專利名稱：：用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備抗人乳頭瘤病毒18型感染的疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備重組人乳頭瘤病毒18型L1蛋白及用該L1蛋白制備抗人乳頭瘤病毒18型感染的疫苗的方法。
背景技術(shù)：
：人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一個(gè)無包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒。HPV可通過人體間的密切接觸傳播，引起被感染者的皮膚出現(xiàn)尋常疣和肛門生殖器尖銳濕疣等病變，被列為性傳播疾病。1995年，國際癌癥研究中心公布的研究結(jié)果證實(shí)，HPV與宮頸癌有密切的因果關(guān)系。由此可見，HPV感染已成為嚴(yán)重危害人類健康的病原體。因此，研制高效、廉價(jià)的HPV疫苗，對于預(yù)防女性宮頸癌和HPV感染所引起的性傳播疾病具有十分重要的意義。根據(jù)HPV亞型與女性生殖道惡性腫瘤的關(guān)系，將HPV分為低危型和高危型。HPV6、11、34、40、42等型別多見于良性宮頸病變?nèi)鐚m頸濕疣及宮頸上皮輕度不典型性增生病變中，屬HPV低危型；而宮頸上皮重度不典型增生及宮頸癌中以HPV16、18、31、33、35、39、45型感染更為多見，這些亞型為高危型。不同人群中一系列的研究已證實(shí)生殖道的HPV16、18型感染與宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)，較其他危險(xiǎn)因素更密切。因此HPV16、18型的疫苗的開發(fā)將能夠有效的預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。HPV是一種DNA病毒，直徑約為4555nm，呈球形，無包膜，衣殼為由72個(gè)殼微粒組成對稱偏斜的20面體。其病毒顆粒衣殼由主要衣殼蛋白(Ll)和次要衣殼蛋白(L2)組成。主要衣殼蛋白L1在細(xì)胞中表達(dá)后能自動(dòng)組裝成衣殼顆粒，稱為病毒樣顆粒(VLPs)，該顆粒與天然病毒有相似的空間構(gòu)象、免疫特性和生物學(xué)活性，并可以大規(guī)模制備和純化，因而基于Ll衣殼蛋白的VLP預(yù)防性疫苗的開發(fā)成為目前HPV疫苗研究的主要方向。目前，Merck公司的預(yù)防型HPV四價(jià)疫苗(商品名Gardasil)已經(jīng)上市。該疫苗為釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)的HPV16+18+6+11Ll蛋白，臨床實(shí)驗(yàn)表明Merck疫苗在預(yù)防16型、18型、6型(6a和6b)、ll型HPV感染的有效率接近100%。GlaxoSmithKline公司的預(yù)防型HPV雙價(jià)疫苗(商品名為Cervarix，昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HPV16+18L1蛋白)也己經(jīng)進(jìn)入FDA審批階段，已獲準(zhǔn)在澳大利亞、歐盟、菲律賓、阿聯(lián)酋等地上市。畢赤酵母(i^/2/"/7wton^)表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、易于培養(yǎng)、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，還具有原核生物表達(dá)系統(tǒng)所不具有的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點(diǎn)，如糖基化、蛋白磷酸化等。同時(shí)它還避免了釀酒酵母分泌效率差、表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷。畢赤酵母中加到外源蛋白每條側(cè)鏈的平均長度為8~14個(gè)甘露糖殘基，較之釀酒酵母每條側(cè)鏈平均50-150甘露糖殘基要短得多。專利CN1869215A公開了一種利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備人乳頭瘤病毒的病毒樣顆粒的方法，分別將用PCR擴(kuò)增宮頸癌病理組織標(biāo)本得到的編碼人乳頭瘤病毒晚期蛋白的基因克隆到畢赤酵母分泌表達(dá)載體中，構(gòu)建重組畢赤酵母細(xì)胞；利用重組畢赤酵母細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)Ll蛋白，培養(yǎng)上清經(jīng)純化后，所得L1蛋白可自組裝成病毒樣顆粒，但該文獻(xiàn)未公開該根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性合成的HPVL1基因的核苷酸序列以及重組L1蛋白的活性。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要解決的問題就是提供一種表達(dá)量高的用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備重組人乳頭瘤病毒18型L1(HPV18L1)蛋白的方法。本發(fā)明還要解決的問題是提供用所述重組HPV18Ll蛋白制備抗HPV18感染的疫苗的4方法，制得的疫苗具有較佳活性。本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，成功的建立了用優(yōu)化密碼子的基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高量表達(dá)病毒樣顆粒和制備抗人乳頭瘤病毒18型疫苗的技術(shù)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。首先，本發(fā)明人經(jīng)過仔細(xì)的研究，設(shè)計(jì)了適用畢赤酵母偏好密碼子的人乳頭瘤病毒18型基因的核苷酸序列。遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。畢赤酵母和人的基因?qū)γ艽a子的利用有各自的偏愛。由于遺傳密碼是簡并的，每個(gè)氨基酸都由一個(gè)以上的密碼子編碼，同一氨基酸的密碼子在野生型的基因中的使用頻率是不同的。畢赤酵母的密碼子偏好可能導(dǎo)致重組蛋白低的翻譯效率和表達(dá)水平。由于現(xiàn)有技術(shù)中，N端缺失61個(gè)氨基酸的編碼核苷酸序列的截短型HPV18Ll基因更有利于在重組載體中進(jìn)行表達(dá)，故本發(fā)明人對野生型的全長HPV18L1基因(GenebankAAP20601)以及上述截短型HPV18L1基因(GenebankAAQ92369)進(jìn)行改造對其所有的氨基酸全部采用使用頻率最高的密碼子。Pichia酵母密碼子使用頻率見表1，該數(shù)據(jù)來源為http:〃www.kazusa.or.jp/codon/。