專利名稱：：一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品安全領域，主要涉及一種抑制花生田土壤中產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉群體的生防菌株-一黃曲霉菌株A051，以及該菌株的生防應用。
背景技術：
：黃曲霉毒素(Aflatoxins，以下簡寫成AFT)主要是黃曲霉(Asper^77"s/7aras)和寄生曲霉(A/ara^"c"^的代謝產(chǎn)物，是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強的一類生物毒素。其中，毒性最強、危害最大的為黃曲霉毒素B1，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，被列入嚴管的特劇毒物質(zhì)。農(nóng)產(chǎn)品AFT污染已成為影響食品安全和危害人們身體健康的隱形殺手。據(jù)世界糧農(nóng)組織估計，目前世界范圍內(nèi)有25%的農(nóng)作物產(chǎn)品受真菌毒素的污染，其中主要就是AFT。近年來，世界各國不僅紛紛制訂了相應的AFT限量標準和法規(guī)，而且其允許上限均有進一步降低。1998年歐盟委員會通過了1525/98號指令，公布了歐盟國家食品中黃曲霉毒素的最高限量規(guī)定人類直接食用的花生及其制品中黃曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)從20ug/kg統(tǒng)一降到4ug/kg，其中Bl《2ug/kg。目前，AFT污染對農(nóng)產(chǎn)品輸出國的對外貿(mào)易己產(chǎn)生了嚴重影響。因此。AFT污染的有效防治與控制對于保障我國食品安全和提升我國農(nóng)產(chǎn)品出口競爭力具有重要意義。生物防治是目前控制農(nóng)產(chǎn)品AFT非常有效的手段，美國近來在AFT生物防治研究方面已取得重大進展，即利用不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株NRRL21882能有效防治花生AFT污染，其防效可達90%以上，使花生中AFT的含量能有效控制在限量標準范圍內(nèi)。但是美國的生防菌株在對非洲黃曲霉群體沒有很好的抑制作用，而非洲分離到的高競爭力的不產(chǎn)毒素的菌株對非洲產(chǎn)毒黃曲霉則有很好的抑制作用；表明，不同地區(qū)的不產(chǎn)毒素的黃曲霉生防菌株有其一定的適用范圍。目前，我國在該領域還沒有相關報道。黃曲霉和寄生曲霉是腐生菌，主要在土壤中存活。在作物生長期，農(nóng)作物對病菌有較強的抗性，病菌難以侵染作物或僅在表面處于潛伏狀態(tài)。在農(nóng)產(chǎn)品成熟期和收獲后的儲存過程中，潛伏在農(nóng)產(chǎn)品表面的病菌遇到適合的條件可迅速生長，并產(chǎn)生AFT。因此，防治農(nóng)作物生長過程中黃曲霉的潛伏侵染是控制農(nóng)產(chǎn)品生長后期和儲存過程中AFT污染的非常重要的環(huán)節(jié)，而防治農(nóng)作物生長過程中黃曲霉?jié)摲秩镜闹匾胧┦菧p少土壤中產(chǎn)AFT的黃曲霉病菌的菌量。AFT主要是黃曲霉和寄生曲霉這兩種真菌產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)，但并不是所有的黃曲霉和寄生曲霉菌株都能產(chǎn)AFT毒素。AFT是病菌在長期進化過程中對逆境的一種適應反應，因此，在正常的環(huán)境條件下，一些黃曲霉菌的菌株由于AFT合成途徑中的某個或某些基因發(fā)生缺失或突變，使得這些菌株不產(chǎn)生AFT，而且有些不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株的競爭力可能會優(yōu)于產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株。因此，將高競爭力的不產(chǎn)AFT的菌株大面積施用于田間后，使其在自然種群的競爭中以強勁的生長優(yōu)勢來抑制產(chǎn)AFT菌株，進而可顯著降低AFT污染農(nóng)產(chǎn)品的風險。目前，我國在AFT生物防治方面研究還剛剛起步。開發(fā)利用防治AFT的生物農(nóng)藥，對解決我國農(nóng)產(chǎn)品AFT污染問題將具有重要的應用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株及其用途，該菌株能用于抑制花生田土壤中產(chǎn)毒黃曲霉群體。