專利名稱：一種在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是動植物體內(nèi)分泌的一類小分子活性多肽，一般由15-45個氨基酸組成， 在動植物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。目前，由于抗生素的濫用導致耐藥菌株不斷增多， 人們對抗菌肽的研究投入極大熱情。家蠶抗菌肽屬于Cecropin家族中的一個成員，為線性、d_螺旋肽，含有35個氨基酸；抗菌肽具兩親性N端具有親水性、C端具有疏水性，同時抗細菌、抗真菌及抗腫瘤作用， 且對正常真核細胞無明顯毒副作用?？咕腃M4是張雙全等從中國家蠶(Bombyx mori)(浙農(nóng)1號X蘇12號)中分離得到的。它是線性的、具有α螺旋兩親的陽離子肽，由35個氨基酸組成，分子量約為3. 8KD， 有很強的殺菌能力，對細菌，真菌等都有作用且不含甲硫氨酸。從蠶蛹中提取的執(zhí)菌肽CM4 具有較廣泛的抗菌和殺傷某些腫瘤細胞的能力，并且不破壞正常細胞。目前已有在大腸桿菌表達系統(tǒng)、畢赤酵母表達系統(tǒng)中表達抗菌肽CM4的報道，但至今尚未有在昆蟲細胞中表達抗菌肽CM4的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法，包括如下步驟1)將兩端分別包含BamHI和HindiII酶切位點的抗菌肽CM4基因克隆入 pFastBacHT B 載體的 BamHI/Hindlll 位點間得到重組質(zhì)粒 pFastBac HTB-ABP ；幻將重組質(zhì)粒pFastBac HTB-ABP轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞，與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組，獲得插入ABP基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP ；3)脂質(zhì)體介導重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，獲表達抗菌肽的重組病毒；4)培養(yǎng)所述的重組病毒，表達抗菌肽CM4。其中，步驟1)所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的抗菌肽CM4基因通過如下方法獲得以中國家蠶(Bombyx mori)(浙農(nóng)1號X蘇12號)的總RNA為模板，利用上游引物sABP-F =SEQ ID NO. 1，下游引物sABP-R =SEQ ID NO. 2通過rPCR擴增得到所述的抗菌肽CM4基因；然后以所述的抗菌肽CM4基因為模板，利用上游引物pFastBacHTB-F SEQID N0. 3，下游引物pFastBacHTB-R :SEQ ID NO. 4通過PCR擴增得到兩端分別包含BamHI 和HindIII酶切位點的抗菌肽CM4基因。本方法還包含所述的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP的鑒定。
所述的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP的鑒定方法優(yōu)選PCR鑒定分別以 M13-F=SEQ ID NO. 5、M13_R :SEQ ID NO.6 和 M13-F :SEQ ID NO. 5、pFastBacHTB-R :SEQ ID NO. 4 以及 pFastBacHTB-F =SEQ ID NO. 3、M13-R =SEQ ID NO. 6 為引物對重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP進行PCR擴增，能夠擴增出對應(yīng)的M7 Ibp、1876bp、740bp目標片段的即為真正含有整合了目的基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP。所述的重組病毒培養(yǎng)基為無血清無抗生素的Sf-900II SFM。有益效果發(fā)明人參照CM4序列合成了昆蟲細胞偏愛密碼子的引物，進而將CM4克隆入 PFastBacHTB載體，并進一步獲得含ABP基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP，通過脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，成功實現(xiàn)了抗菌肽CM4基因在昆蟲細胞中的表達，為抗菌肽 CM4的大量獲得提供一條新途徑，為進一步的抗菌機理的研究及新藥的開發(fā)打下工作基礎(chǔ)。本發(fā)明首次實現(xiàn)了在昆蟲細胞中表達抗菌肽CM4基因，與在畢赤酵母中表達CM4 比較的積極作用1.在昆蟲中表達家蠶抗菌肽CM4，由于與家蠶的種屬相近，有望得到后加工完整、 生物活性高的CM4 ；2.只要獲得高滴度的重組CM4的桿狀病毒，可直接感染昆蟲細胞，易于純化，易于大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白。


