專(zhuān)利名稱(chēng)：一株肺炎克雷伯氏菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品微生物，酶制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)酸性脲酶的細(xì)菌。
背景技術(shù)：
脲酶(EC 3. 5. 1. 5)，又稱(chēng)尿素氨基水解酶，能將尿素分解為氨和二氧化碳。有部 分微生物產(chǎn)生的酸性脲酶不同于植物中提取的中性、偏堿性脲酶，它能耐受酸性環(huán)境，在 pH4. 0 5. 5的飲料酒中仍具有活性。 氨基甲酸乙酯(簡(jiǎn)稱(chēng)EC，又稱(chēng)脲烷)，廣泛存在于各種發(fā)酵食品中，是一種潛在的 致癌物質(zhì)，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將氨基甲酸乙酯(EC)歸為2A類(lèi)致癌物，與丙 烯酰胺同等危險(xiǎn)。自1985年加拿大食品監(jiān)管部門(mén)在白蘭地酒中檢測(cè)出較高含量的氨基甲 酸乙酯后，一些國(guó)家對(duì)飲料酒中的氨基甲酸乙酯給予了高度關(guān)注，加拿大，美國(guó)，歐盟等國(guó) 家和組織相繼制定了酒精飲料中氨基甲酸乙酯的限量標(biāo)準(zhǔn)。 研究發(fā)現(xiàn)，飲料酒中氨基甲酸乙酯主要由尿素和乙醇在一定條件下反應(yīng)生成，我 國(guó)黃酒中90%以上的氨基甲酸乙酯來(lái)源于該反應(yīng)。飲料酒中的尿素一部分來(lái)源于原輔料和 水中，但最主要的還是在發(fā)酵過(guò)程中由酵母菌代謝精氨酸產(chǎn)生。國(guó)內(nèi)外研究表明，在實(shí)際生 產(chǎn)中，向酒中添加酸性脲酶將酵母代謝產(chǎn)生的尿素及時(shí)除去可以有效地控制氨基甲酸乙酯 的形成和積累。日本學(xué)者將酸性脲酶加入酒中，放置14h后酒中尿素的含量幾乎降至零，而 且酒在貯存期也不再產(chǎn)生氨基甲酸乙酯。 我國(guó)擁有十分悠久的釀酒歷史，在距今7000多年的李家村文化時(shí)期，漢中就出現(xiàn) 了谷物酒，并逐步發(fā)展為現(xiàn)在的漢中黃酒，黃酒也因此與葡萄酒、啤酒并稱(chēng)為世界三大古 酒。我國(guó)黃酒品質(zhì)優(yōu)良，口感醇厚，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有深厚的文化底蘊(yùn)而遠(yuǎn)銷(xiāo)日本，韓國(guó)，東南 亞，歐美等多個(gè)國(guó)家。但近年來(lái)，我國(guó)黃酒在出口貿(mào)易上由于氨基甲酸乙酯殘留問(wèn)題遭到了 嚴(yán)重的技術(shù)貿(mào)易壁壘威脅。為了使產(chǎn)品質(zhì)量符合國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)黃酒廠至今仍然從國(guó)外進(jìn) 口價(jià)格昂貴的酒用酸性脲酶以降低氨基甲酸乙酯含量。因此研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的酒用 酸性脲酶對(duì)于我國(guó)釀酒行業(yè)突破發(fā)達(dá)國(guó)家設(shè)置的貿(mào)易技術(shù)壁壘，拓展國(guó)際市場(chǎng)等方面具有 重大的意義。 目前國(guó)內(nèi)也有關(guān)于產(chǎn)酸性脲酶菌株分離篩選的研究，但分離所得菌株產(chǎn)得的酸 性脲酶活性普遍不高。劉穎等從污水中分離的一株肺炎克雷伯氏菌所產(chǎn)酸性脲酶活力僅 有0. 268U/mL，而吳偉祥等分離所得的一株腸桿菌經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后酸性脲酶活力也僅有 2. 4U/mL，這些菌株都不能滿足酸性脲酶的規(guī)?；a(chǎn)，極大限制了我國(guó)酸性脲酶的應(yīng)用。 因此對(duì)高產(chǎn)酸性脲酶菌株的分離篩選顯得十分有必要，具有極大的研究和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
為改變現(xiàn)有菌株所產(chǎn)酸性脲酶活性不高的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)酸性脲酶 的肺炎克雷伯氏菌。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目的的提供一種肺炎克雷伯氏菌株，該肺炎克雷伯氏菌株保藏名稱(chēng)為肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML (Klebsiella pneumonia ZJUQHFML)，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保 藏日期2009年9月17號(hào)，保藏號(hào)CGMCC NO. 3286。 該肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML為克雷伯氏菌屬，在LB培養(yǎng)基上，菌株生長(zhǎng)良好，形 成灰白色圓形菌落，菌落表面隆起濕潤(rùn)，顯微鏡下觀察，細(xì)菌形態(tài)呈短桿型，兩端橢圓，革蘭 氏染色反應(yīng)呈陰性，有莢膜，無(wú)鞭毛。 本發(fā)明所述的肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML可用于酸性脲酶的生產(chǎn)，產(chǎn)酸性脲酶活 力為17. 17-28. 74U/mL。 本發(fā)明還提供了一種肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)ZJUQHFML CGMCC NO. 3286的培養(yǎng)方法，采用的培養(yǎng)基的組成以g/L計(jì)為 葡萄糖5-8，蛋白胨3-7，酵母膏0-2，Na2HP04 O.H，NaCl l-4，MgS040_0. 