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株，屬于曲霉屬(^perg說^)黃曲霉"印wgz7/w;yy7av附)，保藏名稱為黃曲霉菌株A051，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(位于北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏日期2008年6月24日，保藏號CGMCCNO.2556。上述黃曲霉菌株A051在査氏培養(yǎng)基上菌落生長較快，3(TC條件下5天可長滿直徑9cm的培養(yǎng)皿；菌落黃綠色，產(chǎn)生大量分生孢子；分生孢子梗長度一般為700^im1200pm，直徑為llHm16pm，頂囊近球形；分生孢子球形或近球形，直徑3.5pm4.5pm，孢子表面粗糙。上述黃曲霉菌株A051缺乏黃曲霉毒素合成基因CA黃曲霉毒素合成基因C2、黃曲霉毒素合成基因C3、黃曲霉毒素合成基因"oW、黃曲霉毒素合成基因C3^X、黃曲霉毒素合成基因a/r、黃曲霉毒素合成基因pfoj、黃曲霉毒素合成基因wor/、黃曲霉毒素合成基因&;^、黃曲霉毒素合成基因&;c5、黃曲霉毒素合成基因^/7及、黃曲霉毒素合成基因q/LT、黃曲霉毒素合成基因fl^L4、黃曲霉毒素合成基因M"和黃曲霉毒素合成基因朋M;因此，該菌株不能合成黃曲霉毒素。本發(fā)明還同時提供了上述黃曲霉菌株A051的用途，用于抑制花生田土壤中產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉病菌群體。本發(fā)明的黃曲霉菌株A051的菌落形態(tài)與普通黃曲霉相似，但不合成黃曲霉毒素；其不產(chǎn)毒素的機制是該菌株的毒素合成基因從基因"至/70/^基因出現(xiàn)缺失，Ke/7基因至最后一個毒素合成基因AKP/I之間的基因是完整的；該菌株的毒素合成基因的缺失位點位于基因M/7啟始密碼子上游297bp處，缺失位點的序列是TTCATTGAGACACACGGCGGTTTTCGTT。具體內(nèi)容如下在本發(fā)明中，首先用YES培養(yǎng)基從土壤中分離出黃曲霉菌株，用生物測定、化學分析以及分子生物學方法篩選出其中不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株，然后測定這些不產(chǎn)AFT菌株的生長速率、產(chǎn)孢量、土壤中的存活期、以及與產(chǎn)AFT菌株的競爭力等指標，從而篩選出了一個高競爭力的不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株A051。根據(jù)毒素合成相關基因67、O、加r仏cy/^、a/77\a/7y、/orArer入KerAort/A力"力和《7d的基因序列，設計PCR引物，以黃曲霉菌株A051的DNA為模板，進行PCR擴增，結(jié)果表明，該菌株的毒素合成基因從基因C/至/70/^基因出現(xiàn)缺失，Ke/7基因至最后一個毒素合成基因Zy。a4之間的基因是完整的。通過TAIL-PCR技術，發(fā)現(xiàn)C7基因后的缺失位點的序列是TTCATTGAGACACACGGCGGTTTTCGTT。根據(jù)該缺失點的DNA序列，設計一組PCR引物AFB-F:5，一TATTCCGAATTGCATGCATCA_3，和AFB-R:5，-AACGAAAACCGCCGTGTGT-3'，該組引物能從A051菌株中特異地擴增出一條260bp的DNA片段，而其他類型的不產(chǎn)毒素和產(chǎn)毒素黃曲霉則不能擴到相應的片段。因此，該組引物能特異性鑒定該黃曲霉菌株A051。本發(fā)明的黃曲霉菌株A051對土壤中產(chǎn)毒黃曲霉群體有抑制作用，該菌株A051對產(chǎn)毒素的黃曲霉菌具有高競爭力，將該菌株A051施用于作物田后，使其在自然種群的競爭中以強勁的生長優(yōu)勢來減少土壤中產(chǎn)毒黃曲霉菌群體，控制農(nóng)作物生長過程中的潛伏侵染，進而可顯著降低農(nóng)作物生長后期和存貯過程中黃曲霉毒素污染的風險。為了證明黃曲霉菌株A051對土壤中產(chǎn)毒黃曲霉群體有抑制作用，發(fā)明人作了如下的實驗將黃曲霉菌株A051以麥粒為基質(zhì)，28-30'C條件下發(fā)酵5天，將發(fā)酵的麥粒在低于50'C條件下烘干，然后于5月下旬至6月上旬施用于花生田中。黃曲霉菌株A051在土壤中以強勁的生長優(yōu)勢來抑制土壤中產(chǎn)毒黃曲霉菌群體，其抑制效果可達到97%以上。