圖1、CM4基因PCR擴增產(chǎn)物；1 :CM4 gene(105bp)，M =Marker 2000。圖 2、BamHI/Hindlll 雙酶切鑒定重組表達載體 pFastBac HTB-ABP ；1 :pFastBac HTB-ABP BamHI/Hindlll 酶切產(chǎn)物，M :Marker 2000。圖3、I單酶切鑒定重組表達載體pFastBac HTB-ABP ；1 :pFastBac HTB ；2 :Sal I 單酶切 pFastBac HTB 產(chǎn)物；3 :Sal I 單酶切 pFastBac HTB-ABP 產(chǎn)物；M =Marker 2000。圖 4、PCR 鑒定 Bacmid-ABP ；1 以M13-F、M13-R為弓丨物擴增Bacmid，2 以M13-F、M13-R為弓丨物擴增 Bacmid-ABP, 3 以 M13-F、pFastBacHTB-R 為引物擴增 Bacmid，4 以 M13-F、pFastBacHTB-R 為引物擴增 Bacmid-ABP, 5 以 pFastBacHTB-F、M13-R 為引物擴增 Bacmid, 6 以 pFastBacHTB-F、M13-R 為弓丨物擴增 Bacmid-ABP, LaneM =Marker 2000。圖5、正常Sf9細胞。圖 6、Bacmid/ABP 轉(zhuǎn)染的 Sf9 細胞。圖7是.重組融合抗菌肽CM4的SDS-PAGE和^festern blotting分析；M泳道分子量標記；1泳道未感染的培養(yǎng)液；2泳道感染的細胞培養(yǎng)液；3泳道未感染的細胞裂解液；4泳道感染的細胞裂解液；5泳道融合抗菌肽的Western blotting 結(jié)果。
具體實施方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內(nèi)容相同。實施例IpFastBac HT B/ABP表達載體的構(gòu)建(1)獲得兩端分別包含BamH I和HindIII酶切位點的抗菌肽CM4基因sABP-F 5’ -CGTTGGAAGATCTTCAAGAAGATCGAGAAGGTGGGTCAGAACATCC GTGACGGTATC GT -3，(SEQ ID NO. 1)sABP-R 5’ -GATGGTAGCAGCCTGACCCACCACAGCCACAGCGGGACCAGCCTTC ACGATACCGTC AC -3，(SEQ ID NO. 2)斜黑體為互補部分。以中國家蠶(Bombyx mori)(浙農(nóng)1號X蘇12號)的總RNA為模板，利用上游引物sABP-F :SEQ ID NO. 1，下游引物sABP-R SEQ ID NO. 2通過rPCR擴增得到所述的抗菌肽 CM4基因(圖1)。以上一步擴增的的抗菌肽CM4基因為模板，利用上游引物pFastBacHTB-F =SEQ ID NO. 3，下游引物pFastBacHTB-R =SEQ ID NO. 4通過PCR擴增得到兩端分別包含BamHI和 HindIII酶切位點的抗菌肽CM4基因。PCR擴增(引入酶切位點和腸激酶切割位點)，引物設(shè)計如下pFastBacHTB-F 5 ‘ -ATCT GGATCC GACGACGACGACAAGCGTTGGAAGATCTTC-3 ‘(SEQ ID N0. 3) 個BamHI 腸激酶切割位點pFastBacHTB-R 5 ‘ -GCTCGA AAGCTT TCATTAGTTGATGGTAGCAGCCTG-3 ’(SEQ ID N0. 4)個HindIII(2)抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B載體利用BamHI和hindIII分別對步驟(1)擴增得到的兩端分別包含BamHI和HindIII 酶切位點的抗菌肽CM4基因和pFastBacHT B載體(金思瑞生物科技有限公司)進行雙酶切，獲得抗菌肽CM4基因目的片段和pFastBacHT B載體線性片段，連接兩片段，得到連接產(chǎn)物。(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒鑒定將甘油凍存保存的DH5 α (北京百億新創(chuàng)科技有限公司)接種劃平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜；挑取單克隆至裝有:3ml LB的試管中，37°C 220rpm振搖12h ；吸取Iml菌液至1. 5ml 離心管中，4°C 12000g離心;3min，棄上清；用400 μ 1 0. lmol/1預冷的CaCl2重懸菌體沉淀， 12000g離心3min，棄上清；用200 μ 1 0. lmol/1預冷的CaCl2再次重懸菌體沉淀，置冰上過夜；將連接液20 μ 1全部加入200 μ 1感受態(tài)細菌中，置冰上Ih ；42°C熱休克90sec，迅速置冰中5min ；加入800 μ 1 37°C預熱的LB培養(yǎng)液；37°C，220rpm振搖lh，離心后全部涂布于含 100 μ g/mlAmp的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種含100 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)基37°C過夜振蕩培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進行BamHI/Hindlll雙酶切鑒定和Ml I單酶切鑒定，結(jié)果見圖2和圖3。酶切驗證正確的質(zhì)粒命名為重組表達載體pFastBac HTB-ABP0實施例2重組桿狀病毒的獲得將pFastBac HTB-ABP轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞(金思瑞生物科技有限公司，其中含有一個桿狀病毒穿梭載體簡稱Bacmid，還有一個輔助質(zhì)粒)，以獲得插入ABP 基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP。