專利名稱：在真核細胞中生產(chǎn)丁醇的制作方法
在真核細胞中生產(chǎn)丁醇
本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)丁醇的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞，以及通過使用所述經(jīng) 轉(zhuǎn)化的真核細胞生產(chǎn)丁醇的工藝。
近幾年中，丙酮/丁醇/乙醇(ABE)發(fā)酵工藝作為從生物質(zhì)生產(chǎn)商業(yè)化學 品(如丁醇和丙酮)的有希望的工藝而受到了可觀的關注。產(chǎn)溶劑的 (solventogenic) C/oWn'Aa將碳水化合物發(fā)酵為丙酮、丁醇和乙醇在數(shù)十年 間是公知的。C/o^7'A"通過將合適的碳源轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA來生產(chǎn)丁醇。 底物乙酰-CoA隨后進入產(chǎn)溶劑(solventogenesis)途徑，使用六個協(xié)同酶反 應來生產(chǎn)丁醇。所述反應和催化這些反應的酶列于下文
2乙酰-CoA ->乙酰乙酰-CoA + HSCoA (乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移
酶)
乙酰乙酰-CoA + NAD(P)H -> 3-羥基丁酰-CoA + NAD(P)+
(3-羥基-CoA脫氫酶) 3-羥基丁酰-CoA ->巴豆酰-CoA + H20 (3-羥基丁酰-CoA脫水酶) 巴豆酰-CoA + NAD(P)H -> 丁酰-CoA +NAD(P)+ (丁酰-CoA脫氫酶) 丁酰-CoA + NAD(P)H -> 丁醛+ CoA + NAD(P)+ (丁醛脫氫酶)
丁醛+ NAD(P)H -> 丁醇+ NAD(P)+ (丁醇脫氫酶)
丁醇的形成需要通過乙酰基轉(zhuǎn)移酶將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰-CoA。該反應后通過3-羥基丁酰-CoA脫氫酶將乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為3-羥 基丁酰-CoA，之后通過3-羥基丁酰-CoA脫水酶(也稱作巴豆酸酶)將3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為巴豆酰-CoA，以及通過丁酰-CoA脫氫酶將巴豆酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁酰-CoA，然后通過丁醛脫氫酶將丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁醛，最 后通過丁醇脫氫酶將丁醛轉(zhuǎn)化為丁醇(Jones, DT. , Woods, D. R., 1986, Microbiol. Rev., 50， 484-524)。
然而，丁醇的生產(chǎn)受制于差的工藝經(jīng)濟學，因為產(chǎn)生的丁醇對微生物細胞是有毒的，因此效價較低。許多研究已經(jīng)涉及提高C70^7V/^菌株對
丁醇的抗性，并因而取得了效價的提高。例如在US 6,960,465中顯示熱 休克蛋白在C7oWW^/m aceto^0^'cwm中的過表達導致與野生型菌株相比 提高的丁醇生產(chǎn)產(chǎn)率。
因為C/o^^fl對氧是敏感，所以C7^/n^fl-發(fā)酵必須在嚴格的厭氧條 件下進行，這使得難以大規(guī)模進行這類發(fā)酵。由于厭氧條件下的低ATP-增益，厭氧發(fā)酵通常導致低的生物質(zhì)濃度。另外，C/o^nVfez對噬菌體敏 感，導致發(fā)酵期間細菌細胞的裂解。因為C/o^n'J^發(fā)酵在中性pH下進 行，所以為防止發(fā)酵液被例如乳酸菌污染，無菌條件是必要的，這導致了 以工業(yè)規(guī)模發(fā)酵的高成本(Zverlov et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 71 , p. 587-597， 2006， Spivey, Process Biochemistry November 1978)。 在
C/0^7V/&中生產(chǎn)丁醇的另一缺點是還產(chǎn)生了不想要的副產(chǎn)物，如丙酮、乙 酸鹽和丁酸鹽，這降低了丁醇相對碳的產(chǎn)率。
WO2007/041269公開了經(jīng)至少一種DNA分子轉(zhuǎn)化的重組微生物，例 如酵母如SaccAaramjc" cwev&ae，所述DNA分子編碼催化如上文所述的 丁醇途徑的反應之一的多肽。然而，WO 2007/041269中公開的經(jīng)遺傳修飾 的^cc/wram;;c^菌株中產(chǎn)生的丁醇量僅為0.2至lj 1.7 mg/l之間，這比經(jīng)典 ABE發(fā)酵中生產(chǎn)的丁醇量低約10,000-100,000倍。
本發(fā)明的目的是提供下述備選的真核細胞，所述真核細胞能夠生產(chǎn)比 現(xiàn)有工藝水平中已知更高量的丁醇。
根據(jù)本發(fā)明，該目標通過經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞達成，所述細胞包含一條 或多條編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、3-羥基丁 酰-CoA脫水酶、丁酰-CoA脫氫酶、醇脫氫酶或乙醛脫氫酶和/或 NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在轉(zhuǎn)化 細胞后賦予細胞生產(chǎn)丁醇的能力。
本發(fā)明還涉及選自 J5/ erg/〃i 、 Pem,c/〃/wm、尸z'c/n.a、 f/t(yver函少ces、 7arra術.a、 Cawc/^/a、 //aw56聽/a、 //t/m/co/a、 7bnz/a5pora 、 ZWc/zosporow 、 ^Sre"awom，cas、 ZygoMccAarom^ycas^尸acA"o/ew禾口 Tawac/aEyma構成的組 的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞，其包含一條或多條編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、3-羥基丁酰-CoA脫水酶、丁酰-CoA脫氫酶、醇脫 氫酶或乙醛脫氫酶和/或NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列，其中 所述核苷酸序列在轉(zhuǎn)化細胞后賦予細胞生產(chǎn)丁醇的能力。
在本文中使用時，經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞被定義為用本文定義的一條或多 條核苷酸序列遺傳修飾的或轉(zhuǎn)化的真核細胞。未經(jīng)轉(zhuǎn)化或遺傳修飾的真核 細胞是不包含一條或多條下述核苷酸序列的細胞，所述核苷酸序列使得細 胞能夠生產(chǎn)丁醇。因此，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞是天然不生產(chǎn)丁醇的細胞。 在本文中使用時，丁醇是正丁醇或l-丁醇。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，醇脫氫酶或乙醛脫氫酶催化與丁醛脫氫酶相同的 反應。本發(fā)明中的醇脫氫酶或乙醛脫氫酶可也具有丁醇脫氫酶活性。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真核細胞表達了選自下組的一條或多條核苷酸
序列，該組由以下組成
a. 編碼乙酰-CoA乙酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選
