專利名稱：：一種粘質(zhì)沙雷氏菌及生產(chǎn)的靈菌紅素的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及其產(chǎn)物酶領域。具體的說，本發(fā)明涉及一種可產(chǎn)生靈菌紅素的內(nèi)生菌及其制備產(chǎn)生靈菌紅素的
技術領域：
。
背景技術：
：色素可分為天然色素和人工合成色素兩類，其在食品和化妝品生產(chǎn)中的應用非常廣泛。隨著醫(yī)學毒理和生物學研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)允許使用的人工合成色素中，大多數(shù)種類對人體有不同程度的傷害，尤其是致癌，致畸，致突變，已引起人們的高度重視。為此，天然色素已逐漸在取代合成色素。因動植物材料生長繁殖受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的影響,原料不足,從中提取的色素價格昂然色素的諸多缺點,并且易于工業(yè)化。因此,采用微生物生產(chǎn)天然色素將逐漸成為天然色素來源的發(fā)展方向。靈菌紅素(Prodigiosin，PG)是一類含曱氧基吡咯骨架結構的天然色素，通常都有3個吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結構，是一些放線菌、沙雷氏菌及其他細菌的次級代謝產(chǎn)物，具有免疫抑制、抗細菌、抗真菌和抗癥疾等多種生物活性。最近研究表明靈菌紅素有很強的抗腫瘤及免疫抑制活性，因而成為研究熱點。靈菌紅素屬于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在極性較強的酸性和堿性水溶液中微溶，在極性較弱的有機溶劑如乙醚或石油醚中微溶或不溶；該色素對溫度穩(wěn)定，但受pH的影響較大，酸性環(huán)境中能保持較長的時間，堿性條件下則損失較大，分子式為C20H25N30;靈菌紅素具有強烈的細胞溶解酶活性，能殺滅引起赤潮的浮游藻類，靈菌紅素有望通過毒性實驗和環(huán)境影響檢測，成為治理赤潮的產(chǎn)品?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),靈菌紅素以其獨特的結構，具有毗咯亞曱基骨架、特異的活性，而在癌癥治療上具有很大的藥用潛力。微生物發(fā)酵生產(chǎn)領域內(nèi)靈菌紅素屬天然色素，可大量用于食品工業(yè)。但靈菌紅素作用機理還不十分清楚，現(xiàn)研究主要集中在靈菌紅素誘導腫瘤細胞凋亡的作用上?？傊?，靈菌紅素作為一種新研究的抗腫瘤活性物質(zhì)，具有很好的開發(fā)成抗癌新藥的潛力。對靈菌紅素性質(zhì)的研究國內(nèi)已有多篇文獻報道，但這些產(chǎn)靈菌紅素的細菌多自海水或土壤中分離，而對內(nèi)生菌類產(chǎn)生靈菌紅素的系統(tǒng)研究卻未見報道。
發(fā)明內(nèi)容針對目前國內(nèi)外內(nèi)生菌類特別是塊根芍藥內(nèi)生菌類靈菌紅素的系統(tǒng)研究未見報道，通過對藥用植物內(nèi)生菌的多樣性研究，可以找到產(chǎn)生與宿主相同、相似甚至全新結構活性成分的菌林具有重要意義。本發(fā)明通過對新疆藥用植物塊根芍藥內(nèi)生菌進行篩選分離鑒定，獲得了一批能產(chǎn)生靈菌紅素的菌林，并對該菌抹的獲得高效的生物活性物質(zhì)和天然色素奠定了菌種基礎，該菌珠產(chǎn)生的靈菌紅素可作為抗肺瘤藥物和抗生素資源，其安全性高，熱穩(wěn)定性強，具有較好的研究前景。本發(fā)明的技術方案本發(fā)明根據(jù)新疆的地理環(huán)境的特殊性，從新疆典型的新疆藥用植物塊根芍藥樣本中進行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批內(nèi)生菌菌才朱，并從中分離篩選出產(chǎn)靈菌紅素產(chǎn)生菌林，編號為toAGg/7a/aj^^-6，從而提供了一林產(chǎn)靈菌紅素的產(chǎn)生菌，其具有生產(chǎn)靈菌紅素的優(yōu)良特性，經(jīng)微生物學分類與鑒定，屬于粘質(zhì)沙雷氏菌(mwcwce附)。本發(fā)明具體提供了一種粘質(zhì)沙雷氏菌(5^ratomarcescem)、其產(chǎn)生的靈菌紅素及其制備工藝。