專利名稱：一種能夠自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種能特異性降解果實(shí)中 農(nóng)藥殘留的植物種質(zhì)的培育方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥污染是全球性環(huán)境問題之一 ，有機(jī)磷農(nóng)藥又是其中使用量最大、 施用面最廣、毒性最高的一類化合物。有些農(nóng)藥具有"三致"物質(zhì)，致癌與 致突變作用的潛伏期可達(dá)數(shù)十年以上，有的農(nóng)藥是環(huán)境激素，進(jìn)入動(dòng)物和 人體后干擾內(nèi)分泌，使生殖機(jī)能異常。目前已查明的"環(huán)境激素名錄"中，有
機(jī)化合物有67種，其中農(nóng)藥為44種，占65.7%。全世界每年需要施用百 萬噸農(nóng)藥，但直接用于靶標(biāo)生物的不超過5%,絕大多數(shù)農(nóng)藥殘留釋放到環(huán) 梗中(Pimental andLevitan 1986)。全世界因有機(jī)磷農(nóng)藥中毒每年死亡人數(shù)達(dá) 數(shù)十萬，主要發(fā)生在發(fā)展中國家(Eddleston M. 2000; Eddleston M, 2004)。 有機(jī)磷農(nóng)藥在蔬菜中的殘留不可忽視，2003年土耳其番茄中最大樂果殘留 水平達(dá)到mg/kg，而年產(chǎn)量達(dá)到425000噸(Anonymous 2003)。 2004年 P.Aysal等通過"C標(biāo)記樂果，檢測(cè)番茄果實(shí)中有機(jī)磷農(nóng)藥樂果殘留，發(fā)現(xiàn) 季中或季末殘留水平達(dá)到0.49ppm和0.45ppm,超過了歐盟最大樂果殘留限 制的0."ppm,其中果醬富集k殘比果汁高(P. Aysal， 2004)。
我國是個(gè)農(nóng)業(yè)大國，也是生產(chǎn)和消費(fèi)農(nóng)藥的大國。近年來，我國每年 生產(chǎn)的農(nóng)藥品種約200多個(gè)，加工鋪劑500多種，原藥的生產(chǎn)量約40萬噸， 排名世界第2位，農(nóng)藥中殺蟲劑占70%以上，而高毒的有機(jī)磷殺蟲劑又占 70%以上。每年農(nóng)藥使用達(dá)45億畝次，其中70-80%的農(nóng)藥直接散落到環(huán)境 中，對(duì)土壤、地表水、地下水和農(nóng)產(chǎn)品造成污染。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年引發(fā)數(shù)萬 起人員中毒傷亡事件，中毒的人數(shù)占世界同類事故中毒人數(shù)的50%。
農(nóng)藥的大量施用與濫用，使農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)。不僅農(nóng)產(chǎn)品表 面農(nóng)藥殘留高，而且由于許多農(nóng)藥具有接觸吸收作用，可以滲透進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品 內(nèi)部，尤其是植物源農(nóng)產(chǎn)品還可以通過維管束從水體中吸收而富集，導(dǎo)致 農(nóng)副產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，并進(jìn)一步進(jìn)入生物一隨。如茶葉中DDT超標(biāo)，蜂蜜 中含有殺蟲醚，蘋果中含有曱胺磷，葡萄汁商品飲料中檢測(cè)到甲基內(nèi)吸磷、 克線磷、曱硫威(Yolanda Pic6,2007),番茄醬中含有多種有機(jī)磷(李鋒格， 2006)，凍豬肉、凍免、凍雞中農(nóng)藥殘留超標(biāo)等，嚴(yán)重影響我國的對(duì)外貿(mào)易。
利用農(nóng)藥降解基因構(gòu)建工程菌用于降解酶生產(chǎn)或農(nóng)殘修復(fù)，已進(jìn)行了 一些研究。Shimazu等用INPNC-OPH把農(nóng)藥水解酶OPH定位到大腸桿菌(Eco//)和摩氏桿菌(Morare//" sp.)細(xì)胞表面，使其能夠同時(shí)降解有機(jī)
磷農(nóng)藥和PNP。 Lan等在pETDuet中同時(shí)表達(dá)了來自黃桿菌的有機(jī)磷水解
酶基因opd和來自致倦庫蚊Culex pipiens的羧酸酯酶基因bl,攜帶該載體
的工程菌可以同時(shí)降解有機(jī)磷、氨基曱酸鹽和擬除蟲菊酯三類農(nóng)藥。蔣建
東等將mpd基因插入到鞘氨醇單胞菌CDS-1菌抹的rDNA位點(diǎn)且不帶入外
