專利名稱：一種黃曲霉毒素b1的免疫學(xué)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及動(dòng)物性食品安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)中毒素殘留檢測的試劑盒，特別是一種用于檢測動(dòng)物性食品和飼料生產(chǎn)中黃曲霉毒素BI的免疫學(xué)檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是一類真菌(如黃曲霉 和寄生曲霉)的有毒代謝產(chǎn)物，它們具有很強(qiáng)的致癌性，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及一些和人類血液、動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。黃曲霉毒素(AFT)目前已發(fā)現(xiàn)20余種，其中黃曲霉毒素BI (AFBl)的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。黃曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素BI的羥基化代謝產(chǎn)物，也是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)。當(dāng)哺乳動(dòng)物攝入黃曲霉毒素BI污染的飼料后，在體內(nèi)經(jīng)羥基化會(huì)將黃曲霉毒素Ml分泌于乳汁當(dāng)中，奶牛經(jīng)攝入黃曲霉毒素BI污染的飼料后產(chǎn)出的牛奶中便含有黃曲霉毒素Ml。由于黃曲霉毒素Ml相當(dāng)穩(wěn)定，巴氏滅菌法也無法將其消除，所以檢測黃曲霉毒素Ml不僅要檢測動(dòng)物飼料原料，而且要檢測最終產(chǎn)品。為此世界各國都規(guī)定了牛乳及其制品中黃曲霉毒素Ml的最大允許含量并將其作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，如中國政府規(guī)定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、奶油等)中黃曲霉毒素Ml的最聞允許含量為O. 5ng/ml?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的黃曲霉毒素殘留檢測主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和免疫學(xué)分析法等。采用理化分析方法雖然是一種較理想的藥物殘留分析方法，但黃曲霉毒素BI分子中沒有紫外發(fā)光團(tuán)和熒光團(tuán)，在化學(xué)分析中需要將它轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂凶贤獍l(fā)光團(tuán)或熒光團(tuán)的衍生物才能進(jìn)行分析，這給檢測工作帶來了極大困難，而且具有樣品前處理步驟繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，儀器價(jià)格昂貴，需要專業(yè)人員操作等缺點(diǎn)。免疫學(xué)分析法具有特異性強(qiáng)、樣品前處理簡單、成本低、能進(jìn)行批量檢測等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測是常用的免疫學(xué)分析方法，但國內(nèi)用于藥物殘留檢測的研究較少，用于檢測黃曲霉毒素BI的ELISA試劑盒更是一項(xiàng)空白。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供了一種小巧輕便的黃曲霉毒素BI的免疫學(xué)檢測試劑盒，使用該試劑盒操作簡便，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中黃曲霉毒素BI的檢測。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種黃曲霉毒素BI的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內(nèi)包含有酶標(biāo)板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標(biāo)板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預(yù)包被黃曲霉毒素BI偶聯(lián)抗原后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架上，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔；所述的蓋板膜大小與酶標(biāo)板一致；所述的模具上的下凹瓶位分別為標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、高濃度標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、酶標(biāo)二抗工作液瓶位、黃曲霉毒素BI抗體瓶位、顯色液A液瓶位、顯色液B液瓶位、終止液瓶位、濃縮洗滌液瓶位、濃縮樣品稀釋液瓶位。所述的盒體是硬紙盒；所述的酶標(biāo)板由聚苯乙烯制成，放于真空鋁鉬袋內(nèi)；所述的蓋板膜是透明塑料硬膜，放于鋁鉬袋內(nèi)；所述的14瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶酶標(biāo)二抗工作液、I瓶黃曲霉毒素BI抗體、I瓶顯色液A液、I瓶顯色液B液、I瓶終止液、I瓶濃縮洗滌液、I瓶濃縮樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛裝，酶標(biāo)二抗工作液用紅色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，黃曲霉毒素BI抗體用黃色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，顯色劑A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛裝，顯色劑B液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，終止液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，濃縮洗滌液和樣品稀釋液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛裝；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14個(gè)下凹瓶位，14個(gè)試劑瓶依次放入對應(yīng)下凹瓶位內(nèi)。所述的6瓶標(biāo)準(zhǔn)液,均為lml/瓶,濃度分別為0ng/ml,0. 02ng/ml,0. 06ng/ml,O. lng/ml,0. 3ng/ml,0. 8ng/ml ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液I瓶，lml/瓶；酶標(biāo)二抗工作液I瓶，6ml/瓶；黃曲霉毒素BI抗體工作液I瓶，6ml/瓶；顯色液A液I瓶，7ml/瓶；顯色液B液I瓶，7ml/瓶；終止液I瓶，7ml/瓶；濃縮洗滌液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；濃縮樣品稀釋液(2X) I 瓶，40 ml/瓶。本實(shí)用新型用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)控報(bào)告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96份測定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，即可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品 的檢測，也可將酶標(biāo)板微孔條拆開進(jìn)行多次使用。