該粘質(zhì)沙雷氏菌(&rra//a歸rcascmy)代謝產(chǎn)生的色素在酸性條件下呈現(xiàn)紅色，堿性條件下顯示黃色，在酸性條件下較穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性較好，不同濃度的蔗糖、亞硫酸鈉和苯甲酸鈉溶液對其穩(wěn)定性影響不大，該色素溶于乙醇、曱醇、丙酮，不溶于水。按照光譜特性、pH值及溶解性，確定該天然色素為靈菌紅素(/rac^/ow'w)。本發(fā)明提供的一種產(chǎn)生靈菌紅素沙雷氏菌抹，命名為toAag/wto少-W-6,其能夠產(chǎn)生穩(wěn)定而明顯的靈菌紅素。該菌抹已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2008年7月14日，保藏號是CGMCC.No2593。經(jīng)微生物學鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌(Swrato應脂c微)。該菌抹大小為0.8-0.9umx1,2-1.3um，短桿狀，革蘭氏陰性細菌，無芽孢，有莢膜，無鞭毛，無運動。菌落呈圓形，光滑，濕潤，表面隆起呈金屬光澤，邊緣不整齊，有輕微異味，菌落呈紫紅色，色素不擴散到培養(yǎng)基中。該菌抹產(chǎn)紅色代謝產(chǎn)物，生長快，代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高，無毒性；該菌抹兼性好氧，可氧化發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、海藻糖，不能夠氧化發(fā)酵鼠李糖，能夠氧化發(fā)酵山梨醇、甘露醇、肌醇，氧化酶陰性，淀粉酶陰性，可利用檸檬酸鹽，不能還原硝酸鹽，不能夠產(chǎn)&S，VP陽性，精氨酸水解酶陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，尿素分解陰性，鳥氨S臾脫羧酶陽性，可液化明膠。28°C~38°C為該菌抹最適生長溫度，最適生長pH值為pH5-9，培養(yǎng)基NaCl的濃度不高于4。/。時均可以生長。依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學鑒定手冊》"WwgwjMam^/o/S，fema"c^octen'o-fog^)和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對to^ag/^to,a6-6菌才朱進行形態(tài)學測定，生理生化檢測確定tor^g/z"to,W-6菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌(mmrescem)中的成員。該菌抹經(jīng)16SrDNA分析及G+Cmo1%含量測定，都表明tor6ag/jato,aZ)-6菌為粘質(zhì)沙雷氏菌屬中的成員，屬粘質(zhì)沙雷氏菌(柳(3Tcescms1)。本發(fā)明建立菌種篩選、鑒定、保藏、復壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技術。一.菌種歸選通過對塊根芍藥的內(nèi)生菌進行分離，并對所分離的塊根芍藥內(nèi)生菌進行篩選并對分離獲得的內(nèi)生細菌進行顯微形態(tài)特征的觀察，依據(jù)經(jīng)典形態(tài)學方法，合并表型相同的菌抹，篩選分離表型不同的菌才朱，并獲得產(chǎn)靈菌紅素的菌林。二.菌種鑒定A.生理生化4全測依據(jù)《伯杰氏細菌分類鑒定手冊》(7th^^/ow)和東秀抹編著的《常見細菌分類鑒定手冊》中的方法進行發(fā)酵類型、代謝底物、營養(yǎng)依賴型等方面的檢測。B.G+CmoP/。含量測定用高效反相液相色譜儀來測定該菌林基因組的G+Cmol。/。含量，具體方法參照林萬明的《細菌分子遺傳學分類鑒定法》。本發(fā)明粘質(zhì)沙雷氏菌(&rra""應證固)CGMCCNo.2593的G+Cmol。/。含量為57.8mol%,將其最終鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌。該菌抹的獲得為開發(fā)出廉價、高效的生物活性物質(zhì)和天然色素奠定了菌種基礎，有較好的研究前景。C.16SrRNA序列分析模版采用CTAB法所提取的菌林基因組DNA為模板。引物16SrDNA的PCR引物為L:5'CGGACGGGTGAGTAATGTCT3';R:5'CTTCTTTTGCAACCCACTC(y;用Blastn比較菌株16SrDNA與GenBank中已登錄的序列，調(diào)出與菌抹16SrDNA同源并且已經(jīng)鑒定的菌種的16SrDNA序列，并進行比對。