然后在此基礎(chǔ)上，又為了避免翻譯出來的mRNA的GC比例過高，mRNA的二級結(jié)構(gòu)影響翻譯的效率和一些常用的酶切位點(diǎn)，本發(fā)明人對最高頻率的密碼子進(jìn)行一定的修正。由此，本發(fā)明人優(yōu)化設(shè)計(jì)出若干種適于畢赤酵母表達(dá)的HPV18Ll基因的核苷酸序列，按照所述的序列全合成了全長及該基因的截短型HPV18L1基因，將其克隆到現(xiàn)有畢赤酵母表達(dá)載體中，通過同源重組及高濃度抗生素的篩選構(gòu)建重組畢赤酵母表達(dá)菌株；利用重組畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)胞內(nèi)表達(dá)HPV18Ll蛋白。從中篩選出6種全新的HPV18Ll基因的核苷酸序列，可在畢赤酵母中高表達(dá)HPV18Ll蛋白，并在胞內(nèi)同時(shí)形成病毒樣顆粒(VLPs)，破菌上清經(jīng)過層析方法純化后，純化的病毒樣顆粒純度大于90%，吸附鋁佐劑后，具有極高的免疫原性，可作為人用預(yù)防宮頸癌的疫苗。這些優(yōu)化設(shè)計(jì)的全長HPV18Ll基因的核苷酸序列如SEQIDNO.l、SEQIDNO.25或SEQIDNO.3所示，其相應(yīng)的截短型HPV18LI基因的核苷酸序列如SEQIDN0.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示。表1Pichia酵母密碼子表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>然后，本發(fā)明利用上述6種全新的適于畢赤酵母表達(dá)的全長或截短型HPV18L1基因的核苷酸序列，可以采用現(xiàn)有常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了基因工程菌，并發(fā)酵培養(yǎng)工程菌，分離純化得到重組的HPV18L1蛋白。其中，本發(fā)明基因工程菌的構(gòu)建方法根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性，全基因合成上述優(yōu)化設(shè)計(jì)的全長或截短型病毒HPV18衣殼蛋白L1基因，克隆至畢赤酵母表達(dá)載體中，所用的表達(dá)載體選自pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pA0815等現(xiàn)有常用的畢赤酵母表達(dá)載體，將含HPV18L1基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌株，通過篩選獲得重組畢赤酵母工程菌，轉(zhuǎn)化方法可用電轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，所用的宿主酵母菌選自現(xiàn)常用的畢赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168等菌株。本發(fā)明基因工程菌的發(fā)酵方法將本發(fā)明基因工程菌接入活化培養(yǎng)基(YPD或LB或SOC)，2537r培養(yǎng)過夜。將鏡檢合格的活化液接入種子培養(yǎng)基(YPD或LB或SOC)，2537°C培養(yǎng)過夜。鏡檢無雜菌污染。按一定比例接種。發(fā)酵用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(BSM1或BSM2或BSM3)，發(fā)酵溫度為2037°C,初始pH38，添加痕量鹽類(PTM1、PTM2、PTM3)。初始增殖階段大約1530小時(shí)，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓等維持溶氧值2080%。當(dāng)碳源消耗完畢時(shí)，菌體濕重達(dá)到約50150g/L。補(bǔ)加甘油或葡萄糖溶液。維持溶氧值2080%。補(bǔ)加一定時(shí)間，菌體濕重約50500g/L時(shí)，停止補(bǔ)料。同時(shí)將pH值控制調(diào)為38，開始加入甲醇誘導(dǎo)。維持溶氧值高于2080%，溫度維持在2037。C，pH值控制為38。每210小時(shí)取一次樣，WesternBlot檢測。誘導(dǎo)590小時(shí)發(fā)酵結(jié)束，放出發(fā)酵液。用冷凍離心機(jī)離心發(fā)酵液后收集菌體。收獲的菌體在-20'C凍存。誘導(dǎo)表達(dá)的HPV18Ll蛋白，可在在畢赤酵母體內(nèi)自組裝成病毒樣顆粒(HPV18LlVLPs)。本發(fā)明純化HPV18LlVLPs的方法7取-2(TC冷凍的表達(dá)目的蛋白的菌體，通過中性緩沖鹽溶液或純化水解凍并清洗菌體，去除其中的培養(yǎng)基成分(鹽、色素等)，減少對后期純化的影響。經(jīng)過清洗后的菌體，使用適當(dāng)?shù)暮幸欢}濃度和表面活性劑成分的破菌緩沖液混合可使用的鹽成分有NaCl、KC1等，濃度范圍在0.4~0.8mol/l左右；可使用的表面活性劑有Tween-80、Tween-20、Triton-X100等，濃度范圍在0.005-0.05%(w/v)左右，可使用的緩沖系統(tǒng)有磷酸鹽緩沖、Tris緩沖液、MOPS緩沖液、HEPES緩沖液等，使用濃度范圍在0.02~0.2mol/l左右?；旌虾蟮木w可以通過高壓均質(zhì)機(jī)或珠磨勻漿機(jī)等設(shè)備進(jìn)行破壁，高壓均質(zhì)機(jī)使用破菌的壓力范圍8002000Bar左右，破碎循環(huán)2~4遍可至破菌率>90%，珠磨勻漿機(jī)選用珠體直徑0.20.4mm，珠體的裝量控制在70%~90%左右，循環(huán)12遍可至破菌率>80%以上。將破碎后的菌液通過高速離心或者切向流微濾的方法分離沉淀和上清，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速控制在6000~10000rpm(SORVALL、HITACHI等)，離心時(shí)間20~60分鐘，切向流微濾可使用0.45~0.65um的膜包(Millipore，PALL等)收集上清用于后期純化。經(jīng)過澄清后的上清，可以先經(jīng)過陰離子交換層析柱如QSephroseFlastFlow(GE)或DEAESephroseFastFlow(GE)去除上清中部分雜質(zhì)如DNA、雜蛋白和RNA等，然后再進(jìn)行后期純化過程；也可以用澄清細(xì)胞上清直接進(jìn)行后期純化。后期純化先將上清樣品上樣于可吸附HPV18LlVLPs的層析介質(zhì)上如SPSepharoseFF、HeparinS印haroseCL國6B(GE)、Poros50HS(Merk)及Fractogel@EMDTMAE-650(Merck)等，HPV18LlVLPs蛋白有效結(jié)合于上述層析介質(zhì)上，并通過一定的鹽濃度梯度(如0.51.0MNaCl或KCl緩沖溶液)洗脫，將雜質(zhì)與HPV18LlVLPs蛋白分離，用含高鹽(如1.0~2.0mol/lNaCl或KC1緩沖溶液)的緩沖溶液洗脫結(jié)合的HPV18LlVLPs蛋白，收集洗脫的初步純化的HPV18L1VLPs蛋白。