建體，更優(yōu)選地使用如上所述的兩個(gè)構(gòu)建體。如果使用兩個(gè)構(gòu)建體，則優(yōu)選地，所述昆蟲細(xì)胞含有(a)如上定義的用于Rep蛋白表達(dá)的第一核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體還含有如上面(b)所定義的第三核苷酸序列(含有與至少一個(gè)用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接的細(xì)小病毒Cap蛋白編碼序列，另見(jiàn)下文)；和(c)含有如上面(a)定義的第二核苷酸序列的笫二核酸構(gòu)建體(含有至少一個(gè)細(xì)小病毒/AAVITR核苷酸序列)。如果使用三個(gè)構(gòu)建體，優(yōu)選地，配置與使用兩種構(gòu)建體時(shí)相同，除了使用分別的構(gòu)建體表達(dá)衣殼蛋白和表達(dá)Rep蛋白。每種構(gòu)建體中的序列相互之間可為任意次序。例如，如果一個(gè)構(gòu)建體含有ITR和一個(gè)含有編碼VP衣殼蛋白的核苷酸序列的0RF，則VPORF可以位于該構(gòu)建體上，從而使得ITR序列之間的DM復(fù)制時(shí)，VPORF被復(fù)制或不被復(fù)制。再例如，Rep編碼序列和/或含有編碼VP衣殼蛋白的核苷酸序列的ORF可按任何次序位于構(gòu)建體上。應(yīng)理解，同樣地，所述第二、第三和其他核酸構(gòu)建體優(yōu)選地是昆蟲細(xì)胞相容的栽體，優(yōu)選為如上所述的桿狀病毒載體?；蛘撸诒景l(fā)明的昆蟲細(xì)胞中，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和笫四核苷酸序列以及任選的其他核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)可穩(wěn)定地整合到昆蟲細(xì)胞的基因組中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何將核苷酸序列穩(wěn)定地導(dǎo)入昆蟲基因組中，以及如何識(shí)別在基因組中有這種核苷酸序列的細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)例如使用含有與昆蟲基因組的區(qū)域高度同源的核苷M列的載體來(lái)幫助整合到基因組中。將核苷^f列引入基因組的另一種方法是使用特殊序列，如轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明中，含有細(xì)小病毒衣殼(Cap)蛋白編碼序列的第三核苷酸序列在本文中被理解為含有編碼三種細(xì)小病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3中的每一種的序列。含有衣殼蛋白編碼序列的第三核苷酸序列可以多種形式存在，例如可使用分別針對(duì)衣殼蛋白VP1、VP2和VP3中的每一種的編碼序列，其中每個(gè)編碼序列與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接。然而，更優(yōu)選地，第三核苷酸序列含有編碼所有三種動(dòng)物細(xì)小病毒(AAV)衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的單個(gè)開放閱讀框，其中衣殼蛋白VP1翻譯的起始密碼子是非ATG的次優(yōu)起始密碼子，例如如Urabeetal.(2002，見(jiàn)上文)所述。VP1衣殼蛋白的次優(yōu)起始密碼子可以是上文定義的Rep78蛋白的次優(yōu)起始密碼子。更優(yōu)選的衣殼蛋白VP1的次優(yōu)起始密碼子可選自ACG、TTG、CTG和GTG,其中CTG和GTG是最優(yōu)選的。優(yōu)選的用于衣殼蛋白表達(dá)的第三核苷酸序列還包括表達(dá)控制序列，它含有SEQ.IDN0:7的9核苷酸序列或與SEQ.IDN0:7基本同源的核苷酸序列，位于編碼衣殼蛋白VP1的核苷酸序列的起始密碼子的上游。與SEQ.IDNO:7的核苷酸序列基本同一且有助于提高VP1表達(dá)的序列為例如與SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列具有至少60%、70%、80%或90°/。同一性的序列。更優(yōu)選的用于表達(dá)衣殼蛋白的第三核苷,列還更優(yōu)選地包含對(duì)編碼衣殼蛋白VP1的核苷酸序列的選自12位核苷酸的C、21位核苷酸的A和24位核苷酸的C(l位是翻譯起始密碼子的第一個(gè)核苷酸；參見(jiàn)SEQIDNO.1)的至少一個(gè)修飾。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員非常理解在昆蟲細(xì)胞中可被識(shí)別的推定剪接位點(diǎn)的消除一樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還非常理解翻譯其他血清型VP1的可能的發(fā)溪的翻譯起始密碼子的消除。技術(shù)人員了解對(duì)VP編碼區(qū)的多種其他修飾，這些修飾能夠增加VP和病毒粒子的產(chǎn)量或產(chǎn)生其他所需效果，例如改變向性或減少病毒粒子的抗原性。這些修飾都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明編碼細(xì)小病毒衣殼蛋白的核苷^f列與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接，所&達(dá)控制序列至少包括一個(gè)在昆蟲細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。這類控制序列和用于在昆蟲宿主細(xì)胞中表達(dá)細(xì)小病毒衣殼蛋白的其他技術(shù)和材料(如載體)已經(jīng)在上面Rep蛋白部分描述過(guò)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在于本發(fā)明昆蟲細(xì)胞中的第二核苷酸序列，即含有至少一個(gè)細(xì)小病毒(AAV)ITR的序列，還含有至少一個(gè)編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列，其中優(yōu)選地，所述至少一個(gè)編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列整合到在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體的基因組中。優(yōu)選地，所述至少一個(gè)編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的序列。優(yōu)選地，第二核苷酸序列含有兩個(gè)細(xì)小病毒(AAV)ITR核苷酸序列，且其中所述至少一個(gè)編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列位于兩個(gè)細(xì)小病毒(AAV)ITR核香酸序列之間。優(yōu)選地，如果編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列(用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá))位于兩個(gè)規(guī)則ITR之間或位于經(jīng)改造的具有兩個(gè)D區(qū)的一個(gè)ITR的任一側(cè)時(shí)，那么它會(huì)整合到在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體中。