專利名稱：預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑療效的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過檢測表皮生長因子受體的基因多態(tài)性，預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑藥 物的療效。本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藥物基因組學(xué)主要研究基因變異所致的不同患者對藥物的不同反應(yīng)，并在此基礎(chǔ)上研制 新的藥物或新的用藥方法。藥物基因組學(xué)區(qū)別于一般意義上的基因?qū)W，它不是以發(fā)現(xiàn)人體基因 組為主要目的,而是相對簡單地用已知的基因?qū)W理論改善患者的治療。藥物基因組學(xué)不能簡單 地看成是預(yù)測易患病的體質(zhì)，或者提供統(tǒng)計學(xué)資料用于預(yù)測發(fā)病危險性的試驗,它是研究有關(guān) 基因?qū)λ幬镒饔帽旧懋a(chǎn)生的影響及與基因變異的關(guān)系，而這些變異又是不同個體產(chǎn)生不同藥 物效應(yīng)的根本原因。藥物基因組學(xué)以追求藥物效應(yīng)及安全性為目的，研究各種基因突變與藥效 及安全性之間的關(guān)系。藥物基因組學(xué)主要在基因水平研究藥效的差異，由于基因分析技術(shù)的發(fā) 展,藥物基因組學(xué)對醫(yī)藥行業(yè)會越來越大。
表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Rec印tor ，EGFR)基因位于7號染色體短 臂7pl2-14區(qū)，由28個外顯子組成。所編碼的蛋白質(zhì)屬I型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體， 分子量約為170KDa。 EGFR的前體為含有1210個氨基酸殘基的單一多肽鏈，其中24個氨基酸 為信號肽段，在翻譯加工時被裂解，故成熟的EGFR是由1186個氨基酸組成的受體酪氨酸蛋 白激酶。EGFR包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)三個部分，外顯子15編碼單一的跨膜序列以及 這一序列兩邊的少量氨基酸殘基，跨膜區(qū)由23個氨基酸殘基組成，將受體錨定在胞膜上。EGFR 的胞外區(qū)由外顯子2-14編碼。由621個氨基酸組成，是其與相應(yīng)的配體結(jié)合所在部位。酪氨 酸激酶區(qū)由外顯子由542個氨基酸殘基組成，是典型的ATP結(jié)合位點(diǎn)和酪氨酸激酶區(qū)。
EGFR廣泛分布于正常的哺乳動物上皮細(xì)胞表面，平均每個細(xì)胞受體個數(shù)為5xl04-10xl04。 研究表明EGFR配體通過與EGFR相互作用，將有絲分裂信號向下傳遞，從而調(diào)控細(xì)胞周期、 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化和促進(jìn)損傷修復(fù)。正常組織中，EGFR呈低表達(dá)或不表達(dá)，而在包括非小 細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種上皮源性腫瘤中EGFR呈過表達(dá)，且與腫瘤增生、轉(zhuǎn)移、放化療敏感性下 降關(guān)系密切，是極具發(fā)展前途的基因治療靶位。
4在對肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、食管癌、肺癌、頭 頸部腫瘤和腦腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR信號傳導(dǎo)失調(diào)的腫瘤占相當(dāng)大的比重(Kim HG， [J ]. Histol Histopathol， 1999， 14(4) : 1175-1182) 。 EGFR的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、 腫瘤血管生成、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞的凋亡(NormannoN ， J Cell Physiol， 2003, 194( 1) :13 -1 9)。
針對EGFR的靶向抑制劑主要有4類①阻斷EGFR胞外受體功能區(qū)的單克隆抗體 (EGFR-Mab);②抑制EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶(TK)功能區(qū)自磷酸化的小分子藥物(EGFR-TKI); ③阻斷EGFR產(chǎn)生的反義核昔酸；④一些毒素與EGFR及其配位子或者單克隆抗體形成復(fù)合物， 通過其毒性而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。其中，小分子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)以吉非 替尼(英文名Gefitinib，商品名易瑞沙Iressa)和埃羅替尼(英文名Erlotinib ，商 品名特羅凱Tarceva)為代表.