此時(shí)，將剩下的微孔條放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。檢測時(shí)，樣本中的殘留物黃曲霉毒素BI將和微孔條上預(yù)包被的黃曲霉毒素BI偶聯(lián)抗原竟?fàn)幙裹S曲霉毒素BI抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素BI的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素BI的含量，其操作簡便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很聞的靈敏度最低檢測限為O. 02ng/ml,回收率花生、玉米等谷物類為90± 15%、飼料樣品為85± 15%、食用油為90± 15%、鮮奶類及其制品為92±15%，且試劑盒的變異系數(shù)均小于10%。相對于其他檢測黃曲霉毒素BI殘留的方法，本試劑盒所需要的儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩機(jī)和微量加樣器，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，操作簡單易行，所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地用于動(dòng)物源性食品中黃曲霉毒素BI殘留的定量、定性檢測。

圖I是本實(shí)用新型中酶標(biāo)板的主視圖；圖2是圖I中沿A-A的縱向剖視圖；圖3是本實(shí)用新型蓋板膜的主視圖；圖4是本實(shí)用新型中試劑瓶的主視圖；圖5是本實(shí)用新型中具有下凹瓶位模具的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6是本實(shí)用新型中放入下凹瓶位模具盒體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖面說明1、支撐架；2、微孔條；3、黃曲霉毒素BI偶聯(lián)抗原；4、蓋板膜；5、白色瓶帽；6、半透明塑料試劑瓶；7、黃色瓶帽或紅色瓶帽；8、黑色瓶帽；9、黑色塑料試劑瓶；10、綠色瓶帽；11、白色塑料試劑瓶；12、白色瓶帽；13、6ml黃曲霉毒素BI抗體工作液瓶位；14、6ml酶標(biāo)二抗工作液瓶位；15、7ml底物顯色劑A液瓶位；16、Iml高濃度黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位；17、7ml底物顯色劑B液和7ml終止液瓶位；18、lml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液瓶位；19、40ml濃縮洗滌液瓶位；20、40ml濃縮樣品稀釋液瓶位；21、具有下凹瓶位的模具；
22、盒體。
具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖詳細(xì)描述實(shí)施例。酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被黃曲霉毒素BI偶聯(lián)抗原
(3)后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架(I)上，且酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2 );白色瓶帽(5 )的半透明塑料試劑瓶(6)用于封裝40ml濃縮洗滌液或40ml濃縮樣品稀釋液；黃色瓶帽(7)的白色塑料試劑瓶用于封裝6ml黃曲霉毒素BI抗體工作液，紅色瓶帽(7)的白色塑料試劑瓶用于封裝6ml酶標(biāo)二抗工作液；黑色瓶帽(8)的黑色塑料試劑瓶(9)用于封裝7ml底物顯色劑A液，綠色瓶帽(10)的白色塑料試劑瓶(11)用于封裝7ml底物顯色劑B液或7ml終止液；白色瓶帽(12)的半透明塑料試劑瓶用于封裝lml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；實(shí)用新型盒體(22)內(nèi)置新型·具有下凹瓶位的模具(21)，上有14個(gè)瓶位，放置位置依次為6ml黃曲霉毒素BI抗體工作液瓶位(13)，6ml酶標(biāo)二抗工作液瓶位(14)，7ml底物顯色劑A液瓶位(15)，Iml高濃度黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(16)，7ml底物顯色劑B液和7ml終止液瓶位(17)，6種lml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液瓶位(18)，40ml濃縮洗滌液瓶位(19)，40ml濃縮樣品稀釋液瓶位(20)。動(dòng)物飼料樣品中黃曲霉毒素BI含量的測定I)樣本前處理取3g粉碎飼料樣品，加入9ml樣品提取液；劇烈振蕩IOmin ；4000r/min離心5min,或用定量分析濾紙過濾；上清液或?yàn)V液用去離子水按1:9比例稀釋(I份濾液+9份去離子水)；取稀釋后液體待測。稀釋倍數(shù)30倍。2)使用試劑盒的操作步驟①將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20 25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻取出需要數(shù)量的微孔條，將不用的微孔條放進(jìn)原鋁箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2 8°C 洗滌工作液在使用前也需回溫；④編號將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置； 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ I到對應(yīng)的微孔中，隨即加入酶標(biāo)二抗工作液50 μ I /孔，再加入黃曲霉毒素BI抗體工作液50μ1 /孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;⑥洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300μ I/孔，充分洗滌5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破) ’⑦顯色加入底物顯色劑A液50 μ I/孔，再加底物顯色劑B液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光環(huán)境反應(yīng)15 20min ’⑧測定加入終止液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。3)結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，而定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含黃曲霉毒素BI成負(fù)相關(guān)。①用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍。假設(shè)樣本I的吸光度值為O. 659，樣本2的吸光度值為I. 525，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是0ng/ml為2. 101 ；O. 02ng/ml 為 I. 738 ；0. 06ng/ml 為 I. 313 ；0. lng/ml 為 O. 831 ；0. 3ng/ml 為 O. 262。則樣本I的濃度范圍是O. lng/ml O. 3ng/ml ;樣本2的濃度范圍是O. 02ng/ml O. 06ng/ml,再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中黃曲霉毒素BI的濃度范圍。