將初純的HPV18L1VLPs蛋白上樣于精細(xì)純化的層析介質(zhì)上如CHT(BIO-RADTypell)，HPV18LlVLPs蛋白在一定鹽濃度范圍(如0.3~1.5mol/lNaCl或KC1緩沖溶液)能有效結(jié)合于CHT(BIO-RADTypeII)介質(zhì)上，并通過一定的磷酸鹽濃度梯度(如磷酸鹽的濃度可使用20~400mM)洗脫，將雜質(zhì)與HPV18LIVLPs蛋白分離。經(jīng)過純化的樣品也可上樣與精細(xì)純化的介質(zhì)如SephacrylS-1000(GE)和HW-75(TSK)，通過凝膠分離將雜質(zhì)與HPV18LIVLPs蛋白分離。通過精細(xì)純化后收集洗脫的HPV18LIVLPs蛋白即為最后純化的樣口noo本方法能除去很大部分污染生物分子(包括DNA、脂類和蛋白質(zhì))；還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳(BeckmanCoulter)檢測表明，通過POROS50HS介質(zhì)層析純化的樣品純度在75%~80%;通過羥磷灰石介質(zhì)純化的HPV18LIVLPs蛋白最終樣品純度在卯°/。95%。Westernblot(Bio-RAD)檢測顯示目的蛋白條帶可與HPV18LIVLPs的單抗或多抗呈特異性的顯色反應(yīng)；經(jīng)過動(dòng)態(tài)光散射(MalvernInstrumentsZetasizerNanoZS)的檢測，純化樣品顆粒范圍在50-80nm左右，經(jīng)過透射電鏡(Philips)觀察純化樣品中呈現(xiàn)病毒樣顆粒(VLPs)，顆粒直徑在5080nm之間。本實(shí)驗(yàn)步驟中的羥磷灰石介質(zhì)最好使用粒子大小約為2050um且孔徑約為800A陶瓷羥磷灰石填料。在層析過程中，所使用的緩沖液pH范圍6~9，優(yōu)選緩沖系統(tǒng)用50mMMOPS。因此，本發(fā)明利用畢赤酵母(巧c/^apaston;s)表達(dá)系統(tǒng)制備重組人乳頭瘤病毒18型Ll蛋白的方法，包括將優(yōu)化設(shè)計(jì)的HPV18Ll基因克隆至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的HPV18L1蛋白；其中，所述的優(yōu)化設(shè)計(jì)的HPV18Ll基因的核苷酸序列如SEQIDNO.l、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示。優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體選自市售商品pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pA0815。優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)化用電轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的，所述的畢赤酵母選自選自市售商品畢赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。本發(fā)明解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案可以是將本發(fā)明上述方法制得的重組人乳頭瘤病毒18型L1蛋白作為抗原，利用現(xiàn)有疫苗的制備方法來制備抗人乳頭瘤病毒18型感染的疫苗。因此，本發(fā)明一種制備抗人乳頭瘤病毒18型感染的疫苗的方法，包括采用上述方法制備重組人乳頭瘤病毒18型L1蛋白病毒樣顆粒，然后加入藥學(xué)上可用的疫苗佐劑。所述的該疫苗佐劑可以是鋁佐劑，純化后的人乳頭瘤病毒18型蛋白(HPV18L1)形成病毒樣顆粒，吸附于佐劑上，可作為預(yù)防宮頸癌的疫苗。本發(fā)明除特別說明之處外，所用的百分比都是重量百分比。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明選用優(yōu)化設(shè)計(jì)的HPV18Ll基因(全長或N端缺失61個(gè)氨基酸的編碼核苷酸序列的截短型基因)，克隆至畢赤酵母中，使HPV18L1蛋白表達(dá)量較其他表達(dá)系統(tǒng)(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、桿狀病毒、釀酒酵母)有明顯提高。表達(dá)所得病毒樣顆粒經(jīng)純化后在電鏡下觀察為50~80nm，與野生型HPV病毒顆粒相似。重組的HPV18Ll蛋白病毒樣顆粒吸附鋁佐劑后，免疫小鼠，能產(chǎn)生高效價(jià)的抗HPV18L1抗體；假病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該抗體具有較佳的中和活性(即能夠阻止假病毒進(jìn)入細(xì)胞)。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。圖1是pPICZA-18Ll'載體構(gòu)建示意圖。圖2是pPICZA-18L1，載體鑒定圖。M，250bpladderMarker(Takara公司)；1,BstBI+Kpnl雙酶切pPICZA;2，BstBI+Kpnl雙酶切pPICZA-18Ll,。圖3是全長HPV18Ll表達(dá)WesternBlot鑒定圖。M，預(yù)染Marker(NEB公司)；1，表達(dá)的陽性對照；2，表達(dá)的陰性對照；3，篩選到的全長HPV18Ll表達(dá)菌株。箭頭所指之處即為表達(dá)的全長HPV18L1。10圖4是截短型HPV18Ll表達(dá)WesternBlot鑒定圖。M，彩虹Marker(Fermentas公司)；1，表達(dá)的陽性對照；2，篩選到的截短型HPV18Ll表達(dá)菌株；3，表達(dá)的陰性對照。箭頭所指之處即為表達(dá)的截短型HPV18L1。圖5是HPV18Ll層析純化樣品還原性SDS-PAGE電泳圖。1)POROS50HS收集峰l;2)POROS50H收集峰2;3)POROS50HS收集峰3;4)CHT收集峰l;5)CHTPeakl濃縮樣品；6)陽性對照。圖6是純化產(chǎn)物HPV18L1免疫印跡圖。l抗fitzgerald公司18Ll抗體l:5000稀釋；2抗山羊抗鼠l:250;1:陽性對照；2、3:純化后的HPV18L1蛋白。圖7是HPV18LlVLPs純化樣品透射電鏡圖(X105000)。圖8a是HPV18假病毒感染293FT細(xì)胞圖。圖8b是鼠血清中和HPV18假病毒圖。具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1合成全長HPV18Ll基因按照畢赤酵母使用的密碼子偏愛性設(shè)計(jì)全長HPV18Ll基因的核苷酸序列。見序列表中的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。由捷瑞公司分別商業(yè)合成上述全長基因，并應(yīng)用DNA測序儀#3730對HPV18L1基因進(jìn)行測序。