源抗性，工程菌抹CDS-lmpd和CDS-2mpd能同時(shí)降解曱基對(duì)硫磷和克百
威。已有研究主要集中在使用基因工程菌或其生產(chǎn)的降解酶修復(fù)農(nóng)藥污染 的水體和土壤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述缺點(diǎn)而提供的一種既能降低果實(shí)的農(nóng)藥殘 留，同時(shí)也不影響田間農(nóng)藥的功效，從而有利于提高產(chǎn)量和質(zhì)量的一種能 自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)培育方法。
本發(fā)明的一種能自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)的培育方法，包括下列步驟 (1 )按常規(guī)方法克隆果實(shí)特異性啟動(dòng)子
所述的果實(shí)特異性啟動(dòng)子是E8等果實(shí)特異性基因表達(dá)啟動(dòng)子；根據(jù) Genbank accession: AF515784.1中提供的E8啟動(dòng)子序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物 以番茄DNA為模板做PCR擴(kuò)增，E8啟動(dòng)子的引物為
P1: 5 ，-CCCAAGCTTAGGAATTTCACGAAATCG -3';
P2: 5 ，-CGCGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATG -3'; (2 )人工合成有機(jī)磷水解酶OPH的基因
所述的有機(jī)磷水解酶具有Genebank Accession: AAA24930所述氨基酸 序列，根據(jù)番茄密碼子偏好性翻譯成堿基序列后人工合成而得； (3 )構(gòu)建果實(shí)特異性O(shè)PH植物表達(dá)載體
將E8擴(kuò)增產(chǎn)物和人工合成的OPH基因序列分別連接到pGEM-T easy 上構(gòu)建出pGEM-E8和pGEM-OPH,然后用HindIII和BamHI雙酶切 pGEM-TE8和pSH,把E8構(gòu)建到pSE8;用EcoRI單酶切pGEM-OPH和 pSE8，把OPH構(gòu)建到pSE80P,篩選出正向連接載體，從而得到果實(shí)特異 性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體備用；
(4) 轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌和植物外植體 所述植物外植體來源于番茄、黃瓜或辣椒等植物。
將表達(dá)載體pSE80P用凍融法轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌LBA4404,挑取含有 表達(dá)載體pSE80P的農(nóng)桿菌單菌落，在含100mg'U1 Km和20 mg'L/1 Rif的 YEP培養(yǎng)基中28。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.7, 6000rpm離心5min收集 菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌體；挑選鮮嫩的植物外植體于重懸的菌液 中浸泡10min,用無菌濾紙吸干菌液后接于共培養(yǎng)基上，2天后轉(zhuǎn)入脫菌培 養(yǎng)基(含06纟30011^七-1)上，保持選擇壓繼代2次，直至脫菌完全；
(5) 轉(zhuǎn)基因植抹的分化、移栽
5將在脫菌培養(yǎng)基上存活下來的外植體接于分化培養(yǎng)基上，分化的幼苗
長至2-3cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待苗長至5-10cm時(shí)打開瓶差，煉
苗3-5d后移植到土壤中。
所述MS重懸培養(yǎng)基中含有100 mg.L-1 AS及20 g'L一蔗糖。 所述預(yù)培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg丄-1 6-BA、 0.1 mg.L" IAA及20g.U1蔗糖。 所述共培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg丄"6-BA、 O.lmg.L"IAA、 100mg七-'AS及 20g丄"蔗糖。
所述脫菌培養(yǎng)基中含有1.0mg.L/1 6-BA、 0.1 mg'L" IAA、 300mg.L—1 Cef 及30g'L—'蔗糖；