2，KH2P04 0-2，尿素1-6。 培養(yǎng)基pH為6. 5，在37t:培養(yǎng)24-72h。 本發(fā)明所述的肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML發(fā)酵產(chǎn)酸性脲酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，從而 獲得了適合工業(yè)化生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)條件和技術(shù)參數(shù)。本發(fā)明所公開(kāi)的肺炎克雷伯氏菌 ZJUQHFML產(chǎn)得的酸性脲酶活力是現(xiàn)有報(bào)道菌株的6-10倍，所產(chǎn)酶在酸性條件下性質(zhì)穩(wěn)定， 適宜用于飲料酒的生產(chǎn)。本發(fā)明所公開(kāi)的肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML經(jīng)過(guò)急性毒理動(dòng)物試 驗(yàn)為安全的，可以用于酸性脲酶的發(fā)酵生產(chǎn)和應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML的革蘭氏染色顯微鏡檢圖。
具體實(shí)施方式

菌株的篩選 從杭州市區(qū)不同地點(diǎn)采集的污泥中進(jìn)行菌種的分離與篩選，具體操作為將污泥采 用分離培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，取培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋?zhuān)谒嵝云桨迳贤坎迹羧?菌落周?chē)凕S色的單菌落于中性平板中，菌落周?chē)恍纬勺兩Φ募纯勺C明該菌株為產(chǎn)酸 性脲酶菌株，將這些菌株保存于斜面種子培養(yǎng)基上備用。將這些菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中 培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定酶活力，比較各菌株所產(chǎn)酶的活力，得到一株酶活力較高的菌株編號(hào) 為ZJUQHFML, 37。C培養(yǎng)48h后酶活力可達(dá)17. 17±0. 185U/mL。
篩選所用各種培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，蛋白胨4，KH2P043，NaCl 3，化2昍041，尿素5，p朋.5 ;
酸性平板培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨3，葡萄糖20，腿2 04 2，NaCl 5，MgS04 0. l，Na2HP04 l，尿素IO，溴甲酚紅紫0. 1，瓊脂3X，pH5. 5 ; 中性平板培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2，葡萄糖10，KH2P04 2，MgS04 0. l，NaCl 3，Na2HP04 l，尿素IO，中性酚紅O. 12，瓊脂3X，pH7.0 ; 液體種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl IO(斜面種子培養(yǎng)基需加 3%瓊脂)； 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，蛋白胨4，酵母膏l(xiāng)，Na2HP04 0. 5，NaCl 3，MgS04 0. 1，
4KH2P04 1 ，尿素5 ， p朋.5 ，裝瓶量30mL/250mL搖瓶。 菌株的保存與擴(kuò)培(種子斜面及平板培養(yǎng)方法37t:條件下培養(yǎng)48h。
發(fā)酵培養(yǎng)方法活化好的斜面種子轉(zhuǎn)接到液體種子培養(yǎng)基中，在37°C， 120rpm的 條件下擴(kuò)培一天，吸取lmL培養(yǎng)好的液體種子(菌齡24h)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37t:在旋轉(zhuǎn) 式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為120r/min。) 本發(fā)明的菌株在LB培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)良好，形成灰白色圓形菌落，菌落表面隆起濕 潤(rùn)，顯微鏡下觀察，細(xì)菌形態(tài)呈短桿型，兩端橢圓，革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性，有莢膜，無(wú)鞭毛。 革蘭氏染色顯微鏡檢圖如圖1所示。 利用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)該微生物的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如 下
生理生化特征結(jié)果生理生化特征結(jié)果生理生化特征結(jié)果
APPA—ADO+PyrA+
IARL-dCEL+BGAL+
H2S-BNAG一AGLTp-
dGLU+GGT+OFF+
BGLU+dMAL+dMAN+
dMNE+BXYL+BAlap-
ProA-LIP一PLE+
TyrA+URE+dSOR+
SAC+dTAG+dTRE+
CIT+固T+5KG一
ILATk+AGLU-SUCT+
NAGA-AGAL+PHOS+
GlyA—ODC-LDC+
IHISa-CMT-BGUR-
0129R+GGAA-IMLTA-