II期IDEAL1和IDEAL2的臨床試驗表明，ZD1839單藥治療化療失敗的晚期非小細(xì)胞肺 癌(NSCLC)患者的有效率分別為18. 4%和11.8%，疾病穩(wěn)定率(SD)分別為54.4%和42. 2% ( MuXL, [J].Clin Cancer Res，2005，11:4289-4294. Chabner BA. [J]. Oncologist, 2004， 9:245-246)。研究發(fā)現(xiàn)它主要是通過競爭性阻斷胞內(nèi)TK功能區(qū)的ATP 結(jié)合位點(diǎn)而阻止EGFR的自磷酸化，進(jìn)而經(jīng)過以下途徑來提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性①EGFR-TKI 能增強(qiáng)放療誘導(dǎo)的細(xì)胞周期再分布效應(yīng)，使更多的細(xì)胞集中在G1-M期，而S期細(xì)胞更少；② 提高放射治療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡；③抑制放療引起的腫瘤細(xì)胞損傷的修復(fù)。另外，也有研 究發(fā)現(xiàn)，ZD1839還能抑制腫瘤內(nèi)的血管生成而進(jìn)一步提高腫瘤的放射敏感性。
EGFR屬于I型生長因子受體家族，具有受體酪氨酸激酶活性。EGFR的酪氨酸激酶功能區(qū)含 有3個重要結(jié)構(gòu):①氨基端小葉(N-lobe)，由5條平行的b-折迭構(gòu)成,其中的ATP磷酸結(jié)合環(huán) (P-Loop)的GSGSFG序列是ATPy-磷酸基團(tuán)的主要結(jié)合位點(diǎn)；②aC螺旋(aChelix)，此螺旋中含有 ATP的a-和p-磷酸基團(tuán)結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)aC螺旋與ATP結(jié)合后,其構(gòu)象發(fā)生改變，從而引起受體自身 磷酸化和激酶活化；③羧基端小葉(C-lobe),此小葉中的活化環(huán)(A-loop)是酪氨酸激酶的活性 中心，由20 30個氨基酸組成,其中DFG序列在所有酪氨酸激酶中高度保守，改變此序列的組成 或構(gòu)象將顯著影響激酶活性。
迄今為止發(fā)現(xiàn)的EGFR基因突變9(F。以上位于外顯子18 21，這些突變可以分為4種類型
1.第18外顯子2155位G—A置換，導(dǎo)致甘氨酸719密碼子錯義突變成半胱氨酸(G719S)。2. 外顯子19堿基缺失主要是第746 752位密碼子的堿基缺失突變，導(dǎo)致EGFR蛋白中氨基 酸(ELREATS)序列丟失，這一缺失改變了受體ATP結(jié)合囊(ATP-bindingpocket， ABP)的角度，從 而顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞對Gefitinib的敏感性(SodellaR，. Science, 2004， 305:1163-1167. KosakaT, Cancer Res， 2004， 64:8919-8923.)。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的外顯子19基因突變 至少有22種不同的類型。
3. 外顯子20的點(diǎn)突變或堿基插入突變點(diǎn)突變主要是第790位密碼子出現(xiàn)C一T轉(zhuǎn)換，引起 EGFR蛋白中該位點(diǎn)的氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?T790M)，這一突變僅見于藥物治療后復(fù) 發(fā)者，突變使得癌細(xì)胞對Gefitinib和Erlotinib產(chǎn)生抗性(PaoW， PLoS Medicine, 2005, 2: 57-61)。堿基插入突變出現(xiàn)在第770 775位密碼子，在GACAACCCCCACGTGTGC序列之間(主要在 CCCCC序列兩側(cè))存在8種不同的插入方式,插入的片段為3 9個堿基。這類插入突變的臨床意 義目前尚不清楚(Shigmatsu H,. JNCI' 2005， 97:339-346)。
4.外顯子21的點(diǎn)突變主要是第858位密碼子出現(xiàn)T一G轉(zhuǎn)換，引起EGFR蛋白中該位點(diǎn)的氨 基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?簡稱L858R)，此突變位于DFG序列附近,其作用是使A-loop的穩(wěn) 定性提高，癌細(xì)胞對Gef itinib和Erlotinib的敏感性明顯增強(qiáng)。
美國哈佛醫(yī)學(xué)院Lynch等(LynchTJ， NEnglJ Med, 2004， 350:2129-2139.)報道了16例接受 Gefitinib治療的肺癌病人,9例有效者中8例存在EGFR基因突變(其中4例為del E746-A750， 2 例為外顯子21 L858R， 1例為L861Q，另1例的突變出現(xiàn)在外顯子18,為G719C,而7例無效者均為 野生型,首次揭示EGRF基因突變與藥物療效的關(guān)系。此后不久，該院另一組研究者Paez等 (PaezJG， Science, 2004， 304:1497-1500.)也報道，在9例肺癌病人中，5例Gef itinib治療有效 者均為EGFR突變型(4例為外顯子19缺失突變,1例為L858R)，而4例無效者均為野生型。美國華 盛頓大學(xué)Pao等(Pao WPNAS, 2004,101:13306-13311).報道了類似的研究結(jié)果，在10例 Gefitinib治療有效者7例檢測到EGFR基因突變(其中6例為外顯子19缺失突變，1例為L858R), 而8例無效者均為野生型。但該作者還率先報道,7例經(jīng)Erotinib治療有效者中5例存在EGFR基 因突變(3例為外顯子19缺失突變，3例為L858R，其中1例同時存在外顯子19和21突變)，而10例 無效者均為野生型。