因此本文上面定義的第二核苷酸序列可含有一個(gè)編碼至少一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的"目的基因產(chǎn)物"的核苷酸序列，其位置使其可整合到在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體中。任何核苷酸序列都可被整合，以隨后在用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)?？删幋a例如一個(gè)蛋白的核苷酸序列可表達(dá)出RNAi試劑，即能夠進(jìn)行RNA干擾的RNA分子，例如shRNA(短發(fā)夾RNA)或siRNA(短干擾RM)。"siRNA"指小干擾RM，它是對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒的短雙鏈RNA(Elbashiretal.，2001，Nature494-98;Caplenetal.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9742-47)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二核苷酸序列可含有兩個(gè)核苷酸序列，且每一個(gè)都編碼一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的目的基因產(chǎn)物。編碼目的基因產(chǎn)物的兩個(gè)核苷^列的每一個(gè)的位置都可使其可被整合到在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的目的產(chǎn)物可以是治療用基因產(chǎn)物。治療用基因產(chǎn)物可以是多肽或MA分子(siRNA)或其他基因產(chǎn)物，所迷其他基因產(chǎn)物在靶細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可提供想要的治療效果，例如消除不想要的活性，如除去感染的細(xì)胞或補(bǔ)足基因缺陷(如導(dǎo)致酶活缺失的缺陷)。治療用多肽基因產(chǎn)物的實(shí)例包括CFTR、IX因子、脂蛋白脂肪酶(LPL,優(yōu)選為L(zhǎng)PLS447X;參見(jiàn)W001/00220)、栽脂蛋白Al、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)、視網(wǎng)膜色素變性GTP酶調(diào)節(jié)因子相互作用蛋白(RP-GRIP)和細(xì)胞因子或白細(xì)胞介素例如IL-IO。另外或此外，作為第二基因產(chǎn)物，本文上面定義的第二核苷酸序列可含有編碼用作標(biāo)記蛋白的多肽的核苷酸序列，以測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)化和表達(dá)。用于此目的的合適的標(biāo)記蛋白為例如熒光蛋白GFP和選擇性標(biāo)記基因HSV胸苷激酶(用于HAT培養(yǎng)基上的選擇)、細(xì)菌潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(用于對(duì)潮霉素B的選擇)、Tn5氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(用于對(duì)G418的選擇)和二氳葉酸還原酶(DHFR)(用于對(duì)曱氨蝶呤的選擇)、CD20(低親和性神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因)。獲得這些標(biāo)記基因的來(lái)源和其使用方法見(jiàn)SambrookandRussel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork。另外，本文上面定義的第二核苷酸序列可含有編碼可用作故障保險(xiǎn)機(jī)制的多肽的核苷酸序列，在認(rèn)為必要時(shí)，所述多肽使得可以用由本發(fā)明的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞來(lái)治愈受試者。這種通常被稱為自殺基因的核苷i^列編碼能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)變?yōu)橛卸疚镔|(zhì)的蛋白，所述有毒物質(zhì)能夠殺死所述蛋白在其中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。這種自殺基因的合適的實(shí)例包括例如大腸桿菌(Aco/Z)胞嘧咬脫氨酶基因或單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和水痘帶狀皰滲病毒的胸苷激酶基因之一，在這些實(shí)例中，更昔洛韋可用作殺死受試者中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的前藥(參見(jiàn)例如Clairetal.，1987，Antimicrob.AgentsChemother.H:844-849)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)目的基因產(chǎn)物可以是AAV蛋白。特別是R印蛋白，如Rep78或R印68,或其功能片段。編碼Rep78和/或Rep68的核苷酸序列，如果存在于本發(fā)明重組細(xì)小病毒(rAAV)載體的基因組中并在被所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，則可使重組細(xì)小病毒(rAAV)載體整合到經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組中。Rep78和/或Rep68在rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，可通過(guò)允許經(jīng)所述重組細(xì)小病毒(rAAV)載體引入細(xì)胞的其他目的基因產(chǎn)物長(zhǎng)期或永久地表達(dá)，而有利于所述載體的某些應(yīng)用。在本發(fā)明的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體中，至少一個(gè)編碼在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列，優(yōu)選地與至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子可操作地連接。本領(lǐng)域已知許多這類啟動(dòng)子(見(jiàn)SambrookandRussel，2001，見(jiàn)上文)。可使用在許多種細(xì)胞中廣a達(dá)的構(gòu)成型啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子。然而，更優(yōu)選的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的、組織特異的、細(xì)胞種類特異的或細(xì)胞周期特異的。