專利名稱：以高產(chǎn)率生物生產(chǎn)正丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括一種通過代謝工程化的微生物，把可發(fā)酵的碳源以高產(chǎn)率生物轉(zhuǎn)化為 正丁醇的方法。
背景技術(shù)：
正丁醇是一種無色，中等揮發(fā)性的中性液體，其在水中具有有限的可混溶性(大 約7-8 % )，但是與所有常見的溶劑如二醇，酮，醇，醛，醚以及芳香族和脂肪族烴任意混 溶。正丁醇i)用于制備其他的化學(xué)品，ii)用作溶劑和iii)用作按配方制造的產(chǎn)品 (formulated product)如化妝品中的成分。正丁醇用作原料的主要用途是在丙烯酸酯/甲 基丙烯酸酯，乙二醇醚，乙酸正丁酯，氨基樹脂和正丁胺的合成中。目前世界上每年消耗超 過9百萬噸的正丁醇。近年來已經(jīng)表明正丁醇是比乙醇更好的生物燃料，歸功于更低的蒸汽壓，更高的 能含量(接近于汽油的能含量)和在存在水時(shí)對(duì)分離更低的敏感性。而且，正丁醇可以按 高于乙醇的濃度混合，用于標(biāo)準(zhǔn)車輛引擎，而且它不需要汽車制造商在性能上作出讓步以 符合環(huán)境保護(hù)法規(guī)。它還適于管道運(yùn)輸，因此它有潛力被快速引入到汽油中并避免對(duì)另外 的大規(guī)模供給基礎(chǔ)設(shè)施的需求。正丁醇可以通過產(chǎn)溶劑梭菌(solventogenic Clostridia)發(fā)酵碳水化合物，作 為丙酮/正丁醇/乙醇(ABE)混合物產(chǎn)生。ABE發(fā)酵分兩個(gè)階段。在第一個(gè)產(chǎn)酸的階段期 間，高生長(zhǎng)率伴隨有乙酸和丁酸的產(chǎn)生。在第二個(gè)產(chǎn)溶劑階段，生長(zhǎng)率降低，并且產(chǎn)生溶劑 (ABE)，同時(shí)伴隨著對(duì)第一個(gè)階段產(chǎn)生的有機(jī)酸的消耗。發(fā)酵自始至終都產(chǎn)生二氧化碳和
Μ,ο正丁醇的生物生產(chǎn)需要形成丁酰輔酶A作為中間體，丁酰輔酶A取決于生理?xiàng)l件 能夠通過adhEl和adhE2編碼的兩個(gè)不同的雙功能醛-醇脫氫酶還原。丁酰輔酶A也可以 通過ptb和buk基因分別編碼的磷酸_轉(zhuǎn)丁酰酶和丁酸激酶轉(zhuǎn)化為丁酸。乙酸是通過pat 基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和ack基因編碼的乙酸激酶從乙酰-輔酶A生產(chǎn)的。丙酮是通過 ctfAB和adc基因分別編碼的輔酶A-轉(zhuǎn)移酶和乙酰乙酸脫羧酶，從乙酰-乙酰輔酶A(丁 酰-輔酶A生產(chǎn)中的中間體)生產(chǎn)。氫是由hydA基因編碼的僅作用于鐵的氫化酶產(chǎn)生的。 當(dāng)在一氧化碳，一種氫化酶抑制劑，存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，正丁醇，乙醇和乳酸是主要的發(fā)酵 產(chǎn)物。乳酸是通過由Idh基因編碼的乳酸脫氫酶從丙酮酸產(chǎn)生的。論文中已經(jīng)描述了帶有滅活的buk基因的丙酮丁醇梭菌菌株(Clostridium acetobutylicum)(通過與不可復(fù)制的質(zhì)粒單交換獲得)(Green等，1996)。將帶有0. 8kb的 內(nèi)部buk片段的不可復(fù)制的載體pJC4BK整合到染色體的buk基因中，其導(dǎo)致內(nèi)源基因的滅 活。從質(zhì)粒的名稱把獲得的菌株命名為“突變體PJC4BK”。如在該論文中明確描述的，由于 這種類型基因失活的不穩(wěn)定性，其可以通過質(zhì)粒切除逆轉(zhuǎn)為野生型，所以這種基因整合沒 有完全消除酶活性或丁酸形成。其后將這種突變株用于幾個(gè)研究中(Green and Bennett, 1998 ；Desai and Harris, 1999 ；Harris 等，2000)。傳統(tǒng)地，由于生產(chǎn)型梭菌的連續(xù)培養(yǎng)不穩(wěn)定性，商用ABE發(fā)酵只以分批模式進(jìn)行。已經(jīng)描述了幾種生產(chǎn)溶劑的發(fā)酵方法。這些方法以6 3 1的比例出產(chǎn)正丁醇，丙酮和 乙醇。該文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了可發(fā)酵碳源的29-34%的溶劑產(chǎn)率(正丁醇僅僅18-25%)。