專利名稱：一種大鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)定簡便的大鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞在醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域得到極為廣泛的應(yīng)用，長期以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對肝細(xì)胞分離 方法、培養(yǎng)條件進(jìn)行了大量的研究，但要獲得高活率、功能好的肝細(xì)胞，至今仍較困難。早 期主要用非酶法分離肝細(xì)胞，包括機(jī)械法(如勻漿法)及螯合法。但機(jī)械法對肝細(xì)胞損傷大， 細(xì)胞活率低；螯合法是用可結(jié)合Ca2+、 Mg^的螯合劑(如枸櫞酸鹽或EDTA)分離肝細(xì)胞，但 螯合劑單獨(dú)使用效果不好，常需與酶法結(jié)合使用。后期逐漸改為酶消化法分離肝細(xì)胞，包括 膠原酶消化法、胰蛋白酶消化法等?，F(xiàn)在廣泛使用的是兩步原位灌流法，這是目前國際上流 行的肝細(xì)胞分離方法。先從門靜脈用無鈣、含氧前期緩沖液，沖出血細(xì)胞和鈣離子，再換含 蛋白水解酶的溶液至組織軟化。此法分離獲得的肝細(xì)胞幾乎為純的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，不僅數(shù)量多， 活性高，而且保留了肝細(xì)胞的各種功能。但該方法使用的膠原酶及灌流裝置的價(jià)格昂貴，操 作環(huán)節(jié)多，技術(shù)要求高，所需時(shí)間長，易污染，限制了該方法在一般實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的再于針對現(xiàn)有肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的不足，提供一種能夠快速有效分離高 細(xì)胞活力的肝細(xì)胞，并提供合適的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所說的大鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其步驟是
(1) 大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，并給予肝素鈉抗凝，用連接于輸液器的留置針做門靜脈插 管；
(2) 用D-Hank' s液開放灌流后，用含0.18%胰酶的D-Hank' s液繼續(xù)灌流；待停止灌流 后取出肝臟，用含雙抗的PBS清洗肝臟；
(3) 用含雙抗、lXBSA的Hank's液終止消化反應(yīng)，收集肝細(xì)胞懸液并用篩網(wǎng)過濾，離 心，棄上清，在沉淀中再加入r^BSA的Hank's液重懸，離心，棄上清；
(4)收集沉淀于Leibovitz，s-15 (L-15)完全培養(yǎng)基中，調(diào)整肝細(xì)胞密度為3 6X 105個(gè) /ml接種于鋪鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，于37t:、 5%<:02環(huán)境中培養(yǎng)；4h細(xì)胞貼壁后換用L-15 完全培養(yǎng)基去除死亡及未貼壁細(xì)胞，再培養(yǎng)20h后細(xì)胞貼壁后變平變薄，雙核細(xì)胞呈島狀連 接，形態(tài)良好。
上述方法中所說的Leibovitz's-15完全培養(yǎng)基，是在L-15培養(yǎng)基中加入青霉素100kU/L、鏈霉素100mg/L、胎牛血清10%、胰島素0.8pM、地塞米松0.5pM配成的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 基的pH為7.6。
相對于現(xiàn)有技術(shù)來說，本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法中，使用輸液器、動靜脈留置針替代經(jīng)典 的肝細(xì)胞原代分離培養(yǎng)中使用的灌流裝置；選用胰酶代替膠原酶進(jìn)行灌注；用含1XBSA的 Hank' s液終止胰酶消化反應(yīng)(而不應(yīng)是含血清的終止液)；選用Leibovitz's-15 (L-15)培養(yǎng) 基，在L"15培養(yǎng)基中加入青霉素U00kU/L)、鏈霉素(100mg/L)、胎牛血清(10%)、胰島 素(0.8pM)、地塞米松(0.5pM)配成完全培養(yǎng)基方法；使用經(jīng)過尾膠原處理過的培養(yǎng)板接 種肝細(xì)胞，細(xì)胞貼壁效果更好。因此本發(fā)明建立的大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)櫝型簡便易行、價(jià)格 低廉，且分離的肝細(xì)胞數(shù)量多，純度高，接種后2 4h內(nèi)即可呈單層緊密排列貼壁生長，并 在一定的體外培養(yǎng)條件下仍保留許多體內(nèi)的細(xì)胞功能和活性，可用于藥理及毒理試驗(yàn)并可在 一般實(shí)驗(yàn)室推廣。


圖l剛分離的大鼠肝細(xì)胞，ioox 圖2培養(yǎng)24h的大鼠肝細(xì)胞，100X 圖3臺盼蘭染色的肝細(xì)胞，100X 圖4PAS染色的肝細(xì)胞，100 X
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的 含義。
下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理
解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
本發(fā)明中所使用的百分濃度，除特別說明外，均指質(zhì)量百分濃度。 實(shí)施例