所述分化培養(yǎng)基含有l(wèi).Omg.L" 6-BA、 0.1 mg丄"IAA、 300mg.L/1 Cef、 70mg七"Km及30g'U'蔗糖；
所述生根培養(yǎng)基中含有0.1 mg丄"IAA、 300 mg'L—1 Cef、 70mg.L一 Km 及20 g七—1蔗糖。
除生根培養(yǎng)基以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其余培養(yǎng)基均以MS為基礎(chǔ)培 養(yǎng)基。
其中1LMS培養(yǎng)基中包含硝酸鉀(KN03) 1900mg,硝酸銨(NH4N03) 1650mg,氯化釣(CaC12'2H2O)440mg，硫酸鎂(MgS04.7H20) 370mg，磷酸 二氫鉀(KH2P04) 170mg , 硫酸錳(MnS04'4H20) 22.3mg , 硫酸鋅 (ZnS04'7H20) 8.6mg,硼酸(H2B03) 6.2mg,碘化鉀(KI) 0.83mg,鉬酸鈉 (Na2Mo04.2H20) 0.25mg,乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg, 硫酸亞鐵(FeS04.7H20) 27.8mg,硫酸銅(CuSO小5H20) 0.025mg,氯化鈷 (COC12.6H20) 0.025mg,肌醇100mg,煙酸0.5mg,鹽酸石克胺素(維Bl) O.lmg,鹽酸吡,素(維B6)0.5mg,甘氨酸2mg, PH值5.80。 1LYEP培養(yǎng) 集中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl， PH值7.20。
由上可知，本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把 由杲實(shí)特異性啟動(dòng)子E8和有機(jī)磷水解酶OPH基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體 pE80P轉(zhuǎn)化植物外植體，使其獲得果實(shí)特異性降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的能力， 也不影響整個(gè)植株噴施農(nóng)藥對(duì)病害防治的功效，增強(qiáng)了果蔬的食品安全。 以下通過具體實(shí)施方式
來進(jìn)一點(diǎn)說明本發(fā)明的有益效果。


圖1 E8啟動(dòng)子的克隆；
圖2人工合成有機(jī)磷水解酶OPH基因的堿基序列及氨基酸序列; 圖3植物表達(dá)載體pE80P的構(gòu)建示意圖； 圖4番茄GUS染色與酶活分析具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:自發(fā)消除農(nóng)殘的番茄種質(zhì)培育(1 )按常規(guī)方法克隆果實(shí)特異性啟動(dòng)子
從番茄葉片中提取基因組DNA,用PCR方法克隆UKbE8啟動(dòng)子(見 圖l),根據(jù)GenbankID: AF515784J中提供的E8啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)PCR引 物，由上海捷瑞生物工程公司合成，序列為
P1: 5, -CCCAAGCTTAGGAATTTCACGAAATCG -3';
P2: 5 ,-CGCGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATG -3';
上游引物引入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)。按 照質(zhì)粒pGEM-T easy使用說明，將克隆產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pGEM-T easy上轉(zhuǎn) 化￡. co// TGI,通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆，送北京三博遠(yuǎn)志生物公司 測(cè)序，以獲得正確的E8啟動(dòng)子基因序列。
(2 )人工合成有機(jī)磷水解酶OPH的基因
根據(jù)Genebank gi:148713公布有機(jī)磷水解酶氨基酸序列和番茄密碼子 偏好性，設(shè)計(jì)OPH基因序列(見圖2),由上海捷瑞生物工程公司合成。
(3) 構(gòu)建果實(shí)特異性O(shè)PH植物表達(dá)載體