同時根據(jù)從GeneBank中調(diào)出的已經(jīng)鑒定的to^ag/zato,"&6，高度相似的細菌菌種的16SrDNA構建系統(tǒng)進化樹。經(jīng)比對，該菌林與〃a.spPSGB18的同源性為99%。從系統(tǒng)進化樹中可以發(fā)現(xiàn)該菌抹與SerraaaspPSGB18的相關性為87%。系統(tǒng)進化樹參見附圖1所示。通過以上的生理生化4全測、G+C含量測定，16SrRNA同源分析結果都可以表明tor6ag/z(3toy-aZ)-6菌才朱為粘質(zhì)沙雷氏菌(&rra/7."附"/rescera)中的成員,乂人而可以精確的將本發(fā)明的tork7g/wto_y-W-6菌才朱分類為粘質(zhì)沙雷氏菌(5^raWamwrescem),也建立了分類鑒定孩i生物的一種可靠、準確的途徑。三.菌種保藏真空冷凍干燥或石蠟油保存。無菌條件下將100%石蠟油加入試管斜面上，使石蠟油液面超出培養(yǎng)基斜面，完全隔絕空氣對菌種的影響，將6菌種保存于-70。C的超低溫水箱中。四.菌種活化從石蠟油中取一菌種移植塊，接種到MEA培養(yǎng)基上，在20~25。C下培養(yǎng)l天左右，再轉(zhuǎn)接到一新鮮MEA培養(yǎng)基上，連續(xù)活化數(shù)次，就可進行菌林其它實驗的測定。五.菌種復壯首先按上述步驟的活化菌種，然后在篩選培養(yǎng)基中接種活化好的菌并進行培養(yǎng)，選取優(yōu)良菌抹接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并將此菌抹作為生產(chǎn)菌株使用。本發(fā)明還具體提供一種靈菌紅素的制備方法，其包括(一)對粘質(zhì)沙雷氏菌(5"erra由wwcMcms)CGMCCNo.2593進行菌種活化培養(yǎng)步驟；(二)利用如上步驟獲得的活化菌種進行發(fā)酵步驟；(三)發(fā)酵后的純化提取步驟。具體的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生的靈菌紅素的方法，其特征在于將粘質(zhì)沙雷氏菌(5^ra"a)為生產(chǎn)菌林，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，提取及純化紅色代謝產(chǎn)物的過程，具體步驟如下1、菌種發(fā)酵發(fā)酵采用LB液體培養(yǎng)基；500mL三角瓶，內(nèi)裝培養(yǎng)液200mL,1125x121Pa滅菌20min在37。C條件150r/min搖培5d。2、靈菌紅素的提取發(fā)酵液中等量裝入無水乙醇，在搖床振動20min，靜置10min,并以4000r/min離心10min去雜，得紅色上清液，殘渣繼續(xù)用無水乙醇反復抽提3次。將收集到的紅色上清液混合，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得紅色祐稠粗制O口口。本發(fā)明具體提供沙雷氏菌產(chǎn)生靈菌紅素的最佳發(fā)酵條件，優(yōu)化該菌抹的發(fā)酵工藝，提高菌林的色素產(chǎn)量，為色素的分離純化作好準備。通過對菌抹合成色素發(fā)酵工藝的研究，分別選擇MEA培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，YM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，得到了發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方按重量比計為氯化鈉1%,蛋白胨1%，酵母精浸粉O.5%。本發(fā)明通過所得到色素的理化性質(zhì)及結構的鑒定試驗可以證明得到的紅色素是靈菌紅素。通過實施本發(fā)明具體的技術指標，實現(xiàn)本
