一株新的產(chǎn)丁醇菌株及其生產(chǎn)丁醇的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株新的產(chǎn)丁醇的貝氏梭菌，其分類(lèi)命名為貝氏梭菌IT66（ClostridiumbeijerinckiiIT66），保藏編號(hào)為CCTCCMNO：2011404。本發(fā)明還公開(kāi)了上述貝氏梭菌在發(fā)酵生產(chǎn)丁醇中的應(yīng)用。本產(chǎn)品采用恒化器連續(xù)培養(yǎng)、等離子誘變貝氏梭菌IB4，然后經(jīng)刃冬青平板篩選出對(duì)抑制物耐受、還原力強(qiáng)的菌株，該菌株高耐受酸解副產(chǎn)物、高丁醇比、高溶劑產(chǎn)量；未脫毒的玉米芯酸解糖液為碳源時(shí)，在5L發(fā)酵罐中總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到了11.3g/L和9.1g/L，分別比同等條件培養(yǎng)的出發(fā)菌株提高了2.3倍和2.4倍，丁醇比高達(dá)80%，糖轉(zhuǎn)化率為0.32，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株新的產(chǎn)丁醇菌株及其生產(chǎn)丁醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株新的產(chǎn)丁醇的菌株及其生產(chǎn)丁醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著石油資源加速枯竭和價(jià)格飛漲，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇又受到了廣泛的重視，已經(jīng)成為生物能源的研究熱點(diǎn)之一。作為新一代的液體能源，丁醇正在被越來(lái)越多的國(guó)家重視，其具有能量密度大、可直接用于內(nèi)燃機(jī)、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，在能源危機(jī)日益嚴(yán)峻的今天，丁醇作為燃料有著廣闊的發(fā)展前景。
[0003]丙酮丁醇梭菌和貝氏梭菌可直接有效利用玉米等淀粉物質(zhì)或糖蜜等原料，且丁醇生產(chǎn)菌株對(duì)纖維水解液中的葡萄糖和木糖都有較高的利用效率。以纖維素原料生產(chǎn)丁醇具有優(yōu)勢(shì)，但纖維素原料處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定量的酸類(lèi)、醛類(lèi)、木質(zhì)素衍生物等副產(chǎn)物。水解液中含有乙酸、甲酸、醛類(lèi)物質(zhì)(糠醛和HMF)、酚類(lèi)物質(zhì)(阿魏酸、香豆酸、丁香醛、香草醛)等，這些物質(zhì)通過(guò)破壞H+離子梯度、抑制發(fā)酵過(guò)程中酶的活性、破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、改變滲透性等方式抑制丁醇發(fā)酵的正常進(jìn)行。
[0004]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇的研究很多，主要圍繞著菌種誘變選育、纖維原料糖液的制備、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化和溶劑提取等發(fā)面進(jìn)行。
[0005]Mermelstein 等(Biotechnology and Bioengineering.1993, 42: 1053 ~1060)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了重組菌株，丁醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株Clostridiumnacetobutylicum ATCC 824 提高了 37%。 Nasib Qureshi 等(Biomass and Bioenergy.2008，32: 176-183)利用貝氏梭菌P260，在小麥秸桿中加入纖維素酶、木聚糖酶等進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，經(jīng)過(guò)533小時(shí)的連續(xù)發(fā)酵,其溶劑的產(chǎn)率為0.41。Annous等(Appl.Environ.Microbiol.1991，57: 2544-2548)利用化學(xué)誘變，得到了超級(jí)菌株BA101，單批發(fā)酵總?cè)軇┳罡呖蛇_(dá) 25 g/L 以上；Tha`ddeus Ezeji 等(Bioresource Technology.2008, 99:5915-5922)利用突變株BA101，以XAD-4 resin脫毒的玉米芯酸解和酶解糖液為底物發(fā)酵，總?cè)軇┊a(chǎn)量為9.30 g/L，但其不能利用未脫毒的酸解和酶解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇。木質(zhì)纖維原料經(jīng)稀酸處理后，會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、糠醛、酚類(lèi)等抑制物，這些抑制物的除去成本較高、并對(duì)微生物生長(zhǎng)有一定的抑制作用；Guo等(J Ind Microbiol Biotechnol, 2012, 99 (3)，401-407.)利用離子束誘變，得到了一株能利用未脫毒玉米芯酸解糖液的丁醇生產(chǎn)菌株Clostridium beijerinckii IB4 (本專(zhuān)利的出發(fā)菌株),利用毒素總酹約為1.4g/L的水解液得到產(chǎn)丁醇和總?cè)軇┓謩e為6.8g/L和9.5g/L。。
[0006]可見(jiàn)，木質(zhì)纖維原料中的毒素抑制物嚴(yán)重抑制產(chǎn)丁醇梭菌的發(fā)酵性能；而菌種改良是提高菌株對(duì)抑制物的耐受性、發(fā)酵經(jīng)濟(jì)性的關(guān)鍵手段之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的第一目的是提供一株新的產(chǎn)丁醇的菌株。[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述菌株生產(chǎn)丁醇的方法。
[0009]一、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一株新的產(chǎn)丁醇的菌株，其分類(lèi)命名為貝氏梭菌IT66 {Clostridium beijerinckiiIT66)，已于2011年11月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào):CCTCC MNO:2011404。[0010]上述貝氏梭菌IT66的獲取方法，是以貝氏梭菌IB4為出發(fā)菌株經(jīng)恒化器連續(xù)培養(yǎng)裝置，等離子誘變，再利用含有酚類(lèi)等抑制物的刃天青平板篩選得到對(duì)抑制物耐受性高、還原力強(qiáng)的菌株，最后以未脫毒的玉米芯酸解糖液(本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)文章發(fā)表，J Ind MicrobiolBiotechnol, 2012，99 (3)，401-407.)為底物，經(jīng)厭氧發(fā)酵篩選獲得高耐受纖維酸解副產(chǎn)物、高產(chǎn)溶劑的貝氏梭菌目標(biāo)菌株。
[0011]具體地說(shuō)，所述貝氏梭菌IT66的獲取方法包括如下步驟:
a)連續(xù)培養(yǎng)馴化誘變:將貝氏梭菌原始菌株IB4活化培養(yǎng)，33~37°C培養(yǎng)，在25mL的厭氧瓶裝液量為10~15mL，培養(yǎng)時(shí)間12~18 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，接入含有新鮮培養(yǎng)基的自制連續(xù)培養(yǎng)裝置中連續(xù)培養(yǎng)，接種量為5%~15% (v/v)0以纖維酸解副產(chǎn)物為限制因子加TPC培養(yǎng)450~600 h，初步篩選到耐纖維酸解副產(chǎn)物的貝氏梭菌菌株；
b)等離子體誘變:將恒化器連續(xù)培養(yǎng)裝置(本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)在先專(zhuān)利申請(qǐng)，專(zhuān)利申請(qǐng)
【發(fā)明者】姜岷, 賀愛(ài)永, 尹春燕, 孔祥平, 陳佳楠, 馬江鋒, 韋萍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)