自下組，該組由以下組成
i. 編碼乙酰-CoA乙酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，所述乙酰-CoA乙?；?轉(zhuǎn)移酶包含與SEQ ID NO:l的氨基酸序列至少具有20%,優(yōu)選地至少具有 25%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 與SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少具有15%，優(yōu)選地至少具有 20%、 25%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，
b. 編碼3-羥基丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 選自下組，該組由以下組成
i.編碼3-羥基丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，所述3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶包含與SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少具有25%，優(yōu)選地至少具有30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 與SEQ ID N0:4的核苷酸序列至少具有20%，優(yōu)選地至少具有 25%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，
c. 編碼3-羥基丁酰-CoA脫水酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 選自下組，該組由以下組成
i. 編碼3-羥基丁酰-CoA脫水酶的核苷酸序列，所述3-羥基丁酰-CoA 脫水酶包含與SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少具有30%，優(yōu)選地至少具有 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 與SEQ ID NO:6的核苷酸序列至少具有25%,優(yōu)選地至少具有 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，
d. 編碼丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自下 組，該組由以下組成
i. 編碼丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，所述丁酰-CoA脫氫酶包含與 SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少具有20%,優(yōu)選地至少具有25%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 與SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少具有15%，優(yōu)選地至少具有 20%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，
e. 編碼醇脫氫酶或乙醛脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選 自下組，該組由以下組成
i. 編碼醇脫氫酶或乙醛脫氫酶的核苷酸序列，所述醇脫氫酶或乙醛脫 氫酶包含分別與SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列至少具有 20%，優(yōu)選地至少具有30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨 基酸序列，
ii. 分別與SEQ ID NO:IO或SEQ ID NO: 12的核苷酸序列至少具有 15%，優(yōu)選地至少具有20%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性 的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，禾口
f. 編碼NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸 序列選自下組，該組由以下組成
i. 編碼NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列，所述NAD(P)H-依 賴性丁醇脫氫酶包含與SEQ ID NO: 13和/或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列 至少具有30%，優(yōu)選地至少具有40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨 基酸序列，
ii. 與SEQ ID NO:14禾口/或SEQ ID NO 16的核苷酸序列至少具有 25%,優(yōu)選地至少具有30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核 苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和iv.核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序
列不同。
序列同一性和相似性
序列同一性在本文中被定義為兩條或更多氨基酸(多肽或蛋白質(zhì))序 列或兩條或更多核酸(多核苷酸)序列之間的關系，其通過比較序列確 定。通常，序列同一性或相似性在被比較序列的整個長度上比較。在本領 域中，"同一性"還表示氨基酸或核酸序列之間的序列親緣關系程度，其 根據(jù)情況由這類序列字符串之間的匹配測定。"同一性"和"相似性"可 通過本領域技術人員己知的多種方法容易地計算。測定同一性的優(yōu)選的方 法被設計為在測試的序列之間給出最大的匹配。測定同一性和相似性的方 法被編纂在公眾可獲得的計算機程序中。測定兩條序列之間同一性和相似
性的優(yōu)選的計算機程序方法包括例如BestFit、 BLASTP、 BLASTN和 FASTA (Altschul, S.F.etal.,J.Mol.Biol. 215:403-410 (1990))，公眾可從 NCBI和其它來源獲得(BLAST Manual, Altschul, S.， et al.， NCBI NLM NIH Bethesda, MD 208940。使用BLASTP進行氨基酸序列比較的優(yōu)選的參數(shù)為 缺口開放IO.O，缺口延伸0.5， Blosum62矩陣。使用BLASTP進行核酸序 列比較的優(yōu)選的參數(shù)為缺口開放10.0，缺口延伸0.5， DNA完全矩陣 (DNA同一性矩陣)。
雜交核酸序列
編碼在本發(fā)明的細胞中表達的酶的核苷酸序列也可以通過它們分別與 SEQ ID NO. 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16的核苷酸序列在中度雜交條件 下，或優(yōu)選地在嚴格雜交條件下雜交的能力來定義。嚴格雜交條件在本文 中被定義為下述條件，所述條件允許至少約25個核苷酸，優(yōu)選地約50、 75或100個核苷酸，最優(yōu)選地約200或更多個核苷酸的核酸序列，在約65 t:的溫度下，在包含約1M鹽的溶液中，優(yōu)選地在6 x SSC中或具有相當 離子強度的任何其它溶液中雜交，并在包含約0.1 M或更少鹽的溶液中， 優(yōu)選地在0.2 x SSC中或具有相當離子強度的任何其它溶液中洗滌。優(yōu)選地，雜交過夜進行，即至少進行10小時，且優(yōu)選地，洗滌進行至少一個 小時，且至少將洗滌溶液更換兩次。這些條件通常會允許具有約90%或更 多序列同一性的序列特異雜交。