將E8擴(kuò)增產(chǎn)物和人工合成的OPH基因序列分別連接到pGEM-T easy 上構(gòu)建出pGEM-E8和pGEM-OPH,然后用HindIII和BamHI雙酶切 pGEM-TE8和pSH,將E8啟動(dòng)子替換pSH上35S啟動(dòng)子，把E8構(gòu)建到pSE8; 用EcoRI單酶切pGEM-OPH和pSE8，由T4 DNA連接酶連接，把OPH構(gòu) 建到pSESOP，然后通過HindIII和KpnI雙酶切篩選正向植物表達(dá)載伴，從 而得到果實(shí)特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化￡. co// TG1保存菌種 備用(見圖3)。
質(zhì)粒pGEM-T easy購自Promega公司，所有宿主菌co/z' TG1和 爿grai)flcten.ww ZwMey^c/era LBA4404由本室j呆存。LA.Taq DNA聚合酶，以 及各種限制性內(nèi)切酶BamHI、 Kpnl、 HindIII和EcoRI、 T4 DNA連接酶均 為TaKaRa產(chǎn)品，其余試劑為分析純。細(xì)菌增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng) 基，含質(zhì)粒菌體的培養(yǎng)基中加卡那霉素濃度為100mg/l;
(4) 轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌和番茄外植體
將表達(dá)載體pSE80P用凍融法轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌LBA4404。挑取含有 表達(dá)載體pSE80P的農(nóng)桿菌單菌落，在含lOOmg丄-1 Km和20 mg丄-1 Rif的 YEP培養(yǎng)基中28。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.7, 6000rpm離心5min收集 菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌體用于侵染番茄外植體。
小皇后櫻桃番茄種子購買自中國農(nóng)科院蔬菜花卉所。成熟的番茄種子 用75。/。酒精浸泡45s,再用0.05。/。HgC12浸泡60S,用無菌水清洗5次，吸 干水分接于MS培養(yǎng)基上，當(dāng)種子萌發(fā)有5cm高并且子葉充分伸展時(shí)，切 取下胚軸和子葉塊在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天。番茄的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介 導(dǎo)法。將預(yù)培養(yǎng)的番茄下胚軸和子葉塊在重懸的菌液中浸泡10min,用無菌 濾紙吸干菌液后接于共培養(yǎng)基上，2天后轉(zhuǎn)入脫菌培養(yǎng)基(含Cef 300mg丄") 上，保持選擇壓繼代2次，直至脫菌完全；(5)轉(zhuǎn)基因植抹的分化、移栽
將脫菌完全的外植體接于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為4000ux、 Mh/d。每20天繼代一次，分化的幼苗長至3-5cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，待苗長至5-10cm時(shí)打開瓶蓋，煉苗3-5d后移植到土壤中。
植物組織培養(yǎng)各個(gè)階段培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化為暗培養(yǎng)；脫菌、分 化、生根為光培養(yǎng)，光強(qiáng)為40001ux、 14h/d。MS重懸培養(yǎng)基中含有l(wèi)OOmg-L" AS及20 g.L"蔗糖；預(yù)培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg.L" 6-BA、 0.mg.L" IAA及 20g'L"蔗糖；共培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg.U1 6-BA、 0.1 mg.L-1 IAA、〗00 mgl/'AS 及20g七"蔗糖；脫菌培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg.L" 6-BA、 0.1 mg'!/1 IAA、 300mg.L" Cef及30 g.L-1蔗糖；分化培養(yǎng)基含有l(wèi).Omg.L" 6-BA、 0.1 mg.U'IAA、 300mg丄-'Cef、 70mg.L/1 Km及30g七-'蔗糖；生根培養(yǎng)基中含 有0.1 mg丄—1 IAA、 300 mg'L/' Cef、 70mg'L" Km及20 g'U1蔑糖。實(shí)驗(yàn)中除 生根培養(yǎng)基以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其余培養(yǎng)基均以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