例如，對(duì)于肝臟特異性表達(dá)，啟動(dòng)子可選自ocl-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子、曱狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、LPS(甲狀腺素結(jié)合球蛋白)啟動(dòng)子、HCR-ApoCII雜交啟動(dòng)子、HCR-hAAT雜交啟動(dòng)子和栽脂蛋白E啟動(dòng)子。其18他實(shí)例包括用于腫瘤選擇性一一特別是神經(jīng)細(xì)胞腫瘤選擇性一一表達(dá)的E2F啟動(dòng)子(Parretal.，1997，Nat.Med.3:1145-9)或用于在單核血細(xì)胞中4吏用的IL-2啟動(dòng)子(Hagenbaughetal.，1997，JExpMed;185:2101-10)。AAV能感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。參見(jiàn)如Tratschinetal.(1985，Mol.CellBiol.互3251-3260)和GrimmetaL(1999，Hum.GeneTher.n:2445-2450)。然而，人類滑膜成纖維細(xì)胞的AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)明顯比類似的鼠細(xì)胞更有效(Jenningsetal.，ArthritisRes，3:1，2001)，且AAV的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)機(jī)能在各血清型中不同。參見(jiàn)如Davidsonetal.(2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,^:3428-3432)，該文獻(xiàn)討論了AAV2、AAV4和AAV5在哺乳動(dòng)物CNS細(xì)胞向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率方面的不同?？捎糜诒景l(fā)明以在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組AAV載體的AAV序列可源自任何AAV血清型的基因組。通常，MV血清型具有在M酸和核酸水平上有明顯的同源性的基因組序列，提供一系列相同的遺傳功能，產(chǎn)生在生理和功能上基本等價(jià)、并通過(guò)幾乎相同的機(jī)制進(jìn)行復(fù)制和裝配的病毒粒子。對(duì)于各種AAV血清型的基因組序列和基因組相似度的綜述，參見(jiàn)如GenBank登陸號(hào)U89790;GenBank登陸號(hào)J01901;GenBank登陸號(hào)AF043303;GenBank登陸號(hào)AF085716;Chlorinietal.(1997,J.Vir.71:6823-33);Srivastavaetal.(1983，J.Vir.45:555-64);Chlorinietal.(1999，J.Vir.73:1309-1319);Rutledgeetal.(1998，J.Vir.72:309-319)和Wuetal.(2000，J.Vir.74:8635-47)。AAV血清型1、2、3、4和5是用于本發(fā)明上下文中的AAV核苷酸序列的優(yōu)選來(lái)源。優(yōu)選地，用于本發(fā)明上下文中的AAVITR序列源自AAV1、AAV2和/或AAV4。同樣，R印(Rep78和Rep52)編碼序列優(yōu)選地源自AAV1、AAV2和/或AAV4。然而，用于本發(fā)明上下文的編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的序列可選自已知的42種血清型的任何血清型，更優(yōu)選地選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通過(guò)例如衣殼改組(capsidshuffling)技術(shù)和AAV衣殼文庫(kù)獲得的新開發(fā)的AAV樣顆粒。AAVR印和ITR序列在大多數(shù)血清型中是特別保守的。各種AAV血清型的R印78蛋白有例如超過(guò)89。yd的同一性，并且AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之間在基因組水平的總核苷酸序列的同一性為約82%(Bantel-Schaaletal.，1999，J.Virol.，73(2):939-947)。另外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生AAV顆粒方面，已知許多AAV血清型的Rep序列和ITR與其他血清型的相應(yīng)序列是有效交叉互補(bǔ)的(即功能可替代的)。US2003148506才艮道了AAVRep和ITR序列與在昆蟲細(xì)胞中的其他AAVRep和ITR序列是有效交叉互補(bǔ)的。已知AAVVP蛋白決定AAV病毒粒子的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)機(jī)能。不同AAV血清型的VP蛋白編碼序列的保守性明顯比R印蛋白和基因的要低。R印和ITR序列與其他血清型的相應(yīng)序列交叉互補(bǔ)的能力可^:得產(chǎn)生假型rAAV顆粒，該顆粒包含一種血清型(如AAV3)的衣殼蛋白和另一種AAV血清型(如AAV2)的R印和/或ITR序列。這種假型rAAV顆粒是本發(fā)明的一部分。經(jīng)修飾的"AAV"序列也可用于本發(fā)明的上下文中，如用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生rAAV載體。這種經(jīng)修飾的序列例如包括與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或MV9至少有約70。/"至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更高核苷酸和/或#^酸序列同一性(例如具有約75-99%核*酸序列同一性的序列)的序列，ITR、Rep或VP可用于代替野生型AAVITR、Rep或VP序列。盡管在許多方面與其他AAV血清型相似，AAV5與其他人類和猿AAV血清型的不同比其他已知的人類和^jfe清型要大。因此，rAAV5在昆蟲細(xì)胞中的生產(chǎn)與其他血清型的生產(chǎn)不同。當(dāng)^f吏用本發(fā)明的方法來(lái)生產(chǎn)rAAV5時(shí)，優(yōu)選地，一種或多種構(gòu)建體(總之在超過(guò)一種構(gòu)建體的情況下)含有一個(gè)含有AAV5ITR的核苷酸序列、一個(gè)含有AAV5Rep編碼序列的核苷酸序列(即含有AAV5R印78的核苷酸序列)。這種ITR和Rep序列可根據(jù)需要被修飾，以在昆蟲細(xì)胞中有效生產(chǎn)rAAV5或假型rAAV5載體。例如可修飾Rep序列的起始密碼子，可修飾或除去VP剪接位點(diǎn)，和/或可修飾VP1起始密碼子和附近核苷酸，從而提高rAAV5載體在昆蟲細(xì)胞中的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明另一方面涉及在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組細(xì)小病毒(rAAV)粒子(含有如上定義的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體)的方法。