中度條件在本文中被定義為下述條件，所述條件允許至少約50個核 苷酸，優(yōu)選地約200個或更多核苷酸的核酸序列，在約45"C的溫度下，在 包含約1M鹽的溶液中，優(yōu)選地在6 x SSC中或具有相當離子強度的任何 其它溶液中雜交，并在包含約1 M鹽的溶液中，優(yōu)選地在6 x SSC中或具 有相當離子強度的任何其它溶液中洗滌。優(yōu)選地，雜交過夜進行，即至少 進行10小時，并且優(yōu)選地，洗滌進行至少一個小時，并且至少將洗滌溶 液更換兩次。這些條件通常會允許具有高達50%序列同一性的序列特異雜 交。本領域技術人員應當能夠修改這些雜交條件，從而特異地鑒定同一性 在50%和90%之間變化的序列。
編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、3-羥基丁酰-CoA脫水酶、丁酰-CoA脫氫酶、醇脫氫酶或乙醛脫氫酶和/或NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列可以來自原核或真核起源。編碼乙酰-CoA 乙?；D(zhuǎn)移酶的原核核苷酸序列可例如是SEQ ID. NO: 2中所示的 C/oWr,^wm aceto^0^'cwm的,/n工基因。編碼3-羥基丁酰-CoA脫氫酶的原 核核苷酸序列可以例如是序列SEQ ID NO: 4中所示的C/oWnWt/m ^"o^0^c謂的AM基因。編碼3-羥基丁酰-CoA脫水酶的原核核苷酸序 列可以例如是如序列SEQ ID NO: 6中所示的C/os^W/wm acetoZ M(y"cwm的 cW基因。編碼丁酰-CoA脫氫酶的原核核苷酸序列可例如是如序列SEQ ID NO: 8中所示的C/o^r,Wwm ac"ok^y//cww的6ed基因。編碼醇脫氫酶或乙 醛脫氫酶的原核核苷酸序列可以例如分別是如序列SEQ ID NO: 10中SEQ ID NO: 12所示的C/o對nWMm acetoZw^/Zcwm的adAE或a<iAEl基因編石馬 NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的原核核苷酸序列可以例如是分別如SEQ ID NO: 14禾口 SEQ ID NO: 16中所示的C/o步W謹臟toZ —Zc應的腿A或 k/AB基因。
為了提高被引入的酶在本發(fā)明的真核細胞中以活性形式表達的可能 性，可以對相應的編碼核苷酸序列加以適應性改造，從而針對選擇的真核宿主細胞的密碼子使用優(yōu)化其密碼子使用。編碼酶的核苷酸序列對選擇的 宿主細胞密碼子使用的適應性可以被表述為密碼子適應指數(shù)(CAI)。密碼子 適應指數(shù)在本文中定義為的相對適應性的度量，所述相對適應性是基因的 密碼子使用趨向于高度表達的基因的密碼子使用的相對適應性。各密碼子 的相對適應性(W)是各密碼子使用與針對相同氨基酸的最豐富密碼子使用的 比例。CAI指數(shù)被定義為這些相對適應性數(shù)值的幾何平均值。非同義密碼
子和終止密碼子(依賴于遺傳密碼)排除在外。CAI數(shù)值范圍從0到1， 更高的數(shù)值表示更高比例的最豐富密碼子(見Sharp and Li， 1987， Nucleic Acids Research 15: 1281-1295;還見Jansen et al.， 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8):2242- 51)。經(jīng)適應的核苷酸序列優(yōu)選地具有至少0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6或0.7的CAI。
在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的真核細胞被一條或多條核苷 酸序列遺傳修飾，使用如PCT/EP2007/05594中所公開的密碼子對優(yōu)化技 術，針對真核細胞的密碼子使用對所述核苷酸序列進行了適應性改造。密 碼子對優(yōu)化是用于在宿主細胞中生產(chǎn)多肽的方法，其中編碼所述多肽的核 苷酸序列已在其密碼子使用、尤其是關于使用的密碼子對的方面被修飾， 從而獲得編碼多肽的核苷酸序列的提高的表達和/或多肽的提高的生產(chǎn)。密 碼子對在本文中被定義為編碼序列中一組兩個先后的三聯(lián)體(密碼子)。
驚人地發(fā)現(xiàn)，使用密碼子對優(yōu)化方法針對選擇的宿主細胞對被轉(zhuǎn)化的 真核細胞中的核苷酸序列進行了適應改造時，與用未經(jīng)密碼子對優(yōu)化的核 苷酸序列轉(zhuǎn)化的真核細胞相比，前一真核細胞生產(chǎn)的丁醇量提高。
可通過公知的方法，如易錯PCR或定向進化，來獲得真核宿主細胞中 體內(nèi)酶活性的進一步提高。定向進化的一種優(yōu)選的方法描述于 WO03010183和WO030腦l中。
根據(jù)本發(fā)明的真核細胞可以是任何合適的宿主細胞，優(yōu)選地來自微生 物起源。優(yōu)選地，宿主細胞為酵母或絲狀真菌。更優(yōu)選地，宿主細胞屬于 iSacc/^z-om少cay 、 J5/ efgz7/ws 、 尸ew/cz'〃/wm 、 尸Zc/n'a 、 X/w_yverom_yces 、 7a廠row/a、 C"awfifzV/a、 //awseww/a 、 //w附/co/a、 7brw/a5/ orfl 、 JWcAosporow 、 Sre"flwomyces、 PacA3As0/e打或 Ybmadaz_yma屬。更ifc選的宿主細胞屬于mana.朋ws 、 K /acfc 〖/jer附oto/eraws 、 yam w'a /—/,'ca 、 C朋c^fl sowore/is7、、 C g/aZ ra/a、 //"awseww/a / o/少mo^p/ja、 7bn/Axs/ ora fife/6廠wecAi/、
Mvarwm、 》SaccAaram_yces Z7a3^m/s或SaccAarcwyces1 cerev&ae禾中。優(yōu)選地， 真核細胞是SaccAaromyc&y cerevz、/fle。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真核細胞是酵母，優(yōu)選地為Sacc/^ra/^c^ ce"v^ae，其包含一個或多個選自下組的基因，該組由SEQ ID NO. 17、 SEQ ID NO. 18、 SEQ ID NO. 19、 SEQ ID NO. 20、 SEQ ID NO. 21或SEQ ID NO 22 ，和SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24組成。
編碼下述酶的核苷酸序列可以與核酸構建體連接，以協(xié)助轉(zhuǎn)化根據(jù)本 發(fā)明的真核細胞，所述酶生產(chǎn)乙酰乙酰基-CoA、 3-羥基丁酰-CoA、巴豆 酰-CoA、 丁酰-CoA、 丁醛和丁醇。核酸構建體可以是帶有編碼如上所述 丁醇代謝途徑的所有六種酶的基因的質(zhì)粒，或者核酸構建體包含兩種或三 種下述質(zhì)粒，所述質(zhì)粒分別帶有編碼丁醇途徑六個酶的三個或兩個基因， 所述基因以任何合適的方式分布?？墒褂萌魏魏线m的質(zhì)粒，例如低拷貝質(zhì) ?；蚋呖截愘|(zhì)粒。選自乙酰-CoA乙酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫 酶、3-羥基丁酰-CoA脫水酶、丁酰-CoA脫氫酶、醇脫氫酶或乙醛脫氫酶 和NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的酶對宿主細胞來說可以是固有的，并且 賦予細胞生產(chǎn)丁醇的能力可能不需要用一條或多條編碼這些酶的核苷酸序 列轉(zhuǎn)化?？赏ㄟ^經(jīng)典的菌株改進獲得宿主細胞對丁醇生產(chǎn)的改進。
