專利名稱：人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝細(xì)胞體外培養(yǎng)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種穩(wěn)定簡便的人原代肝 細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞在醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域得到極為廣泛的應(yīng)用，長期以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對原代 肝細(xì)胞分離方法、培養(yǎng)條件進(jìn)行了大量的研究，但要獲得高活率、功能好的肝細(xì)胞，至今仍 較困難，尤其是人原代肝細(xì)胞。早期分離肝細(xì)胞的方法主要是非酶法分離肝細(xì)胞，包括機(jī)械 法(如勻漿法)及螯合法。但是機(jī)械法對肝細(xì)胞損傷大，分離下來的肝細(xì)胞活率低；螯合法 是用可結(jié)合Ca2+、Mg2+的螯合劑(如枸櫞酸鹽或EDTA)分離肝細(xì)胞，但螯合劑單獨(dú)使用效果 不好，常需與酶法結(jié)合使用。后期逐漸改為酶消化法分離肝細(xì)胞，包括膠原酶消化法、胰蛋 白酶消化法等?，F(xiàn)在廣泛使用的是兩步原位灌流法，這是目前國際上流行的肝細(xì)胞分離方 法。先從門靜脈用無鈣、含氧前期緩沖液，沖出血細(xì)胞和鈣離子，再換含蛋白水解酶的溶液 至組織軟化。此法分離獲得的肝細(xì)胞幾乎為純的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，不僅數(shù)量多，活性高，而且保 留了肝細(xì)胞的各種功能。但使用該方法不僅灌流裝置價(jià)格昂貴，操作環(huán)節(jié)多，技術(shù)要求高， 所需時(shí)間長，易污染，而且對于一般以手術(shù)切除而獲得的人肝組織并不適用，所以限制該方 法在一般實(shí)驗(yàn)室以及人原代肝細(xì)胞在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述缺陷，提供了一種簡便有效的分離培養(yǎng)人肝 細(xì)胞的方法，特別是針對以手術(shù)切除獲得的人肝組織來進(jìn)行的人原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟用D-Hank’ s液清洗肝組織表面血塊，并將結(jié)締組織剪除；用針頭注射器多點(diǎn)穿刺灌注預(yù)溫38°C的前灌流液，使肝組織塊由暗紅色變?yōu)榛野?色且流出的前灌流液變清亮，最好用5ml針頭注射器，灌注時(shí)壓力、流速要恒定，不能有氣 泡；繼以預(yù)溫的II型膠原酶溶液針頭多點(diǎn)穿刺灌注，直至組織塊變疏松、失去彈性， 表面呈龜背狀裂隙，II型膠原酶溶液可循環(huán)使用，為保持膠原酶溶液溫度，可將標(biāo)本至于熱 水袋上操作；剪開組織塊，鈍性分離肝組織，并去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，然后繼續(xù)在II 型膠原酶溶液中37°C震蕩消化；將消化物吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，在冰浴條件下，過濾，收集過濾后的肝細(xì)胞懸液，移至 離心管中，低速離心；第一次低速離心所得底層沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，吹打，室溫靜置后加入DMEM混 勻清洗、低速離心，再加入DMEM混勻、低速離心重復(fù)2-4次，最后一次低速離心所得沉淀加入Williams’ Medium E完全培養(yǎng)基懸?。徽{(diào)整肝細(xì)胞密度為1乂105/!111，接種于鋪有鼠原膠原的培養(yǎng)瓶中，于0)2培養(yǎng)箱中 37°C恒溫培養(yǎng)，貼壁后，換液除去死亡及未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)選地，前灌流液為去離子水配制的溶液，該溶液中包含的成分及濃度為=NaCl 8. 000g/L, KCl 0. 400g/L, NaHCO3 0. 350g/L, HEPES 2. 380g/L, NaH2P042H20 0. 078g/L, Na2HPO412H20 0. 151g/L, EDTA 0. 190g/L, Glucose 0.900g/L。優(yōu)選地，II型膠原酶溶液為去離子水配制的溶液，該溶液中包含的成分及濃度為 NaCl 3.945g/L, KCl 0. 500g/L, CaCl22H20 0. 700g/L, HEPES 24. OOg/L, collagenase Type II 500mg/Lo優(yōu)選地，所述Williams’ Medium E完全培養(yǎng)基為Williams’ Medium E中加入青霉 素100KU/L，鏈霉素100mg/L，Hyclone胎牛血清10%配置而成，培養(yǎng)基PH值為7. 