(1)重組pFastBac HT B-ABP轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)大腸桿菌DHlOBac (轉(zhuǎn)座)1)取5 μ 1重組表達載體pFastBacHT B-ABP加入IOOul感受態(tài)大腸桿菌DHlOBac 中，輕輕混勻，將離心管放入冰水浴30min。再置于42°C熱休克45s，然后迅速移至冰水中放置 2min ；2)在該管中加入滅菌的LB液體培養(yǎng)基900ul，37°C搖床220r/min振蕩培養(yǎng)4h，使之發(fā)生轉(zhuǎn)座；3)用LB培養(yǎng)液制備10倍系列的細胞稀釋液，以KT1UO-2,和10_3，不同的稀釋度稀釋，各取100 μ 1分別涂布于含50 μ g/ml卡那霉素、7 μ g/ml慶大霉素、10 μ g/ml四環(huán)霉素、100 μ g/ml x-gal，and 40 μ g/ml IPTG 的 LB 平板；4)將平皿于37°C倒置培養(yǎng)48h，觀察藍白斑的生長情況。發(fā)生轉(zhuǎn)座后的DHlOBac 細菌因其LacZ基因被插入失活，而使含有重組Bacmid的大腸桿菌菌落成為白色。(2)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP的提取陽性表形的確定1)用10 μ 1的槍頭輕輕挑取10個分隔較大的白色菌落，劃線于同樣含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)霉素、X-gal、IPTG的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜；2)如果所得菌落仍然均為白斑，說明所挑菌落均為真正含有整合了目的基因的陽性克隆Bac-ABP ；3)從再劃線平板上挑取陽性白色單克隆進含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)霉素的液體培養(yǎng)液中，37°C搖床225rpm振蕩培養(yǎng)Mh。重組桿狀病毒的提取1)將此培養(yǎng)液分裝至1. 5ml的Eppendorf管中，14000g離心Imin沉淀菌體；2)棄凈上清，加入 300 μ 1 溶液 I (15mM Tris-HCl, pH 8. 0，IOmM EDTA, 100 μ g/ml RNaseA,過濾除菌)，重懸沉淀；3)加入300 μ 1溶液11(0. 2Ν NaOH, 1% SDS，過濾除菌)，溫和顛倒混勻，室溫放置 5min，使細菌裂解；4)緩慢逐滴加入300 μ 1 3Μ(ρΗ5. 5)的乙酸鉀溶液，加入過程中輕微搖動，一層厚厚的白色菌體蛋白和基因組DNA慢慢出現(xiàn)，將樣品置于冰上5-lOmin，14000g離心IOmin ；5)同時標好另一干凈的Eppendorf管，加入800 μ 1異丙醇，輕輕將4)中所得上清轉(zhuǎn)移至已加好異丙醇的新管中，注意不要混有任何白色沉淀，將離心管顛倒數(shù)次混勻，置于冰上5-10min, 14000g離心15min,棄上清；6)分別用75%和100%的乙醇各洗滌一次，14000g離心5min ；
7)棄上清，室溫風干(在細胞室內(nèi)無菌條件下)5-10min，得表達抗菌肽的重組桿狀穿梭載體病毒fecmid-ABP ；8)溶于 40μ 1 IXTE 緩沖液(IOmmol Tris-HCI, lmmol EDTA, ρΗ8· 0)，4°C保存。(3)重組桿狀穿梭載體病毒Bacmid-ABP的PCR鑒定Bacmid中的M13引物配對位點位于mini_attTn7兩側(cè)，以M13上游引物和M13下游引物擴增重組桿狀穿梭載體病毒Bacmid-ABP，以野生的桿狀病毒(金思瑞生物科技有限公司)為對照。M13-F 5' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3‘ (SEQ ID NO. 5)；M13-R 5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3‘ (SEQ ID NO. 6)； pFastBacHTB-F 5 ‘ -ATCT GGATCC GACGACGACGACAAGCGTTGGAAGATCTTC-3，；(SEQ ID NO. 3)。pFastBacHTB-R 5 ‘ -GCTCGAAAGCTTTCATTAGTTGATGGTAGCAGCCTG-3‘ (SEQ IDN0. 4)。分別以M13-F、M13-R 和 M13-F、pFastBacHTB-R 以及 pFastBacHTB-F、M13-R 為引物，對重組桿狀穿梭載體病毒Bacmid-ABP進行PCR鑒定，結(jié)果見圖4。由圖4可見對于重組桿狀穿梭載體病毒Bacmid-ABP，以M13-F、M13-R為引物，可擴增出2471bp的條帶，以 M13-F、pFastBacHTB-R 為引物，可擴增出 1876bp 的條帶，以 pFastBacHTB_F、M13-R 為引物， 可擴增出740bp的條帶。實施例3重組桿狀穿梭載體病毒Bacmid-ABP轉(zhuǎn)染Sf9細胞(1)轉(zhuǎn)染Sf9單層細胞在35mm的六孔板中每孔以2ml的無血清無抗生素的Sf-900 II SFM培養(yǎng)液接種9X IO5個Sf9細胞(南京金思瑞生物科技有限公司)，培養(yǎng)過夜，待細胞密度長至 60% -70%時進行轉(zhuǎn)染。在無菌的Eppendorf管中配制以下溶液，A 液5 μ 1 重組 Bacmid-ABP 加 100 μ 1 無血清無抗生素的 Sf-900 II SFM ；B液6 μ 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin加100 μ 1無血清無抗生素的Sf-900 II SFM ；然后將A液和B液輕輕混合均勻，室溫放置15-45min。