通過上述實驗可表明該黃曲霉菌株A051能有效控制農(nóng)作物生長過程中的產(chǎn)毒素黃曲霉菌的潛伏侵染，進而可顯著降低農(nóng)作物生長后期和存貯過程中黃曲霉毒素污染的風險。本發(fā)明的黃曲霉菌株A051的花生田間使用方法具體如下在花生種植后兩至兩個半月，將經(jīng)菌株A051發(fā)酵的麥粒均勻撒在花生田中，含菌株A051麥粒的用量為3公斤/畝；施用后如果土壤干燥，可灌溉一次，使土壤濕潤，以利于生防菌的定殖。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是黃曲霉菌株A051毒素合成基因缺失示意圖2是黃曲霉菌株A051毒素合成基因缺失位點DNA序列及檢測A051特異PCR引物在該DNA序列上的位置圖譜。具體實施例方式實施例l、生防菌株A051(即黃曲霉菌株A051)的采集、分離、鑒定(1)、從土壤中分離黃曲霉菌株從江蘇、浙江、山東等花生田塊采集的土壤用YES培養(yǎng)基培養(yǎng)分離黃曲霉菌株。每升YES培養(yǎng)基成分酵母提取物lg，蔗糖10g，NaC160g,瓊脂20g,滅菌后加入CuS04.ZnS04lml，0.4%氯硝胺5ml，鏈霉素100ppm。(2)、用生物測定、薄層層析以及分子生物學方法篩選出其中不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株，然后測定這些不產(chǎn)AFT菌株的生長速率、產(chǎn)孢量、土壤中的存活期、以及與產(chǎn)AFT菌株的競爭力等指標，從而篩選出了一個高競爭力的不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株A051。具體如下生物測定方法將分離到的黃曲霉菌株接種在含0.3X環(huán)狀糊精的YES培養(yǎng)基上，30'C培養(yǎng)7天后，將菌落用25%氨水熏蒸3分鐘，如果菌落背面呈粉紅色，該菌株為產(chǎn)毒菌株；如果菌落背面不變色，該菌株可能是不產(chǎn)毒素菌株，需進行下一步的薄層層析檢測。薄層層析測定方法:將分離到的黃曲霉菌株接種在含0.3%環(huán)狀糊精的YES培養(yǎng)基上，30。C培養(yǎng)7天后，收集100毫克菌絲和孢子，置于1.5毫升的離心管中，并向其中加入200微升的80%甲醇；室溫下震蕩30分鐘后10，000g離心5分鐘，取50微升上清液點到硅膠層析板上，吹干后將薄層層析板置于展布槽內(nèi)用無水乙醚預展12厘米，取出涼干后在經(jīng)過丙酮一三氯甲烷(8:92)展開10—12厘米，然后取出層析板，365nm紫外燈下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)、以提取的黃曲霉菌株A051的DNA為模板，分別用以上引物進行常規(guī)PCR反應，每個反應均有產(chǎn)毒黃曲霉菌株DNA對照和陰性對照(以無菌水作為模板)。PCR反應的體系為:luLDNA模板(約4ng)，0.lmM引物各lul，10mMdNTP0.5ul,25mMMgC122ul，10Xbuffer(北京東勝公司生產(chǎn))2.5ul，聚合酶1.5U個單位，雙蒸水補足至25"。反應條件為95。C預變性3min，94。C變性40s，各組引物53。C退火40s，72。C延伸(具體時間視擴增片段大小而定)，進行35個循環(huán)，最后延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.5W的瓊脂糖在1XTAE緩沖液中電泳后，用EB顯色拍照。(3)、通過各組引物的多次PCR驗證，本發(fā)明涉及的黃曲霉菌株A051的毒素合成基因從基因Cl缺失至基因norA，verl基因至最后一個毒素合成基因之間的基因是完整的(如圖l所示)。實施例3、菌株A051毒素合成基因缺失位點序列的確定通過上述方法已經(jīng)確定菌株A051是從第一個毒素合成基因缺失至毒素合成基因norA，從verl基因至最后一個毒素合成基因是完整的。根據(jù)verl的序列設計3個特異性巢式引物AFT1、AFT2和AFT3，與1個隨機引物RA5組合進行Tail-PCR擴增，從而確定具體的缺失位點。(引物序列見表2)表2、Tail-PCR擴增所用巢式引物以及隨機引物的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>按照以下步驟進行巢式PCR反應，每個反應均有陰性對照(以產(chǎn)毒黃曲霉菌株DNA和無菌水作為模板)Tail-PCR-1:以菌株A051的DNA為模板，用隨機引物RA5和引物AFT1進行PCR擴增。