除美國學(xué)者外，亞洲學(xué)者也相繼報道了各自的研究結(jié)果。韓國漢城大學(xué)Han等(Han SW， JClinOncol， 2005, 23:1-9.)報道，17例EGFR突變型肺癌經(jīng)Gefitinib治療后ll例顯效64. 7%, 其中4例為外顯子19缺失突變，5例為L858R, 2例為外顯子18突變G719A，而73例野生型肺癌中僅 10例(13. 7%)有效。此外,還首次報道，EGFR突變型的疾病進(jìn)展時間(TTP)和總體生存率(0S)等指標(biāo)均顯著優(yōu)于野生型，提示突變型病人經(jīng)藥物治療的預(yù)后較好。
日本Aichi癌癥中心醫(yī)院(Mitsudomi J Clin Oncol， 2005， 11:2513-2520).也報道了EGFR 基因突變、Gefitinib療效與預(yù)后的關(guān)系。作者分析了經(jīng)Gefitinib治療的術(shù)后復(fù)發(fā)病人，發(fā)現(xiàn) 20例治療后腫瘤縮小^30%的病人中，19例(95M)為EGFR突變型，而17例治療后病情進(jìn)展的病人 中，僅2例(12%)為突變型。此外，還觀察到，外顯子19堿基缺失者的有效率(16/16例，100%)顯著 高于點(diǎn)突變(G719C，L858R和L861Q， 5/8例，67%)，并且治療有效者的生存率顯著高于無效 者,Kaplan-Meier檢驗揭示EGFR基因突變是影響預(yù)后的主要因素。
中國臺灣研究者Huang等(HuangSF, ClinCancer Res, 2004， 10:8195-8203.)首先報道了我 國EGFR基因突變與Gefitinib治療的關(guān)系,在19例接受藥物治療的病人中，有效(PR)6例均為突 變型(其中2例為外顯子19缺失,2例L858R， 2例為外顯子21突變A839T和K846R)，而無效7例中僅 l例為突變型。
北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)Mu等(MuXL, Clin Cancer Res, 2005,11:4289-4294.)報道了中國大陸 的首份研究結(jié)果，22例經(jīng)Gef itinib治療的病人中7例有效(PR) ， 7例病情穩(wěn)定(SD), 8例病情進(jìn) 展(PD)，在14例PR+SD病人中，10例為突變型(71.4y。)，而PD病人均為野生型。與Mitsudomi等的 報道不同之處是，6例L858R突變中5例為PR， 1例為SD，而4例外顯子19缺失中PR與SD各為2例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中表皮生長因子受體基因突變，提供一種用 PCR方法檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性的特異性引物
SEQUENCE 3: TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC
SEQUENCE 4: TGCCAGGGACCTTACCTTATACA。
同時，本發(fā)明提供一種用PCR方法檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性的探針 SEQUENCE 1: VIC-AAGTGCTGGGCTCC; SEQUENCE 2: FAM-AAAGTGCTGAGCTCC。
同時，本發(fā)明又提供特異性弓I物TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC、 TGCCAGGGACCTTACCTTATACA和探針VIC-MGTGCTGGGCTCC、FAM-AAAGTGCTGAGCTCC在制備通過PCR 擴(kuò)增生物核酸樣品檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性的試劑中的用途。其中，試劑包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、Mg2+。
同時，本發(fā)明又提供一種檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性的試劑盒。
本發(fā)明提供的試劑盒包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增試劑組合物、檢測表皮生長因子受體基 因多態(tài)性的檢測組合物、表皮生長因子受體基因野生/突變基因型陽性對照質(zhì)粒。
其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增試劑組合物包括Taq DNA聚合酶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、dNTP 混合物、Mg2+。擴(kuò)增中各組分的比例經(jīng)過試驗進(jìn)行優(yōu)化。其中，Taq DNA聚合酶，是可以熱啟 動的Taq DNA聚合酶。
其中，檢測表皮生長因子受體基因多態(tài)性的檢測組合物，包括
探針