發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下有益效果。本發(fā)明提供的粘質(zhì)沙雷氏菌(wawescera)CGMCCNo.2593菌林的色素產(chǎn)量為7.85g/L;本發(fā)明產(chǎn)生的靈菌紅素最大吸收峰入m為533.8nm,pH值3-7時保持較穩(wěn)定的玫瑰紅色，pH值〉8時，變成黃色，在酸性條件下較穩(wěn)定，對光的穩(wěn)定性不好。熱穩(wěn)定性較好。(h=Q時，吸光度為0.27)蔗糖的存在對該色素的穩(wěn)定性無影響。苯甲酸鈉對該色素溶液的穩(wěn)定性無影響。圖l所示為粘質(zhì)沙雷氏菌(5^ra"amwcMcmOCGMCCNo."93菌株系統(tǒng)進化樹。圖2所示為標準堿基溶液分離圖譜。圖3所示為菌抹堿基分離圖。圖4所示為色素醇溶液的紫外吸收光譜。具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另夕卜，在下述的說明中，如無特別說明，則按100kg重量為基準，％皆指重量百分比。實施例一產(chǎn)靈菌紅素菌林的篩選本發(fā)明首次對塊根芍藥的內(nèi)生菌進行分離，并對所分離的ll抹塊根芍藥內(nèi)生菌進行篩選獲得產(chǎn)靈菌紅素的菌抹，具體步驟如下稱取塊根芍藥樣品2組，每組兩份各7g，先用封口膜密封材料兩端(因塊根芍藥為中空植株)再用清水沖洗3分鐘。用碾碎法在超凈臺中用無菌水沖洗4次，1%升汞處理13s,無菌水沖洗4次，在250ml的三角并瓦每次用無菌水100ml以上，在不斷的搖動下漂洗5min,用次氯酸鈉漂洗13分鐘，再用無菌水沖洗5次，最后加入6ml無菌蒸餾水進行研碎，經(jīng)三層無菌紗布過濾，收集濾汁，將濾汁分別涂于LB、PDA、MEA、YM培養(yǎng)基平板上，分別把LB培養(yǎng)基置于37°C，其它培養(yǎng)基置28。C溫箱，待平板有菌落出現(xiàn)后，平板劃線純化，直至得到單菌落，斜面保存?zhèn)溆?。?jīng)多次反復試驗，其最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方按重量比計為氯化鈉1%,蛋白胨1%,酵母精浸粉0.5°/。。對分離獲得的內(nèi)生細菌進行顯微形態(tài)特征的觀察，依據(jù)經(jīng)典形態(tài)學方法，合并表型相同的菌株，篩選分離表型不同的菌抹，并獲得產(chǎn)靈菌紅素的菌抹。實施例二、產(chǎn)靈菌紅素菌抹的鑒定1、形態(tài)結構和培養(yǎng)特性觀察該菌株個體形態(tài)特征、菌落形態(tài)特征、運動性和生理生化特征觀察測定參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》、《常見細菌鑒定手冊》進行。1.1形態(tài)結構觀察分離所得的細菌在LB培養(yǎng)平板中于28。C下培養(yǎng)LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)1~3d后，觀察其菌落形態(tài)針頭、圓形、不規(guī)則形、絲形和分枝狀；菌落的邊緣整齊、波紋狀、裂刻狀、絲狀和巻發(fā)狀；菌落的高度扁平、隆起、凸起、中央凸起或下凹，進行芽孢染色、革蘭氏染色和菌體形態(tài)觀察，分別按菌落形態(tài)、顏色、菌體形態(tài)、芽孢有無和革蘭氏染色分組，編菌抹號，用常規(guī)的細菌鑒定方法將每一細菌菌抹鑒定到屬。1.2培養(yǎng)特性觀察細菌細胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細胞群體叫菌落。不同微生物在培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。細菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容①在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等；②在液體培養(yǎng)中的表面生長情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等；③半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運動、擴散情況。菌落及菌體形態(tài)觀察而得該菌抹大小為0.8-0.9umx1.2-1.3um，短桿狀，革蘭氏陰性細菌，無芽孢，有莢膜，無鞭毛，無運動。菌落呈圓形，光滑，濕潤，表面隆起呈金屬光澤,邊緣不整齊，菌落呈紫紅色，色素不擴散到培養(yǎng)基中。2、生理生化試驗微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一'。依據(jù)《伯杰氏細菌分類鑒定手冊》(7thedition)和東秀抹編著的《常見細菌分類鑒定手冊》中的方法進行發(fā)酵類型、代謝底物、營養(yǎng)依賴型等方面的檢測。