實(shí)施例2全長或截短型HPV18Ll畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例1中獲得的序列為SEQIDNO.l的全長HPV18Ll基因兩端以EcoRI和Kpnl酶切位點(diǎn)裝入pUC18質(zhì)粒(捷瑞公司)中，命名為pUC-18Ll,送至上海生工生物工程有限公司應(yīng)用DNA測序儀3730進(jìn)行DNA測序。ii委托上海生工生物工程有限公司合成擴(kuò)增全長或截短型HPV18Ll所需的引物三條。兩條正向引物包括一個(gè)BstBI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，并具有如下核苷酸序列PI，5'誦TCCCAATCTTCGAAACGATGTGTTTGTACACTAGAGTTT-3，(全長型，如SEQIDNO,7所示)；P2，5，-TCCCAATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGGA-3，(截短型，如SEQIDNO.8所示)。反向引物包括位于終止密碼子側(cè)翼的Kpnl限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)并具有核苷酸序列P3，5，-AATGGTACCCTATTACTTTCTAGCTCTAACT-3，(如SEQIDN0.9所示)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以pUC-18Ll為DNA模板，用引物Pl、P3擴(kuò)增出全長HPV18L1基因，其核苷酸序列見序列表中的SEQIDNO.l;用引物P2、P3擴(kuò)增出截短型HPV18L1基因，其核苷酸序列見序列表中的SEQIDN0.4。PCR片段按常規(guī)亞克隆方案經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶BstBI和Kpnl雙酶切消化，再與BstBI/Kpnl雙酶切消化的pPICZA(購自Invitrogen)連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5oc的感受態(tài)細(xì)胞，鋪板于含25pg/ml零霉素(Zeocin)的LB瓊脂上。分離已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的單菌落，制備質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制性圖譜和核苷酸序列分析HPV18Ll基因和載體序列的存在。分別鑒別出包含全長HPV18Ll基因的正確構(gòu)建體(命名為pPICZA-18Ll)和截短型HPV18Ll基因的正確構(gòu)建體(命名為pPICZA-18Ll，)。圖1是pPICZA-18Ll，載體構(gòu)建示意圖。圖2是pPICZA-18Ll，載體的鑒定結(jié)果。實(shí)施例3全長或截短型HPV18Ll畢赤酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建和篩選為了提高重組質(zhì)粒在酵母染色體上的整合效率，用Sacl限制性內(nèi)切酶單酶切pPICZA-18Ll質(zhì)粒和pPICZA-18Ll，質(zhì)粒使其線性化，對空質(zhì)粒pPICZA進(jìn)行同樣的酶切作為陰性對照。酶切反應(yīng)液加入無水乙醇沉淀DNA，用少量雙蒸水溶解線性化的DNA片段，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)的步驟電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌X-33(購自Invitrogen)。電轉(zhuǎn)化條件為DNA片段5微克，電壓1500伏，電阻25歐姆，電擊時(shí)間為5毫秒。電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪板于含200|_ig/ml零霉素的YPDS瓊脂上，分離已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的單菌落，重新接種至含100(Vg/ml、1500]ig/ml零霉素抗性平板上。高濃度抗性平板上獲得的克隆，分別用4mlYPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后換成BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)基因表達(dá)，表達(dá)48h后離心收獲菌體。玻璃珠法破菌，WestemBlot檢測各個(gè)菌株的表達(dá)量，篩選后獲得全長HPV18Ll表達(dá)量較高的菌株pX226和截短型HPV18Ll表達(dá)量較高的菌株pX123。圖3是全長HPV18Ll表達(dá)WesternBlot鑒定圖。圖4是截短型HPV18Ll表達(dá)WesternBlot鑒定圖。實(shí)施例4重組截短型HPV18L1蛋白的表達(dá)種液制備從工作種子庫取1支菌種甘油凍存管，即實(shí)施例3所得的表達(dá)截短型HPV18L1的基因工程菌pX123，融化后吸取100pL接入5mlYPD培養(yǎng)基，280轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)，3(TC培養(yǎng)20小時(shí)。006()()在1~2。鏡檢無雜菌污染。將檢驗(yàn)合格的活化液lml接入500mlYPD培養(yǎng)基，280rpm，3(TC培養(yǎng)20小時(shí)。OD6(K)在26。鏡檢無雜菌污染。發(fā)酵工藝發(fā)酵用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM，(K2S04273g，MgS04109g，CaS042H2017.6g，H3P04400.5ml，KOH62g，甘油600g，PTM!60ml，泡敵lml,去離子水加至15L)，用去離子水配制，其中不含有抗生素，配制后在30L發(fā)酵罐(Bioengineering公司)中進(jìn)行實(shí)罐滅菌。滅菌條件為121°C，30分鐘，消后冷至30°C。按1:15接種。發(fā)酵溫度為30.0士0.5。C，初始pH5.00士0.05,起始轉(zhuǎn)速300rpm培養(yǎng)，通氣量0.5vvm，DO100%，添加PTM1(CuSO45H2O6.0g，NaIO細(xì)g，MnSO43.0g，NaMoO40.2g，H3BO30.02g，ZnSO420.0g，CoCl20.5g，F(xiàn)eS04.7H2065.0g，biotin0.2g，H2SO45.0ml，去離子水加至1L)痕量鹽類。初始增殖階段大約20小時(shí)左右，維持溶氧值不13低于30%，當(dāng)碳源消耗完畢時(shí)，溶氧值迅速地上升,菌體濕重達(dá)到約100g/L。初始兩小時(shí)以每小時(shí)200ml/h的速率補(bǔ)加體積百分比50%的甘油溶液(每升添加12mlPTM^。補(bǔ)料兩小時(shí)后改為300ml/h。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓(<0.8bar)使溶氧水平維持在20%以上。補(bǔ)加約8小時(shí)，菌體濕重約350g/L時(shí)，停止補(bǔ)料，溶氧值上升。