SEQUENCE 1: VIC-AAGTGCTGGGCTCC; SEQUENCE 2: FAM-MAGTGCTGAGCTCC; 引物
SEQUENCE 3: TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC SEQUENCE 4: TGCCAGGGACCTTACCTTATACA。
探針SEQUENCE1為針對第18外顯子G719S位點(diǎn)野生型的探針，而探針SEQENCE 2為針對 第18外顯子G719S位點(diǎn)突變型的探針。弓l物SEQENCE 3、 SEQENCE 4分別為針對EGFR基因第 18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的特異性正向引物和反向引物。
本發(fā)明涉及的檢測表皮生長因子受體基因多態(tài)性的檢測組合物，是針對EGFR基因的一個 多態(tài)性位點(diǎn)的檢測。在檢測組合物中，探針可以是普通的Taqman探針，也可以是MGB探針。探 針的的5'端用發(fā)光基團(tuán)熒光標(biāo)記，3'端采用淬滅基團(tuán)熒光標(biāo)記。5'端的標(biāo)記熒光基團(tuán)可以是 FAM 、 R0X 、 TET 、 HEX 、 TAMRA 、 CY3 、 CY5 、 J0E 、 Texas red等中間的一種， 3，端的標(biāo)記基團(tuán)可以是TAMRA， NFQ中的一種。
同時，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的試劑盒通過檢測生物樣品確定該生物樣品表皮生長 因子受體基因第18外顯子多態(tài)性，尤其是第18外顯子G719S位點(diǎn)基因型多態(tài)性的用途。
同時，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的試劑盒通過檢測生物樣品預(yù)測表皮生長因子受體抑 制劑治療惡性腫瘤的療效的用途。其中，如果生物樣品EGFR基因18外顯子為G719S純合突變型，則預(yù)測表皮生長因子受體 抑制劑治療惡性腫瘤的療效好；如果為雜合型或者野生型，則預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑 治療惡性腫瘤的療效差。
在本發(fā)明提供的用途中，所述的試劑盒包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增試劑組合物、檢測表 皮生長因子受體基因多態(tài)性的檢測組合物、表皮生長因子受體基因野生/突變基因型陽性對照 質(zhì)粒。
其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增試劑組合物包括Taq DNA聚合酶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、dNTP 混合物、Mg2+。擴(kuò)增中個組分的比例經(jīng)過試驗進(jìn)行優(yōu)化。其中，Taq DNA聚合酶，是可以熱啟 動的Taq DNA聚合酶。
其中，檢測表皮生長因子受體基因多態(tài)性的檢測組合物，包括
探針
SEQUENCE 1: VIC-AAGTGCTGGGCTCC; SEQUENCE 2: FAM-AAAGTGCTGAGCTCC。 引物
SEQUENCE 3: TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC SEQUENCE 4: TGCCAGGGACCTTACCTTATACA。
探針SEQENCE1為針對第18外顯子G719S位點(diǎn)野生型的探針，而探針SEQENCE 2為針對第18 外顯子G719S位點(diǎn)突變型的探針。引物SEQENCE3、 SEQENCE 4分別為針對EGFR基因第18外顯子 G719S多態(tài)性位點(diǎn)的特異性正向引物和反向引物。
在本發(fā)明提供的用途中，表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑藥物是指針對于EGFR酪酸激 酶活性區(qū)域的抑制劑，或者稱為酪氨酸激酶抑制劑藥物。優(yōu)選地，本發(fā)明所指的EGFR抑制劑 是指小分子酪氨酸激酶抑制劑。更加優(yōu)選地，本發(fā)明所指的小分子酪氨酸激酶抑制劑指的是 吉非替尼(英文名Gefitinib，商品名易瑞沙Iressa)和埃羅替尼(英文名:Erlotinib, 商品名特羅凱Tarceva)。
在本發(fā)明提供的用途中，檢測生物樣本均為DNA或者mRNA樣本，優(yōu)選地，本發(fā)明針對的樣 本為來源于腫瘤組織的生物樣本。在本發(fā)明提供的用途中，惡性腫瘤包括但不限于肺癌、結(jié) 直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌以及頭頸部鱗癌。更加優(yōu)選地，本發(fā)明針對的樣本為來源于肺癌組織的樣本，尤其是來源于非小細(xì)胞肺癌 的基因組DNA樣本。
本發(fā)明探針、引物、試劑盒和用途，尤其適用于表皮生長因子第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)。
在本發(fā)明提供的用途中所使用的基因擴(kuò)增儀包括所有的2通道以上的熒光定量PCR儀，以 及不設(shè)通道的光柵控制的熒光定量PCR儀。 本發(fā)明用于檢測樣本基因型的過程
1. 檢測樣本的準(zhǔn)備
如樣本為DNA樣本，直接用紫外分光光度計檢測樣本濃度和純度，要求樣本的 OD260/OD280比值在1.8-2.0，并將樣本稀釋至合適的濃度范圍，具體為5ng/ml- 400ng/ml 之間，優(yōu)選為lOng/ml- 100ng/ml。
