專利名稱：一種酵母蔗糖酶的化學修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學、生物化學和酶工程等學科的交叉技術(shù)領(lǐng)域， 更具體地說涉及一種蔗糖酶的化學修飾方法。
背景技術(shù)：
利用大分子或小分子修飾劑對酶分子的側(cè)鏈進行改造，以獲得具 有臨床和工業(yè)應(yīng)用價值的酶蛋白，是目前應(yīng)用最廣泛的酶化學修飾技 術(shù)。
當前修飾技術(shù)中被廣泛應(yīng)用的小分子化合物有氨基葡萄糖、乙酸 酐、硬脂酸、鄰苯二酸酐等，如環(huán)糊精轉(zhuǎn)糖基酶經(jīng)丁二酸酐修飾后，
其環(huán)化、偶合和水解的活性降低，而歧化活性卻提高了30%。 D-葡糖 胺與未糖基化的RNase A進行化學偶聯(lián)，得到單糖基化酶和雙糖基化 酶，其中53位的天冬氨酸和49位的谷氨酸被認為可能是糖基化位點， 經(jīng)過修飾的單糖基化RNase A活力比天然酶低，但是熱穩(wěn)定性大大提 高。
大分子化合物對酶分子的化學修飾是目前國際上酶工程的研究 熱點之一。大分子化合物如聚乙二醇、羧甲基纖維素、右旋糖酐等對 酶蛋白表面進行修飾，可以降低酶的免疫原性和增加酶的熱穩(wěn)定性。 一般而言，化學修飾可以快速改變酶分子的酶學、理化特性及其醫(yī)學 性質(zhì)，因而有著重要的應(yīng)用研究價值。
然而在實際應(yīng)用中，由于大分子化學修飾的隨機性，修飾后往往
會降低酶的催化活性和穩(wěn)定性。也就是說現(xiàn)有技術(shù)對酶進行化學修飾 后修飾酶存在缺陷要么穩(wěn)定性有所提高但催化活性急劇下降；要么 催化活性有所提高但穩(wěn)定性直線下降。因此尋找科學的方法同時提高 修飾酶的活性和穩(wěn)定性是大分子化合物修飾酶分子技術(shù)的重點和難占。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對酶蛋白經(jīng)大分子化合 物修飾后往往酶活性降低的缺陷，提供了 一種利用大分子化合物對酵 母蔗糖酶進行化學修飾的方法，合理的設(shè)計了修飾的步驟和條件，修 飾產(chǎn)物的催化活性大幅度提高且穩(wěn)定性有所增加，可以在常溫常壓下 發(fā)揮其高效催化性能。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種酵母蔗糖酶的化學修飾方法，包括 以下步驟
(1) 酵母蔗糖酶的活化；
(2) 采用多糖類大分子作為修飾劑對活化酵母蔗糖酶進行修飾。
步驟(1)所述酵母蔗糖酶的活化包括以下步驟
(a) 酵母蔗糖酶溶于緩沖液中并定容，使酵母蔗糖酶濃度為5 mg/ mL ，加入與定容后體積相等的高碘酸鈉水溶液；
(b) 在上述(1)體系中以酵母蔗糖酶底物二l: 20 100的比
例加入保護底物；
(c) 將上述(2)體系置于0 7(TC培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)0.5 4小時
后，加入乙二醇，迅速混勻后靜置2小時，對0. lmol/L緩沖液透析
過夜，得到活化的蔗糖酶。
上述步驟(a)所述高碘酸鈉水溶液的濃度為10 80 mg/mL。 步驟(2)所述活化酵母蔗糖酶的修飾包括以下步驟
(d) 活化后的蔗糖酶中加入與活化步驟中等質(zhì)量的底物進行保 護；加入溶于pH 8.0緩沖液中的修飾劑溶液，置于0 7(TC下攪拌 反應(yīng)O. 5 48小時；
(e) 在不斷攪拌的條件下往(1)中加入NaBH4水溶液，持續(xù)攪 拌4小時后，對0.1mol/L緩沖液透析過夜，得到修飾的蔗糖酶。
上述步驟(e)所述NaBH4的用量為與酵母蔗糖酶的比例為5: 8 16，濃度為40 80mg /mL蒸餾水。
本發(fā)明所述緩沖液為醋酸緩沖液，濃度為O. lmol/L， pH范圍為 2. 0 10.0。
所述底物為蔗糖。
步驟(d)所述修飾劑與酵母蔗糖酶的比例為5: 2 16，濃度為 5 40mg修飾劑/mL緩沖液。
所述修飾劑為分子量為3000 18000的殼聚糖。
本發(fā)明的有益效果是 (1)本發(fā)明針對天然酵母蔗糖酶催化活性低、穩(wěn)定性差等問題， 用一種大分子化合物對天然酶進行化學修飾后得到催化活性大大提 高而穩(wěn)定性也有所提高的修飾產(chǎn)物，修飾產(chǎn)物的催化活性大幅度提高 且穩(wěn)定性有所增加，可以在常溫常壓下發(fā)揮其高效催化性能等優(yōu)點。(2) 本發(fā)明所采用的大分子化學修飾劑具有原料豐富，修飾條 件溫和，降低酵母蔗糖酶在工業(yè)應(yīng)用上的生產(chǎn)成本，拓寬其應(yīng)用，具 有重要的應(yīng)用價值。