同時(shí)將pH值控制調(diào)為6.00±0.05,開始加入甲醇(每升添加12mlPTM。誘導(dǎo)。最初甲醇加入量控制在30ml/h。緩慢增加甲醇的加入量，甲醇誘導(dǎo)4小時(shí)后將補(bǔ)料速度設(shè)定為90ml/h。維持溶氧值高于體積百分比20%，溫度維持在3(TC，pH值控制為6.00士0.05。每8小時(shí)取一次樣，WesternBlot檢測。誘導(dǎo)24小時(shí)發(fā)酵結(jié)束時(shí)放出發(fā)酵液。菌體收獲用冷凍離心機(jī)離心發(fā)酵液后收集菌體，稱重。標(biāo)明批號、曰期、重量，收獲的菌體交付于純化，或在-2(TC凍存。實(shí)施例5提純制備截短型HPV18Ll蛋白病毒樣顆粒(VLPs)清洗將-2(TC冷凍保存的、實(shí)施例4制得的表達(dá)截短型HPV18Ll的畢赤酵母細(xì)胞，放于室溫下解凍，加入清洗緩沖液100mMPBpH7.0、0.15MNaCl或者純化用水，按比例l:3(g/ml)混合，使用勻漿機(jī)(FLUKO)將酵母細(xì)胞與清洗緩沖充分打勻，隨后通過高速離心(SORVALLRC6PLUS)8000rpm，5min分離細(xì)胞和清洗上清。重復(fù)以上操作二遍，即完成細(xì)胞的清洗。破碎將清洗后的細(xì)胞加入破菌緩沖液(100mMMOPS，0.75MNaCl，0.05%Tween-80，pH7.0)，按h5(g/ml)的比例混合，用勻漿機(jī)(FLUKO)將酵母細(xì)胞與破菌緩沖液充分混勻。使用高壓均質(zhì)機(jī)(ATSAH110B)在壓力12001300bar的操作壓力下破碎以上經(jīng)過勻漿的細(xì)胞懸液，重復(fù)4遍，4'C8""C出口冷卻，使90%的細(xì)胞破碎。澄清將經(jīng)過高壓破碎的破菌液倒入離心杯中，通過高速離心去除細(xì)胞碎片，收集離心上清用于隨后的柱層析分離。使用的離心機(jī)SORVALLRC6PLUS，轉(zhuǎn)子型號FIBERLITEF10-6x500y，離心設(shè)置9000卬m，30min，10°C。初純使用層析介質(zhì)POROS50HS(AppliedBiosystems)裝柱(直徑26mm，高度10，體積50ml)。通過以下步驟進(jìn)行純化清洗消毒0.5MNaOH清洗2個(gè)柱體積；再生平衡緩沖液B(1.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)清洗2個(gè)柱體積，緩沖液A(50mMMOPS，0.75MNaCl，0.05%Tween-80，pH7.0)平衡層析柱；上樣將經(jīng)過離心澄清的破菌上清，以流速4ml/min的速度上樣；淋洗緩沖液(50mMMOPS,0.75MNaCl，0.05%Tween-80，pH7.0)淋洗5個(gè)柱體積，至基線平穩(wěn)。洗脫100%緩沖液A至100M的緩沖液B的線性梯度洗脫。洗脫流速10ml/min，洗脫總體積為6個(gè)柱體積。收集電導(dǎo)在70100ms/cm的層析峰，放在4'C保存收集。精純使用層析介質(zhì)CHT陶瓷羥磷灰石(BIO-RAD，TypeII，40um)裝柱(直徑26mm，高度10cm,體積50ml)。通過以下步驟進(jìn)行純化清洗消毒0.5MNaOH清洗2個(gè)柱體積；再生平衡緩沖液B(50mMMOPS，0.5MNaCl，0.2MNaH2PO4，0.05%Tween-80，pH=7.0)清洗2個(gè)柱體積，緩沖液A(50mMMOPS，0.5MNaCl，0.04MNaH2P04，0.05%Tween-80，pH7.0)平衡層析柱。上樣將經(jīng)過初純后收集的樣品加入PB至終濃度為30mM，以流速10ml/min的速度上樣；淋洗緩沖液A淋洗5個(gè)柱體積，至基線平穩(wěn)。洗脫100。/。緩沖液A至100。/。的緩沖液B的線性梯度洗脫。洗脫流速8ml/min。收集分部收集洗脫組分，將含有截短型HPV18L1VLPs的組分合并，即為最后的純化樣品。經(jīng)過還原性SDS-PAGE(Bio-RAD)(見圖5),純度>90%。Westernblot(Bio-RAD)檢測的電泳目的條帶可與HPV18LIVLPs的單抗或多抗呈特異性的顯色反應(yīng)(見圖6)。經(jīng)過動(dòng)態(tài)光散射(MalvemInstrumentsZetasizerNanoZS)的檢測純化樣品顆粒范圍在5080nm左右，經(jīng)過電鏡(PhilipsTecnai-12Biotwin透射電子顯微鏡，上海中醫(yī)藥大學(xué)科技中心電鏡室)觀察純化樣品中呈現(xiàn)病毒樣顆粒，顆粒直徑在5080nm之間，見圖7。實(shí)施例3中表達(dá)的全長HPV18L1蛋白經(jīng)過相同方法純化后也可獲得VLPs純化樣品，經(jīng)過動(dòng)態(tài)光散射和電鏡檢測，形成的顆粒大小與截短型HPV18L1蛋白顆粒相同，顆粒直徑在5080nm之間。實(shí)施例6HPV18L1基因的在畢赤酵母中發(fā)酵表達(dá)量的檢測用純化的截短型HPV18L1蛋白做標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，以誘導(dǎo)前菌體做陰性對照，采用ELISA夾心法檢測截短型HPV18Ll基因在畢赤酵母中發(fā)酵表達(dá)量，具體步驟如下-用包被液2000倍稀釋截短型HPV18Ll蛋白免疫的兔多抗，向酶標(biāo)板的凹孔中各加入O.lmL稀釋后的兔多抗(1:2000，上海普欣生物技術(shù)有限公司制備)，于4'C過夜后，移去包被液，并用0.3mLPBST洗滌凹孔，然后用0.3mL封閉液(5X脫脂奶粉+PBST)于37。C保溫2小時(shí)，進(jìn)行封閉。用稀釋液以對倍稀釋的方式，將純化的截短型HPV18Ll蛋白從濃度2嗎/mL梯度稀釋到0.0625pg/mL，同時(shí)將獲得的發(fā)酵菌體的破菌上清分別稀釋200倍，然后分別向凹孔中加入O.lmL梯度稀釋后不同濃度的截短型HPV18L1蛋白溶液或稀釋后的破菌上清，于37"C保溫1小時(shí)后，移去抗原液，并用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；然后用稀釋緩沖液將MAB885鼠單抗(購自CHEMICON公司)IOOO倍稀釋后加入到凹孔中，每孔各O.lmL，37'C保溫1小時(shí)后，移去單抗溶液后，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；再向凹孔中加入用稀釋緩沖液5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG各O.lmL，在37°C保溫0.5小時(shí)后，移去酶標(biāo)液，并用0.3mL洗滌液洗滌凹孔后，向凹孔中各加入O,lmLDAB顯色液，室溫下作用20分鐘后，向每個(gè)凹孔中加入0.05mL2MH2S04終止液以終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)比色儀測定OD45Q值。利用梯度稀釋的截短型HPV18L1的OD45。