專(zhuān)利名稱(chēng)：：一株克雷伯氏菌及其在微氧發(fā)酵產(chǎn)氫中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種克雷伯氏菌HPB及其在微氧條件下以甘露醇為碳源的微生物制氫方法中的用途。
背景技術(shù)：
：氫氣作為一種應(yīng)用范圍廣，無(wú)污染，熱值高的替代能源，已經(jīng)在世界上引起高度重視。而生物制氫技術(shù)具有不產(chǎn)生二次污染，消耗能量少等優(yōu)點(diǎn)，正越來(lái)越受到人們的青睞。生物制氫技術(shù)主要包括利用光合方法制氫和發(fā)酵方法制氫。但因光合微生物利用光能產(chǎn)氫的效率十分有限，使得單獨(dú)利用光合微生物實(shí)現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)氫有很大的難度。而微生物發(fā)酵法產(chǎn)氫具有無(wú)需光照，產(chǎn)氫量穩(wěn)定，速率高等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用前景顯得更為廣闊。目前，國(guó)內(nèi)外有大量的文獻(xiàn)報(bào)道了利用微生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的方法，如Yokio等利用耐酸菌-氣腸桿菌(五"fera^c^^erage"^)BY-29厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氫，王凱軍等利用產(chǎn)氣腸桿菌HU-101，以及任南琪等篩選利用哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49(￡Aa"o/oge"6acfen'wmB49)進(jìn)行了大量的厭氧產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，他們都是在完全厭氧條件下通過(guò)改變PH、溫度，充入其他不同氣體等培養(yǎng)方法使其具有最大產(chǎn)氫效率。另外還有很多微生物發(fā)酵產(chǎn)氫方面的專(zhuān)利，如中國(guó)專(zhuān)利CN1488758A03126345.3、CN1088185A92114477.1以及美國(guó)發(fā)明專(zhuān)利US5464539等，這些專(zhuān)利同樣都無(wú)一例外的利用完全厭氧的方式發(fā)酵農(nóng)業(yè)秸稈或者有機(jī)廢水產(chǎn)氫，通過(guò)改變菌種或者發(fā)酵工藝流程提高產(chǎn)氫效率，也同樣面臨發(fā)酵效率的問(wèn)題，且都還不能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)氫。因而還需要進(jìn)一步篩選產(chǎn)氫效率更高、適應(yīng)能力更強(qiáng)的新菌種，改進(jìn)發(fā)酵條件比如利用部分有氧發(fā)酵的方法使一部分有機(jī)物完全降解，為生物產(chǎn)氫提供更多的能量和還原力，從而進(jìn)一步提高產(chǎn)氫效率，并最終實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)大多數(shù)產(chǎn)氫細(xì)菌來(lái)說(shuō)氧氣是不利因子，過(guò)高的氧氣濃度會(huì)嚴(yán)重影響氫酶以及固氮酶的生物活性，嚴(yán)重影響產(chǎn)氫，故利用一般的細(xì)菌在有氧條件下產(chǎn)氫并不能達(dá)到較好的效果。但是很明顯，如果產(chǎn)氫微生物能首先進(jìn)行有氧呼吸，產(chǎn)生更多的能量和還原力，進(jìn)而在微氧或者厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫，會(huì)明顯提高微生物的產(chǎn)氫能力，然而以氧氣作為重要影響因子研究對(duì)產(chǎn)氫影響的文獻(xiàn)并不多見(jiàn)，其中龍敏南等篩選的《/eZm'e^o;c聲ocaHP1可以在一定氧氣濃度下產(chǎn)氫，但是這株細(xì)菌以葡萄糖為碳源，只有在完全厭氧下才能獲得最高產(chǎn)氫效率，隨著氧氣濃度的增加(0-10%)，產(chǎn)氫率從1.0molH2/mol葡萄糖下降到0.06molH2/mol葡萄糖。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株克雷伯氏菌(K/AwW/asp.),該菌能在微氧條件下發(fā)酵產(chǎn)氫。本發(fā)明另一目的是提供一種以微量利用氧氣，以甘露醇為碳源的產(chǎn)氫的實(shí)用方法，解決在非嚴(yán)格厭氧條件下微生物發(fā)酵產(chǎn)氫的問(wèn)題，提高底物利用率進(jìn)而提高氫氣產(chǎn)量。本發(fā)明提供的利用微量氧氣產(chǎn)氫的微生物HPB是一株克雷伯氏菌a:/ezww/。sp.)，已于2008年i月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2317。