由 于產(chǎn)生的正丁醇的毒性，16-24g/l的總?cè)軇舛龋?0-14g/l的正丁醇濃度一般是極限。 然而，這些低的溶劑滴度似乎不再是對(duì)該方法的經(jīng)濟(jì)限制，因?yàn)樽罱呀?jīng)證明在發(fā)酵期間， 可以通過利用“低成本”氣體抽取技術(shù)回收這些溶劑。本發(fā)明要解決的問題是獲得一株沒有乙酸形成的穩(wěn)定的突變株，其可以培養(yǎng)幾代 而沒有任何回復(fù)到野生型基因型的可能性。該菌株可用于通過梭菌的遺傳穩(wěn)定培養(yǎng)物，從 一些廉價(jià)的碳底物如葡萄糖或其他的糖，高產(chǎn)率地生物生產(chǎn)正丁醇。對(duì)于一種工業(yè)可行的 正丁醇生產(chǎn)方法，滅活的生化步驟的數(shù)量，和代謝調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，必須要利用一種代謝工程 化的全細(xì)胞催化劑。發(fā)明概述申請(qǐng)人:已經(jīng)解決了陳述的問題，而且本發(fā)明提供了一種用于通過梭菌的遺傳穩(wěn)定 培養(yǎng)物，把可發(fā)酵的碳源生物轉(zhuǎn)化為正丁醇作為主要產(chǎn)物的方法。葡萄糖用作模式底物，重 組體丙酮丁醇梭菌用作模式宿主。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過中斷編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和/ 或乙酸激酶(Pta和ack)的基因，構(gòu)建不能生產(chǎn)乙酸的穩(wěn)定的重組丙酮丁醇梭菌。另外，通 過中斷編碼丁酸激酶的基因(buk)和/或Ptb基因，構(gòu)建不能代謝丁酰-輔酶A為丁酸的 重組丙酮丁醇梭菌。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過中斷編碼輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因(CtfAB) 和/或乙酰乙酸脫羧酶的基因(adc)，構(gòu)建不能產(chǎn)生丙酮的重組丙酮丁醇梭菌。在本發(fā)明的 一個(gè)進(jìn)一步的方面中，通過中斷編碼乳酸脫氫酶的基因(Idh)，構(gòu)建不能生產(chǎn)乳酸的重組菌 株。在本發(fā)明的最后一個(gè)方面中，通過中斷編碼氫化酶的基因(hydA)，降低氫生產(chǎn)的通量， 然后使還原當(dāng)量的通量改變方向到正丁醇生產(chǎn)。本發(fā)明一般可應(yīng)用于包括容易轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的任何碳底物。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組生物體，其可用于正丁醇的生產(chǎn)，包括 (a)至少中斷涉及乙酸形成的兩個(gè)基因之一，(b)至少中斷涉及把丁酰-輔酶A轉(zhuǎn)化為丁酸 的兩個(gè)基因之一和(c)至少中斷編碼輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的兩個(gè)基因之一。任選地重組生物 體可包括i)在選自以下的內(nèi)源基因中的滅活突變(a)編碼具有乳酸脫氫酶活性的多肽的 基因和(b)削弱編碼具有氫化酶活性的多肽的基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于從重組生物體高產(chǎn)率生產(chǎn)正丁醇的 穩(wěn)定的方法，其包括(a)使本發(fā)明的重組生物體與選自生產(chǎn)正丁醇的單糖，寡糖，多糖和 單碳底物的至少一種碳源接觸；任選地(b)在生產(chǎn)期間回收正丁醇和(c)通過蒸餾從冷凝 液純化正丁醇。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種用于通過在包含碳源的合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，并從該培養(yǎng) 基回收正丁醇來生產(chǎn)正丁醇的方法，其中在該微生物中將涉及乙酸形成的至少一個(gè)基因通 過穩(wěn)定插入外源DNA到所述的至少一個(gè)基因中而中斷。如這里使用的，下列術(shù)語可用于解釋權(quán)利要求書和說明書。術(shù)語“微生物”指所有種類的單細(xì)胞生物，包括原核生物如細(xì)菌，和真核 生物如酵母。