核酸構建體可以被保持為游離狀態(tài)，并因此包含用于自主復制的序 列，例如常染色體復制序列。如果宿主細胞是真菌起源的，則合適的游離 體核酸構建體可例如基于酵母2ai或pKDl質(zhì)粒(Gleer et al., 1991 , Biotechnology 9: 968-975)或AMA質(zhì)粒(Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489)?；蛘?，各核酸構建體可以以一個或多個拷貝被整合進宿主細 胞的基因組中。整合進宿主細胞基因組可通過非同源重組隨機發(fā)生，但是 優(yōu)選地，可通過如本領域所公知的同源重組將核酸構建體整合進宿主細胞 的基因組中(見例如WO90/14423、 EP-A-0481008、 EP-A-0635 574和US6,265,186)。
任選地，可選擇的標記物可存在于核酸構建體中。本文使用的術語 "標記物"是指編碼下述性狀或表型的基因，其允許選擇或篩選含有標記 物的宿主細胞。標記物基因可以是抗生素抗性基因，從而可使用適當?shù)目?生素從未被轉(zhuǎn)化的細胞中選擇被轉(zhuǎn)化的細胞。然而，優(yōu)選地使用非抗生素 抗性標記物，如營養(yǎng)缺陷標記物(URA3， TRP1 , LEU2)。用核酸構建體轉(zhuǎn)化 的宿主細胞可以不含標記物基因。不含重組標記物基因的微生物宿主細胞 的構建方法公開于EP-A-0 635 574中，其基于雙向標記物的使用?；蛘?， 可向本發(fā)明的核酸構建體中整合可選擇的標記物如綠色熒光蛋白、/^Z、 螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、]3-葡萄糖苷酸酶，以允許篩選被轉(zhuǎn)化的細 胞。WO0540186中描述了引入異源多核苷酸的一種優(yōu)選的無標記物方法。
在一個優(yōu)選的實施方案中，下述核苷酸序列各自與下述啟動子可操作 地連接，所述核苷酸序列編碼生產(chǎn)乙酰乙酰-CoA、 3-羥基丁酰-CoA、巴豆 酰-CoA、 丁酰-CoA、 丁醛和丁醇的酶(例如本文定義的酶)，所述啟動 子引起相應的核苷酸序列在根據(jù)本發(fā)明的真核細胞中足量表達，以賦予細 胞生產(chǎn)丁醇的能力。
在本文中使用時，術語"可操作地連接"是指多核苷酸元件(或編碼 序列或核酸序列)以功能性關系相連。當核酸序列被置于與另一核酸序列 的功能性關系中時，該核酸序列是"可操作地連接"的。例如，如果啟動 子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子或增強子與編碼序列可操作 地連接。
在本文中使用時，術語"啟動子"是指下述核酸序列，其發(fā)揮控制一 個或多個基因轉(zhuǎn)錄的功能，按照轉(zhuǎn)錄方向位于基因轉(zhuǎn)錄起點的上游，并在 結(jié)構上通過DNA-依賴性RNA聚合酶結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起點、和任何其它 DNA序列的存在來鑒定，所述其它DNA序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 位點、阻遏蛋白和激活蛋白結(jié)合位點以及本領域技術人員已知直接或間接 作用以調(diào)節(jié)來自啟動子的轉(zhuǎn)錄量的任何其它核苷酸序列。"組成型"啟動 子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動子。"誘導型"啟動子是在 環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動子。對于編碼待表達的酶的核苷酸序列而言，可用于達成編碼酶的核苷酸 序列表達的啟動子可能不是固有的，即啟動子對與其可操作地連接的核苷 酸序列(編碼序列)而言是異源的。優(yōu)選地，啟動子對宿主細胞是同源 的，即內(nèi)源的。
真核宿主細胞中的合適啟動子可以是GAL7、 GAL10或GAL 1、 CYC1、 HIS3、 ADH1、 PGL、 P簡、GAPDH、 ADC1、 TRP1、 URA3、 LEU2、 ENO、 TPI和A0X1 。其它合適的啟動子包括PDC、 GPD1 、 PGK1、 TEF1禾卩TDH。
本發(fā)明中可使用在細胞中有功能的任何終止子。優(yōu)選的終止子得自宿 主細胞的天然基因。合適的終止子序列是本領域公知的。優(yōu)選地，將這類 終止子與下述突變組合，所述突變在本發(fā)明的宿主細胞中防止無義密碼子 介導的mRNA衰變(見例如Shirley et al., 2002， Genetics 161 :1465-1482)。
優(yōu)選的啟動子和終止子示于SEQ ID NO. 25到30中。
用于表示給定(重組)的核酸或多肽分子與給定的宿主生物或宿主細 胞之間的關系時，術語"同源的"被理解為表示在天然中，核酸或多肽分 子由相同物種的宿主細胞或生物產(chǎn)生，優(yōu)選地由相同變種或菌株產(chǎn)生。
在關于核酸(DNA或RNA)或蛋白質(zhì)的方面，使用術語"異源的" 表示下述核酸或蛋白質(zhì)，其不作為其存在的生物、細胞、基因組或DNA 或RNA序列的部分天然存在，或其存在于與其天然存在的細胞或位置基 因組或DNA或RNA序列中的位點不同的地方。異源核酸或蛋白質(zhì)對其被 引入的細胞而言不是內(nèi)源的，其得自另一細胞或被合成或重組地生產(chǎn)。
可過表達如上所述的丁醇途徑中的一個或多個酶，以達成細胞對丁醇 的足量生產(chǎn)。本領域存在多種可獲得的手段，用于在本發(fā)明的宿主細胞中 過表達酶。具體地，可通過增加宿主細胞中編碼酶的基因的拷貝數(shù)，例如 通過在宿主細胞的基因組中整合基因的額外拷貝，來過表達酶。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的宿主細胞可以是天然能夠進行醇發(fā)酵(例如 厭氧的醇發(fā)酵，尤其是乙醇發(fā)酵)的真核細胞，能夠生產(chǎn)乙醇的一組真核 細胞是例如酵母，如5bcc/wram少c" cwevWae。如果真核細胞能夠進行乙醇發(fā)酵，則優(yōu)選一個或多個編碼丙酮酸脫羧酶的基因被敲除，從而將代謝 轉(zhuǎn)換至丁醇途徑。
為了進一步提高丁醇生產(chǎn)，可優(yōu)選如下增加真核宿主細胞中的胞質(zhì)乙 酰COA庫在存在可發(fā)酵碳源(例如葡萄糖或半乳糖)和乙酸鹽、或乙酸 鹽來源如脂肪酸的混合物時，培養(yǎng)真核細胞，從而提供具有足量胞質(zhì)乙酰-
CoA的細胞。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞還對醇具有高耐受，所述醇例如乙 醇、丙醇、丁醇、異丙醇、異丁醇、異戊醇、無醇、肌醇、庚醇或辛醇。 高的醇耐受性可天然地存在于宿主細胞中，或可通過遺傳修飾被引入或修 飾，所述遺傳修飾可包括經(jīng)典的菌株改進技術或定向進化。根據(jù)本發(fā)明的 優(yōu)選的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞可能夠在本領域己知的任何合適碳源上生長，并 將所述碳源轉(zhuǎn)化為丁醇。經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞可能夠直接轉(zhuǎn)化植物生物質(zhì)、 纖維素、半纖維素、果膠、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、麥芽糖、麥芽糖糊 精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，優(yōu)選 的宿主生物表達下述酶，例如將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖單體和將半纖維素轉(zhuǎn) 化為木糖和阿拉伯糖單體所必需的纖維素酶(內(nèi)纖維素酶和外纖維素酶) 和半纖維素酶(例如內(nèi)-和外-木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能夠?qū)⒐z轉(zhuǎn)化 為葡糖醛酸的果膠酶或?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為葡萄糖單體的淀粉酶。優(yōu)選地，宿主 細胞能夠轉(zhuǎn)化選自下組的碳源，該組由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、