2。優(yōu)選地，上述步驟中的過濾為先用150目濾網(wǎng)過濾，收集過濾后的肝細(xì)胞懸液，再 用200目濾網(wǎng)過濾。上述步驟中的低速離心為10g，3-5分鐘。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法中，僅用一個(gè)注射器就替代了經(jīng)典的肝 細(xì)胞原代分離培養(yǎng)中使用的灌流裝置，運(yùn)用多點(diǎn)穿刺灌注的方法克服了手術(shù)標(biāo)本無法體外 灌流的缺點(diǎn)，同時(shí)大大的節(jié)約了膠原酶以及灌注液的使用，節(jié)約了成本。因此，本發(fā)明建立 的人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)模型簡便易行，成本低。


圖1為本發(fā)明剛分離的人原代肝細(xì)胞(臺盼藍(lán)拒染200 X)的顯微觀察圖；圖2為本發(fā)明分離后培養(yǎng)2小時(shí)的人原代肝細(xì)胞貼壁生長情況100X顯微觀察 圖；圖3為本發(fā)明分離后培養(yǎng)M小時(shí)PAS染色鑒定人原代肝細(xì)胞100X顯微觀察圖；圖4為本發(fā)明分離后培養(yǎng)M小時(shí)白蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定人原代肝細(xì)胞 200 X顯微觀察圖；圖5為本發(fā)明分離后培養(yǎng)48小時(shí)人原代肝細(xì)胞吖啶橙/碘化丙啶染色200X顯 微觀察圖。
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明。實(shí)施例一針對以手術(shù)切除獲得的人肝組織來進(jìn)行的人原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方 法具體步驟為1.經(jīng)知情同意，取肝切除手術(shù)病人切除的正常肝組織(大小約為3cmX 2cmX lcm, 約8克)，將其迅速投入裝有肝組織保存液DMEM(高糖)+1 %雙抗(青、鏈霉素，即青霉素 的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為lOOug/ml)的無菌離心管中，放入冰盒(溫度 0 4°C )帶回實(shí)驗(yàn)室；2.將裝有肝組織塊的離心管取出，酒精布涂擦外表消毒后，放入超凈臺；無菌鑷 取出組織塊，放入培養(yǎng)皿中，用4°C的D-Hank’ s液清洗肝組織表面血塊，并用眼科剪將其余 結(jié)締組織剪除；
3.將裝有肝組織(約剩7克)的培養(yǎng)皿放于50°C熱水袋上，用5ml針頭注射器多 點(diǎn)穿刺灌注預(yù)熱的38°C前灌流液，使肝組織塊由暗紅色逐漸變?yōu)榛野咨伊鞒龅那肮嗔饕?變清亮，灌注時(shí)壓力、流速要恒定，不能有氣泡，此過程15分鐘；4.灌注完畢，將肝組織取出放入另一無菌的培養(yǎng)皿中，更換5ml針頭注射器，吸 取5ml 38°C預(yù)溫的II型膠原酶溶液多點(diǎn)穿刺灌注，直至組織塊變疏松、失去彈性，表面呈 龜背狀裂隙，II型膠原酶溶液可循環(huán)使用；同時(shí)，為保持膠原酶溶液的溫度，將培養(yǎng)皿置于 50°C熱水袋之上，此過程需15分鐘；5.灌注完畢，將肝組織(約6. 5克)取出，放入一 2ml廣口燒杯中，用無菌眼科剪 刀和眼科鑷鈍性分離肝組織，并去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，分離完畢，放入15ml離 心管中，用吸管吹打數(shù)次后，繼續(xù)在II型膠原酶溶液中37°C震蕩消化15分鐘；6.消化完畢，用粗口吸管將消化物吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，在冰浴條件下，先用150目不 銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集過濾后的肝細(xì)胞懸液，再用200目濾網(wǎng)過濾，將濾液移至離心管中；7.第一次離心50g，離心5分鐘，去上清，底層沉淀加入紅細(xì)胞裂解液吹打，室溫靜 置3分鐘后，加入適量DMEM液，吹打混勻；第二次離心10g，3分鐘，去上清，加入適量DMEM 液，吹打混勻；第三次離心10g，離心3分鐘，去上清，加入適量DMEM液，吹打混勻；第四次離 心10g，離心3分鐘，去上清，加含Williams'Medium E完全培養(yǎng)基5ml，吹散，取細(xì)胞懸液進(jìn) 行計(jì)數(shù)；8.調(diào)整懸浮在Williams，Medium E完全培養(yǎng)基中的肝細(xì)胞密度為lX105/ml，接 種于鋪有I型鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，于37°C，5% C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2小時(shí)貼壁后，換 液除去死亡及未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，并用過碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)和白蛋白(ALB)免疫細(xì) 胞化學(xué)等方法鑒定肝細(xì)胞。