優(yōu)選地，微生物選自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，芽胞桿菌科 (Bacillaceae)，鏈霄菌禾斗(Streptomycetaceae)，棒桿菌禾斗(Corynebacteriaceae)，和梭菌科(Clostridiaceae)。更優(yōu)選地，微生物是埃希氏菌屬(Escherichia)，克雷伯氏菌屬 (Klebsiella),泛菌屬(Pantoea),沙門氏菌屬(Salmonella)棒桿菌屬(Corynebacterium) 或梭菌屬(Clostridium)的一個(gè)種。甚至更優(yōu)選地，微生物是丙酮丁醇梭菌?！昂线m的培養(yǎng)基”的表述是指適于所用的微生物的培養(yǎng)基，它是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的。術(shù)語“碳底物”或“碳源”指能被微生物代謝的任何碳源，其中該底物包含至少一 個(gè)碳原子。作者尤其指可再生的，廉價(jià)的且可發(fā)酵的碳源如單糖，寡糖，多糖，單碳底物，和 多元醇如甘油。單碳底物定義為只含有一個(gè)碳原子的碳分子如甲醇?；瘜W(xué)式為(CH2O)n的單糖也稱為糖(oses)或“簡(jiǎn)單的糖”；單糖包括蔗糖，果糖，葡 萄糖，半乳糖和甘露糖。包含超過一個(gè)單糖的其他碳源稱為二糖，三糖，寡糖和多糖。二糖 包括蔗糖(saccharose)(蔗糖(sucrose))，乳糖和麥芽糖。淀粉和半纖維素是多糖，也稱為 “復(fù)合糖”。因此，術(shù)語“碳源”指上面提到的任何產(chǎn)品，及其混合物。術(shù)語“中斷”指穩(wěn)定插入外源DNA到基因中，導(dǎo)致作為該基因的產(chǎn)物的蛋白質(zhì)生產(chǎn) 的滅活。外源DNA優(yōu)選是一個(gè)內(nèi)含子，其大小為適于在連續(xù)世代中提供穩(wěn)定的滅活。專利申請(qǐng)EP 0851940和EP 0941338中精確描述了這種技術(shù)，而且申請(qǐng)人已經(jīng)如 下面的實(shí)施例中所示的使用了該技術(shù)。實(shí)施例中使用的術(shù)語“內(nèi)含子II”，指細(xì)菌可動(dòng)組 π內(nèi)含子(bacterial mobile group II intron)的950bp的序列，其來源于乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis) LL Ltrb 內(nèi)含子。在本發(fā)明的描述中，酶通過它們的特異性活性來鑒定。該定義因此包括在其他的 生物體中，更特別地在其他的微生物中也存在的具有限定的特異性活性的所有多肽。通常， 具有相似活性的酶，可以通過把它們分組到如PFAM或COG所限定的某些家族來鑒定。PFAM(蛋白家族的比對(duì)和隱蔽馬爾科夫模型的數(shù)據(jù)庫(kù)(protein families database of alighments and hidden Markov models) ；http://www. Sanger, ac. uk/ Software/Pfam/)，表示一個(gè)蛋白序列比對(duì)的大集合。每個(gè)PFAM使顯示多重比對(duì)，查看蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，評(píng)估在多種生物體中的分布，登錄其他數(shù)據(jù)庫(kù)，和顯現(xiàn)已知的蛋白結(jié)構(gòu)成為可 能。COGs (蛋白的肓向同源組的簇http //www, ncbi. nlm. nih. rov. COG/)是通過比 較來自代表30個(gè)重要系統(tǒng)發(fā)育系的43個(gè)完全測(cè)序的基因組的蛋白序列而獲得的。每個(gè) COG由至少3個(gè)系限定，其允許鑒定以前的保守結(jié)構(gòu)域。鑒定同源序列和它們的同源性百分?jǐn)?shù)的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且 特別包括BLAST程序，其可以從網(wǎng)址http://www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/使用，使 用該網(wǎng)址中表明的缺省參數(shù)。