優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟(a)在產(chǎn)生重組細(xì)小病毒(rAAV)載體的條件下培養(yǎng)如本文上面定義的昆蟲細(xì)胞；并(b)回收所述重組細(xì)小病毒(rAAV)載體。在此，應(yīng)理解以所述方法生產(chǎn)的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體優(yōu)選為一種感染性細(xì)小病毒或AAV病毒粒子，它含有重組細(xì)小病毒(rAAV)載體核酸。本領(lǐng)域熟知培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)條件以及昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)中異源產(chǎn)物的生產(chǎn)，這些例如在上面引用的昆蟲細(xì)胞分子工程學(xué)參考文獻(xiàn)中有所描述。優(yōu)選地，所述方法還包括使用抗AAV抗體(優(yōu)選固定化抗體)對(duì)重組細(xì)小病毒(rAAV)載體(或含有所述載體的病毒粒子)進(jìn)行親和純化的步驟。所述抗AAV抗體優(yōu)選為單克隆抗體。一種特別合適的抗體是一種單鏈駝科動(dòng)物(cameloid)抗體或其片段，可例如從駱駝或美洲駝獲得(參見(jiàn)如Muyldermans，2001,Biotechnol.74:277-302)。用于AAV親和純4匕的抗體優(yōu)選為一種與rAAV衣殼蛋白上的表位特異結(jié)合的抗體，因此優(yōu)選地，所it^位為在多種AAV血清型的衣殼蛋白上存在的表位。如所述抗體可基于與AAV2衣殼特異性結(jié)合產(chǎn)生或選擇，但同時(shí)它也可與AAV1、AAV3和AAV5衣殼特異性結(jié)合。本發(fā)明另一方面涉及使用上述核酸構(gòu)建體和細(xì)胞，在上述本發(fā)明的方法中生產(chǎn)的rAAV病毒粒子。優(yōu)選地，所述rAAV病毒粒子在其基因組中包含至少一個(gè)編碼目的基因產(chǎn)物的核普酸序列，其中所述至少一個(gè)核苷,列不是天然AAV核苷酸序列，并且其中在AAVVP1、VP2和VP3衣殼蛋白的比例中，VP1的量為(a)至少為VP2量的100°/。、105%、110%、120%、150%、200%或400%;或(b)至少為VP3量的8%、10%、10.5%、11%、12%、15%、20%或40%;或(c)至少為(a)和(b)共同定義的。優(yōu)選地，使用識(shí)別VP1、VP2和VP3中的每一種所共有的表位的抗體來(lái)測(cè)定VP1、VP2和VP3的量。本領(lǐng)域有多種可對(duì)VP1、VP2和/或VP3的相對(duì)量進(jìn)行定量的免疫試趙參見(jiàn)如UsingAntibodies,E.HarlowandD.Lane,1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)。一種可識(shí)另3三種衣殼蛋白中的每一種所共有的表位的合適抗體為例如小鼠抗CapBl抗體(可從Progen,Germany購(gòu)得)。一種本發(fā)明的優(yōu)選的rAAV病毒粒子是在其基因組中含有至少一個(gè)編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列的病毒粒子，其中所述至少一個(gè)核苷酸序列不是天然AAV核苷酸序列，且其中所述AAV病毒粒子含有一種VPl衣殼蛋白，它1位氮基酸為亮氨酸或纈氨酸。一種本發(fā)明更優(yōu)選的AAV病毒粒子具有上面定義的衣殼蛋白比例，并含有一種其1位氨基酸為亮氨酸或纈氨酸的VPl衣殼蛋白。在本文件及其權(quán)利要求中，動(dòng)詞"含有"及其各種形式是用其非限制21性的含義表示包括該詞之后的項(xiàng)目，但并不排除未專門提到的項(xiàng)目。另外，用"一"或"一個(gè)"(不定冠詞"a"或"an")提及的要素不排除多個(gè)該要素存在的可能性，除非上下文明確要求有一個(gè)且只能有一個(gè)該要素。因此"一"或"一個(gè)"(不定冠詞"a"或"an")通常是指"至少一個(gè)"。圖1:A)野生型AAV基因組中R印表達(dá)的組織結(jié)構(gòu)。Rep78和Rep52基因分別由P5和P19啟動(dòng)子表達(dá)。Rep68和Rep40(分別為R印78和Rep52的剪接變體)的表達(dá)未給出。這兩種表達(dá)單元都含有ATG起始位點(diǎn)。B)本發(fā)明的構(gòu)建體具有在單一啟動(dòng)子(例如多角體(PolH)啟動(dòng)子)控制下的R印0RF。因?yàn)镽ep78的起始密碼子ATG#:轉(zhuǎn)化為備用ACG起始密碼子并被核糖體部分跳過(guò)，因此上述單一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Rep78和Rep52兩者的表達(dá)。C)Urabeetal.(2002，見(jiàn)上文)的原始構(gòu)建體獨(dú)立地通過(guò)兩個(gè)不同的啟動(dòng)子(分別為AIEl和polH)驅(qū)動(dòng)Rep78和Rep52。圖2:從在昆蟲細(xì)胞中傳代5次的重組桿狀病毒表達(dá)的Rep蛋白的蛋白印跡分析。Urabeetal.，2002i殳計(jì)的原始桿狀病毒(原始REP/Bac-to-Bac)在5次傳代中Rep78/52的表達(dá)緩慢下降。插入在桿狀病毒骨架PSC中的Urabeetal.,2002設(shè)計(jì)的Rep78和52表達(dá)單元(原始REP/PSC)在昆蟲細(xì)胞中傳代后R印78/52的表達(dá)發(fā)生了下降。然而，PSC骨架中帶有含ACG起始密碼子的REP表達(dá)單元的桿狀病毒(REP-ACG/PSC)在至少5次傳代中其Rep78/52的表達(dá)是穩(wěn)定的。Western雜交分析如實(shí)施例1.1.3所述進(jìn)行。圖3:表l結(jié)果的曲線圖。圖4:昆蟲細(xì)胞中各種rAAV構(gòu)建體穩(wěn)定性的比較。如上面實(shí)施例1所述，在SF+細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV。對(duì)于所有生產(chǎn)而言，含有ITR的桿狀病毒和含有衣殼基因的桿狀病毒是相同的，世代數(shù)與含有Rep基因的桿狀病毒的相同。使用了4種不同的含有Rep基因的桿狀病毒1)REP-ACG/PSC;2)SLR:Urabeetal.(2002，見(jiàn)上文)的原始構(gòu)建體；3)Rep52+Rep78(B2B):兩種獨(dú)立的Bac-to-Bac桿狀病毒，一種含有Rep78基因，另一種含有Rep52基因；4)R印52+Rep78(PSC):兩種獨(dú)立的ProteinSciences桿狀病毒，一種含有R印78基因，另一種含有R印52基因。圖5:最高達(dá)傳代8次的REP-ACG/PSC桿狀病毒構(gòu)建體的穩(wěn)定性。如上面實(shí)施例1所述，在SF+細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV。圖6:傳代作用對(duì)Urabeetal.(2002，見(jiàn)上文)的原始構(gòu)建體和本發(fā)明的REP-ACG/PSC構(gòu)建體的對(duì)Rep蛋白表達(dá)的影響的比較。桿狀病毒傳代和蛋白印跡的進(jìn)行如實(shí)施例1所述。在rep桿狀病毒正常傳代的過(guò)程中，向SF細(xì)胞加入桿狀病毒后40小時(shí)取樣并進(jìn)行蛋白印跡。