Tail-PCR-2:以Tail-PCR-l的稀釋產(chǎn)物(體積比1:10)為模板，用隨機引物RA5和AFT2進行PCR擴增。Tail-PCR-3:以Tail-PCR-2的稀釋產(chǎn)物(1:10)為模板，用隨機引物RA5和AFT3進行PCR擴增。Tail2和Tail3的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖在1XTAE緩沖液中電泳后，用EB顯色拍照。發(fā)現(xiàn)Tail2-PCR產(chǎn)物中有目標片段，將目標產(chǎn)物純化、測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明涉及的菌株A051毒素合成基因的缺失位點位于基因verl啟始密碼子上游297bp處，缺失位點上游300-bp的DNA序列見圖2。實施例4、特異性PCR引物檢測黃曲霉菌株A051根據(jù)菌株A051毒素合成基因確定的缺失位點的序列，在缺失位點處設計SEQIDNO:30所示的特異性下游引物AFB-R(5，AACGAAAACCGCCGTGTGT3，)，在缺失位點上游設計SEQIDNO:31所示的特異性上游引物AFB-F(5，TATTCCGAATTGCATGCATCA3，)，利用該組引物，以A051菌株DNA和其它黃曲霉菌株的DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應的體系為1uLDNA模板(約4ng)，0.lmM引物各lul，10mMdNTP0.5ul，25mMMgC122ul，10Xbuffer(北京東勝公司生產(chǎn))2.5ul，聚合酶1.5U個單位，雙蒸水補足至25ixL。反應條件為95°C預變性3min，94。C變性40s，各組引物58'C退火40s,72。C延伸30s，進行35個循環(huán)，最后延伸7min。PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該特異性引物能夠從菌株A051中擴增出260bp大小的DNA片段，不能從其他類型的黃曲霉菌株中擴增出任何DNA片段。表明，該組PCR引物能特異檢測A051菌株。實施例5、生防菌株A051(黃曲霉菌株A051)施用花生田間能有效抑制土壤產(chǎn)毒素黃曲霉病菌群體增長以江蘇、浙江、山東、四川、遼寧等地的花生田作為實驗對象，在花生種植后兩至兩個半月為施用的時間。以小麥為基質(zhì)發(fā)酵菌株A051,小麥先高溫12rC滅菌2h，再將菌齡為3天菌株A051接種于小麥，接種量為105個分生孢子/500克麥粒,28-3(TC培養(yǎng)5天，期間應適當震蕩以防菌絲集結(jié)產(chǎn)孢，5(TC干燥2天，然后將這些小麥顆粒以3公斤/畝均勻播撒于田間的花生中，施用菌A051后灌溉一次使土壤濕潤，以利于生防菌株繁殖。施用菌A051后每隔15天，取施用菌株A051花生田間的土樣，檢測土樣中菌株A051的群體數(shù)量，比較使用生防菌前后土樣中的產(chǎn)毒黃曲霉百分比的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用菌株A051前，土壤中產(chǎn)AFT毒素的黃曲霉菌占84%—98%;菌株A051施用15天后，從土壤中分離的黃曲霉菌株基本均為不產(chǎn)毒素的A051，表明在田間施用菌株A051后，可以有效的抑制土壤中產(chǎn)毒素的黃曲霉病菌群體增長。具體結(jié)果如表3所示。表3、菌株A051的施用效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例6、將美國的黃曲霉菌株NRRL21882替代生防菌株A051，其余同實施例5。所得的結(jié)果如下施用15天后，土壤中產(chǎn)AFT毒素的黃曲霉菌仍然占1030%。具體如表4所示。表4、菌株NRRL21882的施用效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。