獲得的序列然后可以被開發(fā)(例如，比對(duì))，使用例如 CLUSTALff (http//www. ebi. ac. uk/clustalw/)或 MULTALIN(http//prodes. toulouse. inra. fr/multalin/cRi-bin/multalin. pi)程序，用那些網(wǎng)頁中表明的缺省參數(shù)。使用GenBank中提供的用于已知基因的參考文獻(xiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定其他生 物體，細(xì)菌菌株，酵母，真菌，哺乳動(dòng)物，植物等等中的同等基因。有利地如下進(jìn)行這種常 規(guī)工作，使用能夠通過與來源于其他微生物的基因進(jìn)行序列比對(duì)來確定的共有序列，并設(shè) 計(jì)簡(jiǎn)并探針來克隆另一個(gè)生物體中相應(yīng)的基因。這些常規(guī)的分子生物學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且在例如 Sambrook 等(Molecular Cloning :a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York, 1989.)中描述。本發(fā)明提供了一種用于發(fā)酵性的分批或連續(xù)生產(chǎn)正丁醇的方法，其通過在包含碳 源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，并從該培養(yǎng)基中回收正丁醇，其中該微生物中至少一個(gè)涉 及乙酸形成的基因被缺失。優(yōu)選地，丁醇的回收與培養(yǎng)是同時(shí)的。本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案提供了一種方法，其中對(duì)微生物進(jìn)行修飾以使其由 于中斷了至少一個(gè)編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Pta)或乙酸激酶(ack)的基因而不能生產(chǎn)乙酸?？梢允褂脤＠暾?qǐng)EP 0851940和EP 0941338中描述的方法中斷梭菌中的基因。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)微生物進(jìn)行修飾以使其不能生產(chǎn)丁酸。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，由于中斷了至少一個(gè)涉及丁酸形成的基因，尤其是選自下列的基因編 碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(Ptb)或丁酸激酶(buk)的基因，微生物不能把丁酰-輔酶A轉(zhuǎn)化為丁酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物不能生產(chǎn)丙酮。優(yōu)選地，在所述微生物中， 中斷微生物中至少一個(gè)涉及丙酮形成的基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種生產(chǎn)丙酮的能力的缺乏，是由于中斷了至少一個(gè) 編碼輔酶A-轉(zhuǎn)移酶(CtfAB)或乙酰乙酸脫羧酶(adc)的基因。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中使用的微生物不能生產(chǎn)乳 酸。特別地，這可能是由于中斷了編碼乳酸脫氫酶的基因ldh。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還提供了一種如上所述的微生物，其具有降低的氫生產(chǎn)通 量，然后還原當(dāng)量通量改變方向到正丁醇生產(chǎn)；這可通過中斷編碼氫化酶(hydA)的基因來 實(shí)現(xiàn)，氫化酶是為以氫生產(chǎn)形式的還原當(dāng)量提供接收者(sink)的酶。根據(jù)本發(fā)明，通過插入內(nèi)含子到基因中來進(jìn)行基因的中斷。優(yōu)選地，使用的微生物選自丙酮丁醇梭菌，拜氏梭菌(C.beijerinckii)，糖多丁醇