如樣本為RNA，則需要逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后依照DNA的要求進(jìn)行樣本的準(zhǔn)備。
2. 樣本目的基因片段的擴(kuò)增
以欲檢測的DNA樣本為模板，使用檢測混合物以及相應(yīng)配套的陽性對照和陰性對照，在 合適的基因擴(kuò)增儀上，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行相應(yīng)多態(tài)性位點(diǎn)的基因擴(kuò)增。在合適 的基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。
3. 目的基因多態(tài)性熒光掃描和基因型判定。
將擴(kuò)增產(chǎn)物放入合適的實(shí)時定量PCR儀，進(jìn)行熒光掃描。根據(jù)陽性對照的掃描結(jié)果和熒 光掃描結(jié)果判定樣本的基因型。
4. 預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑療效
根據(jù)基因型進(jìn)行表皮生長因子受體抑制劑的療效預(yù)測。具體的，如果樣本為外顯子18
G719S純合突變型，則預(yù)測藥物療效好；如果為雜合型或者野生型則預(yù)測療效差。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是以特異性引物 TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC 、
TGCCAGGGACCTTACCTTATACA和探針VIC-AAGTGCTGGGCTCC、 FAM-MAGTGCTGAGCTCC為核心，在
制備通過PCR擴(kuò)增生物樣品檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性的試劑，并提供一
種通過檢測PCR擴(kuò)增生物核酸樣品的表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性的試劑盒、試
劑盒通過檢測生物樣品確定該生物樣品表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性，以及通過
檢測生物樣品預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑治療惡性腫瘤的療效的用途。本發(fā)明PCR模板制
備方法操作簡單，無需特殊設(shè)備，PCR擴(kuò)增后采用檢測熒光信號的方法直接檢測PCR產(chǎn)物從
而得到基因型結(jié)果，不涉及到如電泳的污染和對于環(huán)境可能造成的污染，而且高通量檢測，高
10效率，準(zhǔn)確性高，特別適合臨床和科研的大規(guī)模人群使用，便于推廣應(yīng)用。根據(jù)表皮生長因子受 體基因第18外顯子多態(tài)性結(jié)果對表皮生長因子受體抑制劑的療效進(jìn)行預(yù)測。本發(fā)明克服了臨 床選擇表皮生長因子受體抑制劑類藥物的盲目性，在基因型分析的基礎(chǔ)上可以預(yù)測患者使用 表皮生長因子受體抑制劑類藥物的有效性和安全性，指導(dǎo)臨床用藥，使患者能夠進(jìn)行個體化 醫(yī)療，盡早有效地控制腫瘤，減少毒副作用，減少醫(yī)療成本。
本發(fā)明特別針對表皮生長因子受體基因第18外顯子多態(tài)性位點(diǎn)基因型設(shè)計了PCR擴(kuò)增引 物和探針，與常規(guī)的擴(kuò)增引物和探針相比較，擴(kuò)增效率高、特異性好、省時，能夠直接根據(jù) PCR產(chǎn)物的熒光信號特征來鑒定該位點(diǎn)的基因型，無需后續(xù)的檢測步驟和相應(yīng)的試劑、設(shè)備， 有更好的使用價值。


圖l.質(zhì)?？寺“逷CR擴(kuò)增結(jié)果圖。1. marker, 2. PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖2. 46名服用吉非替尼的非小細(xì)胞肺癌患者基因型的測定結(jié)果SDS數(shù)據(jù)分析圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1表皮生長因子受體基因野生/突變基因型陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建 材料和方法
儀器離心機(jī)(E卯endorf 5415D) ， PCR儀 (ABI 2700)，凝膠成像系統(tǒng)(華電DH2000) 材料pET28載體質(zhì)粒，大腸桿菌菌株DH5a
操作步驟
1. 組織基因組DNA提取
選取石蠟包埋的非小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織，脫蠟后使用DNA提取試劑盒(QIAmpDNAkit) 提取腫瘤組織中基因組DNA。
2. EGFR第18外顯子基因片段的擴(kuò)增
擴(kuò)增表皮生長因子受體目的基因片段，使用下列引物擴(kuò)增EGFR第18外顯子基因片段。 SEQUENCE 5: CTCGAATTCTCCAATGAGCTGGCAAGTG， SEQUENCE 6: TCCAAGCTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAA在引物的5'端，分別包含有EcoRl和Hindi 11的酶切位點(diǎn) PCR程序