實(shí)施例實(shí)施例1:R印構(gòu)建體1.1.材料和方法1.1.1桿狀病毒質(zhì)粒構(gòu)建為從單獨(dú)的雙順?lè)醋有臹吏RM表達(dá)R印78和R印52,將位于表達(dá)載體pFastBacDualSLR(Urabeetal.，2002，見(jiàn)上文)上的Rep78的ATG起始密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)锳CG。所用的上游引物是BamHI5'-cgcggatcctgttaagACGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTC-3'(SEQIDNO.8)正向引物序列PCR反應(yīng)中使用的3，-引物位于REP78基因的側(cè)翼并含有Xbal位點(diǎn)(TCTAGA):Xbal5'-AGGCTCTAGATTCGAAAGCGGCCCG-3'(SEQIDNO,9》反向引物序列通過(guò)PCR(反應(yīng)體積50lxPfxAmp.緩沖液，0.3mMdNTP，lmMMgS04,150mM正向引物，150mM反向引物，2x增強(qiáng)溶液，模板50ng23(pFastBacDualSUO，1UPlati畫Pfx(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA))，使用以下實(shí)驗(yàn)方案來(lái)擴(kuò)增上述引物對(duì)之間的序列95X:、5min的1個(gè)循環(huán)；95X:、15s,55t:、30s，72*C、2min的35個(gè)循環(huán)；721C、10min的1個(gè)循環(huán)；4t:齡存)。使用ZeroBluntT0P0PCR克隆試劑盒(Invitrogen)將PCR產(chǎn)物克隆到PCR-bluntII-TOPO中。再利用限制位點(diǎn)Spel和Xbal將Rep78亞克隆到pFastBacDual(Invitrogen)中。最終將突變的Rep表達(dá)盒克隆到(使用限制性酶BstZ171和AvrII)桿狀病毒表達(dá)構(gòu)建體(用EcoRV和Xbal切開)pPSCIO(ProteinSciencesCorporation,Meriden，CT，USA)中。Baseclear，Leiden,theNetherlands對(duì)所述構(gòu)建體的序列進(jìn)行了確i人分析。1.1.2重組桿狀病毒生產(chǎn)使用GeneXpressBaculoKIT(ProteinSciencesCorporation)生產(chǎn)源自苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒。轉(zhuǎn)染如下進(jìn)行在一個(gè)圓底14ml試管中將200nlGRACE培養(yǎng)基與6ju1Cellfectine(Invitrogen)混合，并在一個(gè)Eppendorf管中將200piGRACE培養(yǎng)基與50ji1病毒DM(ProteinSciences)和2pg轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(REP)混合。將E卯endorf管中的容納物加入上述試管并小心混合。室溫培育30分鐘之后將1,300piGRACE加入至轉(zhuǎn)染混合物中。用GRACE培養(yǎng)基清洗T25燒瓶中的昆蟲細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入細(xì)胞層。在28X:培育6小時(shí)后，小心加入添加有10%FBS的SF900II血清，并將T25燒瓶置于28"C溫箱中5天，然后收獲重組桿狀病毒。1.1.3蛋白印跡分析用桿狀病毒-REP感染昆蟲細(xì)胞(SF+)。在感染細(xì)胞后16、40和64小時(shí)取樣品，通過(guò)加入0.IV10xTRIS裂解緩沖液(1.5MNaCl，0.5MTRIS，0.01MMgCl，1%TRITONX-100,pH8.5，過(guò)濾滅菌)裂解細(xì)胞，在搖床(Innova44，NewBrunswick)中于28tl下培育30分鐘。通過(guò)與Benzonase在37"C培育30分鐘降解游離的MA和RNA。對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行離心(1，900xg;15min;40。在上清液樣品中加入NuPAGELDS樣品緩沖液(4x，Invitrogen),然后上樣到4-12%的Bis-Tris膠(120V)上。蛋白質(zhì)在PVDF膜(BioRad)上印膜30分鐘，IOV(半干印跡)。Western免疫化學(xué)通過(guò)用Superblock-PBS封閉緩沖液(PIERCE)封閉膜并隨后用小鼠抗Rep(303.9，Progen，Germany;稀釋度1:50)和兔抗小鼠-HRP歸0，稀釋度1:500)培育來(lái)進(jìn)行。用發(fā)光底物(lumi-lightplusWestern-blottingsubstrate)(Roche)通過(guò)化學(xué)發(fā)光染色使Rep蛋白可見(jiàn)。1.2結(jié)果將新設(shè)計(jì)的本發(fā)明的R印構(gòu)建體(REP-ACG/PSC)與1)PSC桿狀病毒骨架中和2)Bac-to-Bac桿狀病毒骨架中的原始Rep構(gòu)建體(Urabeetal.，2002)的性能進(jìn)行對(duì)比。所有三種構(gòu)建體都進(jìn)行連續(xù)傳代直至第5代。使用第2、3、4和5代R印構(gòu)建體以及第2、3、4和5代各代的AAV-LPL和AAV-Cap重組桿狀病泰這里使用的AAV-LPL和AAV-Cap重組桿狀病毒如下面實(shí)施例2中所述)進(jìn)行AAV1-LPL生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。用qPCR測(cè)定AAV1-LPL的產(chǎn)量，如表l所示。Urabeetal.，2002設(shè)計(jì)的原始桿狀病毒(原始REP/Bac-to-Bac)的AAV產(chǎn)量在5次傳代中迅速下降。插入在桿狀病毒骨架PSC中的Urabeetal.，2002i殳計(jì)的Rep表達(dá)單元(原始REP/PSC)導(dǎo)致了在昆蟲細(xì)胞中傳代后也發(fā)生了AAV產(chǎn)量的下降。然而，PSC骨架中具有含ACG起始密碼子的REP表達(dá)單元的桿狀病毒(REP-ACG/PSC)的AAV產(chǎn)量在至少5代中穩(wěn)定。因此，只有用含有REP-ACG構(gòu)建體的桿狀病毒才能在幾代(如2-5)中得到可重現(xiàn)的AAV-LPL產(chǎn)量。代數(shù)原始REP/PSCvg/mlREP-ACG/PSCvg/ml原始REP/Bac_to-Bacvg/ml25.38E+093.04E+093.62E+1039.57E+094.77E+097.28E+0941.66E+097.81E+097.59E+0857.35E+089.90E+092.03E+08表1:使用幾代桿狀病毒構(gòu)建體生產(chǎn)rAAV病毒粒子用編碼第2、3、4或5代的LPL載體單元、編碼第2、3、4或5代的Rep表達(dá)單元和編碼第2、3、4或5代的Cap表達(dá)單元的三種重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞。三天后收獲細(xì)胞并用qPCR測(cè)定AAV產(chǎn)量(每ml載體基因組；vg/ml)。