該菌株主要生理生化特征如表1表l:菌抹主要生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3、菌林16SrDNA序列的PCR與測序模版采用CTAB法所提取的菌林基因組MA為模板。引物16SrDNA的PCR引物為L:5'CGGACGGGTGAGTAATGTCT3';R:5'CTTCTTTTGCAACCCACTCC'^用^"W/比較菌林16SrDNA與^/^3/2ir中已登錄的序歹'j，調(diào)出與菌抹16SrDNA同源并且已經(jīng)鑒定的菌種的16SrDNA序列，并進行比對。同時根據(jù)從GeneBank中調(diào)出的已經(jīng)鑒定的與toA"g/wto,^)-6,高度相似的細菌菌種的16SrDNA構建系統(tǒng)進化樹。提交NCBI注冊，并經(jīng)進行比對，結果顯示該菌抹與&rra^7.wPSGB18的同源性為99%。該菌株與相關菌株的系統(tǒng)進化樹分析，從系統(tǒng)進化樹中可以發(fā)現(xiàn)該菌抹與&;r加/flspPSGB18的相關性為87%。參見附圖14、產(chǎn)靈菌紅素菌株G+Cmol。/。測定用高效反相液相色譜儀來測定該菌林基因組的G+Cmoiy。含量。高效液相色譜儀為日本島津LC-6AD高效液相色譜儀，島津57W-7似P77紫外檢測器，"a^-M數(shù)據(jù)處理工作站，KromasilC18柱(5〃m，250mmx4.6mmi.d)，流速lml/min,;險測波長260nm。移動相為10%曱醇，90。/。2G腿ol/L磷酸二氬鉀溶液(pH=5.6)。DNA水解加入60jLiL高氯酸，溶解基因組后，轉(zhuǎn)入l.5ml的EP管，封口膜封口，沸水浴水解DNA,時間為lh,加無菌雙蒸水300ju1到EP管，離心:取上清。4'C水箱保存?zhèn)溆谩藴蕢A基的配置分別準確稱取四種核酸堿基(AMRESCO,sangon分裝)，加數(shù)滴磷酸溶解后，加入移動相定容至10mL,各堿基濃度分別為2.779、2.870、4.520及3.256mmol/L。各取200juL配成混合液，并加入移動相定容至ltnl,在混合液中，標準溶液的配制中各堿基濃度見表2。表2:標準溶液的配制中各堿基濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>堿基的K值的計算:取5^L混合液上柱，即可獲得標準溶液的色譜分離圖語。根據(jù)各標準堿基的進樣量和標準圖傳峰面積可計算出各種堿基的K值(單位面積的毫克分子數(shù))。計算公式堿基1(值=毫克分子數(shù)/堿基峰面積。G+Cmol。/。含量的計算樣品中各堿基的毫摩爾數(shù)就可以依據(jù)四種堿基的峰面積和標準堿基的K值得出。計算公式堿基的毫摩爾數(shù)-堿基峰面積x標準堿基K值。G+Cmol%=G+C/A+T+G+C=2C/2T+2C=C/T+C加入5jaL標準堿基混合液，測定K值，力口5juL樣品處理液，測定樣品中基因組的G+Cmo"/。含量。細菌DNA純度檢查結果對提取DNA樣品的純度進行檢測，DNA樣品的吸光度比值為A嵐咖:A28。nm=1.87,符合DNA純品的吸光度比值A2^:A飾,l.8。采用高效反相液相色譜來測定G+Cmo1%含量從標準堿基混合液的柱色譜分離圖譜，參見附圖2，表明各峰分離效果良好，其檢出時間、峰型和峰面積穩(wěn)定。根據(jù)各堿基的進樣量及標準圖譜峰面積計算各種堿基的K值(單位面積的毫克分子數(shù))。計算公式堿基〖值=毫摩爾分子數(shù)/堿基峰面積由堿基的毫摩爾數(shù)，可以得到菌抹to^ag/zato,W-6基因組DNA的G+Cmo1%,參見附圖3，測得菌抹to^ag/wto,a6-6的G+Cmol。/。為57.8mol%，跟粘質(zhì)沙雷氏菌的DNAG+Cmoiy。相同。產(chǎn)靈菌紅素的該菌林16SrRNA經(jīng)序列分析表明，該菌與沙雷氏菌屬的相似性為87%，初步鑒定為沙雷氏菌屬；進一步通過形態(tài)學、生化特征和(G+C)mo"/。含量，將其最終鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌。該菌林的獲得為開發(fā)出廉價、高效的生物活性物質(zhì)和天然色素奠定了菌種基礎，有較好的研究前景。