ELLM-ILATa- 注+代表陽(yáng)性，_代表陰性 將表中的生理生化特征鑒定結(jié)果與儀器內(nèi)自帶的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該微生物為肺 炎克雷伯氏菌。同時(shí)查閱伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯氏菌的菌落形態(tài)與本發(fā)明分離 所得菌株的菌落形態(tài)一致。 采用細(xì)菌16S rDNA通用引物F27和R1522擴(kuò)增該微生物的16S rDNA，將PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序，再將得到的堿基序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的16S rDNA基因比對(duì)。結(jié)果顯 示該菌的16S rDNA基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中肺炎克雷伯氏菌的16S rDNA基因序列相比，重合度高
5達(dá)100 % ，同源性也有99 % ，因此可以認(rèn)定該菌為肺炎克雷伯氏菌，并命名為肺炎克雷伯氏 菌(Klebsiella pneumonia)ZJUQHFML CGMCC NO. 3286。 利用本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)ZJUQHFMLCGMCC N0.3286生 產(chǎn)酸性脲酶的發(fā)酵培養(yǎng)方法如下 首先將其接種于斜面種子培養(yǎng)基進(jìn)行活化，再將菌種轉(zhuǎn)入液體種子培養(yǎng)基進(jìn)行增 殖培養(yǎng)，隨后按一定的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中在一定條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定酶活。
種子培養(yǎng)方法液體種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨IO，酵母提取物5， NaCl 10(斜面 種子培養(yǎng)基需加3%瓊脂)。 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵溫度為37t:，轉(zhuǎn)速為120r/min，發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間后停 止發(fā)酵，分析其酸性脲酶活性，具體為
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法一 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，蛋白胨4，酵母膏l(xiāng)，Na2HP04 0. 5， NaC13， MgS04 0. 1， KH2P04 1 ，尿素5 ， p朋.5 ，裝瓶量30mL/250mL搖瓶。 發(fā)酵培養(yǎng)基中接培養(yǎng)24h的種子液lmL，37t:培養(yǎng)48h后獲得酸性脲酶活為 17.17U/mL。 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法二 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖8，酵母膏1. 8， NaCl 5，尿素8， Na2HP040 . 9， MgS040. 2， 蛋白胨6. 015， p朋.5，裝瓶量30mL/250mL搖瓶。 發(fā)酵培養(yǎng)基中接培養(yǎng)24h的種 菌液lmL，37t:培養(yǎng)48h后獲得酸性脲酶活為 28.74U/mL。
權(quán)利要求
一種肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)ZJUQHFML CGMCCNO.3286。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML CGMCCNO. 3286，其特征在于在LB培養(yǎng)基上菌株形成灰白色圓形菌落，菌落表面隆起濕潤(rùn)，細(xì)菌形態(tài)呈短桿型，兩端橢圓，革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性，有莢膜，無(wú)鞭毛。
3 如權(quán)利要求1或2所述的肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML CGMCCNO. 3286，其特征在于產(chǎn)酸性脲酶活力為17. 17-28. 74U/mL。
4. 一種肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)ZJUQHFML CGMCCNO. 3286在生產(chǎn)酸性脲酶中的用途。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，將肺炎克雷伯氏菌ZJUQHFML CGMCCNO. 3286在pH為6. 5條件下，在37。C培養(yǎng)24_72h獲得酸性脲酶，其中采用的培養(yǎng)基的組成以g/L計(jì)為:葡萄糖5-8，蛋白胨3-7，酵母膏0-2， Na2HP04 0. 1-1， NaCl 1-4， MgS040_0. 2， KH2P040-2，尿素1-6。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)ZJUQHFML CGMCC NO.3286。其具有高產(chǎn)酸性脲酶能力，所產(chǎn)酸性脲酶活力可達(dá)17.17-28.74U/mL，可用于生產(chǎn)酸性脲酶。
文檔編號(hào)C12N9/80GK101712940SQ20091015356
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者何國(guó)慶, 傅明亮, 章海鋒, 陳啟和 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)