②準(zhǔn)確定量計(jì)算分兩個(gè)步驟第一步，百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，S卩百分吸光度(％)= B/B0 X 100%式中，B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值A(chǔ)tl-OngAil標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。第二步，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素BI實(shí)際含量。4)注意事項(xiàng)①室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20 25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低；②在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作；③每加一種試劑前需將其搖勻；④反應(yīng)終止液為濃度2 mol/1硫酸,避免接觸皮膚；⑤不使用過有效日期的試劑盒；不使用過有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑；⑥保存試劑盒于2 8°C，不可冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑(底物液)對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；⑦試劑變質(zhì)的跡象底物液有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。O標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)；⑧在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時(shí)間為15 20min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到30min (或更長)。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間；⑨濃縮洗滌液如有結(jié)晶屬正常現(xiàn)象，請加熱溶解后使用；⑩該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種黃曲霉毒素BI的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內(nèi)包含有酶標(biāo)板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標(biāo)板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預(yù)包被黃曲霉毒素BI偶聯(lián)抗原后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架上，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔；所述的蓋板膜大小與酶標(biāo)板一致；所述的模具上的下凹瓶位分別為標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、高濃度標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、酶標(biāo)二抗工作液瓶位、黃曲霉毒素BI抗體瓶位、顯色液A液瓶位、顯色液B液瓶位、終止液瓶位、濃縮洗滌液瓶位、濃縮樣品稀釋液瓶位。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃曲霉毒素BI的免疫學(xué)檢測試劑盒，其特征在于所述的盒體是硬紙盒；所述的酶標(biāo)板由聚苯乙烯制成，放于真空鋁鉬袋內(nèi)；所述的蓋板膜是透明塑料硬膜，放于鋁鉬袋內(nèi)；所述的14瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶酶標(biāo)二抗工作液、I瓶黃曲霉毒素BI抗體、I瓶顯色液A液、I瓶顯色液B液、I瓶終止液、I瓶濃縮洗滌液、I瓶濃縮樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛裝，酶標(biāo)二抗工作液用紅色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，黃曲霉毒素BI抗體用黃色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，顯色劑A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛裝，顯色劑B液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，終止液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，濃縮洗滌液和樣品稀釋液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛裝；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14個(gè)下凹瓶位，14個(gè)試劑瓶依次放入對應(yīng)下凹瓶位內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃曲霉毒素BI的免疫學(xué)檢測試劑盒，其特征在于所述的6瓶標(biāo)準(zhǔn)液，均為 lml/ 瓶，濃度分別為 Ong/ml, O. 02ng/ml, O. 06ng/ml, O. lng/ml, O. 3ng/ml,.0.8ng/ml ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液I瓶，lml/瓶；酶標(biāo)二抗工作液I瓶，6ml/瓶；黃曲霉毒素BI抗體工作液I瓶，6ml/瓶；顯色液A液I瓶，7ml/瓶；顯色液B液I瓶，7ml/瓶；終止液I瓶，.7ml/瓶；濃縮洗滌液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；濃縮樣品稀釋液(2X ) I瓶，40 ml/瓶。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種黃曲霉毒素B1的免疫學(xué)檢測試劑盒。本實(shí)用新型的技術(shù)方案要點(diǎn)為一種黃曲霉毒素B1的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內(nèi)包含有酶標(biāo)板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標(biāo)板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預(yù)包被黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架上，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔；所述的模具上具有14個(gè)下凹瓶位，14瓶試劑依次放入對應(yīng)下凹瓶位內(nèi)。本實(shí)用新型能實(shí)現(xiàn)快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地對食品中黃曲霉毒素B1殘留的定量、定性檢測。
文檔編號G01N33/558GK202614766SQ20122025248
公開日2012年12月19日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者姜金慶, 張海棠, 楊雪峰, 范國英, 梁新紅, 張 浩, 莫海珍, 楊志, 李桂平, 李晨照 申請人:河南知微生物工程有限公司