實施例三、菌抹紅色素的提取及其結構鑒定1、色素的提取提取采用以下兩種方法(1)發(fā)酵液中等量裝入無水乙醇，在搖床振動20min,靜置IOmin，并以4000r/min離心10min去雜，得紅色上清液，殘渣繼續(xù)用無水乙醇反復抽提3次。將收集到的紅色上清液混合，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得紅色黏稠粗制品。(2)在MEA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天后，以4000r/min離心5min，往沉淀加無水乙醇使色素溶解在其中，以4000r/min離心5min,取上清經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，使其烘干。用乙酸乙酯溶解，用飽和NaCl溶卒取兩次后，使其烘干。2、薄層層析薄層層析采用的是硅膠薄層層析，展開劑用石油醚乙酸乙酯按5:1，刮板收集W為O.6的紅色區(qū)帶，用曱醇溶解。通過過慮將組分從硅膠粉中洗脫下來后使其蒸干，然后用H麗R分析。3、色素的理化性質(zhì)3.1色素的光鐠特性取紅色黏稠液用體積濃度95%乙醇稀釋至體積濃度O.1%,測定其在可見光及紫外光范圍內(nèi)的吸光度A值。該色素的最大吸收峰入m為533.8nm。參見附圖4A57i7^-iZv^嫂紫外可見分光光度計(入17UV/VIS),(/^AT/^-說yl/朋"y^W17〃r/raimr,麼,則。3.2不同pH值下色素的顏色取一定量的色素乙醇溶液，分別用O.1mol/L的鹽酸和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值。表3.1不同pH值下色素溶液的顏色23456789以上顏色玫瑰紅玫瑰紅玫瑰紅玫瑰紅玫瑰紅玫瑰紅菊黃色黃色pH值3—7時保持較穩(wěn)定的玫瑰紅色，pH值〉8時，變成黃色，在酸性條件下較穩(wěn)定。3.3色素的光穩(wěn)定性用體積濃度95%的乙醇將所提取色素配成體積濃度O.1%和體積濃度O.2%的溶液，在自然光下分別放置Oh、12h、24h、48h、72h、96h,在入max下測定其吸光度A值。由表3.2可知，該紅色素經(jīng)自然光照射96h后，其吸光度值A幾乎為零，說明該色素對光的穩(wěn)定性不好。表3.2色素的光穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.4色素的熱穩(wěn)定性取該色素乙醇溶液在20。C、40°C、70。C下分別加熱20min、35min、50min、65min,冷卻后用721型分光光度計測定最大吸收峰下色素溶液的吸光度A值。由表4色素的熱穩(wěn)定性可以看出，該色素隨著加熱時間的延長和溫度的提高，其吸光度值變化不大，說明該色素的熱穩(wěn)定性較好。(h=0時，吸光度為O.27)表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.5蔗糖對色素的影響取10mL色素實驗溶液，分別加入不等量的蔗糖，配成蔗糖質(zhì)量濃度分別為3.0g/100mL、6.0g/100mL、10.0g/100mL、16.0g/100mL的色素溶液。用721紫外分光光度計測定在室溫下放置48h后的最大吸收峰下色素的吸光度A值。由表5中看出，蔗糖的存在對該色素的穩(wěn)定性無影響。表5:蔗糖溶液對色素的影響3g/100ml<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.6苯曱酸鈉對色素的影響取IOmL色素試驗溶液，分別加入苯曱酸鈉，配制成質(zhì)量濃度分別是O、0.1g/100mL和lg/100mL的溶液，在入max下用721型紫外分光光度計測定其在室溫下放置Oh、24h、48h、72h時的吸光度A值。由表6可知，苯曱酸鈉對該色素溶液的穩(wěn)定性無影響。表6:苯曱酸鈉對色素穩(wěn)定性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.7還原劑對色素的影響取5份色素溶液各10mL，分別加入Na2S04,0.Omg、0.2mg、2.Omg、5.Omg，配成不同質(zhì)量濃度的色素溶液，用721紫外分光光度計測定其放置0h、24h、50h、74h、96h、120h后在入max下測定其吸光度A值。由表7可知，該色素溶液隨還原劑質(zhì)量濃度增加，放置時間的延長，其吸光度值和色素溶液顏色變化較明顯，這說明該色素的耐還原性較差。