上述步驟前灌流液為去離子水配制的溶液，其配方為NaCl 8. 000g/L，KCl 0. 400g/L, NaHCO3 0. 350g/L, HEPES 2. 380g/L, NaH2P042H200. 078g/L, Na2HP0412H20 0. 151g/ L，EDTA 0. 190g/L, Glucose 0. 900g/L，本實(shí)施例以1000ml前灌流液的量配制。II型膠原酶溶液為去離子水配制的溶液，其配方為為NaCl 3. 945g/L，KCl 0. 500g/L, CaCl22H20 0. 700g/L, HEPES 24. OOg/L, colIagenaseType II 500mg/L，本實(shí)施例 以200ml量配制。Williams' Medium E 完全培養(yǎng)基為 Williams' Medium E 中加入青霉素 100KU/L, 鏈霉素100mg/L，Hyclone胎牛血清10%配置而成，培養(yǎng)基PH值為7. 2。Williams' Medium E來自美國品牌hvitrogen。DMEM來自美國品牌Gibco，為高糖型。紅細(xì)胞裂解液來自sigma公司，主要成分8. 3g/L氯化銨，Tris-HCL，PH 7. 5士0. 2，紅細(xì)胞裂解液是一種比較溫和去除紅細(xì)胞簡便易行的方法，它既不損傷有核細(xì) 胞又能充分的去除紅細(xì)胞，主要用于經(jīng)酶消化分散的組織細(xì)胞的分離純化，經(jīng)紅細(xì)胞裂解 液裂解得到的組織細(xì)胞中不含紅細(xì)胞，可進(jìn)一步用于原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合、流式細(xì)胞分析、 核酸與蛋白的分離和提取等。在此處應(yīng)用可以除去組織分離過程中混雜紅細(xì)胞的的影響， 出去雜質(zhì)細(xì)胞，起到純化肝細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)例一臺盼藍(lán)染色檢測剛分離的人原代肝細(xì)胞，臺盼藍(lán)主要用來鑒定原代培 養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞分離后的存活情況，用0. 4%臺盼藍(lán)直接染色，在顯微鏡下觀察即可，活細(xì)胞不被染色。先配制1. 4%臺盼藍(lán)母液，稱取4g臺盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml， 用濾紙過濾，4°C保存，使用時(shí)，用PBS稀釋至0.4% ；染色步驟為1、將上述步驟6中得到的剛分離的人原代肝細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，用DMEM高糖溶 液懸浮細(xì)胞，并作適當(dāng)稀釋(IO5細(xì)胞/ml)；2、染色用吸管吸取1滴細(xì)胞懸液滴在載玻片上，加1滴0. 4%臺盼藍(lán)溶液，混勻3 分鐘；3、觀察。置于倒置顯微鏡下觀察，胎盤藍(lán)拒染可見活細(xì)胞呈圓形，透亮，細(xì)胞膜完整，飽滿， 參見圖1。實(shí)驗(yàn)例二 臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活率計(jì)算，取一滴細(xì)胞懸液滴于載玻片上，臺盼藍(lán) 拒染，顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞活率=(活細(xì)胞數(shù)/200) X 100%，本實(shí)驗(yàn)中計(jì)數(shù) 結(jié)果為活細(xì)胞數(shù)為180個(gè)，即細(xì)胞活率為90%。實(shí)驗(yàn)例三細(xì)胞計(jì)數(shù)，第7步后細(xì)胞計(jì)數(shù)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，從5ml細(xì)胞懸液 中取一滴懸液，滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)板中4大格細(xì)胞數(shù)均數(shù) 為2，根據(jù)公式細(xì)胞濃度=(4大格細(xì)胞數(shù)總和/4) X 104，再乘以原液體積，即細(xì)胞濃度為 IX 105/ml，總數(shù)為 5 X IO5 個(gè)。實(shí)驗(yàn)例四過碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)染色鑒定原代肝細(xì)胞，利用強(qiáng)氧化劑使多糖產(chǎn) 生游離的醛基，醛基和SCHIFF試劑結(jié)合，形成紫紅色的化合物，多糖部位就會呈現(xiàn)紫紅色 陽性反應(yīng)，此染色法用于初步鑒定肝細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)例五白蛋白(ALB)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定肝細(xì)胞，利用抗原抗體反應(yīng)特 異性的鑒定肝細(xì)胞，由于ALB只在肝細(xì)胞中產(chǎn)生，ALB的抗原抗體反應(yīng)可以特異性的鑒定肝 細(xì)胞，染色步驟1.