SEQIDNO:1ccgttgcagttaaaactcacaSEQIDNO:2gaagctcgatcttctccatgaSEQIDNO:3tctggagtcggaggttaggttSEQIDNO:4gagcaacacgatcattgcatSEQIDNO:5gtgcccagcatcttggtccaSEQIDNO:6aggacttgatgattcctcgtcSEQIDNO:7tgcggacatctaacgaccatSEQIDNO:8aggtcacttcgttcgtgaaggSEQIDNO:9cccttggtctaccattgtttgaSEQIDNO:10cagttgctcccaaggagtggtSEQIDNO:11cggtcgatcagatcgctaattSEQIDNO:12acttcatgttgggaagcgg序列表21212120202120212221211912SEQIDNO:13aataaggctcgtaaccccagaSEQIDNO:14aagtgcaagctggctattgtgSE(JIDNO:15tgagaaaggggacgctggatSEQIDNO:16caatcgaatcasccaccacaSEQIDNO:17ccttatgcctgggaacgatSEQIDNO:18ttcgcatcacttcctccacaSEQIDNO:19accaccgtttagatggcaaaSEQIDNO:20agagctggtcaggataatccgSEQIDNO:21ac￡ictc￡iattgcaccaccaaaSECIDNO:22gaagtagtggccgggtgaatSEQIDNO:23tattctgggcgaagcatcaaSEQIDNO:24cagagtagttggtcccacgaSEQIDNO:25gcatgtccgtcgtcctgataSEQIDNO:26cccattgatcaatctcggatSEQIDNO:27catcggcctggattgcgataSEQIDNO:28EictttctccgcggcctcacSEQIDNO:29cgccggtgactaaggccactSEQIDNO:30aacgaaaaccgccgtgtgtSEQIDNO:31tattccgaattgcatgcatca2020201920192權利要求1、一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株，其特征是屬于曲霉屬(Aspergillus)黃曲霉(Aspergillusflavus)，保藏名稱為黃曲霉菌株A051，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2008年6月24日，保藏號CGMCCNO.2556。2、根據(jù)權利要求l所述不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株，其特征是所述黃曲霉菌株A051在査氏培養(yǎng)基上菌落生長較快，3(TC條件下5天可長滿直徑9cm的培養(yǎng)皿；菌落黃綠色，產(chǎn)生大量分生孢子；分生孢子梗長度為700pm1200pm，直徑為llpm16pm，頂囊近球形；分生孢子球形或近球形，直徑3.5pm4.5pn，孢子表面粗糙。3、根據(jù)權利要求1或2所述不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株，其特征是:所述黃曲霉菌株A051缺乏黃曲霉毒素合成基因C/、黃曲霉毒素合成基因C2、黃曲霉毒素合成基因C3、黃曲霉毒素合成基因"or5、黃曲霉毒素合成基因cjp4、黃曲霉毒素合成基因q/r、黃曲霉毒素合成基因p/t^、黃曲霉毒素合成基因"or/、黃曲霉毒素合成基因te;^、黃曲霉毒素合成基因te;cB、黃曲霉毒素合成基因q/7及、黃曲霉毒素合成基因q/LT、黃曲霉毒素合成基因i^/"、黃曲霉毒素合成基因^"和黃曲霉毒素合成基因"o";因此，該菌株不能合成黃曲霉毒素。4、如權利要求l所述不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株的用途，其特征是用于抑制花生田土壤中產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉病菌群體。全文摘要本發(fā)明公開了一種不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株，其屬于曲霉屬(Aspergillus)黃曲霉(Aspergillusflavus)，保藏名稱為黃曲霉菌株A051，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2008年6月24日，保藏號CGMCCNO.2556。本發(fā)明還同時公開了上述黃曲霉菌株的用途，其特征是用于抑制花生田土壤中產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉病菌群體。文檔編號C12N1/14GK101363006SQ200810120929公開日2009年2月11日申請日期2008年9月8日優(yōu)先權日2008年9月8日發(fā)明者嚴蕾艷,尹燕妮,蔣金花,馬忠華申請人:浙江大學