乳糖和甘油組成。宿主細胞可例如是如WO03/062430、 WO06/009434、 EP1499708B1、 WO2006096130或WO04/099381中所述的真核宿主細胞。
另一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)丁醇的工藝，所述工藝包括在合適的 發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞，以及任選地回收丁 醇。
生產(chǎn)丁醇的工藝中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基可以是任何合適的發(fā)酵培養(yǎng)基， 所述培養(yǎng)基允許具體的真核宿主細胞生長。發(fā)酵培養(yǎng)基的必需元素是本領 域技術人員已知的，并可針對所選擇的宿主細胞對其進行適應性改變。
優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基包含乙酸鹽。驚人地發(fā)現(xiàn)在存在乙酸鹽時培養(yǎng)真 核細胞時，與無乙酸鹽時培養(yǎng)的細胞相比產(chǎn)生增加的丁醇量。發(fā)酵培養(yǎng)基200 間，優(yōu)選地在1和4 g/1之間，優(yōu)選地在 1.5和3.5 g/l之間。
優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基包含選自以下的碳源植物生物質(zhì)、纖維素、半
纖維素、果膠、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、果糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、 核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘 油。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基還包含氮源，如尿素，或銨鹽如硫酸銨、氯化 銨、硝酸銨或磷酸銨。
根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵過程可以以分批、補料分批或連續(xù)的方式進行。也
可使用獨立的水解和發(fā)酵(SHF)過程或同時糖化和發(fā)酵(SSF)過程。還可使 用這些發(fā)酵過程模式的組合，以獲得最佳生產(chǎn)力。如果在發(fā)酵過程中使用 淀粉、纖維素、半纖維素或果膠作為碳源(其中可能必需添加水解酶，如 纖維素酶、半纖維素酶或果膠酶，以水解底物)，則SSF過程是尤其有吸 引力的。
生產(chǎn)丁醇的過程中使用的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞可以是本文上文定義的任
何合適的宿主細胞。發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)丁醇的過程中使用根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化
的真核細胞是有利的，因為大部分真核細胞不需要無菌條件來繁殖，并且
對噬菌體感染不敏感。另外，可以在低pH下培養(yǎng)真核宿主細胞，以防止
細菌污染。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真核細胞是兼性厭氧微生物。因為兼性厭氧微 生物可以需氧地繁殖至高細胞濃度，然后在厭氧條件下生產(chǎn)丁醇，所以兼 性厭氧微生物是優(yōu)選的。然后可以在高細胞濃度下進行該厭氧周期，這大 幅減小了所需的發(fā)酵提及，并且最小化被需氧微生物污染的風險。 根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)丁醇的發(fā)酵過程可以是需氧或厭氧的發(fā)酵過程。 厭氧發(fā)酵過程在本文中被定義為在無氧時進行的發(fā)酵過程，或是下述
發(fā)酵過程其中基本上不消耗氧，優(yōu)選地消耗少于5、 2.5或1 mmol/L/h
氧，且其中有機分子發(fā)揮電子供體和電子受體兩種作用。根據(jù)本發(fā)明的發(fā) 酵過程也可以首先在需氧條件下進行，然后在厭氧條件下進行。
發(fā)酵過程也可以在氧受限或微量需氧(microaerobical)條件下進行?；?者，發(fā)酵過程可首先在需氧條件下，隨后在氧受限的條件下進行。氧受限發(fā)酵過程是下述過程，其中氧消耗受到從氣體到液體的氧轉(zhuǎn)移的限制。氧 限制的程度通過進入氣流的量和組成，以及使用的發(fā)酵設備的實際混合/質(zhì) 量轉(zhuǎn)移特性來確定。優(yōu)選地，在氧受限條件下的過程中，氧消耗速率至少
為5.5 mmol/L/h，更優(yōu)選地至少為6 mmol/L/h，進一步更優(yōu)選地至少為7 mmol/L/h。
根據(jù)本發(fā)明的過程中丁醇的生產(chǎn)可在宿主細胞的生長期期間、穩(wěn)定 (穩(wěn)定狀態(tài))期期間或兩者期間發(fā)生。可能在不同的溫度下進行發(fā)酵過 程。
生產(chǎn)丁醇的過程優(yōu)選地在對真核細胞最適的溫度下進行。各經(jīng)轉(zhuǎn)化的 真核細胞的最適生長溫度可不同，這是本領域技術人員已知的。最適溫度 可高于對于野生型生物來說在非無菌條件下在最小感染敏感度和最低冷卻 成本下高效生長的最適溫度。
經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞生長的最適溫度可以高于20°C、 22°C、 25°C、 28°C，或高于30°C、 35°C或高于37°C、 40°C、 42°C，并優(yōu)選地低于 45°C。然而在丁醇的生產(chǎn)期，最適溫度可能低于平均，從而優(yōu)化生物質(zhì)穩(wěn) 定性并降低丁醇溶解度。該時期期間的溫度可以低于45°C，例如低于42 °C、 40°C、 37。C，例如低于35°C、 30。C或低于28°C、 25°C、 22。C或低于 20°C，優(yōu)選地高于15°C。
根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)丁醇的過程可在任何合適的pH值下進行。如果經(jīng) 轉(zhuǎn)化的真核細胞是酵母，則酵母培養(yǎng)基中的pH優(yōu)選地具有下述值，所述 值低于6，優(yōu)選地低于5.5，優(yōu)選地低于5，優(yōu)選地低于4.5，優(yōu)選地低于 4，優(yōu)選地低于pH 3.5或低于pH 3.0，或低于pH2.5，優(yōu)選地高于pH2。 在這些低pH下進行發(fā)酵的一個優(yōu)點是可以預防發(fā)酵培養(yǎng)基中污染細菌的 生長。
可通過本領域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收丁醇，例如通過蒸餾、 真空萃耳又(vacuum extraction)、溶齊峰耳又或滲透蒸發(fā)(pervaporation)。