94°C 5分鐘預(yù)變性，94。C 30秒，58°C 30秒，72°C 1分鐘，35個循環(huán)。72°C延伸5分鐘。
3. 擴(kuò)增片段的克隆 酶切
擴(kuò)增片段使用EcoRl和HindIII雙酶切，酶切條件為37°C 1小時，酶切產(chǎn)物用純化試劑 盒進(jìn)行純化。
載體質(zhì)粒PET28同樣用EcoRl和HindIII雙酶切，酶切條件為37°C 1小時，酶切產(chǎn)物用
純化試劑盒進(jìn)行純化。 酶切片段連接
采用T4連接酶，按照載體和擴(kuò)增產(chǎn)物l: 2的比例進(jìn)行連接，連接條件為16°C， 8小時。 轉(zhuǎn)化
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化后在37。C振蕩培養(yǎng)2小時，然后涂Amp抗性的平 板，倒置培養(yǎng)10小時。 篩選
將平板上長出的克隆斑，采用PCR方法進(jìn)行克隆鑒定，鑒定結(jié)果吻合的進(jìn)行測序。從中 篩選出表皮生長因子受體基因的野生型和突變型基因型序列正確的克隆作為陽性質(zhì)粒。
PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。
4. 陽性質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化。
陽性克隆采用1L的培養(yǎng)瓶，大量培養(yǎng)。培養(yǎng)后堿法純化質(zhì)粒，分光光度計檢測純度和濃 度后-20。C冷凍保存。
實(shí)施例2利用試劑盒進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌樣本基因型的測定
1. 樣本的準(zhǔn)備取46份服用吉非替尼的非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織(新鮮組織或者石蠟 塊)，提取基因組DNA。
2. PCR擴(kuò)增混合液的配置 按照表1配置PCR擴(kuò)增混合液。
分別配置46份PCR反應(yīng)混合液，另外，配置兩個基因型的陽性對照樣本混合液和一份陰性樣本混合液。
表l PCR擴(kuò)增混合液配置表
組分體積ul
Taq DNA聚合酶5U/ul0.5
10XPCR buffer2.5
Mg2 + 25mM3
dNTP 1.25mM4
引物l SEQUENCE30.4
引物2 SEQUENCE40.4
探針l SEQUENCE10. 25
探針2 SEQUENCE20. 25
DNA模板11.25
H202.45
Total25
3. PCR擴(kuò)增反應(yīng)
反應(yīng)條件如下95°C IO分鐘，92°C 15秒，60°C 1分鐘40個循環(huán)。
4. 單核苷酸多態(tài)性SNP分析 '
PCR反應(yīng)結(jié)束后采用SDS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行基因型分析，分析結(jié)果見圖3:
由圖2可以得知，VIC熒光為野生型(GG) ， FAM熒光為純合突變型(AA),中間熒光為雜
合型(GA)，根據(jù)圖譜可以得到表2。
5. 吉非替尼療效預(yù)測
根據(jù)上述檢測的結(jié)果，基因型為純合突變型AA的患者服用吉非替尼后，藥物療效要優(yōu)于 基因型為GG野生型和雜合型GA的患者。
13表2 46名服用吉非替尼的非小細(xì)胞肺癌患者基因型
ID號基因型ID號基因型ID號基因型
A001GGA016GAA031GG
A002GAA017GAA032GA
A003GAA018GGA033GG
A004AAA019GAA034GA
A005GGA020GGA035GG
A006GGA021GAA036AA
A007AAA022GAA037GA
A008GAA023AAA038AA
A009MA024GAA039AA
A010GAA025GGA040GG
A011GAA026GGA041AA
A012AAA027AAA042GA
A013AAA028AAA043GA
A014GAA029MA044GG
A015AAA030GAA045GG
A046GG
14<110〉北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司
深圳奧薩醫(yī)藥有限公司
〈120〉預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑療效的試劑盒
<160〉 6
<170〉 Patervtln version 3. 3
<210〉 1
〈211〉 14
<212> DNA
〈213> 人工合成
〈400〉 1
aagtgctggg ctcc 14
<210> 2
<211〉 15
<212〉 腿 <213〉人工合成<400> 2
aaagtgctga gctcc 15
<210> 3
〈211〉 26
〈212〉 醒
<213〉 人工合成
〈400> 3
tgaggatctt gaaggaaact gaattc 26
〈210〉 4
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 人工合成
〈400> 4
tgccagggac cttaccttat aca 23
〈210〉 5 〈211〉 28 〈212〉 DNA<213〉 人工合成 〈400> 5
ctcgaattct ccaatgagct ggcaagtg 28
〈210> 6
〈211> 32
<212〉 腿 〈213〉人工合成
〈400〉 6