克雷伯氏菌HPB菌落大，乳白色，半透明，光滑濕潤(rùn)，粘液狀，該菌株經(jīng)形態(tài)、生理生化特征和16SrRNA基因序列同源性分析，鑒定為克雷伯氏菌(K/e6wW/asp.)。該菌的生理生化特征如表l。其16SrRNA基因序列己提交美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)(AccessionNo:EU368116)。表l克雷伯氏菌(K/e6wW/fl.w)HPB的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>克雷伯氏菌(X7dwW/flsp.)16SrRNA基因序列GAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGTTGAGGTTAATAACCTCCTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC本發(fā)明中HPB菌的篩選過(guò)程所采用的分離和篩選方法為常規(guī)方法，該菌群系從本實(shí)驗(yàn)室所藏的活性污泥中經(jīng)長(zhǎng)期分離培養(yǎng)，在兼性厭氧條件下不斷馴化所得，其詳細(xì)步驟如下1、篩選過(guò)程中所使用的培養(yǎng)基為KH2P04200mg;K2HP04800mg;MgS04.7H20200mg;CaSO4100mg;Na2Mo042H2020mg;FeCl310mg;甘露醇20g;酵母浸汁500mg;蒸餾水1000ml，pH7.0;2、將20ml長(zhǎng)安垃圾場(chǎng)垃圾滲濾液接種到100ml經(jīng)12rC滅菌15分鐘的如1中所述的培養(yǎng)基中進(jìn)行好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為33士rc;3、經(jīng)5-7天后，取步驟2所得培養(yǎng)物3ml轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中按步驟2的方法繼續(xù)培養(yǎng)；4、不斷重復(fù)以上步，同時(shí)每次所得的培養(yǎng)物取25ul平板涂布觀察是否有細(xì)菌長(zhǎng)出，經(jīng)多次篩選最終得到一株可以在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株o以上步驟中平板培養(yǎng)基成分為KH2PO4200mg;K2HP04800mg;MgS047H20200mg;CaSO4100mg;Na2Mo04.2H2020mg;FeCl310mg;甘露醇5g;瓊脂粉20g;蒸餾水1000ml，pH7.0，12rC滅菌15分鐘。5、在平板上挑取培養(yǎng)兩天的生長(zhǎng)良好的菌落，接種到步驟l所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)作為產(chǎn)氫菌種。本發(fā)明提供的微生物發(fā)酵制氫的方法如下將菌種尺/eZw'e〃asp.HPB，CGMCCNo:2317按體積比為1:100的接種量接入經(jīng)滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30-36°C，pH6-8，以高純氮?dú)馀疟M氧氣，然后再注入少量氧氣使反應(yīng)器中初始氧氣濃度約2.72±0.30%，保持在微氧環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵50h，即可獲得大量氫氣。上述反應(yīng)可在溫度30-36°C,pH值6-8之間變化，初始氧氣濃度也可以在較大范圍變化，這只是對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫的效率產(chǎn)生影響。本發(fā)明中產(chǎn)氫發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基成分如下KH2PO4200mg;K2HP04800mg;MgS04.7H20200mg;CaS04100mg;Na2Mo(V2H2020mg;FeCl310mg;甘露醇2-10g或葡萄糖5g或蔗糖5g或淀粉5g;酵母浸汁500mg;蒸餾水1000ml。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)首次發(fā)現(xiàn)適量的氧氣存在可以促進(jìn)微生物發(fā)酵產(chǎn)氫；(2)本發(fā)明中的《/e6wW/asp.HPB，CGMCCNo:2317可以在有氧條件下良好生長(zhǎng)，其最大特點(diǎn)是微氧條件下可以高效產(chǎn)氫，并具有較高的耐氧產(chǎn)氫能力，以甘露醇為碳源初始氧濃度為2.72±0.30%,最大產(chǎn)氫量達(dá)324mlH2/g甘露醇(約合2.37molH2/mol葡萄糖)，產(chǎn)氫效率提高2倍以上；在反應(yīng)器中完全充滿氧氣的條件下，仍然可以有大約五分之一的產(chǎn)氫能力。(4)本發(fā)明中的細(xì)菌同時(shí)還可以利用葡萄糖、蔗糖、淀粉等其他碳水化合物作為碳源快速高效產(chǎn)氫。