發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)丁醇的過程導致產(chǎn)生下述濃度，所述濃度高于 5mg/l發(fā)酵液，優(yōu)選地高于10mg/1，優(yōu)選地高于20mg/1，優(yōu)選地高于30 mg/l發(fā)酵液，優(yōu)選地高于40mg/1，更優(yōu)選地高于50 mg/1，優(yōu)選地高于60mg/l，優(yōu)選地高于70，優(yōu)選地高于80mg/1，優(yōu)選地高于100 mg/l，優(yōu)選地 高于lg/1，優(yōu)選地高于5g/1，優(yōu)選地高于10g/1，但是通常低于70g/1。
本發(fā)明還涉及可通過根據(jù)本發(fā)明的過程獲得的包含丁醇的發(fā)酵液。發(fā) 現(xiàn)所述發(fā)酵液不含或含有低濃度的丁酸鹽和丙酮。
通過本發(fā)明的發(fā)酵過程生產(chǎn)的丁醇可以用于任何已知的丁醇應用中。 其可例如被用作染料、例如用作柴油或汽油的添加劑?；蛘?，發(fā)酵生產(chǎn)的 丁醇可以通過本領域已知的方法被轉(zhuǎn)化為丙烯酸丁酯。
遺傳修飾
標準的遺傳技術(例如在宿主細胞中過表達酶，以及對宿主細胞的額 外遺傳修飾)是本領域已知的方法，例如描述于Sambrook and Russel (2001 ) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，或F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience， New York (1987)中。用于轉(zhuǎn)化和遺傳修飾真菌宿主細胞的方 法可從例如EP-A-O 635 574 、 WO 98/46772、 WO 99/60102禾U WO 00/37671己知。
以下實施例僅用于闡述的目的，而不應被理解為限制本發(fā)明。
實施例
一般性的
寡核苷酸由Invitrogen (Carlsbad CA,美國)合成。
DNA測序在SEQLAB ( Gottingen,德國)進行或由Baseclear (Leiden,荷蘭)進行。
限制性酶由Invitrogen或New England Biolabs提供。
使用的菌豐朱&c^n'c/n'a co" DH10B electromax感受態(tài)細胞 (Invitrogen)。方案由制造商提供。
SDS-PAGE體系(Invitrogen)
NuPAGE Novex Bis-Tris凝膠(Invitrogen) 。
SimplyBlue SafeStainMicrowave方案
實施例1
通過同源重組在5Vzcc/ aram;;c^ cerev&ae中克隆丁醇生物合成途徑， 并生產(chǎn)丁醇。
l丄基因和構建體
為了在51. cereWw'ae中引入丁醇途徑，總計克隆了 8個C/Wn'^/m flceto/)M(y/z'cw附基因
Azl，編碼乙酰CoA-乙?；D(zhuǎn)移酶[E. C. 2.3.1.9] (SEQ ID. NO:2)
AM，編碼3-羥基丁酰-CoA脫氫酶[E. C丄l丄57] (SEQIDNO:4)
cW，編碼巴豆酸酶或3-羥基丁酰-CoA脫水酶[E. C.4.2丄55] (SEQ ID NO:6)
6cd，編碼丁酰-CoA脫氫酶[E. C丄3.99.2] (SEQIDNO: 8) 'a^E或^/AEl，均編碼醇脫氫酶或乙醛脫氫酶[E.C.1.2.1.10] (SEQ
ID NO: 10和SEQ IDNO:12)
^ttA、 Z^/ B， 二者分別編碼NADH-依賴性丁醇脫氫酶A禾Q B [E. C. :l.l丄-](SEQ ID NO: 14和16)
表達構建體在DNA2.0 (Menlo Park CA，美國)合成。兩個高拷貝穿 梭載體pRS425和pRS426 derived (Sirkoski R. S. and Hieter P. Genetics, 1989: 122(1 ):19-27)被制造為各表達3個丁醇生物合成基因。
如Raymon CK. et al Biotechniques (1999) 26:134-141所述，所有合成 的構建體都含有用于三重同源重組的40 bp同源側(cè)翼。^n'L基因和Z M基 因被合成為由雙向GAL1-10啟動子表達并由GAL1-10終止子終止的一個 片段。cW禾卩6ct/從相似的構建體表達。at/ZiE和a^El基因在GAL7啟動 子和終止子以及Z)WA和6WB之間合成，得到4種不同的構建體。
1.2.轉(zhuǎn)化》S. cgrgvWag
通過,/ T7M^構建體與a^E或at/AEl表達構建體和經(jīng)線性化的 pRS425表達載體(LEU2)在X ce"WWae CEN.PK102-3A (ura3-52和leu2-3)中的三重(tripartite)體內(nèi)同源重組，制造前兩個表達構建體，得到pRS425THE和pRS425THEl 。
通過cW/6W表達構建體和或表達構建體與經(jīng)線性化的 pRS426表達載體(URA3)在CEN.PK102-3A中的三重體內(nèi)同源重組，制造 后兩個表達載體，分別得到pRS426CBA和pRS426CBB。
每種質(zhì)粒含有處于半乳糖誘導型啟動子后的3個基因。
從經(jīng)轉(zhuǎn)化的5*. ce"油^菌株中分離質(zhì)粒，并用表達載體轉(zhuǎn)化co// DH10b，以選擇和檢驗正確的質(zhì)粒。
用a) pRS425THE和pRS426CBA、 b) pRS425THE和pRS426CBB、 c) pRS425THEl和pRS426CBA 、 d) pRS425THEl禾tl pRS426CBB轉(zhuǎn)化 CEN.PK102-3A。將轉(zhuǎn)化體涂布在酵母氮基(YNB) w/o AA (Difco) + 2%葡萄 糖上。將各質(zhì)粒組合的總計IO個轉(zhuǎn)化體接種在YNB w/o AA (Difco) + 0.1 %葡萄糖+2%半乳糖中，并在燒瓶中、在需氧條件下、在10ml培養(yǎng)物中 厭氧或氧受限的條件下培養(yǎng)。用于厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)基補充有溶于乙醇中的 0.01 g/1麥角固醇和0.42 g/1吐溫80(Andreasen and Stier， 1953, J. cell. Physiol, 41 , 23-36; Andreasen and Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281 )。所有的 酵母培養(yǎng)物在3(TC下培養(yǎng)。培養(yǎng)和誘導過夜后，將細胞離心，并如下文所 述通過HPLC測量上清液中的丁醇濃度。
1.3.通過HPLC分析丁醇
HPLC分析前置柱(pre-column): Biorad Microguard陽離子H+管。 柱Biorad Aminex HPX-87H。流動相0.01 N H2S04。沉淀試劑:3.3N HC104。
RI檢測Waters 410差示折射計。
實施例2
使用限制性酶在^cc/mro,c" ce^vWae中克隆丁醇生物合成途徑并使用
經(jīng)密碼子對優(yōu)化的基因生產(chǎn)丁醇。
2丄基因和構建體
為了在cweWw'fle中表達，向?qū)嵤├?第1.1段中給出的8個天然基 因應用PCT/EP2007/05594中公開的密碼子對方法。這導致產(chǎn)生了 8個經(jīng)密碼子對優(yōu)化的變體
SEQ ID NO. 17:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的(CPO) Azl基因
SEQIDN0.18:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的AZ^/基因
SEQ ID NO. 19:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的cW基因(逆時針方向)
SEQ ID NO. 20:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的6cd基因