25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>2002設(shè)計(jì)的原始桿狀病毒(原始REP/Bac-to-Bac)顯示顯著量的第五代重組桿狀病毒的Rep序列有缺失。插入在桿狀病毒骨架PSC中的Urabeetal.，2002設(shè)計(jì)的R印78和52的表達(dá)單元(原始REP/PSC)表現(xiàn)出重組桿狀病毒非常早且顯著的損失。然而，PSC骨架中具有含ACG起始密碼子的REP表達(dá)單元的桿狀病毒(REP-ACG/PSC)(克隆C4和A3)表明在至少5代中為穩(wěn)定的重組桿狀病毒。實(shí)施例2:Cap構(gòu)建體2.1.1桿狀病毒質(zhì)粒構(gòu)建體為了從單個(gè)多順?lè)醋有攀筊NA表達(dá)VP1、VP2和VP3，如Urabeeta1.,2002(見(jiàn)上文)所述，設(shè)計(jì)了桿狀病毒-AAV-Cap構(gòu)建體。簡(jiǎn)言之，將VP1的ATG起始密碼子突變?yōu)锳CG。11位上可能的ATG起始密碼子被改為ACG。VP1起始密碼子下游的剪接受體位點(diǎn)被破壞(21位和24位突變)。突變的Cap表達(dá)盒被克隆到帶有BamHl/StuI限制位點(diǎn)的桿狀病毒表達(dá)構(gòu)建體pFastBacDual(pFBDAAVlVPmll)中。此質(zhì)粒(pFBDAAVlVPmll)是引入VP1替代起始密碼子的起始材料。Urabeetal(2002，見(jiàn)上文H吏用的目的在于引入上述突變的正向引物是BamHI11121245'-cgcggatcctgttaagACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO,1)下面的正向引物用于以pFBDAAVlVPmll(Urabeetal.，2002，見(jiàn)上文)為起始材料制備表，建體5'-cgcggatcctgttaagTTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO,2》5'-cgcggatcctgttaagATTGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQ工DNCU3)5'-cgcggatcctgttaagGTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO，4〉5'-cgcggatcctgttaagCTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCG&TTGGCTd(SEQIDNO.5)使用上述正向引物的PCR反應(yīng)中用的反向引物被定位到VP1起始密碼子下游約230bp處并含有一個(gè)特殊的StuI位點(diǎn)(AGGCCT)。5'-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3'(SEQIDNO,6)用上述正向和反向引物對(duì)通過(guò)PCR擴(kuò)增片段。用BamHI和Stul消化PCR產(chǎn)物后，PCR產(chǎn)物被亞克隆到pFBDAAVlvpmll的BamHI/Stul位點(diǎn)，產(chǎn)生多個(gè)待測(cè)的桿狀病毒-AAV-Cap構(gòu)建體。該DM構(gòu)建體在Baseclear，Leiden,theNetherlands通過(guò)序歹'J分析確認(rèn)。2.1.2重組桿狀病毒的生產(chǎn)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)生產(chǎn)了源自苜蓿4艮紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒。通過(guò)感染每ml2xl06個(gè)Sf9細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增rBac-Cap,moi為O.1。感染后三天，通過(guò)離心沉降細(xì)胞，回收含有病毒的上清液。。2.1.3重組AAV的生產(chǎn)用Urabeetal.，2002的三種重組桿狀病毒生產(chǎn)rAAV批次。然而，對(duì)于此研究，一種桿狀病毒含有轉(zhuǎn)基因LPLS447X的表達(dá)構(gòu)建體。從該轉(zhuǎn)基因表達(dá)的治療用活性試劑是人類脂蛋白脂肪酶的天然存在的變體，它是一個(gè)448個(gè)氨基酸的單鏈。所述LPf變體在蛋白C末端有2個(gè)M酸缺失。第二種桿狀病毒含有AAV復(fù)制基因Rep78和Rep52的表達(dá)構(gòu)建體。第三種桿狀病毒含有AAV1衣殼序列，其中VP1的起始密碼子要么是ACG，要么是TTG、CTG、GTG。根據(jù)Grimmetal.，1998(Noveltoolsforproductionandpurificationofrecombinantadeno-associatedvirusvectors.HumGeneTher.1998Dec10;9(18):2745-60)生產(chǎn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物-rAAV各批次。2.1.3蛋白印跡分析用桿狀病毒-Cap感染昆蟲細(xì)胞。感染后三天，細(xì)胞被離心(3，000g;15min)。用0.22umMillex過(guò)濾器過(guò)濾上清液。在上清液樣品中加入NuPAGELDS樣品緩沖液(Invitrogen)，然后上樣到4-12°/。的Bis-Tris膠上。在100V下跑膠。蛋白質(zhì)在IOOV、350mA下于硝酸纖維素膜(BioRad)上印膜l小時(shí)。Western免疫化學(xué)是通過(guò)用1%Marvel脫脂奶粉封閉膜并隨后用小鼠抗Cap(Bl，Progen，Germany;稀釋度l:50)和兔抗小鼠HRP歸0，稀釋度1:100)培育來(lái)進(jìn)行的。用發(fā)光底物(lumi-lightplusWestern-blottingsubstrate)(Roche)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光染色l吏VPl、VP2、VP3可見(jiàn)。2.1.4生化測(cè)量用放射性甘油三油酸酯乳液底物如前所述測(cè)定人類LPLS447X活性(Nilsson-EhleandScholtz，1976)。用雞IgY和小鼠5D2抗hLPL抗體進(jìn)行夾心酶聯(lián)免疫分析測(cè)定人類LPL，x免疫活性物質(zhì)(Liuetal.，2000)。4吏用商業(yè)試劑盒按照廠商說(shuō)明書(BoehringerMannheim,#450032)測(cè)量血漿甘油三酸酯水平。2.2結(jié)果2.2.1重組桿狀病毒的構(gòu)建為了在Urabeetal(2002，見(jiàn)上文)i殳計(jì)的桿狀病毒質(zhì)粒中引入不同的可替代的用于VPl表達(dá)的起始密碼子，設(shè)計(jì)了一系列含有BamHI限制位點(diǎn)的上游引物，并用TTG、ATT、GTG或CTG密碼子替代VPl的ACG起始密碼子。用這些引物結(jié)合含有StuI位點(diǎn)的下游引物進(jìn)行PCR,得到亞克隆到pFBDVPmll(Bac-Cap)的BamHI/StuI位點(diǎn)的擴(kuò)增片段。產(chǎn)生的桿狀病毒質(zhì)粒用于通過(guò)Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備重組桿狀病毒。