專利名稱：一株發(fā)酵產(chǎn)紅色素的粘質(zhì)沙雷氏菌及發(fā)酵產(chǎn)紅色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)紅色素，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及上述方法在發(fā)酵法生產(chǎn)紅色素的鑒定，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
靈菌紅素(pr0digi0Sin，PG)是一天然紅色素家族的總稱，都有3個(gè)吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)，常呈暗紅色，熔點(diǎn)151-152 ，難溶于水，屬于脂溶性色素，易溶于甲醇和苯。在甲醇溶液中，酸性條件下在MOnm處有特征吸收，堿性條件下在466nm處有特征吸收。該色素對(duì)溫度穩(wěn)定，受PH的影響較大，分子式為C2tlH25N3O15靈菌紅素是一些放線菌、 沙雷菌及其他細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有免疫抑制、抗細(xì)菌、抗真菌和抗瘧疾抗真菌和抗原生動(dòng)物的活性等多種生物活性，最近研究表明靈菌紅素有很強(qiáng)的抗腫瘤及免疫抑制活性。 近幾年研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素能引起癌細(xì)胞的凋亡而對(duì)正常細(xì)胞的毒性卻非常小，因此靈菌紅素有望成為一種擁有良好的生物活性且副作用小的抗癌藥物，在癌癥治療上有很大的藥用潛力。靈菌紅素具有強(qiáng)烈的細(xì)胞溶解酶活性，能殺滅引起赤潮的浮游藻類，通過毒性實(shí)驗(yàn)和環(huán)境影響檢測(cè)，它有望成為赤潮的克星。目前因原材料，生產(chǎn)條件，提取費(fèi)用高昂等因素影響，發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素成為了主流。能產(chǎn)生靈菌紅素的微生物主要有Str印tomyces、krratia和I^seudomonas等，其中krratia屬微生物生物合成靈菌紅素的報(bào)道居多。Thomason等則首次將分離到的 Serratia PG基因轉(zhuǎn)入歐文氏(Erwinla carotovora)質(zhì)粒，成功表達(dá)并得到了 PG。Rokem JS (1987)利用碳源為限制性培養(yǎng)基對(duì)Srratia進(jìn)行恒化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它產(chǎn)率只有0. 57mg/L/ h，且在以氮源為限制性培養(yǎng)基進(jìn)行恒化培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞不產(chǎn)靈菌紅素；李厚金對(duì)從海水中分離得到的pseudomonas. sp的GYP液體培養(yǎng)基中選用自來水和海水作介質(zhì)對(duì)照研究NaCl在 PG產(chǎn)生中的作用，發(fā)現(xiàn)鹽度越高細(xì)菌菌體生長和色素產(chǎn)生的速度越快；Sole等用krratia 的靜息細(xì)胞對(duì)PH值影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)靜息細(xì)胞產(chǎn)靈菌紅素最理想的pH值應(yīng)該在 7. 2-7. 5 ；Cang S (2000)篩選到一株可利用乙醇作為碳源的krratia，其產(chǎn)量可達(dá)3g/L ；大量的實(shí)驗(yàn)證明加入某些特殊氨基酸(如ftx))、不飽和脂肪酸可以增加靈菌紅素的產(chǎn)量。產(chǎn)靈菌紅素的菌多自海水或土壤中分離，而對(duì)內(nèi)生菌類產(chǎn)生靈菌紅素系統(tǒng)研究有待進(jìn)行；在靈菌紅素的產(chǎn)量上還不是很理想，從自然資源中篩選得到具有高產(chǎn)靈菌紅素的微生物的途徑很有應(yīng)用前景；靈菌紅素的生產(chǎn)和另外一些表型(如酪蛋白酶活性，血細(xì)胞凝集素活性)的產(chǎn)生有一定聯(lián)系，從遺傳學(xué)角度解釋這些現(xiàn)象需要做進(jìn)一步研究；目前，靈菌紅素的搖瓶生產(chǎn)產(chǎn)量可觀，但是發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)沒能實(shí)現(xiàn)，與工業(yè)化大生產(chǎn)有距離；靈菌紅素屬天然色素，可大量用于食品工業(yè)，醫(yī)療事業(yè)等，現(xiàn)研究主要集中在靈菌紅素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用上，目前靈菌紅素的藥理功效，藥理機(jī)制以及毒副作用等方面都尚未解決，這些方面都有待進(jìn)一步深入的研究