其中1LMS培養(yǎng)基中包含硝酸鉀(KN03) l卯Omg,硝酸銨(NH4N03) 1650mg,氯化釣(CaC12'2H2O)440mg,硫酸鎂(MgS04'7H20) 370mg,磷酸 二氮鉀(KH2P04) 170mg , 硫酸錳(MnS04.4H20) 22.3mg , 硫酸鋅 (ZnS04.7H20) 8.6mg，硼酸(H2B03) 6.2mg,碘化鉀(KI) 0.83mg,鉬酸鈉 (Na2MoO4-2H20) 0.25mg，乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg, 硫酸亞鐵(FeS04.7H20) 27.8mg,硫酸銅(CuSO小5H20) 0.025mg,氯化鈷 (COC12.6H20) 0.025mg,肌醇100mg,煙酸0.5mg,鹽酸石充胺素(維Bl) O.lmg,鹽酸吡,素(維B6)0.5mg,甘氨酸2mg, PH值5.80。 1LYEP培養(yǎng) 集中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl， PH值7.20。
通過以下方法進(jìn)4亍快速檢測(cè)
a. 、 OPH基因?qū)Ψ训乃矔r(shí)轉(zhuǎn)化
將制備表達(dá)載體pE80P的農(nóng)桿菌LBA4404在含100 mg七"Km和20 mg七-i Rif的YEP培養(yǎng)基中28。C震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.7時(shí)，在 6000rpm下5min收集菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌體至OD600約為2.0。 用lml注射器從青果期櫻桃番茄基部插入3-4mm深，4巴6ml左右重懸菌液 輕緩注入番茄果肉組織中，28。C培養(yǎng)3d后進(jìn)行分析。
b、 轉(zhuǎn)化番茄的GUS染色和酶活檢測(cè)
轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)3d,切取薄片進(jìn)行GUS染色，切取染色成功的番茄、剩余 部分進(jìn)行酶活分析。對(duì)GUS染色陽性的番茄進(jìn)行表面消毒后，用液氮速凍 快速研磨成漿，加入2-3倍體積的50mM Tris-Hcl (pH 8.4)緩沖液，冰浴 下繼續(xù)研磨至透明，然后12000rpm, 15min取上清作為粗酶液。取200^1 含O.lmM蠅毒磷的50mM Tris-Hcl ( pH 7.4 )緩沖液，并向反應(yīng)體系中添加 20|il粗酶液，在28。C暗箱靜置30min后，340nrn UV下觀察熒光產(chǎn)生情況 (見圖4)。
在同樣的反應(yīng)體系中，通過對(duì)比A(滅活的轉(zhuǎn)化果實(shí)粗酶液)與B (轉(zhuǎn)化果實(shí)粗酶液)，以及C (未轉(zhuǎn)化果實(shí)粗酶液)之間熒光產(chǎn)生情況，結(jié)果表
明經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的番茄可以表達(dá)GUS和有機(jī)磷水解酶OPH,該酶能將有機(jī)磷 農(nóng)藥蠅毒磷降解生成香豆素類衍生物，從而^ UY激發(fā)下釋放出熒光。"因
OPH，所以反映出的酶活是番茄果實(shí)表達(dá)的情況，可以有效降解有機(jī)磷農(nóng)藥。
實(shí)施例2:自發(fā)消除農(nóng)殘的黃瓜種質(zhì)培育
(1 )按常規(guī)方法克隆果實(shí)特異性啟動(dòng)子 同實(shí)施例l;
(2 )人工合成有機(jī)磷水解酶OPH的基因 同實(shí)施例1;
(3) 構(gòu)建果實(shí)特異性O(shè)PH植物表達(dá)載體 同實(shí)施例1;
(4) 轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌和黃瓜外植體 轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌同實(shí)施例1;