制備的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞以生產(chǎn)AAV衣殼。感染后三天，用蛋白印跡測(cè)定不同批次桿狀病毒的病毒蛋白表達(dá)。從蛋白印跡可清楚地看出，含有VP1的TTG起始密碼子的桿狀病毒構(gòu)建體表達(dá)此蛋白的水平比以前用ACG起始密碼子的構(gòu)建體要高，用TTG密碼子的VP1和VP2之間的比例是1:1,接近于對(duì)野生型AAV的報(bào)道(未給出)。2.2.2各rAAV批次對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染為了研究源自使用TTG起始密碼子的重組桿狀病毒的AAV衣殼的感染性，生產(chǎn)了rAAV。同時(shí)也通過(guò)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物HEK293細(xì)胞生產(chǎn)了一批rAAV。兩批rAAV的載體基因組滴度都用qPCR測(cè)定。此滴度用于在微滴定板中以增加的moi感染HEK293細(xì)胞。感染后兩天，在感染細(xì)胞的培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(LPLS"7x)的定量測(cè)定(LPy定量測(cè)定)。該測(cè)定表明用桿狀病毒生產(chǎn)的rAAV所產(chǎn)生的LPy的量接近于用質(zhì)粒生產(chǎn)的rAAV所產(chǎn)生的LPL(未給出)。2.2.3小鼠中各rAAV批次的注射桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)和常規(guī)哺乳動(dòng)物質(zhì)粒生產(chǎn)系統(tǒng)所生產(chǎn)的各rAAV批次經(jīng)肌內(nèi)注射到小鼠中以觀察體內(nèi)LPLS447X蛋白活性和甘油三酸酯饑餓。在注射后3天、7天和2周^Lik樣并測(cè)定。在病毒給予之后的3天和7天之間，取自用哺乳動(dòng)物rAAV注射的小鼠和用桿狀病毒-rAAV注射的一只小鼠的血漿都從乳狀變?yōu)橥耆吻?。取自一只注射桿狀病毒-rAAV的小鼠的血漿仍然相對(duì)呈乳狀但脂肪水平明顯降低。所有處理小鼠的甘油三酸酯的水平分別降低(未給出)。在第14天，在用哺乳動(dòng)物-AAV和桿狀病毒-(TTG)-AAV處理的小鼠中TG水平都降低了96%。病毒給予后兩周取得的血漿樣品顯示出用桿狀病毒-AAV和哺乳動(dòng)物-AAV處理的小鼠的LPLS447X活性接近(未給出)。實(shí)施例3:具有經(jīng)修飾的Rep78起始密碼子的rAAV構(gòu)建體在昆蟲細(xì)胞中的穩(wěn)、定性3.1各種rAAV構(gòu)建體在昆蟲細(xì)胞中的穩(wěn)定性的比較如上面實(shí)施例l所述，在SF+細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV。對(duì)于所有生產(chǎn)而言，含有ITR的桿狀病毒和含有衣殼基因的桿狀病毒是相同的，代數(shù)與含有R印基因的桿狀病毒的相同。使用了4種不同的含有R印基因的桿狀病毒:1)REP-ACG/PSC;2)SLR:Urabeetal.(2002，見(jiàn)上文)的原始構(gòu)建體;3)Rep52+R印78(B2B):兩種獨(dú)立的Bac-to-Bac桿狀病毒，一種含有R印78基因，另一種4、有Rep52基因；4)Rep52+Rep78(PSC):兩種獨(dú)立的ProteinSciences桿狀病毒，一種^^有Rep78基因，另一種含有Rep52基因。結(jié)果如圖4所示。在桿狀病毒的第5代，使用本發(fā)明的REP-ACG/PSC生產(chǎn)的rAAV已經(jīng)相對(duì)原始Rep構(gòu)建體和分用的Rep構(gòu)建體提高了10倍以上。3.2最高至第8代桿狀病毒構(gòu)建體的穩(wěn)定性如上面實(shí)施例1所述，在SF+細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV。對(duì)于所有生產(chǎn)而言，含有ITR的桿狀病毒和含有衣殼基因的桿狀病毒是相同的，代數(shù)與REP-ACG/PSC桿狀病毒的相同。結(jié)果如圖5所示。REP-ACG/PSC桿狀病毒可保持穩(wěn)定到至少第8代。REP-ACG/PSC的rAAV生產(chǎn)滴度可保持穩(wěn)定最高到至少第8代桿狀病毒。3.3傳代對(duì)Rep蛋白表達(dá)的影響對(duì)Urabeetal.(2002，見(jiàn)上文)的原始構(gòu)建體與本發(fā)明的REP-ACG/PSC構(gòu)建體的傳代數(shù)對(duì)R印蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行了比較。桿狀病毒傳代和蛋白印跡的進(jìn)行如實(shí)施例1所述。在rep桿狀病毒正常傳代的過(guò)程中，向SF細(xì)胞加入桿狀病毒后40小時(shí)取樣并進(jìn)行蛋白印跡。圖6清楚地表明，對(duì)于原始Urabe構(gòu)建體(SLR)而言，較高的世代中的Rep表達(dá)與較早的世代中的相比減弱，而對(duì)于REP-ACG/PSC構(gòu)建體而言，較高的世代中的Rep表達(dá)與較低的世代中的Rep表達(dá)保持一致。3權(quán)利要求1.一個(gè)含有開放閱讀框的核苷酸序列，所述開放閱讀框含有編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的核苷酸序列，其中細(xì)小病毒Rep78蛋白的翻譯起始密碼子是可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)時(shí)實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍的起始密碼子。2.根據(jù)權(quán)利要求l的核苷酸序列，其中所述起始密碼子選自ACG、TTG、CTG和GTG。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核苷酸序列，其中所述核苦酸序列含有表達(dá)控制序列，所^達(dá)控制序列含有SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列或與SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列，位于編碼AAVR印78蛋白的核苷酸序列的起始密碼子的上游。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的核苷酸序列，其中所述細(xì)小病毒R印蛋白是腺伴隨病毒(AAV)R印蛋白。5.—種含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接。6.根據(jù)權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列與多角體啟動(dòng)子可操作地連接。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是昆蟲細(xì)胞相容的載體，優(yōu)選為桿狀病毒載體。8.—種含有不超過(guò)一種類型核苷酸序列的昆蟲細(xì)胞，所述核苷酸序列含有編碼一種或多種細(xì)小病毒Rep蛋白的單個(gè)開放閱讀框。