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用新粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)紅色素的方法和紅色素的鑒定。本發(fā)明的技術(shù)方案一種利用一株新粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)紅色素的方法和應(yīng)用， 一株新粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)紅色素為生產(chǎn)菌株。菌種粘質(zhì)沙雷氏菌krratia sp. FMME043，為本實(shí)驗(yàn)室研究選育并保存，其能夠而明顯的產(chǎn)生靈菌紅素。主要用來發(fā)酵生產(chǎn)，利用本發(fā)明能夠有效提高靈菌紅素的產(chǎn)量及最適發(fā)酵條件，大幅縮短發(fā)酵周期。本發(fā)明具體提供了一種粘質(zhì)沙雷氏菌其產(chǎn)生的靈菌紅素及其制備工藝。該粘質(zhì)沙雷氏菌代謝產(chǎn)生的色素在酸性條件下呈現(xiàn)紅色，堿性條件下顯示黃色，在酸性條件下較穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性較好，該色素溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。按照光譜特性、PH值及溶解性， 通過液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量，確定該天然色素為靈菌紅素。提供了一種產(chǎn)生靈菌紅素的方法，并對(duì)該菌株的發(fā)酵條件，進(jìn)行了一定的優(yōu)化。該色素還對(duì)治理太湖藍(lán)藻有一定的幫助。提供了一個(gè)治理赤潮的研究方向。


圖1 靈菌紅素的質(zhì)譜分析圖。
具體實(shí)施例方式對(duì)照實(shí)施例本發(fā)明所用菌種為沙雷氏菌(Serratia sp. FMME043)。實(shí)施例一色素相關(guān)測(cè)定方法及菌株紅色素的提取與純化色素相對(duì)含量的測(cè)定取發(fā)酵液ImL于12000rpm離心lOmin，用蒸餾水洗滌菌體 2次，加入5mL甲醇，反復(fù)振蕩提取兩次，將兩次提取液合并，靜置lOmin，再12000rpm離心 lOmin，取上清液稀釋10倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在535nm下的吸光度值，空白為甲醇。色素的提取與純化以酸性甲醇(pH值3. 0)浸提色素，以氯仿-水體系進(jìn)行萃取， 氯仿相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得色素濃縮液。濃縮液通過硅膠柱色譜分離純化得色素組分。色譜柱徑長比為1 40，固定相為硅膠QOO目)，洗脫劑為正己烷和乙酸乙酯(初始配比為體積比1 1，終配比為體積比2 1)。收集不同色素條帶洗脫液，真空濃縮。實(shí)施例二 色素的結(jié)構(gòu)的鑒定色素分析，UV-Vis分析，將純化后的色素以甲醇溶解，調(diào)節(jié)pH值為3. 0/9. 0(HC1/ NaOH調(diào)節(jié))，描這2種pH值下各組分在300 700nm波長段的吸光度。酸性條件下，在534nm 處有最大吸收峰，在堿性條件下，最大吸收峰移至465nm出，與已報(bào)道的靈菌紅素吸收光譜
圖一致。LC/MS 分析，儀器=Waters ZMD 4000 液質(zhì)聯(lián)用儀；色譜柱LichrospherC 18column(4. 6mmX 250mm)，流動(dòng)相80 % 甲醇的水溶液，流速lmL/min，柱溫30°C ；MS 條件子化方式為ESI (+)，ESI-MS錐孔電壓60V，毛細(xì)管電壓3. 88KV，離子源溫度120°C，脫溶劑溫度300°C。色素純品采用飛行時(shí)間質(zhì)譜TOFMS對(duì)其分析，結(jié)果得到[M+H]的精確相對(duì)分子質(zhì)量為324. 3，由此精確相對(duì)分子質(zhì)量可以計(jì)算得到其分子式為C2tlH25N3O,這與報(bào)道的靈菌紅素的分子式一致。實(shí)施例三靈菌紅素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生的靈菌紅素的方法，其特征在于將粘質(zhì)沙雷氏菌為生產(chǎn)菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生靈菌紅素，本發(fā)明具體提供沙雷氏菌產(chǎn)生靈菌紅素的最佳發(fā)酵條件， 具體條件如下種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨3、牛肉膏3、氯化鈉1、硫酸鎂0. 5、pH7. 2 7. 5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)甘油4、蛋白胨16、氯化鈉3、氯化鉀4、pH7. 2 7. 5。菌種發(fā)酵，發(fā)酵采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，500mL三角瓶，內(nèi)裝培養(yǎng)液50mL，115°C滅菌 15min，在 30°C條件 200r/min 搖培。實(shí)施例四靈菌紅素的抗菌性研究靈菌紅素具有抗細(xì)菌、抗瘧疾，抗真菌和抗原生動(dòng)物的活性。配制3%的瓊脂，加入適量的靈菌紅素，用微火加熱，攪拌，盡量讓靈菌紅素在瓊脂中分布均勻，待凝固后，將瓊脂塊切成圓柱體。從太湖水體中采集來的新鮮藍(lán)藻用培養(yǎng)皿培養(yǎng)，培養(yǎng)基為過濾后的太湖水，適量的加入一些氮和磷元素，將柱狀的瓊脂塊放到培養(yǎng)皿中央，在有光照的條件常溫下培養(yǎng)。觀察現(xiàn)象，形成了非常明顯的抑菌圈。實(shí)施例五發(fā)酵條件對(duì)色素產(chǎn)量的影響的研究培養(yǎng)基初始PH值的影響pH是靈菌紅素合成的關(guān)鍵。采用實(shí)施例三中的發(fā)酵培養(yǎng)基，將初始PH值分別調(diào)為5. 