(3) 本發(fā)明方法簡單易行，技術(shù)成熟，容易推廣。


圖1修飾酶的pH-酶活性試驗結(jié)果
圖2天然酶和修飾酶的溫度-酶活性試驗結(jié)果
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明采用一種 大分子化合物對天然酶進行化學修飾后得到催化活性大大提高而穩(wěn) 定性也有所提高的修飾產(chǎn)物，下述實施例所給出的具體數(shù)據(jù)用以說明 本發(fā)明思想，本申請人所做大量的實施例不能在實施例中 一一贅述， 但并不因此限定本發(fā)明的范圍。實施例中所用試劑與儀器均為市購的 常規(guī)產(chǎn)品，參照常規(guī)的實驗室常規(guī)即可。 實施例1 (1)酵母蔗糖酶的活化；
(a) 稱取25mg酵母蔗糖酶溶于0. lmol/L pH 7.0的緩沖液中 并定容至5mL，加入含50mg高碘酸鈉的高碘酸鈉水溶液5mL;
(b) 在(a)制備的體系中加入2. 5g底物對酵母蔗糖酶進行保
護；
(c) 將(b)步制備的體系置于4(TC的培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)2小時后， 加入800 u L乙二醇，迅速混勻后靜置2小時，對2. 5L 0. lmol/L pH7. 0緩沖液透析過夜，得到活化的蔗糖酶。 (2 )采用多糖類大分子作為修飾劑對活化酵母蔗糖酶進行修飾。
(d) 經(jīng)步驟(1)活化后的蔗糖酶中加入2.5g底物進行保護； 加入溶于2mL pH 4.0緩沖液中的10mg殼聚糖，殼聚糖的分子量為 10000，置于40。C下攪拌反應(yīng)24小時。
(e) 將80mgNaBH4溶于lmL蒸餾水，在不斷攪拌的條件下，將 (d)步驟制備的體系加入NaBH4溶液，持續(xù)攪拌4小時后，對2.5L
0. lmol/L pH 7.0緩沖液透析過夜。得到化學修飾的蔗糖酶。
酶活性的定義酶催化蔗糖水解的反應(yīng)在5(TC， pH5.0的條件進
行時，每毫克蛋白質(zhì)在1分鐘內(nèi)每催化蔗糖水解產(chǎn)生1微克還原糖定
義為l個酶活性單位(U)。
實驗結(jié)果天然蔗糖酶活力為46362 U/mg Pro,修飾后蔗糖酶
活力為57786 U/mg Pro，修飾酶的活力是天然酶的1. 25倍。天然酶
和修飾酶的pH-酶活性試驗結(jié)果見附圖l，其中曲線1為修飾酶的pH-
酶活性實驗結(jié)果，曲線2為天然酶的pH-酶活性實驗結(jié)果。
實施例2 (1)酵母蔗糖酶的活化；
(a) 稱取25mg酵母蔗糖酶溶于0. lmol/L pH 7.0的緩沖液中 并定容至5mL，加入含100mg高碘酸鈉的高碘酸鈉水溶液5mL;
(b) 在(a)制備的體系中加入lg底物對酵母蔗糖酶進行保護；
(c) 將(b)步制備的體系置于70。C的培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)0.5小時 后，加入800 u L乙二醇，迅速混勻后靜置2小時，對2. 5L 0. lmol/L
pH 7.0緩沖液透析過夜，得到活化的蔗糖酶。 (2 )采用多糖類大分子作為修飾劑對活化酵母蔗糖酶進行修飾。
(d) 經(jīng)步驟(1)活化后的蔗糖酶中加入lg底物進行保護；加 入溶于2mL pH 4. 0緩沖液中的10mg殼聚糖，殼聚糖的分子量為18000， 置于7(TC下攪拌反應(yīng)0. 5小時。
(e) 將100mg NaBH4溶于2. 5mL蒸餾水，在不斷攪拌的條件下， 將(d)步驟制備的體系加入NaBEt溶液，持續(xù)攪拌4小時后，對2. 5L 0. lmol/L pH 7.0緩沖液透析過夜。得到化學修飾的蔗糖酶。 實施例3
(1) 酵母蔗糖酶的活化；
(a) 稱取25mg酵母蔗糖酶溶于0. lmol/L pH 8.0的緩沖液中 并定容至5mL，加入含400mg高碘酸鈉的高碘酸鈉水溶液5mL;
(b) 在(a)制備的體系中加入0. 5g底物對酵母蔗糖酶進行保
護；
(c) 將(b)步制備的上述體系置于0。C的培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)1小時 后，加入800yL乙二醇，迅速混勻后靜置2小時，對2. 5L 0. lmol/L pH 8.0緩沖液透析過夜，得到活化的蔗糖酶。
(2) 采用多糖類大分子作為修飾劑對活化酵母蔗糖酶進行修飾。
(d) 經(jīng)步驟(1)活化后的蔗糖酶中加入5g底物進行保護；加 入10ing溶于2mL pH 4. 0緩沖液中的殼聚糖(分子量2000)溶液， 置于0。C下攪拌反應(yīng)24小時。
