天冬氨酸激酶iii突變體及其宿主細胞和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種天冬氨酸激酶，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在對應于SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸殘基為非天冬氨酸。本發(fā)明的天冬氨酸激酶能高效解除L-賴氨酸的反饋抑制，并且能有效用于生產L-賴氨酸。本發(fā)明還提供包含編碼所述天冬氨酸激酶的基因的宿主細胞以及利用所述宿主細胞或天冬氨酸激酶產生L-賴氨酸的方法。本發(fā)明的天冬氨酸激酶或包含本發(fā)明天冬氨酸激酶的宿主細胞還用于產生L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸。本發(fā)明還提供利用所述天冬氨酸激酶或宿主細胞產生L-天冬氨酰-4-基磷酸的方法。
【專利說明】天冬氨酸激酶111突變體及其宿主細胞和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】。具體地說，本發(fā)明涉及天冬氨酸激酶III (簡稱AKIII，又稱LysC)的突變體及其應用。
【背景技術】
[0002]L-賴氨酸是人類和動物營養(yǎng)中最重要的必需氨基酸，在食品工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和飼料工業(yè)中有著十分重要的地位。近年來，其市場需求穩(wěn)步增加，世界市場銷售量已經突破百萬噸規(guī)模。目前，賴氨酸主要采用微生物發(fā)酵法來生產。
[0003]在許多微生物中L-賴氨酸的合成途徑是以天冬氨酸為前體的，包括兩步和甲硫氨酸和蘇氨酸等氨基酸共用的步驟。在大腸桿菌中，L-賴氨酸生物合成途徑經過九步的酶催化過程(如下式所示)。其中，天冬氨酸激酶催化賴氨酸生物合成的第一步反應，是賴氨酸生產的限速步驟，它的活力決定著代謝流流向L-賴氨酸合成途徑的比例。在大腸桿菌中有三個天冬氨酸激酶，分別命名為天冬氨酸激酶I (AK I，由thrA基因編碼)、天冬氨酸激酶IKAK II，由metL基因編碼)、天冬氨酸激酶III (AK III，由IysC基因編碼，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)。AK I和AK II是雙功能酶，都還具有高絲氨酸脫氫酶活性。AK I在酶活性水平受到蘇氨酸和賴氨酸的反饋抑制，AK III在酶活性水平受終產物賴氨酸的反饋抑制(Bearer CF, Neet KE ；Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., Robichon-Szulmajster, H.(1961)."Feed-back Inhibitionand Repression of Aspartokinase Activity in Escherichia coli and Saccharomycescerevisiae.〃J.Biol.Chem.)。AK II在酶活水平不受天冬氨酸家族氨基酸的反饋抑制但是受到轉錄水平嚴謹調控(X D`ong, PJ Quinn, X Wang.(2011).“Metabolic engineeringof Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production ofL-threonine.，’Biotechnology advances)D
[0004]
【權利要求】
1.一種天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在對應于SEQ IDN0:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸殘基為非天冬氨酸。
2.編碼權利要求1所述天冬氨酸激酶的基因。
3.包含權利要求2所述編碼基因的載體。
4.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求2所述編碼基因。
5.權利要求4所述宿主細胞在生產L-氨基酸中的應用。
6.一種制備L-氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a.培養(yǎng)權利要求4所述的宿主細胞，使之產生L-氨基酸；和 b.從培養(yǎng)液中分離L-氨基酸。
7.權利要求1所述天冬氨酸激酶在生產L-氨基酸中的應用。
8.如權利要求5-7所述的應用或方法，其特征在于，所述的L-氨基酸為L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸。
9.一種制備L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a.利用權利要求1所述的天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)，催化從L-天冬氨酸生成L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸過程中的以下反應，進而獲得L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸，
10.制備權利要求1所述天冬氨酸激酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a.改造SEQID N0:2所示氨基酸序列的編碼序列，使得編碼的氨基酸序列中對應于SEQID N0:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸殘基突變?yōu)榉翘於彼幔? b.將a得到的編碼序列直接轉染合適的宿主細胞或經載體引入合適的宿主細胞； c.培養(yǎng)b得到的宿主細胞； d.從步驟c得到的培養(yǎng)體系中分離所述宿主細胞產生的天冬氨酸激酶；和 e.測定所述天冬氨酸激酶解除賴氨酸反饋抑制的能力。
11.改造野生型天冬氨酸激酶使之解除賴氨酸反饋抑制的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a.將野生型天冬氨酸激酶的氨基酸序列與SEQID N0:2所示氨基酸序列作比對；和 b.改造所述野生型天冬氨酸激酶的編碼序列，使得編碼的氨基酸序列中對應于SEQIDN0:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸殘基突變?yōu)榉翘於彼幔? c.將b得到的編碼序列直接轉染合適的宿主細胞或經載體引入合適的宿主細胞； d.培養(yǎng)c得到的宿主細胞； e.從步驟d得到的培養(yǎng)體系中分離所述宿主細胞產生的天冬氨酸激酶；和 f.測定所述天冬氨酸激酶解除賴氨酸反饋抑制的能力。
【文檔編號】C12N15/54GK103773745SQ201210398902
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優(yōu)先權日:2012年10月18日
【發(fā)明者】岳國君, 孫際賓, 鄭平, 劉嬌, 李慶剛, 夏令和, 周永生, 羅虎, 周勇, 滿云, 盧宗梅, 馬延和 申請人:中糧生物化學（安徽）股份有限公司, 天津工業(yè)生物技術研究所