同時去除六孔板中每個孔中的培養(yǎng)液，以無血清無抗生素的Sf-900II SFM洗滌一遍，棄凈培養(yǎng)液。在上述混合液中補加 800μ 1無血清無抗生素的Sf-900II SFM，至總體積約1ml，再吸入每個孔中，置于27°C孵育證。證后去除DNA混合液，每孔加入anl Sf-900II SFM,在27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 之后觀察細胞病變狀況，細胞病變前后對比見圖5和圖6。(2)重組桿狀病毒的獲得與擴大待被轉(zhuǎn)染的細胞出現(xiàn)明顯病變狀況后，在每個孔中收集含有重組桿狀病毒顆粒的培養(yǎng)上清液，500g離心5min去除細胞和大碎片，將上清分成小份避光4°C保存，此為Pl代病毒，可用于再次感染Sf9單層細胞以獲。為獲高滴度病毒，可用以下公式計算獲某一特定MOI時所需接種的Pl代病毒P(k) = I-P(O)MOI = -InP (0)
權(quán)利要求
1.在昆蟲細胞Sf9中表達抗菌肽的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的抗菌肽CM4基因克隆入PFastBacHTB 載體的BamHI/Hindlll位點間得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-ABP ；(2)將重組質(zhì)粒pFastBacHTB-ABP轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞，與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組，獲得插入ABP基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP ；(3)脂質(zhì)體介導重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，獲表達抗菌肽的重組病毒；(4)培養(yǎng)所述的重組病毒，表達抗菌肽CM4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法，其特征在于步驟1) 所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的抗菌肽CM4基因通過如下方法獲得以中國家蠶浙農(nóng)1號X蘇12號的總RNA為模板，利用上游引物sABP-F =SEQ ID NO. 1，下游引物sABP-R =SEQ ID NO. 2通過rPCR擴增得到所述的抗菌肽CM4基因；然后以所述的抗菌肽CM4基因為模板，利用上游引物pFastBacHTB-F =SEQ ID NO. 3，下游引物pFastBacHTB-R SEQ ID NO. 4通過PCR擴增得到兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點的抗菌肽CM4基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法，其特征在于本方法還包含所述的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP的鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法，其特征在于所述的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP的鑒定方法為PCR鑒定分別以Ml3_F SEQ ID NO. 5、M13-R :SEQ ID NO. 6 和 M13—F :SEQ ID NO. 5、pFastBacHTB-R :SEQ ID NO. 4 以及pFastBacHTB-F :SEQ ID NO. 3、M13-R :SEQ ID NO. 6為引物對重組桿狀病毒穿梭載體 Bacmid-ABP進行PCR擴增，能夠擴增出對應(yīng)的M71bp、1876bp、740bp目標片段的即為真正含有整合了目的基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法，其特征在于所述的重組病毒培養(yǎng)基為無血清無抗生素的Sf-900 II SFM。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，公開了一種在昆蟲細胞sf9中表達抗菌肽的方法。本發(fā)明方法包括如下步驟(1)將抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B載體得到重組質(zhì)粒pFastBacHTB-ABP；(2)將重組質(zhì)粒pFastBac HTB-ABP轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-ABP；(3)Bacmid-ABP轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，獲表達抗菌肽的重組病毒。經(jīng)Western blotting檢測，結(jié)果表明目的基因在昆蟲細胞中獲得融合表達。本實驗建立的昆蟲/桿狀病毒表達系統(tǒng)為抗菌肽的大量獲得提供一條新途徑，為進一步的抗菌機理的研究及新藥的開發(fā)打下工作基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/12GK102191251SQ201110073088
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者康春濤, 張雙全 申請人:鹽城星海飼料有限公司