tccaagcttt cccaaacact cagtgaaaca a_a 3權(quán)利要求
1.一種用PCR方法檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC、TGCCAGGGACCTTACCTTATACA。
2. —種用PCR方法檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的探針 VIC-AAGTGCTGGGCTCC、麗-AAAGTGCTGAGCTCC 。
3. 特異性引物TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC 、 TGCCAGGGACCTTACCTTATACA和探針 VIC-AAGTGCTGGGCTCC、 FAM-AAAGTGCTGAGCTCC在制備通過PCR擴(kuò)增生物核酸樣品檢測表 皮生長因子受體基因第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的試劑中的用途。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的試劑中含有TaqDNA聚合酶、dNTP和 Mg2+。
5. —種檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，包括聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增試劑組合物、檢測表皮生長因子受體基因多態(tài)性的檢測組合物和表皮生 長因子野生/突變基因型陽性對照質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增試劑組合物包括Taq DNA聚合 酶、dNTP混合物、Mg2+、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求書5所述的試劑盒，其特征在于檢測表皮生長因子受體基因第18外顯 子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的檢測組合物包括探針VIC-AAGTGCTGGGCTCC;FAM-MAGTGCTGAGCTCC;引物TGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC;TGCCAGGGACCTTACCTTATACA 。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7中所述的試劑盒，其特征在于:探針是MGB探針。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8中所述的試劑盒，其特征在于:探針的5'端用發(fā)光基團(tuán)熒光標(biāo)記，3'端用 淬滅基團(tuán)熒光標(biāo)記。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的試劑盒，其特征在于:探針5'端的標(biāo)記熒光基團(tuán)選自FAM 、 R0X 、 TET 、 HEX 、 TAMRA 、 CY3 、 CY5 、 J0E 、 Texas red中的一種，3'端的 標(biāo)記基團(tuán)是TAMRA或NFQ。
11. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒檢測表皮生長因子第18外顯子基因多態(tài)性的用途。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于檢測位點(diǎn)為表皮生長因子受體基因第18外顯子G719S位點(diǎn)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒通過檢測生物樣品預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑治療惡 性腫瘤的療效的用途。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于惡性腫瘤包括肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、 胰腺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌以及頭頸部鱗癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)測表皮生長因子受體抑制劑療效的試劑盒，特別地用PCR方法檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物、探針，以及特異性引物和探針在制備通過PCR擴(kuò)增生物樣品檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的試劑中的用途，檢測表皮生長因子受體基因第18外顯子G719S多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒及試劑盒的用途。屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/11GK101586154SQ20081011220
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日
發(fā)明者多 于, 張彥明, 徐希平, 燕 王 申請人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司;深圳奧薩醫(yī)藥有限公司