(5)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例l:1、配制發(fā)酵產(chǎn)氫培養(yǎng)基，其成分如下KH2PO4200mg;K2HPO4800mg;MgS04.7H20200mg;CaSO4100mg;Na2Mo04*2H2O20mg;FeCl310mg;甘露醇5g;酵母浸汁500mg;蒸餾水1000ml;pH7.0;將培養(yǎng)好的菌種按體積比濃度為1%(v/v)的接種量接入經(jīng)12rC滅菌15分鐘的上述培養(yǎng)基中，發(fā)酵所用反應(yīng)器總?cè)莘e為315ml，裝液量為100ml，即反應(yīng)器裝液量約為反應(yīng)器總?cè)莘e的1/3。2、在上述反應(yīng)器中充純氮?dú)饧s5分鐘以趕盡其中的空氣，然后用注射器抽出約6ml氣體，然后再注入約6ml純氧以保證反應(yīng)器中初始氧氣濃度約2.72±0.30%;將步驟1中所述反應(yīng)器連接上帶刻度標(biāo)記的排水集氣裝置。放于33士rC的培養(yǎng)箱中恒溫靜止培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)50小時(shí)左右，獲得最大產(chǎn)氫量1620mlH2。3、收集氣體，利用氣相色譜儀TCD檢測(cè)器測(cè)定氫氣的含量，得到每克甘露醇最大產(chǎn)氫效率為324ml;利用氣相色譜儀氫氧焰離子檢測(cè)器(FID)測(cè)定發(fā)酵液中有機(jī)酸以及乙醇的含量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇，其余為乙酸和丁酸，其中乙醇占總產(chǎn)物的89%左右(質(zhì)量比)。實(shí)施例2:將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH用lmol/LHCl和lmol/LNaOH分別調(diào)到5.5、6、6.5、7、7.5、8，其余步驟與實(shí)施例1相同，產(chǎn)氫效率分別為167.33mlH2/g甘露醇、236.43mlH2/g甘露醇、287.59mlH2/g甘露醇、299.73mlH2/g甘露醇、286.24mlH2/g甘露醇、236.7mlH2/g甘露醇。實(shí)施例3:按實(shí)施例l所述培養(yǎng)基中甘露醇的量分別是2g、3g、4g、5g、6g、8g、10g,其余步驟同實(shí)施例1，其產(chǎn)氫效率分別是278.38mlH2/g甘露醇，287.13mlH2/g甘露醇，298.12mlH2/g甘露醇，312.15mlH2/g甘露醇，301.14mlH2/g甘露醇，263.11mlH2/g甘露醇，243.37mlH2/g甘露醇。實(shí)施例4:按實(shí)施例1所述方法，改變各發(fā)酵瓶中的初始氧氣濃度使呈梯度分布，分別為0.63%、1.02%、1.4%、2.72%、3.55%、5.44%、10.4%、15.44%,其余步驟與實(shí)施例1相同，其產(chǎn)氫效率分別為194.2mlH2/g甘露醇、227.07mlH2/g甘露醇、250.12mlH2/g甘露醇、324.4ml&/甘露醇、238.1mlH2/g甘露醇、198.2mlH2/g甘露醇、194.8mlH2/g甘露醇、172.2mlH2/g甘露醇。實(shí)施例5:將實(shí)施例1中的步驟2改為直接充純氧約5分鐘，以保證反應(yīng)器中氧氣的濃度達(dá)到最大，其余步驟與實(shí)施例1步驟相同，最終發(fā)現(xiàn)，在高初始氧氣濃度下(純氧氣)，仍然有一定產(chǎn)氫能力，約為最高產(chǎn)率的20%左右(60-70mlH2/g甘露醇)。實(shí)施例6:將實(shí)施例l所述培養(yǎng)基中的甘露醇分別改為葡萄糖、蔗糖、以及淀粉，質(zhì)量不變，其余步驟與實(shí)施例1完全相同，最終產(chǎn)氫率分別為161.8-182.6mlH2/g葡萄糖、170.5-186.3mlH2/g蔗糖、135.6-146.5mlH2/g淀粉。SEQUENCELISTING〈110〉中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所〈120>—株克雷伯氏菌及其在微氧發(fā)酵產(chǎn)氫中的用途〈130〉說(shuō)明書(shū)〈140>200810045058.2〈141>2008-03-26〈160>1<170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉1272〈212〉DNA<213>microorganism〈400〉1gagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgat60ggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtg120ggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtgggg180taacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactgga240actgsgacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgc織3tgggCg300caagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttc360agcggggaggaaggcgttgaggtt33taacctcctcgattgacgttacccgcagaagaag420caccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaa480ttactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctc540aacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattcc600aggtgtagcggtg,tgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccct660gg3caa3g3ctgacgctcaggtgcg咖gcgtggggagcaaacaggattagataccctgg720tagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccgga780gctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaat840tgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaacc■ttacctggtcttgacatccacagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactgt960gagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgc1020aacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttaggccgggaactcaa鄉(xiāng)卿ctg1080ccagtgataa3Ctgg3gg33ggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccag1140ggctacacacgtgctacaatggcatatacaa卿gaagcgacctcgcgagagcaagcgga1200cctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatg卿tcggaa1260tcgctagtaatc127權(quán)利要求1、一種克雷伯氏菌，其特征是拉丁文為Klebsiella.spHPB，保藏號(hào)為CGMCCNo.2317，菌落大，乳白色，半透明，光滑濕潤(rùn)，粘液狀，培養(yǎng)該細(xì)菌的培養(yǎng)基成分為KH2PO4200mg，K2HPO4800mg，MgSO4·7H2O200mg，CaSO4100mg，Na2MoO4·2H2O20mg，F(xiàn)eCl310mg，甘露醇2-10g或葡萄糖5g或蔗糖5g或淀粉5g，酵母浸汁500mg，蒸餾水1000ml。2、權(quán)利要求l所述克雷伯氏菌在微氧發(fā)酵產(chǎn)氫中的用途，其方法如下將菌種.spHPBCGMCCNo:2317按體積比為1:100的接種量接入經(jīng)121'C滅菌15分鐘的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30-36'C，pH6-8，以高純氮?dú)馀疟M氧氣，然后再注入氧氣，使反應(yīng)器中初始氧氣濃度為2.72±0.30%，發(fā)酵50小時(shí)，即可獲得氫氣；發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為KH2PO4200mg;K2HPO4800mg;MgS04'7H20200mg;CaS04100mg;Na2Mo04'2H2020mg;FeCl310mg;甘露醇2-10g或葡萄糖5g或蔗糖5g或淀粉5g;酵母浸汁500mg;蒸餾水1000ml。全文摘要本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種克雷伯氏菌HPB及其在微氧條件下以甘露醇為碳源的微生物制氫方法中的用途。本發(fā)明所克雷伯氏菌Klebsiella.spHPB，保藏號(hào)為CGMCCNo.2317，菌落大，乳白色，半透明，光滑濕潤(rùn)，粘液狀。用該菌種在微氧條件下發(fā)酵產(chǎn)氫，其方法如下將菌種接種到培養(yǎng)基中，在溫度30-36℃，pH6-8，以高純氮?dú)馀疟M氧氣，然后再注入氧氣，發(fā)酵50小時(shí)，即可獲得氫氣。本發(fā)明解決了在非完全厭氧條件下高效產(chǎn)氫的問(wèn)題，產(chǎn)氫效率高，成本低，易于工業(yè)化。文檔編號(hào)C12R1/22GK101544955SQ200810045058公開(kāi)日2009年9月30日申請(qǐng)日期2008年3月26日優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日發(fā)明者何曉紅,李大平,王曉梅,勇陶申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所