SEQ ID NO. 21:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的基因
SEQ ID NO 22:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的《WE1基因
SEQ ID NO 23:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的6WA基因
SEQ ID NO 24:經(jīng)密碼子對優(yōu)化的MAB基因
在DNA2.0 (Menlo Park CA,美國)合成這8個設計的經(jīng)密碼子對優(yōu) 化的基因。如下文所述使用經(jīng)密碼子對優(yōu)化的基因制造表達構建體。
2.2.轉(zhuǎn)化5". cereWw.ae
如下構建前兩個表達構建體用^ al/M rt限制性酶雙消化pRS415載 體(LEU)，隨后在該載體中連接與AcI/A^I限制性片段組合的/^fll/^cl限 制性片段，所述AcI/M^I限制性片段含有血L/AM片段，所述^ dA4"I 限制性片段由^/AE或^ttEl基因組成。在該三重連接后，使用連接混合 物轉(zhuǎn)化五.co// DH 10B (Invitrogen)，分別得到構建體pRS415THE和 pRS415THEl。隨后將這些構建體用于在& cer，'5/ae CEN.PK102-3A (ura3-52禾口leu2-3)中的轉(zhuǎn)化。
如下構建后兩個表達載體用S謹HI/A^1限制性酶雙消化pRS416載 體(URA)，隨后在該載體中連接與^ cI/A^1限制性片段組合的5"mHIMwI 限制性片段，所述J^I/A^I限制性片段含有cW/6W片段，所述 5amHI/血cI限制性片段由MAA或M/ B基因組成。在該三重連接后，將 連接混合物用于轉(zhuǎn)化五.co/,' DH 10B (Invitrogen)，分別得到構建體 pRS416CBA禾n pRS416CBB。隨后將這些構建體用于在S. cere由/ae CEN.PK102-3A (ura3-52和leu2-3)中的轉(zhuǎn)化。
每種質(zhì)粒含有處于在半乳糖誘導型啟動子和終止子后的3個基因。圖 1中展示了構建體的圖解。啟動子和終止子的序列表如下SEQIDNO. 26: GAL7終止子；SEQIDN0 27: GAL IO終止子，逆時針方向；SEQIDN0 28: GAL10啟動子，逆時針方向； SEQIDN0 29: GAL 1啟動子；SEQIDNO30: GAL 1終止子。
用a) pRS415THE和pRS416CBA、 b) pRS415THE和pRS416CBB、 c) pRS415THEl和pRS416CBA，或d) pRS415THEl和pRS416CBB轉(zhuǎn)化51. ce^w^ae CEN.PK102-3A。將轉(zhuǎn)化體涂布在酵母氮基(YNB) w/o AA (Difco) + 2%葡萄糖上。將各質(zhì)粒組合的總計10個轉(zhuǎn)化體接種在YNB w/o AA (Difco) + 0.1 %葡萄糖+ 2%半乳糖中并處于需氧條件下。隨后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的 酵母在用橡皮塞子和鋁蓋封閉的燒瓶中，在10 ml培養(yǎng)物微量需氧地培 養(yǎng)。所有的酵母培養(yǎng)物在25。C下培養(yǎng)。誘導過夜后，在培養(yǎng)40、 48和64 小時后取出培養(yǎng)物的小份試樣。將細胞離心，并如下文所述通過頂空色譜 (Headspace Gaschromatography, HS-GC)測量上清液中的丁醇濃度。
2.3.通過HS-GC分析丁醇
在裝備了閃爍電離檢測器和自動注射體系的HS-GC上分析樣品。柱 J&W DB-1長度30 m， id 0.53 mm， df 5 /mi。使用以下的條件氦作為運 載體，流速5ml/分鐘。柱溫度被設定為ll(TC。注射器被設定為14(TC且 檢測器在30(TC下運行。使用Chromeleon軟件獲得數(shù)據(jù)。在頂空采樣器中 將樣品在6(TC下加熱20分鐘。將lml頂空揮發(fā)物自動注射在柱上。
包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的a^E和kttA或b丑A，或和MAA或 Z^/AB的所有不同的轉(zhuǎn)化體都能夠生產(chǎn)丁醇。在培養(yǎng)40小時后，上清液中 的丁醇濃度在5 - 10 mg丁醇/l之間，培養(yǎng)48小時后，在8 - 13 mg 丁醇/1 之間，培養(yǎng)64小時后，在15和20 mg丁醇/l之間。包含未經(jīng)密碼子對優(yōu) 化的基因的X ce"v^ae菌株在培養(yǎng)64小時后生產(chǎn)0.1-2 mg/1。
實施例3:乙酸鹽對丁醇產(chǎn)量的影響 用生產(chǎn)丁醇的酵母菌株CEN.PK102-3A菌株測定發(fā)酵培養(yǎng)基中存在乙 酸鹽對丁醇產(chǎn)量的影響，所述菌株如實施例2中所述用pRS425THE和 pRS426CBB轉(zhuǎn)化。將該酵母菌株接種在Verduyn培養(yǎng)基(Verduyn, C,Postma， E.， Scheffers W. A.， van Dijken, J. P. (1992), Yeast 8， 501-517)中，所 述培養(yǎng)基被如下調(diào)節(jié)用尿素(2 g/l)代替硫酸銨，半乳糖(40 g/l)是唯一的 碳源，并用溶于乙醇中的2g/l乙酸鉀、0.01 g/l麥角固醇和0.42 g/l吐溫80 補充培養(yǎng)基(Andreasen and Stier, 1953， J. cell. Physiol, 41 ， 23-36; Andreasen and Stier, 1954， J. Cell. Physiol, 43: 271-281 )。參照培養(yǎng)物不含2 g/1乙酸 鉀。將細胞在燒瓶中于50 ml培養(yǎng)基中微量需氧地培養(yǎng)，所述燒瓶用橡膠 塞子和鋁蓋封閉。將燒瓶在25"C柔和搖動。在600 nm處1.5的光密度下 (72小時后)，將細胞離心并如實施例2中所述通過HS-GC測量上清液 中的丁醇濃度。
包含乙酸鹽的培養(yǎng)物中丁醇的產(chǎn)量為20 mg/l。不含有乙酸鹽的培養(yǎng)物 中丁醇的產(chǎn)量為13mg/l。
權利要求
1.經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞，其包含一條或多條編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、3-羥基丁酰-CoA脫水酶、丁酰-CoA脫氫酶、醇脫氫酶或乙醛脫氫酶和/或NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在轉(zhuǎn)化所述細胞后賦予所述細胞生產(chǎn)丁醇的能力。
2. 根據(jù)權利要求1的細胞，其中使用密碼子對優(yōu)化，使所述核苷酸序 列適應所述真核細胞的密碼子使用。
3. 根據(jù)權利要求1或2的真核細胞，其表達一條或多條選自下組的核 苷酸序列，該組由以下組成a. 編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選 自下組，該組由以下組成i. 編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，所述乙酰-CoA乙?；?轉(zhuǎn)移酶包含與SEQ ID NO:l的氨基酸序列至少具有20%序列同一性的氨基 酸序列，ii. 與SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少具有15%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，b. 編碼3-羥基丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 選自下組，該組由以下組成i. 編碼3-羥基丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，所述3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶包含與SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少具有25%序列同一性的氨基 酸序列，ii. 與SEQ ID NO:4的核苷酸序列至少具有20%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；禾口iv.核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同，c. 編碼3-羥基丁酰-CoA脫水酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自下組，該組由以下組成i. 編碼3-羥基丁酰-CoA脫水酶的核苷酸序列，所述3-羥基丁酰-CoA 脫水酶包含與SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少具有30%序列同一性的氨基 酸序列，ii. 與SEQ ID NO:6的核苷酸序列至少具有25%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；禾口iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，d. 編碼丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自下 組，該組由以下組成i. 編碼丁酰-CoA脫氫酶的核苷酸序列，所述丁酰-CoA脫氫酶包含與 SEQ IDNO:7的氨基酸序列至少具有20。/。序列同一性的氨基酸序列，ii. 與SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少具有15%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，e. 編碼醇脫氫酶或乙醛脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選 自下組，該組由以下組成i. 編碼醇脫氫酶或乙醛脫氫酶的核苷酸序列，所述醇脫氫酶或乙醛脫 氫酶包含分別與SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列至少具有 20%序列同一性的氨基酸序列，ii. 分別與SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12的核苷酸序列至少具有 15%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和iv.核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同，和f.編碼NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸 序列選自下組，該組由以下組成i. 編碼NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的核苷酸序列，所述NAD(P)H-依 賴性丁醇脫氫酶包含與SEQ ID NO: 13和/或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列 至少具有30%序列同一性的氨基酸序列，ii. 與SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO 16的核苷酸序列至少具有25% 序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交；和iv. 核苷酸序列，其由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序 列不同。
4. 根據(jù)權利要求1到3中任一項的細胞，其中所述細胞是包含下述異 源核苷酸序列的&cc/^ram;;c^ cere油/ae，所述異源核苷酸序列編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、3-羥基丁酰-CoA脫水酶、 丁酰-CoA脫氫酶、醇脫氫酶或乙醛脫氫酶和NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶。
5. 根據(jù)權利要求1到3中任一項的細胞，其為包含一條或多條下述核 苷酸序歹U的》Sflcc/^rom_ycas cergv&ae，所述一條或多條核苷酸序歹U選自由 SEQ ID NO. 17、 SEQ ID NO. 18、 SEQ ID NO. 19、 SEQ ID NO. 20、 SEQ ID NO. 21或SEQ ID NO 22，和SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24組成的組。
6. 根據(jù)權利要求1到5中任一項的細胞，其中編碼丙酮酸脫羧酶的一 個或多個基因被敲除。
7. 根據(jù)權利要求1到6中任一項的細胞，其能夠轉(zhuǎn)化選自下組的碳 源，該組由淀粉、果膠、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、果糖、麥芽糖、麥芽 糖糊精、核糖、核酮糖、纖維素、半纖維素、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、 蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油組成。
8. 用于生產(chǎn)丁醇的工藝，所述工藝包括在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵如前述權利要求中任一項所定義的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞，以及任可選地，回收 丁醇。
9. 根據(jù)權利要求8的工藝，其在低于5的pH下進行。
10. 根據(jù)權利要求8或9的工藝，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含乙酸±卜
11. 包含丁醇的發(fā)酵液，其可通過根據(jù)權利要求8到10中任一項所述 的工藝獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞，其包含編碼乙酰-CoA乙酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、3-羥基丁酰-CoA脫水酶、丁酰-CoA脫氫酶、醇脫氫酶或乙醛脫氫酶和/或NAD(P)H-依賴性丁醇脫氫酶的一條或多條核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在轉(zhuǎn)化細胞后賦予細胞生產(chǎn)丁醇的能力。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)丁醇的工藝。
文檔編號C12N15/53GK101595218SQ200780040436
公開日2009年12月2日 申請日期2007年10月30日 優(yōu)先權日2006年10月31日
發(fā)明者威廉默斯·西奧多瑞斯·安東尼厄斯·瑪麗亞·拉特·德, 羅拉納·麥德勒尼·拉姆斯多克, 馬可·亞歷山大·伯格·范德恩 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權資產(chǎn)管理有限公司