的檢測結(jié)果，制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線換算獲得截短型HPV18Ll蛋白的發(fā)酵表達(dá)量，結(jié)果如表2所示，其中用已測定濃度的純化目的蛋白原液稀釋一系列濃度，例如2pg/mL，l|jg/mL，0.5pg/mL，0.25ng/mL,0.125pg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，通過ELISA檢測，用濃度做縱坐標(biāo)，對應(yīng)OD450檢測值做橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方16程。發(fā)酵破菌液上清稀釋一系列倍數(shù)，例如50，100，200，400倍。測出的OD45。值通過標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程求得對應(yīng)濃度(單位為pg/mL),再乘以稀釋倍數(shù)即為發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(單位為pg/mL)。由于破菌液是由菌體濕重破菌緩沖液=1:5配制的，所以發(fā)酵菌體的目的蛋白表達(dá)量(單位為pg/g菌體)為5X發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(單位為(ig/mL)。再乘以發(fā)酵液菌體密度(單位為g菌體/L發(fā)酵液)，則為發(fā)酵目的蛋白表達(dá)量濃度(單位為pg/L發(fā)酵液)。發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(pg/mL)-稀釋倍數(shù)X標(biāo)準(zhǔn)目的蛋白濃度(pg/mL)XOD45()(發(fā)酵破菌液上清)/OD45()(標(biāo)準(zhǔn)目的蛋白濃度)；發(fā)酵目的蛋白表達(dá)量濃度()ag/L發(fā)酵液)二5X發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(pg/mL)X發(fā)酵液菌體密度(g菌體/L發(fā)酵液)。表2截短型HPV18Ll基因的在畢赤酵母中發(fā)酵表達(dá)量的檢測樣品稀釋倍數(shù)OD450原液濃度(嗎/ml)平均濃度(pg/ml)換算濃度發(fā)酵密度發(fā)酵表達(dá)量破菌液2000.455161.4176880ng/g438g/L385mg/L上清l1000.718185.6濕菌體發(fā)酵液破菌液2000.365153.0152760昭/g413g/L314mg/L上清21000.612160.5濕菌體發(fā)酵液陰性對照1000.091空白對照—0扁實(shí)施例7重組全長或截短型HPV18LlVLPs的免疫原性ELISA間接HPV18Ll疫苗的制備參考《中華人民共和國藥典》(2005年版)中的方法，將實(shí)施例5中純化獲得的截短型HPV18LlVLPs吸附鋁佐劑，獲得具有免疫原性的截短型HPV18Ll疫苗。同時(shí)，將實(shí)施例4中表達(dá)的全長HPV18L1蛋白純化后吸附鋁佐劑，獲得具有免疫原型的全長HPV18L117疫苗。免疫程序選取68周齡的SPF級BALB/c小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，合格證號SCXK(滬)2003-0003，分為4組，每組6只小鼠。第l組小鼠均用含有鋁佐劑的緩沖液進(jìn)行免疫，其它3組分別免疫0.1ml濃度為5pg/ml、0.5昭/ml、0.05pg/ml的吸附鋁佐劑的實(shí)施例5制得的HPV18LlVLPs，采用皮下注射免疫，第0、7、21天免疫三次，免疫后兩周采血。將采集的血液置37X:放置2h，4000g離心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，存放于-2(TC。鼠血清陽轉(zhuǎn)率用包被液稀釋抗原(即實(shí)施例5制得的純化的畢赤酵母表達(dá)的HPV18LlVLPs)至最適濃度liig/ml各0.1ml加于酶標(biāo)板每個(gè)凹孔中，4"C過夜。移去包被液，凹孔用(X3ml洗滌液PBST洗滌。用封閉液(5%脫脂奶粉+PBST)0.3ml封閉，37。C保溫2小時(shí)。每凹孔加入用稀釋緩沖液(2%脫脂奶粉+PBST)以l:400稀釋的被檢血清(免疫過HPV18Ll和鋁佐劑的鼠血清)各0.1ml，37'C保溫1小時(shí)。移去血清液，凹孔用0.3ml洗滌液洗滌。每凹孔加入用稀釋緩沖液以l:5000稀釋的酶標(biāo)抗(HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG)O.lml，37。C保溫0.5小時(shí)。移去酶標(biāo)液，凹孔用0.3ml洗滌液洗滌。加入0.1mlDAB顯色液于每個(gè)凹孔，室溫避光作用20分鐘。每凹孔加2MH2S040.05ml終止。用酶標(biāo)比色儀測定OD^值。cutoff值為檢測陰性對照被檢血清(免疫鋁佐劑的鼠血清)抗體的OD450值的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)cutoff值判斷鼠血清抗體陽轉(zhuǎn)率。采用終點(diǎn)滴度法計(jì)算血清的滴度值，其見表3，表4。表3截短型HPV18L1鼠血清陽轉(zhuǎn)率5嗎免疫組0.5嗎免疫組0.05嗎免疫組陽轉(zhuǎn)率100%100%100%表4全長HPV18L1鼠血清陽轉(zhuǎn)率5昭免疫組0.5嗎免疫組0.05昭免疫組陽轉(zhuǎn)率100%100%100%18鼠血清滴度測定用包被液稀釋抗原(本發(fā)明中純化的畢赤酵母表達(dá)的截短型或全長的HPV18Ll蛋白)至最適濃度l嗎/ml各0.1ml加于酶標(biāo)板每個(gè)凹孔中，4'C過夜。移去包被液，凹孔用0.3ml洗滌液PBST洗滌。用封閉液(5X脫脂奶粉+PBST)0.3ml封閉，37"C保溫2小時(shí)。被檢血清(免疫過本發(fā)明截短型或全長HPV18L1的鼠血清)用稀釋緩沖液(2X脫脂奶粉+PBST)從l:500稀釋到1:32000，陰性對照被檢血清(免疫鋁佐劑的鼠血清)以l:10000稀釋，每凹孔分別加入0.1ml，37。C保溫l小時(shí)。移去血清液，凹孔用0.3ml洗滌液洗滌。每凹孔加入用稀釋緩沖液以l:5000稀釋的酶標(biāo)抗(辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG)O.lml，37'C保溫0.5小時(shí)。移去酶標(biāo)液，凹孔用0.3ml洗滌液洗滌。加入O.lmlDAB顯色液于每個(gè)凹孔，室溫作用20分鐘。每凹孔加2MH2SO40.05ml終止。用酶標(biāo)比色儀測定0045()值。cutoff值為檢測陰性對照被檢血清(免疫鋁佐劑的鼠血清)抗體的OD450值的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差。表5，表6是該測定值。其中的結(jié)果可見本發(fā)明制得的截短型或全長HPV18Ll蛋白病毒樣顆粒吸附鋁佐劑后，免疫小鼠，能產(chǎn)生高效價(jià)的抗HPVL1抗體，本發(fā)明HPV18L1蛋白具有高免疫原性。