津研4號(hào)黃瓜種子購自天津農(nóng)科院。把成熟的黃瓜種子溫水浸泡lh, 剝皮后用75。/。酒精浸泡45s,再用0.1% HgCb浸泡5min,用無菌水清洗5 次，滅菌紙吸干水分接于MS培養(yǎng)基上，當(dāng)種子萌發(fā)有5cm高并且子葉充 分伸展時(shí)，切取子葉帶柄的下半截在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天。將制備表達(dá)載 體pE80P的農(nóng)桿菌LBA4404在含100 mg-L-l Km和20 mg七-1 Rif的YEP 培養(yǎng)基中28。C震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.7時(shí)，在6000rpm下5min收集 菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌體。挑選深綠色預(yù)培養(yǎng)的子葉塊于重懸的 菌液中浸泡，其間不斷搖動(dòng)，10min后取出用無菌濾紙吸干菌液接于共培養(yǎng) 基上培養(yǎng)。經(jīng)共培養(yǎng)3天后的外植體轉(zhuǎn)接于脫菌培養(yǎng)基，保持選擇壓7天 保i正脫菌完全。
(5) 轉(zhuǎn)基因植抹的分化、移栽 同實(shí)施例1。
通過以下方法進(jìn)行快速檢測(cè)
a、 OPH基因?qū)S瓜的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化
將制備表達(dá)載體pE80P的農(nóng)桿菌LBA4404在含100 mg丄"Km和20 mg丄"Rif的YEP培養(yǎng)基中28。C震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.7時(shí)，在 6000rpm下5min收集菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌體至OD600約為2.0。 用重懸菌液在真空70kpa條件下浸潤黃瓜果實(shí)薄片10min,快速釋放后重復(fù) 浸潤10min, 28。C培養(yǎng)3d后進(jìn)行酶活分析。
b、 轉(zhuǎn)化黃瓜的GUS染色和酶活檢測(cè)
轉(zhuǎn)化黃瓜果實(shí)切片28。C培養(yǎng)3d后，切取部分進(jìn)行GUS染色，切取染 色成功的黃瓜剩余部分進(jìn)行酶活分析。'對(duì)GUS染色陽性的黃瓜用液氮速凍 快速研磨成漿，加入2-3倍體積的50mM Tris-Hcl (pH 8.4)緩沖液，冰浴下繼續(xù)研磨至透明，然后12000rpm， 15min取上清作為粗酶液。取200pl 含O.lmM蠅毒磷的50mM Tris-Hcl (pH 7.4 )緩沖液，并向反應(yīng)體系中添加 20^1粗酶液，在28。C暗箱靜置30min后，340nm UV下觀察熒光產(chǎn)生情況。 結(jié)果表明經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的黃瓜可以表達(dá)GUS和有機(jī)磷水解酶OPH。
實(shí)施例3:自發(fā)消除農(nóng)殘的辣椒種質(zhì)培育 (1 )按常規(guī)方法克隆果實(shí)特異性啟動(dòng)子
同實(shí)施例1;
(2 )人工合成有機(jī)磷水解酶OPH的基因 同實(shí)施例1;
(3) 構(gòu)建果實(shí)特異性O(shè)PH植物表達(dá)載體-. 同實(shí)施例1;
(4) 轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌和辣椒外植體 轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌同實(shí)施例1;
天椒一號(hào)辣椒種子購自北京金天利公司。把種子表面用95%酒精浸泡 45s,再用50%漂白劑浸泡10min,用無菌水清洗5次，滅菌紙吸干水分接 于MS培養(yǎng)基上，25。C光照培養(yǎng)，當(dāng)種子萌發(fā)子葉充分伸展時(shí)，切取下胚 軸在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天。將制備表達(dá)載體pE80P的農(nóng)桿菌LBA4404在含 100 mg'L-1 Km和20 mg.L-1 Rif的YEP培養(yǎng)基中28。C震蕩培養(yǎng)至OD600 約為0.5-0.7時(shí)，在6000rpm下5min收集菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌 體。預(yù)培養(yǎng)后的下胚軸段i重懸菌液中浸泡，其間不斷搖動(dòng)，10min后取出， 用無菌濾紙吸干菌液接于共培養(yǎng)基上培養(yǎng)。經(jīng)共培養(yǎng)3天后的外植體轉(zhuǎn)接 于脫菌培養(yǎng)基，保持選擇壓7天保證脫菌完全。