0，6. 0，6. 5，7. 0，7. 2，7. 5，8. 0，8. 5，9. 0接種后振蕩培養(yǎng)檢測(cè)其發(fā)酵液的色素含量。結(jié)果表明，初始PH值在7. 2時(shí)，最利于菌株合成色素。溫度的影響溫度對(duì)菌株的生長和活性物質(zhì)的合成起著重要的作用。采用7個(gè)不同的培養(yǎng)溫度即以最佳發(fā)酵培養(yǎng)基作發(fā)酵培養(yǎng)基，分別取201，251，觀1，301，341， 37°C，6個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果在30°C下色素含量最高。37°C時(shí)基本沒有色素產(chǎn)生。裝液量的影響裝液量是反映發(fā)酵液菌體需氧狀況的一個(gè)間接指標(biāo)。保持其他培養(yǎng)條件不變，以最佳發(fā)酵培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，PH值調(diào)至7. 2。在500mL的三角瓶中分別裝入50mL，IOOmL, 150mL, 200mL, 250mL,振蕩培養(yǎng)后檢測(cè)活性。結(jié)果裝液量在50mL時(shí)，色素合成量最高。甘油的影響甘油是靈菌紅素合成的有利碳源，添加量為4g/L時(shí)靈菌紅素的產(chǎn)量最大。甘油的添加量并不與靈菌紅素的產(chǎn)量成正比，而且較大量加入甘油(大于1.2%)時(shí)靈菌紅素的產(chǎn)量反而低于不添加甘油時(shí)的水平，在這里甘油除了作為碳源，很有可能還充當(dāng)表面活性劑發(fā)揮了作用。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌krratia sp. FMME043。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的粘質(zhì)沙雷氏krratia sp. FMME043制備靈菌紅素的方法，其特征在于，具體步驟如下對(duì)進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)步驟，種子培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨3、牛肉膏3、氯化鈉1、硫酸鎂 0. 5、pH7. 2 7. 5、去離子水定容，發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)甘油4、蛋白胨16、氯化鈉3、氯化鉀 4、pH7. 2 7. 5，去離子水定容；115°C滅菌12min，在200r/min條件下避光搖培。
3.一種按照權(quán)利要求2發(fā)酵獲取的靈菌紅素純化及結(jié)構(gòu)鑒定方法，其特征在于，具體步驟如下色素純化，以酸性甲醇(PH值為3. 0)浸提色素，以氯仿-水體系進(jìn)行萃取，氯仿相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得色素濃縮液，濃縮液通過硅膠柱色譜分離純化，固定相為200目硅膠，洗脫劑為正己烷和乙酸乙酯，收集不同色素條帶洗脫液，真空濃縮；色素分析，將純化后的色素以甲醇溶解，在300 700nm波長段的吸光度；酸性條件下， 在534nm處有最大吸收峰，在堿性條件下，最大吸收峰移至465nm出，與靈菌紅素吸收光譜圖一致；色素純品采用飛行時(shí)間質(zhì)譜TOFMS對(duì)其分析，結(jié)果得到[M+H]的精確相對(duì)分子質(zhì)量為324. 3，由此可以計(jì)算得其分子式為C2tlH25N3O15
4.按照權(quán)利要求2所述的靈菌紅素的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵工藝中，該菌株生長溫度為觀 37°C，最適溫度為30°C，初始pH為7. 2，最適裝液量為50mL，最適甘油添加量為4g/L。
5.一種利用權(quán)利要求1所述的粘質(zhì)沙雷氏菌krratia sp. FMME043按照權(quán)利要求2所述的工藝條件獲得的靈菌紅素。
全文摘要
本發(fā)明公布了一株新粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)紅色素及其鑒定方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過浸提、萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法獲取色素濃縮液，通過硅膠柱色譜分離純化得色素組分，用UV-Vis分析pH值為3.0與9.0條件下最大吸收峰分別在530nm和465nm，通過LC/MS分析測(cè)得其準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量，確定該色素為靈菌紅素。發(fā)酵采用LB液體培養(yǎng)基，500mL三角瓶，內(nèi)裝培養(yǎng)液50mL，115℃滅菌15min在30℃條件200r/min搖培結(jié)束后，8000r/min離心10min去雜，經(jīng)酸性甲醇抽提，產(chǎn)生靈菌紅素沙雷氏菌株色素產(chǎn)量為150mg/L。靈菌紅素在腫瘤治療、食品和化妝品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102337240SQ201110317460
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者劉立明, 張傳亮, 牛盼清, 王鴻江 申請(qǐng)人:江南大學(xué)