將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液倒去，PBS沖洗3次；2.加入95%的酒精固定細(xì)胞10分鐘；3.倒去酒精，用PBS沖洗3次；4.滴加適量10ug/mlALB —抗(R. D公司，鼠抗人)，4°C過夜；5. PBS 沖洗 3 次；6.滴加生物素化二抗工作液(二抗試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)， 室溫孵育15分鐘；7. PBS 沖洗 3 次；8.滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液(來源于二抗試劑盒)室溫孵育15分鐘， PBS沖洗3次；9.滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察，顯示棕紅色時(shí)及時(shí)用PBS洗去顯色劑，終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)例六吖啶橙/碘化丙啶染色，吖啶橙能透過細(xì)胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核 DNA中，使之發(fā)出明亮的綠光；碘化丙啶不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期和死亡的 細(xì)胞，碘化丙啶可以透過細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅；染色步驟將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液倒去， 加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘，避光條件下加入濃度為lOOug/ml的吖啶橙和碘化丙啶各70ul，避光37°C孵育15分鐘，熒光顯微鏡下觀察，此方法用于判斷細(xì)胞活力及死活。本發(fā)明分離培養(yǎng)的人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后，光鏡下觀察可見細(xì)胞鋪展，變大， 變薄，細(xì)胞核明顯參見圖2 ；培養(yǎng)M小時(shí)，光鏡下觀察可見細(xì)胞體積進(jìn)一步變大，形態(tài)變薄， PAS染色見糖原顆粒多且明顯，參加圖3，ALB免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定肝細(xì)胞呈現(xiàn)棕紅色，參 見圖4 ；培養(yǎng)48小時(shí)后，吖啶橙/碘化丙啶染色見細(xì)胞形態(tài)較前進(jìn)一步增大，細(xì)胞活力高 (綠色)，細(xì)胞呈多邊形生長，參見圖5 (紅色為死亡細(xì)胞，綠色為活細(xì)胞)。根據(jù)以上實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例，平均大小為3cmX 2cmX Icm的組織塊，除去電刀切割 引起的損傷，可獲得5X IO5個(gè)肝細(xì)胞，新分離的肝細(xì)胞臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞活率為 90%, PAS染色和ALB免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定為人肝細(xì)胞。本發(fā)明所分離的肝細(xì)胞純度高，活 性好，量多，接種2小時(shí)內(nèi)可呈單層緊密排列貼壁生長，并在一定的時(shí)間范圍內(nèi)保留許多肝 細(xì)胞的功能和活性，可用于藥理、毒性以及一些永生化細(xì)胞的建立，還可以在一般實(shí)驗(yàn)室推 以上所揭露的僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利 范圍，因此依本發(fā)明申請專利范圍所作的等同變化，仍屬本發(fā)明所涵蓋的范圍。
權(quán)利要求