(5) 轉(zhuǎn)基因植抹的分化、移栽 同實(shí)施例1。
通過以下方法進(jìn)行快速檢測(cè)
a、 OPH基因?qū)苯返乃矔r(shí)轉(zhuǎn)化
將制備表達(dá)載體pE80P的農(nóng)桿菌LBA4404在含100 mg丄"Km和20 mg丄-1 Rif的YEP培養(yǎng)基中28。C震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.7時(shí)，在 6000ipm下5min收集菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌體至OD600約為2.0。 用重懸菌液在真空70kpa條件下浸潤辣椒果皮20min,快速釋放后重復(fù)浸潤 20min, 28。C培養(yǎng)3d后進(jìn)行酶活分析。
b、 轉(zhuǎn)化辣椒的GUS染色和酶活檢測(cè) 把轉(zhuǎn)化辣椒果皮用液氮速凍快速研磨成漿，加入2-3倍體積的50mM
Tris-Hd (pH8.4)緩沖液，冰浴下繼續(xù)研磨至透明，然后U000卬m， "min 取上清作為粗酶液。取200^1含0.lmM蠅毒磷的50mM Tris-Hcl (pH 7.4 ) 緩沖液，并向反應(yīng)體系中添加20pl粗酶液，在28。C暗箱靜置30min后， 340nm UV下觀察熒光產(chǎn)生情況。結(jié)果表明經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的辣椒可以表達(dá)GUS 和有機(jī)-疇水解酶OPH。
權(quán)利要求
1、一種能自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)的培育方法，包括下列步驟(1)按常規(guī)方法克隆果實(shí)特異性啟動(dòng)子所述的果實(shí)特異性啟動(dòng)子是E8等果實(shí)特異性基因表達(dá)啟動(dòng)子；根據(jù)Genbank accessionAF515784.1中提供的E8啟動(dòng)子序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物以番茄DNA為模板做PCR擴(kuò)增，E8啟動(dòng)子的引物為P15’-CCCAAGCTTAGGAATTTCACGAAATCG-3’；P25’-CGCGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATG-3’；(2)人工合成有機(jī)磷水解酶OPH的基因所述的有機(jī)磷水解酶具有Genebank AccessionAAA24930所述氨基酸序列，根據(jù)番茄密碼子偏好性翻譯成堿基序列后人工合成而得；(3)構(gòu)建果實(shí)特異性O(shè)PH植物表達(dá)載體將E8擴(kuò)增產(chǎn)物和人工合成的OPH基因序列分別連接到pGEM-T easy上構(gòu)建出pGEM-E8和pGEM-OPH，然后用HindIII和BamHI雙酶切pGEM-TE8和pSH，把E8構(gòu)建到pSE8；用EcoRI單酶切pGEM-OPH和pSE8，把OPH構(gòu)建到pSE8OP，篩選出正向連接載體，從而得到果實(shí)特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體備用；(4)轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌和植物外植體將表達(dá)載體pSE8OP用凍融法轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌LBA4404，挑取含有表達(dá)載體pSE8OP的農(nóng)桿菌單菌落，在含100mg·L-1Km和20mg·L-1Rif的YEP培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.7，6000rpm離心5min收集菌體，用MS重懸培養(yǎng)基重懸菌體；挑選鮮嫩的植物外植體于重懸的菌液中浸泡10min，用無菌濾紙吸干菌液后接于共培養(yǎng)基上，2天后轉(zhuǎn)入脫菌培養(yǎng)基(含Cef 300mg·L-1)上，保持選擇壓繼代2次，直至脫菌完全；(5)轉(zhuǎn)基因植株的分化、移栽將在脫菌培養(yǎng)基上存活下來的外植體接于分化培養(yǎng)基上，分化的幼苗長至2-3cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待苗長至5-10cm時(shí)打開瓶蓋，煉苗3-5d后移植到土壤中。