取禁食24h的SD大鼠以2X戊巴比妥鈉(40mg/kg.b.w)腹腔注射麻醉，腹腔注射肝素 鈉抗凝，固定于固定板上，腹部皮膚消毒，打開腹腔，分離并結(jié)扎門靜脈和下腔靜脈的遠(yuǎn)心 端及上腔靜脈，用連接于輸液器的留置針從門靜脈插管，剪開下腔靜脈近心端，結(jié)扎上腔靜 脈，用37'C D-Hank's液以流速為25ml/min開放灌流約10min，待肝臟變?yōu)橥咙S色后，改用 37'C、含0.18%胰酶的D-Hank' s液以流速為25ml/min繼續(xù)灌流10min (灌流過程中保持灌 流液的溫度為37'C)。停止灌流取出肝臟，用含雙抗(青霉素100kU/L、鏈霉素100mg/L)的 PBS清洗3次，含雙抗、1 %BSA的Hank's液終止消化反應(yīng)，去除肝包膜及血管等纖維結(jié)締
4組織，收集肝細(xì)胞懸液，100目、200目的篩網(wǎng)過濾肝細(xì)胞懸液，700r/min離心5min，去除 上清液，在沉淀中加入BSA液重懸，500r/min離心5min，去上清，沉淀中加入L-15完全培 養(yǎng)基，500r/min離心5min。用L-15完全培養(yǎng)基調(diào)整肝細(xì)胞懸液的密度為3 6Xl()S個(gè)/ml， 接種于預(yù)先鋪有尾膠原的培養(yǎng)板，37°C、 5%(^02條件下培養(yǎng)。4h細(xì)胞貼壁后換液，去除死亡 及未貼壁細(xì)胞，再培養(yǎng)20h后細(xì)胞變平變薄，雙核細(xì)胞呈島狀連接，形態(tài)良好，可用于實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞分離后用倒置顯微鏡對分離純化和接種的肝細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)量，并用 過碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)鑒定肝細(xì)胞。
結(jié)果細(xì)胞分離后置于倒置顯微鏡下觀察，低倍鏡下可見活細(xì)胞呈光亮圓形，飽滿，透光 度好，胞核清晰(圖l)。培養(yǎng)24h后可見細(xì)胞拉平變薄，體積增大，多呈雙核細(xì)胞，部分細(xì) 胞呈多邊形展開，有些細(xì)胞開始呈島狀連接(圖2)。平均每只大鼠肝獲得2X1()S個(gè)肝細(xì)胞。 用新分離的肝細(xì)胞做臺盼蘭排斥試驗(yàn)，結(jié)果顯示細(xì)胞活率大于90% (圖3)， PAS染色后，高 倍鏡下觀察到新分離的肝細(xì)胞內(nèi)由于含有大量的糖原顆粒而被染成紅色(圖4)。
權(quán)利要求
1、一種大鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，其步驟是(1)大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，并給予肝素鈉抗凝，用連接于輸液器的留置針做門靜脈插管；(2)用D-Hank’s液開放灌流后，用含0.18％胰酶的D-Hank’s液繼續(xù)灌流；待停止灌流后取出肝臟，用含雙抗的PBS清洗肝臟；(3)用含雙抗、1％BSA的Hank’s液終止消化反應(yīng)，收集肝細(xì)胞懸液并用篩網(wǎng)過濾，離心，棄上清，在沉淀中再加入1％BSA的Hank’s液重懸，離心，棄上清；(4)收集沉淀于Leibovitz’s-15完全培養(yǎng)基中，調(diào)整肝細(xì)胞密度為3～6×105個(gè)/ml接種于鋪鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)；4h細(xì)胞貼壁后換用Leibovitz’s-15完全培養(yǎng)基去除死亡及未貼壁細(xì)胞，再培養(yǎng)20h后細(xì)胞貼壁后變平變薄，雙核細(xì)胞呈島狀連接，形態(tài)良好。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的大鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，其特征在于，其中所說的 Leibovitz's-15完全培養(yǎng)基，是在Leibovitz，s-15培養(yǎng)基中加入青霉素100kU/L、鏈霉素100mg/L、 胎牛血清10%、胰島素0.8pM、地塞米松0.5nM配成的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH為7.6。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法。大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，并給予肝素鈉抗凝，做門靜脈插管，兩步灌流法灌流，取下消化成熟肝臟，收集肝細(xì)胞于4℃含1％牛血清白蛋白(BSA)的Hanks液中，肝細(xì)胞懸液用篩網(wǎng)過濾，濾液離心、沉淀后，收集沉淀于Leibovitz’s-15(L-15)完全培養(yǎng)基中，調(diào)整肝細(xì)胞密度為3～6×10⁵個(gè)/ml接種于鋪鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)。接種后4h換液去除未貼壁及死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)20h后可用于試驗(yàn)。本方法簡便易行、價(jià)格低廉，穩(wěn)定、高效，獲得的肝細(xì)胞活力高，易貼壁，可用于藥理及毒理試驗(yàn)并在一般實(shí)驗(yàn)室推廣。
文檔編號C12N5/06GK101538552SQ20091003102
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者劉學(xué)忠, 劉宗平, 卞建春, 汪紀(jì)倉, 燕 袁, 裔傳卉 申請人:揚(yáng)州大學(xué)