(C. saccharoperbutylacetonicum) sKUTSt lif (C. saccharobutylicum)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)是連續(xù)和穩(wěn)定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)通過使所述微生物與選自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖，蔗糖，單糖，寡糖，多糖，纖 維素，木聚糖，淀粉或它的衍生物和甘油的至少一種碳源接觸，發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物，(b)任選地，在發(fā)酵期間回收正丁醇和(c)通過蒸餾從冷凝液分離正丁醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定用于本發(fā)明微生物的培養(yǎng)條件。特別地，將梭菌在20°C到 550C，優(yōu)選25°C到40°C的溫度發(fā)酵，更特定地對(duì)于丙酮丁醇梭菌為大約35°C。—般在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，該發(fā)酵罐中具有適于使用的細(xì)菌的已知明確組成的無 機(jī)培養(yǎng)基，其含有至少一種簡(jiǎn)單的碳源，而且如果必要具有生產(chǎn)代謝產(chǎn)物所需的共底物。本發(fā)明還涉及如前面所述的微生物。優(yōu)選地，這種微生物選自丙酮丁醇梭菌，拜氏 梭菌，糖多丁醇乙酸梭菌或糖丁酸梭菌。附圖簡(jiǎn)述

圖1 用有義方向的內(nèi)含子中斷pta基因的瓊脂糖凝膠。第1列，分子標(biāo)記；第 2列，野生型菌株中的pta擴(kuò)增(603pb)；第3列，通過內(nèi)含子以有義方向中斷的pta基因 (1552pb)。
圖2 用內(nèi)含子以有義方向中斷ptb基因的瓊脂糖凝膠。第1列，分子標(biāo)記；第2 列，通過內(nèi)含子以有義方向中斷的Ptb基因(1588pb)；第3列，空泳道；第4列，野生型菌株 中的Ptb擴(kuò)增(639pb)；第5列，分子標(biāo)記。標(biāo)明了分子標(biāo)記條帶的大小。圖3 用內(nèi)含子以有義方向中斷hydA基因的瓊脂糖凝膠。第1列，通過內(nèi)含子以 有義方向中斷的hydA基因(1438pb)；第2列，野生型菌株中的hydA擴(kuò)增(488pb)；第3列， 分子標(biāo)記。標(biāo)明了分子標(biāo)記條帶的大小。圖4 3個(gè)月期間的HPLC測(cè)定，顯示了培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。
實(shí)施例實(shí)施例1pCONS: :upp-內(nèi)含子載體的構(gòu)建該質(zhì)粒含有在梭菌中有功能的pIM13復(fù)制起點(diǎn)，賦予對(duì)甲砜氯霉素的抗性的catP 基因，II組內(nèi)含子RNP的功能性表達(dá)所需的upp基因和LtrAORF。為了構(gòu)建pCONS內(nèi)含子 載體，我們把LtrA ORF的序列亞克隆到pCONS: :upp載體中。用Xbal和PshAI限制性消化 pACD4 載體(SigmaTrageTron)獲得 LtrA ORF 區(qū)。pS0S95 載體用 BamHI 消化和 SfoI 鈍末 端化以除去丙酮形成基因，同時(shí)留下硫解酶啟動(dòng)子區(qū)域。連接LtrA ORF消化產(chǎn)物和線性化 的PS0S95載體，產(chǎn)生pSOS內(nèi)含子載體。通過NsiI和SapI消化pSOS內(nèi)含子載體以除去硫 解酶啟動(dòng)子和LtrA 0RF。pCONS: upp用SapI消化和鈍末端化。把這些片段連接到一起以 產(chǎn)生pCONS: :upp-內(nèi)含子載體。實(shí)施例2pCONS: :upp-內(nèi)含子ack有義和pCONS: :upp-內(nèi)含子ack反義載體的構(gòu)建為了滅活ack基因，如下構(gòu)建了帶有有義或反義內(nèi)含子II插入到ack基因中的菌 株。首先，將計(jì)算機(jī)算法用于確定ack基因中的靶位點(diǎn)。其次，計(jì)算機(jī)算法輸出引物序列(表 1)，其用于利用引物ACKl，ACK2，ACK3和EBS通用引物通過PCR突變(重新靶向)ack有義 內(nèi)含子，或利用引物ACK4，ACK5，ACK6和EBS通用引物通過PCR突變(重新靶向)ack反義 內(nèi)含子。接著，通過BsrGI和HindIII消化突變的350pb PCR片段ack有義或反義內(nèi)含子和 pCONS: :upp-內(nèi)含子載體，然后連接以產(chǎn)生pCONS: :upp-內(nèi)含子ack有義或pCONS: :upp-內(nèi) 含子ack反義。表1:引物序列