表7:還原劑對色素穩(wěn)定性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.8氧化劑對色素的影響取5份色素溶液各10mL，分別加入質(zhì)量分數(shù)30%的雙氧水0.OmL、0.15mL、0.5mL、2.0mL在室溫下放置Oh、2h、12h、20h、48h、96h后，用721紫外分光光度計測定該色素在入max下的吸光度A值。由表8可知，這說明該色素的耐氧化性較差。表8:氧化劑對色素的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>4.色素的毒性測試色素的毒性測試方法分為灌胃和腹腔注射兩種，處理后觀察動物的急性毒性反應禾p死亡的動物lt量。4.1小鼠急性毒性實驗取小鼠20只，雌雄各半，隨機分為2組，即陰性對照組(10只)和實驗組(10只)，雌雄各半。以400g/kg劑量給實驗組腹腔注射，記錄小鼠的毒性反應及死亡情況。小鼠在腹腔注射色素后，第l天注射后，動物出現(xiàn)少動、不進食癥狀，約2-3h恢復正常。連續(xù)觀察14d,未見動物發(fā)生中毒癥狀和死亡。處死動物后，肉眼觀察及鏡下組織形態(tài)學觀察心、肝、脾、肺、腎等臟器，均未發(fā)現(xiàn)異常病變。此時小鼠給藥量即最大給藥量達到400g/kg。動物毒性試驗結果表明，大劑量的色素對小鼠沒有任何作用，色素沒有急性毒性。4.2小鼠長期毒性實驗取小鼠12只，雌雄各半，隨機分為2組，即陰性對照組(8只)和實驗組(4只)，雌雄各半。禁水不禁食16h后，實驗組以每天lmg/ml濃度，按140g/kg劑量灌胃。陰性對照組則給蒸鎦水。實驗期間每天觀察小鼠一般狀態(tài)如進食，行為活動，糞便等。給藥期滿2個月后，每組隨^L各剖殺4只動物，雌雄各半，剖取動物心、肝、腎、脾、肺、等臟器，進行肉眼及鏡下組織形態(tài)學觀察。小鼠l天口服最大給藥為140g/kg。觀察2個月未見動物發(fā)生中毒癥狀和死亡，處死動物后肉眼觀察及鏡下組織形態(tài)學觀察心、肝、脾、肺、腎等臟器，均未發(fā)現(xiàn)異常病變，說明該色素對主要器官組織無明顯毒性，表明該色素在臨床用藥或者食品和化妝品生產(chǎn)范圍內(nèi)應用是比較安全的。該色素在酸性條件下呈現(xiàn)紅色，堿性條件下顯示黃色，在酸性條件下較穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性較好，不同濃度的蔗糖、亞硫酸鈉和苯曱酸鈉溶液對其穩(wěn)定性影響不大，但對光、氧化、還原劑其穩(wěn)定性較差。應進一步研究如何提高其穩(wěn)定性。該色素溶于乙醇、曱醇、丙酮，不溶于水。按照光譜特性、pH值及溶解性，初步確定該天然色素為靈菌紅素(pra^gz'os/")。該色素為一種不定型的紅色固體；mp168-170°C,H-畫R(CDC13，400M)數(shù)據(jù)顯示7.28(brs，H-2)，6.95(brs,H-10),6.98(d,J=3.7Hz，H-4)，6.72(s，H-12),6.39(dd,j=3.8，2.4Hz,H-3),6.11(s,h-7)，4.04(s，21-OCH3),2.54(s,15—CH3)，2.42(m，H-16)，0.89(t，20-CH3);該色素H麗R圖譜與靈菌紅素基本一致，故確定該色素為靈菌紅素(4_methoxy-S_[(5-methyl-4-pentyl-2H-pyrro1-2-yliden)methyl]-2，2,-bi-lH-pyrrole)。靈菌紅素作為一種新研究的抗肺瘤活性物質(zhì)，具有很好的開發(fā)成抗癌新藥的潛力。菌珠產(chǎn)生的靈菌紅素可作為抗腫瘤藥物和抗生素資源，其安全性高，熱穩(wěn)定性強，也可考慮用于食品和化妝品生產(chǎn)。實施例四、發(fā)酵條件對菌抹合成色素的影響4.1產(chǎn)色素最佳培養(yǎng)基的選擇用LB，MEA,PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天觀察色素的合成情況。結果表明LB培養(yǎng)基最適合色素的合成，LB液體培養(yǎng)基里加少量精氨酸時，菌抹能夠穩(wěn)定的產(chǎn)生紅色素。4.2培養(yǎng)基初始pH值的影響采用LB作為發(fā)酵培養(yǎng)基，將初始pH值分別調(diào)為5.0,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0接種后振蕩培養(yǎng)2d,檢測其發(fā)酵液的色素含量。結果表明，初始pH值在6.5時，最利于菌林合成色素。