2、 如權(quán)利要求1所述能自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)的培育方法，其中 植物外植體來源于番茄、黃瓜或辣椒。
3、 如權(quán)利要求1或2所述能自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)的培育方法，其中MS重懸培養(yǎng)基中含有100 mg'U1 AS及20 g.L"蔗糖； 預(yù)培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg.L-1 6-BA、 0.1 mg.U1 IAA及20g.U1蔗糖;所述 共培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg.L-1 6-BA、 0.1 mg-L-1 IAA、 100 mg.L"AS及 20g七"蔗糖；脫菌培養(yǎng)基中含有l(wèi).Omg'L-1 6-BA、 0.1 mg.L" IAA、 300mg-L" Cef及 30 g七"蔗糖；分化培養(yǎng)基含有l(wèi).Omg七-'6-BA、 0.1 mg.L"IAA、 300mg.L" Cef、 70mg丄"Km及30g丄-'蔗糖；生根培養(yǎng)基中含有O.l mg.L—'IAA、 300 mg丄-1 Cef、 70mg.L" Km及20 g-U1蔗糖；除生根培養(yǎng)基以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其余培養(yǎng)基均以MS為基礎(chǔ)培 養(yǎng)基。
4、如權(quán)利要求3所述能自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)的培育方法，其中 ]丄MS培養(yǎng)基中包含硝酸鉀(KN03) 1900mg,硝酸銨(NH4N03) 165Gmg, 氯化鈣(CaCI2'2H20) 440mg，硫酸鎂(MgS04.7H20) 370mg,磷酸二氫鉀 (KH2P04) 170mg,硫酸錳(MnS04.4H20) 22.3mg,硫酸鋅(ZnS04.7H20) 8.6mg,硼酸(H2B03)6.2mg,石典化鉀(KI) 0.83mg,鉬酸鈉(Na2Mo04'2H20) 0.25mg ,乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg ，硫酸亞鐵 (FeS04.7H20) 27.8mg，硫酸銅(CuS04.5H20) 0.025mg,氯化鈷(COC12'6H20) 0.025mg,肌醇100mg,煙酸0.5mg,鹽酸硫胺素(維B〗)O.lmg,鹽酸魂哆 素(維B6)0.5mg,甘氨酸2mg, PH值5.80;1LYEP培養(yǎng)集中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCJ， PH 值7.20。
全文摘要
一種能自發(fā)消除農(nóng)殘的果實(shí)種質(zhì)的培育方法，包括下列步驟(1)按常規(guī)方法克隆果實(shí)特異性啟動(dòng)子(2)人工合成有機(jī)磷水解酶OPH的基因；(3)構(gòu)建果實(shí)特異性O(shè)PH植物表達(dá)載體將E8擴(kuò)增產(chǎn)物和人工合成的OPH基因序列分別連接到pGEM-T easy上構(gòu)建出pGEM-E8和pGEM-OPH，然后用HindIII和BamHI雙酶切pGEM-TE8和pSH，把E8構(gòu)建到pSE8；用EcoRI單酶切pGEM-OPH和pSE8，把OPH構(gòu)建到pSE8OP，篩選出正向連接載體，從而得到果實(shí)特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體備用；(4)轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌和植物外植體；(5)轉(zhuǎn)基因植株的分化、移栽。本發(fā)明既能降低果實(shí)的農(nóng)藥殘留，同時(shí)也不影響田間農(nóng)藥的功效，從而有利于提高產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101451144SQ20081006877
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2008年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日
發(fā)明者晨 潘, 趙德剛, 趙杰宏, 潔 韓 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)