1.一種人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟用D-Hank’ s液清洗肝組織表面血塊，并將結(jié)締組織剪除；用針頭注射器多點(diǎn)穿刺灌注預(yù)溫38°C的前灌流液，使肝組織塊由暗紅色變?yōu)榛野咨?流出的前灌流液變清亮；繼以預(yù)溫的II型膠原酶溶液針頭多點(diǎn)穿刺灌注并循環(huán)使用，直至組織塊變疏松、失去 彈性，表面呈龜背狀裂隙；剪開組織塊，鈍性分離肝組織，并去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，然后繼續(xù)在II型 膠原酶溶液中37°C震蕩消化；將消化物吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，在冰浴條件下，過濾，收集過濾后的肝細(xì)胞懸液，移至離心 管中，低速離心；第一次低速離心所得底層沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，吹打，室溫靜置后加入DMEM混勻 清洗、低速離心，再加入DMEM混勻、低速離心重復(fù)2-4次，最后一次低速離心所得沉淀加入 Williams' Medium E完全培養(yǎng)基懸浮；調(diào)整肝細(xì)胞密度為lX105/ml，接種于鋪有鼠原膠原的培養(yǎng)瓶中，于C02培養(yǎng)箱中37°C 恒溫培養(yǎng)，貼壁后，換液除去死亡及未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述前灌流液為去 離子水配制的溶液，該溶液中包含的成分及濃度為NaCl 8. 000g/L, KCl 0. 400g/L, NaHCO3 0. 350g/L, HEPES 2. 380g/L, NaH2P042H20 0. 078g/L, Na2HPO412H20 0. 151g/L, EDTA 0. 190g/ L, Glucose 0.900g/L。
3.如權(quán)利要求1所述的人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述II型膠原酶溶 液為去離子水配制的溶液，該溶液中包含的成分及濃度為NaCl 3. 945g/L, KCl 0. 500g/L， CaCl22H20 0. 700g/L, HEPES 24. OOg/L, collagenase Type II 500mg/L。
4.如權(quán)利要求1所述的人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述 Williams' Medium E完全培養(yǎng)基為Williams' Medium E中加入青霉素100KU/L,鏈霉素 100mg/L, Hyclone胎牛血清10%配置而成，培養(yǎng)基PH值為7. 2。
5.如權(quán)利要求1所述的人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟中的過濾 為先用150目濾網(wǎng)過濾，收集過濾后的肝細(xì)胞懸液，再用200目濾網(wǎng)過濾。
6.如權(quán)利要求1所述的人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟中的第一 次低速離心為50g，5分鐘；之后離心均為10g，3分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟用D-Hank’s液清洗肝組織表面血塊，并將結(jié)締組織剪除；用針頭注射器多點(diǎn)穿刺灌注預(yù)溫38℃的前灌流液，使肝組織塊由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅那肮嗔饕鹤兦辶?；繼以預(yù)溫的II型膠原酶溶液針頭多點(diǎn)穿刺灌注，直至組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀裂隙，II型膠原酶溶液可循環(huán)使用；剪開組織塊，鈍性分離肝組織，并去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，然后繼續(xù)在II型膠原酶溶液中37℃震蕩消化；將消化物吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，在冰浴條件下，過濾，收集過濾后的肝細(xì)胞懸液，移至離心管中，低速離心；第一次低速離心所得底層沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，吹打，室溫靜置后加入DMEM混勻清洗、低速離心，再加入DMEM混勻、低速離心重復(fù)2-4次，最后一次低速離心所得沉淀加入Williams’Medium E完全培養(yǎng)基懸浮；調(diào)整肝細(xì)胞密度為1×105/ml，接種于鋪有鼠原膠原的培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)，貼壁后，換液除去死亡及未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明建立的人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)模型簡便易行，成本低。
文檔編號C12N5/071GK102061284SQ20101020522
公開日2011年5月18日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者劉廣波, 張志 , 李治國, 杜江, 汪艷, 趙欣, 高毅 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院