9.根據(jù)權(quán)利要求8的昆蟲細(xì)胞，其中所述單個(gè)開放閱讀框編碼全長(zhǎng)Rep78蛋白。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的昆蟲細(xì)胞，其中所述含有編碼一種或多種細(xì)小病毒R印蛋白的單個(gè)開放閱讀框的核苷酸序列是一個(gè)核酸構(gòu)建體的一部分，所述核酸構(gòu)建體中所述核苷酸序列與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接。11.根據(jù)權(quán)利要求8-IO任一項(xiàng)的昆蟲細(xì)胞，其中所迷昆蟲細(xì)胞含有如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所定義的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列含有編碼一種或多種細(xì)小病毒Rep蛋白的單個(gè)開放閱讀框；或含有如權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所定義的第一核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接。12.根據(jù)權(quán)利要求11的昆蟲細(xì)胞，其中所述昆蟲細(xì)胞還含有a)含有至少一個(gè)細(xì)小病毒末端反向重復(fù)(ITR)核苷酸序列的第二核苷酸序列；和b)含有細(xì)小病毒衣殼蛋白編碼序列的第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列與用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接。13.根據(jù)權(quán)利要求12的昆蟲細(xì)胞，其中所述昆蟲細(xì)胞含有a)根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的第一核酸構(gòu)建體，其中所述第一核酸構(gòu)建體還含有如權(quán)利要求9的(b)所定義的第三核苷酸序列；和b)含有如權(quán)利要求9的(a)所定義的笫二核苷酸序列的第二核酸構(gòu)建體。14.根據(jù)權(quán)利要求13的昆蟲細(xì)胞，其中所述第二核酸構(gòu)建體是昆蟲細(xì)胞相容的載體，優(yōu)選為桿狀病毒載體。15.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的昆蟲細(xì)胞，其中所述第二核苷*列還含有至少一種編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列，并且其中所述至少一種編碼目的基因產(chǎn)物的核普酸序列被整合到在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)小病毒載體的基因組中。16.根據(jù)權(quán)利要求15的昆蟲細(xì)胞，其中所述第二核苷酸序列含有兩個(gè)細(xì)小病毒ITR核苷酸序列，且其中所述至少一個(gè)編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列位于兩個(gè)細(xì)小病毒ITR核苷酸序列之間。17.根據(jù)權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的昆蟲細(xì)胞，其中所述第三核苷^f列含有開放閱讀框，所述開放閱讀框含有編碼細(xì)小病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的核苷酸序列，其中所述細(xì)小病毒衣殼蛋白VP1的翻譯起始密碼子選自ACG、TTG、CTG和GTG。18.根據(jù)權(quán)利要求17的昆蟲細(xì)胞，其中所述第三核苷酸序列含有表達(dá)控制序列，所#達(dá)控制序列含有SEQ.IDNO:7的9核苷*列或與SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列，位于編碼細(xì)小病毒VP1衣殼蛋白的核苷酸序列的起始密碼子的上游。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的昆蟲細(xì)胞，其中所述笫三核苷酸序列還包含對(duì)編碼細(xì)小病毒衣殼蛋白VP1的核普酸序列的選自12位核苷酸的C、21位核苷酸的A和24位核苷酸的C的至少一個(gè)《務(wù)飾。20.根據(jù)權(quán)利要求12-19任一項(xiàng)的昆蟲細(xì)胞，其中所述第一核苷#列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的至少一個(gè)被穩(wěn)定地整合到所述昆蟲細(xì)胞的基因組中。21.根據(jù)權(quán)利要求8-20任一項(xiàng)的昆蟲細(xì)胞，其中所述細(xì)小病毒為AAV。22.—種在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組細(xì)小病毒粒子的方法，所述病毒粒子含有如權(quán)利要求12、15和16任一項(xiàng)所定義的第二核苷酸序列，所述方法包括如下步驟a)在產(chǎn)生重組細(xì)小病毒粒子的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求12-21任一項(xiàng)定義的昆蟲細(xì)胞；并b)回收所述重組細(xì)小病毒粒子。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，還包括使用抗細(xì)小病毒抗體，優(yōu)選使用固定化抗體，對(duì)所述病毒粒子進(jìn)行親和純化的步驟。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述抗細(xì)小病毒抗體為單鏈駝科動(dòng)物抗體或其片段。25.根據(jù)權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的方法，其中所述重組細(xì)小病毒粒子是重組AAV病毒粒子。全文摘要本發(fā)明涉及用于在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組細(xì)小病毒(如腺伴隨病毒)載體的核酸構(gòu)建體，以及含有這種構(gòu)建體的昆蟲細(xì)胞，以及用所述細(xì)胞生產(chǎn)重組細(xì)小病毒粒子的方法。所述昆蟲細(xì)胞優(yōu)選地含有編碼細(xì)小病毒Rep蛋白的第一核苷酸序列，其中細(xì)小病毒Rep78蛋白的翻譯起始密碼子是可在昆蟲細(xì)胞表達(dá)時(shí)實(shí)現(xiàn)部分外顯子跳躍的次優(yōu)起始密碼子。所述昆蟲細(xì)胞還含有第二核苷酸序列，它含有至少一個(gè)細(xì)小病毒(AAV)末端反向重復(fù)(ITR)核苷酸序列；和第三核苷酸序列，它含有編碼細(xì)小病毒衣殼蛋白的序列。文檔編號(hào)C12N5/10GK101506369SQ200780030443公開日2009年8月12日申請(qǐng)日期2007年6月20日優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日發(fā)明者A·C·貝克,D·J·比斯曼斯,S·J·P·哈斯特,W·T·J·M·C·赫門斯申請(qǐng)人:阿姆斯特丹分子治療股份有限公司