表5截短型HPV18L1鼠血清滴度測定值鼠1鼠2鼠3鼠4鼠5鼠65昭免疫組418416836022529971923344703242152230.5嗎免疫組107369413854189584183712264001922970.05嗎免疫組79083689716131011819200014099表6全長HPV18L1鼠血清滴度測定值鼠1鼠2鼠3鼠4鼠5鼠65ug免疫組115428534234441534014992410038801037840.5ug免疫組83831315490896331202947443088237810.05ug免疫組2423710003068803414055640892795019實(shí)施例8假病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測小鼠截短型HPV18Ll抗體的中和活性小鼠免疫程序同實(shí)施例7，免疫后兩周采血。將采集的血液置37。C放置2h，4000g離心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，存放于-20。C。將293FT細(xì)胞(Invitrogen)預(yù)先鋪于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(1.1乂107細(xì)胞/dish)，24h后將質(zhì)粒pl8Llh，pl8L2h(BuckCB,PastranaDV,LowyDRetal.EfficientIntracellularAssemblyofPapillomaviralVectors.JVirol,2004，78(2):751-757)和帶綠色熒光基因的pIRES2-EGFP(購自BDBiosciencesClontech)用磷酸鈣方法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，用量分別為20嗎、10嗎、IO昭。48h后進(jìn)行觀察并收集和裂解細(xì)胞，將收集的細(xì)胞裂解上清立即用于純化或置-80。C保存。在5ml離心管(Beckman)中用30%OptiPrep密度梯度離心純化收集的細(xì)胞裂解液，16。C下100，000g離心4h(MLS-50轉(zhuǎn)頭，Beckman超速離心機(jī))，分部收集離心組分，每份約50(^1，以蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測各組分中的HPV18L1蛋白含量，將L1蛋白濃度最高的組分合并，作為假病毒液，分裝后-8(TC保存。將293FT細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(1.5X105細(xì)胞/well)。24h后進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，將不同的血清樣本分別用DMEM培養(yǎng)基從100倍起進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，然后取5(^1分別與5(^1稀釋于DMEM培養(yǎng)基的假病毒液混合，4X:孵育lh后分別加入預(yù)鋪有293FT細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37'C培養(yǎng)48h后用OLUMPUSCKX41F32FL倒置熒光顯微鏡觀察表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞并采集熒光圖像，見圖8a和圖8b。圖8a有熒光，表明HPV18假病毒感染了293FT細(xì)胞。圖8b只剩極少熒光，表明鼠血清中和了HPV18假病毒，降低了293FT細(xì)胞的感染。由此可見小鼠重組HPV18L1抗體具有中和活性，能夠阻止假病毒進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明也可以將核苷酸序列SEQIDN0.2-3替換實(shí)施例2中的SEQIDNO.l，按照實(shí)施例25的制備過程制備本發(fā)明的HPV18Ll蛋白；也可以將上述基因克隆至現(xiàn)有其它畢赤酵母表達(dá)載體，如pPIC6、pGAPZ或pA0815，并選擇與之相應(yīng)的克隆方式，然后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化其它畢赤酵母細(xì)胞，如Pz'c/n'a;asto&GS115、KM71或SMD1168菌株，構(gòu)建基因工程菌，按照常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)發(fā)酵、分離純化得到本發(fā)明的HPV18Ll蛋白(HPV18LlVLPs)，這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在此不詳述。制得的HPV18Ll蛋白也具有與上述實(shí)施例5制得HPV18Ll蛋白相類似的免疫原性。序歹U表<110〉上海澤潤生物科技有限公司<120>用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備抗人乳頭瘤病毒18型感染的疫苗的方法〈130〉P4-071431C<160>9<170>Patentlnversion3.4<210>1<211〉1707<212>■〈213〉A(chǔ)rtificial(人工序列)〈220〉〈223〉適用畢赤酵母偏好密碼子的全長HPV18Ll蛋白基因的核苷酸序列〈400>1atgtgtttgtacactagagttttgattttgcactaccatttgttgcctttgtacggtcca60ttgtaccaccgcctttgcattccattttggtttacatggttcacattatc120atttgtggtcattacattattttgttcttgagaaacgttaacgttttcccaatcttcttg180caaatggctttgtgg卿ccttctgacaacactgtttacttgccacctccatccgttgct2403gagttgtt3ctacgttact3g犯CttCt3ttttctaccacgctggttcc300tctagattgttgactgttggt犯cccttactttagagttccagctggtggtggtaac犯g360caagststtcCt33ggtttCcgcttaccaatacagagttttcsgagttca已ttgccagac420cct犯caagtttggtttgccagatacttctatttacaaccctgagactcaaagattggtt480tgggcttgtgctggtgttga犯ttggtagaggtcaaccattgggtgttggtttgtccggt540catcctttctacaacaagttggacgatactgagtcttcccacgctgctacttctaacgtt600tccg犯gacgttagagat犯cgtttctgttgactac犯gcaaactcaattgtgtattttg660ggttgtgctccagctattggtgagcattgggct鄉(xiāng)ggtactgcttgtaagtccagacct720ttgtctcaaggtgattgtccacctttggaattg犯gaacactgttttggaggacggtgat780atggttgacaCtggtt8LCggtgctatggatttctccactttgcaagacactaagtgtg犯840gttccattggatatttgtcaatctatttgtaagtaccctgactacttgcaaatgtccgct900gatccatacggtgactctatgttcttttgtttg卿卿gagcaattgttCgCt￡lg3C￡lC960ttttgg￡L6lC￡lgagctggtactatgggtgatactgttcctcaatccttgtacattaagggt1020actggta^tgagagcttctccaggttcctgtgtttactctccttccccatctggttccatt1080gttacttctgactcccaattgttcaac^gccttactggttgcat犯ggctcaaggtcac1140犯ca3cggtgtttgttggcataaccaattgtttgttactgttgttgatactactagatcc1200ctatttgtgcttccactcaatctccagttcCtggtC33t3cgacgctact1260aagttcaagcaat3ctccagacscgttgaagagtacgatttgcaattcatcttccaattg1320tgtactattactttgactgctgacgttatgtcttacattcctcttccatt1380ttggaagattggaactttggtgttccacctccacctactacttctttggttgacscttac1440agattcgttcaatccgttgctattacttgtc犯a^ggatgctgctccagctga^aca^g1500gacccttacg已taagttgaagttttggaacgttgwttga3ggaa^gttctctttggat1560ttggaccaatacccattgggt3ga^gtttttggttcaagctggtttgagaagsa^gcct1620actattggtcatccgctccttctgctactacttcctct肪gccagctgiag1680卿gtt卿gttag3gctaga^gt肌1707〈210>2〈211〉1707<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificial(人工序列)〈220〉<223〉適用畢赤酵母偏好密碼子的全長HPV18Ll蛋白基因的核苷酸序列〈400〉28Ltgtgtttgt8C3Ct￡lg3gttttgattttgC3tt￡tCC￡ttttgttgccattgtscggtcca60ttgtaccatcC3C犯CC3ttgccattgcattctattttggtttacatggttcataltatt120atttgtggtcattacattattttgtttttgatgtttttccaatttttttg180caaatggctttgtgg卿ccatctgacaatactgtttacttgccaccaccatctgttgct240agagttgttaatactgacgactacgttactagaacttctattttttaccatgctggttct300tctagattgttgsctgttggtaatccatactttagagttccagctggtgg360C￡La_g3C8ttCC38^gtttCtgcttaccaatax:agagtttttag已gttcaattgccagac420ccaaataaatttggtttgccagacacttct3ttt3C^tC犯gattggtt480tgggcttgtgctggtgttgaaattggtagaggtcaaccattgggtgttggtttgtctggt540catccattttggacgacactgaatcttctcatgctgctacttctaatgtt600tctgaag已cgtgtttctgttggictacaaac3aactc犯ttgtgtattttg660ggttgtgctccagctattggtg犯cattgggct犯aggtactgcttgteia3tCt3g3CC￡l720ttgtctc犯ggtgactgtcc3CC3ttgg犯ctgttttgga鄉(xiāng)cggtgac780atggttgacactggttacggtgctatggacttttctactttgc犯gax^ctaaatgtgaa840gttccattggacatttgtcaatctatttgtsaatacccagactacttgcaaatgtctgct900gacccatacggtgactctatgtttttttgtttg卿卿gtgctagacat96023ttttggaatagagctggtactatgggtgacactgttccacaatctttgtacattaaaggt1020actggtatgagagcttctccaggttcttgtgtttactctccatctccatctggttctatt1080gttacttctgactctcaa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、離心、柱層析純化得到重組的HPV18L1蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，所述的柱純化包括采用POROS50HS柱層析初純，再經(jīng)過CHT柱層析精純。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的重組的HPV18Ll蛋白能在畢赤酵母體內(nèi)自組裝成病毒樣顆粒。8、一種制備抗人乳頭瘤病毒18型感染的疫苗的方法，其特征是，包括采用權(quán)利要求17任一項(xiàng)所述的方法制備重組人乳頭瘤病毒18型L1蛋白病毒樣顆粒，然后加入藥學(xué)上可用的疫苗佐劑。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是，所述的藥學(xué)上可用的疫苗佐劑為鋁佐劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備重組人乳頭瘤病毒18型L1蛋白的方法，包括將按照優(yōu)化設(shè)計(jì)的HPV18L1基因裝入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的人乳頭瘤病毒18型L1蛋白，該蛋白在畢赤酵母體內(nèi)自組裝成病毒樣顆粒；其中，所述的優(yōu)化設(shè)計(jì)的HPV18L1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示。本發(fā)明的方法制備的HPV18L1蛋白表達(dá)量高。本發(fā)明還公開了將該重組HPV18L1蛋白病毒樣顆粒制成抗人乳頭瘤病毒18型感染的疫苗的方法。該疫苗具有較佳的活性。文檔編號C12N15/34GK101487010SQ20081003265公開日2009年7月22日申請日期2008年1月15日優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日發(fā)明者克吳,張夢華,張高峽,瓊沈,熊瑩華,袁靖宇,雷建強(qiáng)申請人:上海澤潤生物科技有限公司