權(quán)利要求
一種用于通過在包含碳源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物并從該培養(yǎng)基中回收正丁醇來生產(chǎn)正丁醇的方法，其中在所述微生物中至少一個(gè)涉及乙酸形成的基因通過穩(wěn)定插入外源DNA到所述的至少一個(gè)基因中而被中斷。
2.權(quán)利要求1的方法，其中被中斷的基因是下列基因中的至少一個(gè) -編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的Pta-編碼乙酸激酶的ack。
3.如權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)要求的方法，其中所述微生物經(jīng)修飾而不能生產(chǎn)丁酸。
4.如權(quán)利要求3中要求的方法，其中至少一個(gè)涉及丁酸形成的基因被中斷。
5.權(quán)利要求4的方法，其中被中斷的基因選自以下 -編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶的Ptb-編碼丁酸激酶的buk。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中在所述微生物中至少一個(gè)涉及丙酮形成的基因 被中斷。
7.權(quán)利要求6的方法，其中至少一個(gè)下面的基因被中斷 -編碼輔酶A-轉(zhuǎn)移酶的ctfAB-編碼乙酰_乙酸脫羧酶的adc。
8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物經(jīng)修飾而不能生產(chǎn)乳酸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中Idh基因被中斷。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)要求的方法，其中使氫通量降低，并且使還原力改變方向 到丁醇生產(chǎn)。
11.如權(quán)利要求10中要求的方法，其中hydA基因被中斷。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)要求的方法，其中至少一個(gè)基因通過插入內(nèi)含子到該基 因中而被中斷。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物選自丙酮丁醇梭菌，拜氏梭菌，糖 多丁醇乙酸梭菌或糖丁酸梭菌。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)是連續(xù)和穩(wěn)定的。
15.權(quán)利要求14的方法，包括以下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇的微生物；b)任選地在發(fā)酵期間排出正丁醇；c)通過蒸餾從冷凝液分離正丁醇。
16.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)限定的微生物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從可發(fā)酵的碳源以高產(chǎn)率生物生產(chǎn)正丁醇的方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過使用包含經(jīng)轉(zhuǎn)化而i)消除乙酸途徑ii)消除丁酸途徑iii)消除乳酸途徑和iv)消除丙酮途徑的宿主丙酮丁醇梭菌(C.acetobutlicum)的重組生物體，來實(shí)現(xiàn)把葡萄糖轉(zhuǎn)化成正丁醇的方法。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過中斷氫化酶基因的表達(dá)，來降低氫通量，并使還原力改變方向到正丁醇生產(chǎn)。任選地，產(chǎn)生的正丁醇在發(fā)酵期間通過氣體抽取來排出，并進(jìn)一步通過蒸餾純化。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101935677SQ20091016394
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者菲利普·索卡勒 申請(qǐng)人:代謝探索者公司