4.3溫度的影響溫度對菌抹的生長和活性物質(zhì)的合成起著重要的作用。采用6個不同的培養(yǎng)溫度即26°C,28°C，29°C，32°C，38°C，測試不同的培養(yǎng)溫度下菌林合成色素的情況。以最佳發(fā)酵培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在20。C-35。C之間分別取4個溫度點進行實驗，結果在35i:下色素含量最高。4.4裝液量的影響裝液量是反映發(fā)酵液菌體需氧狀況的一個間接指標。保持其他培養(yǎng)條件不變，以最佳發(fā)酵培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，pH值調(diào)至6.5。在500mL的三角瓶中分別裝入SOmL,100mL，150mL，200mL，250mL,振蕩培養(yǎng)后檢測活性。結果裝液量在150mL時，色素合成量最高。通過以上實驗得到了菌抹合成色素的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方按重量比計為氯化鈉1%，蛋白胨1%，酵母精浸粉O.5%。最佳培養(yǎng)條件35°C,pH6.5_7.0,180r/min振蕩培養(yǎng)，150ml(500ml三角瓶中)，培養(yǎng)時間為2d。權利要求1、一種產(chǎn)生靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CGMCC.No.2593。2、一種靈菌紅素的制備方法，將提供的生產(chǎn)菌抹經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，提取及純化紅色代謝產(chǎn)物的過程，其特征在于，具體步驟如下(一)對粘質(zhì)沙雷氏菌(^rratoman^cms)CGMCCNo.2593進行菌種活化培養(yǎng)步驟；(二)利用如上步驟獲得的活化菌種進行發(fā)酵發(fā)酵采用LB液體培養(yǎng)基，500mL三角瓶，內(nèi)裝培養(yǎng)液200mL，1125x121Pa滅菌20min在37。C條件150r/min搖培5d;(三)發(fā)酵后的純化提取步驟發(fā)酵液中等量裝入無水乙醇，在搖床振動20min，靜置10min,并以4000r/min離心10min去雜，得紅色上清液，殘渣繼續(xù)用無水乙醇反復抽提3次，將收集到的紅色上清液混合，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得紅色黏稠粗制口Co3、按照權利要求2所述的靈菌紅素的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵中培養(yǎng)基配方按重量比計為氯化鈉1%，蛋白胨1%,酵母精浸粉O.5%。4、按照權利要求2所述的靈菌紅素的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵工藝中，該菌抹生長溫度為28。C-38。C，生長pH值為pH5-9，培養(yǎng)基NaCl的濃度不高于4%。5、一種利用權利要求1所述的粘質(zhì)沙雷氏菌(5^ra""marcescem)CGMCC.No.2593按照權利要求2所述的工藝條件獲得的靈菌紅素。全文摘要本發(fā)明公開了一種粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CGMCC.No.2593及產(chǎn)生的靈菌紅素。該菌株生長溫度為28℃-38℃，pH值為5-9，發(fā)酵采用LB液體培養(yǎng)基，500mL三角瓶，內(nèi)裝培養(yǎng)液200mL，1125×121Pa滅菌20min在37℃條件150r/min搖培5d后，裝入無水乙醇，在搖床振動20min，靜置10min，并以4000r/min離心10min去雜，經(jīng)無水乙醇抽提，產(chǎn)生靈菌紅素沙雷氏菌株色素產(chǎn)量為7.85g/L，其靈菌紅素最大吸收峰入m為533.8nm，熱穩(wěn)定性較好。獲得靈菌紅素可作為抗腫瘤藥物、食品和化妝品等領域具有重要的應用前景。文檔編號C12P17/16GK101392227SQ20081007297公開日2009年3月25日申請日期2008年10月23日優(yōu)先權日2008年10月23日發(fā)明者古麗祖熱·佐努尼,吾甫爾·米吉提,阿依努爾·阿不都熱合曼申請人:新疆大學