(e) 在不斷攪拌的條件下加入溶于lmL蒸餾水的80mg NaBH4，持續(xù)攪拌4小時后，對2. 5L 0. lmol/L pH 8. 0緩沖液透析過夜，得 到化學修飾的蔗糖酶。
酶活性的定義酶催化蔗糖水解的反應(yīng)在5(TC， pH5.0的條件進 行時，每毫克蛋白質(zhì)在1分鐘內(nèi)每催化蔗糖水解產(chǎn)生1微克還原糖定 義為1個酶活性單位(U)。
實驗結(jié)果天然蔗糖酶活力為46362 U/mg Pro，修飾后蔗糖酶 活力為49162 U/mg Pro,修飾酶的活力是天然酶的L 06倍。天然酶 和修飾酶的溫度-酶活性試驗結(jié)果見附圖2，其中曲線3為修飾酶的 溫度-酶活性實驗結(jié)果，曲線4為天然酶的溫度-酶活性實驗結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一種酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特征在于包括以下步驟(1)酵母蔗糖酶的活化；(2)采用多糖類大分子作為修飾劑對活化酵母蔗糖酶進行修飾。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特征在 于步驟(1)所述酵母蔗糖酶的活化包括以下步驟(a) 酵母蔗糖酶溶于緩沖液中并定容，酵母蔗糖酶濃度為5mg/ mL ，加入與定容后體積相等的高碘酸鈉水溶液；(b) 在上述(a)體系中以酵母蔗糖酶底物=1: 20 100的比 例加入保護底物；(c) 將上述(b)體系置于0 70。C培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)0.5 4小時 后，加入乙二醇，迅速混勻后靜置2小時，對0. lmol/L緩沖液透析 過夜，得到活化的蔗糖酶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特征在 于步驟(a)所述高碘酸鈉水溶液的濃度為10 80 rag/mL。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特征在 于步驟(2)所述活化酵母蔗糖酶的修飾包括以下步驟(d) 活化后的蔗糖酶中加入與活化步驟中等質(zhì)量的底物進行保 護；加入溶于pH 8.0的緩沖液的修飾劑溶液，置于0 7(TC下攪拌 反應(yīng)O. 5 48小時；(e) 在不斷攪拌的條件下向(1)中加入NaBH4水溶液，持續(xù)攪 拌4小時后，對0. lmol/L緩沖液透析過夜，得到修飾的蔗糖酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特征在 于步驟(e)所述NaBH4的用量為與酵母蔗糖酶的比例為5: 8 16， 濃度為40 80mg /niL蒸餾水。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特 征在于所述緩沖液為醋酸緩沖液，濃度為0. lmol/L， pH范圍為2. 0 10.0。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特 征在于所述底物為蔗糖。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特 征在于所述修飾劑與酵母蔗糖酶的用量重量比為5: 2 16，修飾劑 的濃度為5 40mg修飾劑/mL緩沖液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述酵母蔗糖酶的化學修飾方法，其特征在 于所述修飾劑為分子量為2000 18000的殼聚糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母蔗糖酶的化學修飾方法，包括酵母蔗糖酶的活化和采用多糖類大分子作為修飾劑對活化酵母蔗糖酶進行修飾等步驟，本發(fā)明優(yōu)化了酵母蔗糖酶的修飾步驟和條件，得到了酶活性提高了1.5倍以上的修飾產(chǎn)物，其耐酸性和耐熱性同時得到提高，對部分有機溶劑和變性劑尿素的抗性有所增加，克服了現(xiàn)有技術(shù)對酶進行化學修飾后修飾酶存在的穩(wěn)定性和催化活性不能同時得到提高的技術(shù)缺陷，具有很高的應(yīng)用于推廣價值。
文檔編號C12N9/96GK101353653SQ200810029089
公開日2009年1月28日 申請日期2008年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者伍志權(quán), 初志戰(zhàn), 巫光宏, 李姣清, 霞 王, 黃卓烈, 黎春怡 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學