專利名稱：一種單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定量檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別是涉及一種單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
單增李斯特菌a"ter/a;wo"oqytoge"M)與志賀氏菌(幼/ge/to)是重要的食源性病原菌，其中單增李 斯特菌導(dǎo)致的李斯特菌病("WenVM")可引起腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)，孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷 病人是易感人群。動(dòng)物性食品是其主要傳播源，該菌在4'C仍5J以生長(zhǎng)，對(duì)冷凍產(chǎn)品和速食食品構(gòu)成潛在 威脅。志賀氏菌是危害嚴(yán)重的腸道致病菌，在我國(guó)感染性腹汚致病菌中居宵位，其導(dǎo)致的志賀氏菌性痢疾 (^ 'ge//0A，)是世界上，尤其是發(fā)展中國(guó)家重要的傳染病之-。
單增李斯特菌能夠引起致病是由丁'其產(chǎn)生多個(gè)毒力閃子，分別為李斯特菌溶血素O，侵襲性蛋白P60， 內(nèi)化素A、 B和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因prfA等。由hly基因編碼的李斯特菌溶血素O是單增李斯特幽最重要的致
病因子，大多數(shù)PCR檢測(cè)方法都將其作為靶基因，體現(xiàn)出r很強(qiáng)的特異性。志賀氏菌致病性主要由3;力質(zhì)
粒介導(dǎo)，侵襲性質(zhì)?？乖璈基囚ipaH以多個(gè)拷貝形式同日、j存在—f質(zhì)粒和染色體上，將其作為PCR檢測(cè)靶 基因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于-克服上述技術(shù)的缺陷，而提供一種爭(zhēng)增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方 法，并提供一種用于熒光定量PCR才倉(cāng)測(cè)單核細(xì)胞增生李斯4爭(zhēng)菌和志賀氏菌的特異性引物與探針序列。
本發(fā)明公開了一種食源性病原il中單增李斯特菌(/力fm'amo"oqytoge"M)與志賀氏菌(幼Zge/fe^p) 同步熒光定量PCR檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以"F技術(shù)力案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，
包括以F步驟-
(I. l)、 PCR模板DNA提取
(I. I. l)、待測(cè)樣品DNA提取取lml待測(cè)rf.品進(jìn)行DNA提取，取其中4個(gè)稀釋度的O.lml
菌液涂布BHI平板，于37'C培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌落記數(shù)；hrd恃測(cè)樣品-l2000rpm, 2min，棄上清-沉淀用PBS
洗兩次-200ial TE重懸-加入8(il溶菌酶(10mg/ml)及2pl RNaseA (10mg/ml) ， 37'C水浴30min-按照UMQ-10
DNA提取試劑盒加入裂解液與蛋白酶K, 55'C水浴30min-后參照UNIQ-10 DNA提取試劑盒說(shuō)明f 提取
DNA;(1. 1. 2)、菌液DNA提取取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，采用UNIQ-10DNA提取試劑盒提??； (1. 2)、 hly與ipaH質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建
(1. 3)、熒光定量PCR擴(kuò)增及分析將己經(jīng)計(jì)算出原始拷貝數(shù)的單增李斯特菌與志賀氏菌質(zhì)粒DNA， 按10倍梯度稀釋，取數(shù)量級(jí)105copies/nl到1(^c叩ies/nl作為模板加入25nl反應(yīng)體系，在IQTM5熒光定量 PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25pl):模板DNA各1^1; 2^PremixEx TaqTM12.5jil; 10pmol/L引物各10〖unol/L探針各0.5|J;加滅菌超純水至25^il,反應(yīng)條件95°C 3min; 95°C 15s; 58.5'C lmin， 45個(gè)循環(huán)。
所述的單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，所述的hly與ipaH質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建，具 體步驟為
(1. 2. 1)、分別通過(guò)hly與ipaH引物擴(kuò)增單增李斯特菌hly與忐賀氏菌ipaH基因，擴(kuò)增體系 (25|il):模板DNA l(xl; 10xTaq緩沖液2jil; Mg2+ 1.5mmol/L; dNTPs 0.25mmol/L;上、下游引物500nmol/L; TaqDNA聚合酶2U;加滅菌超純水至25^1,反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 4min;變性94°C 30s;退火59°C 30s; 延伸72'C 20s;共35個(gè)循環(huán)，最后72'C 10min:
(1. 2. 2)、擴(kuò)增產(chǎn)物先進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，將其連 入pGEM-T載體，將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a菌(空質(zhì)粒大腸桿菌，感受態(tài)細(xì)胞)，挑單克隆菌落培養(yǎng)， 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)、電泳鑒定，DNA測(cè)序；
(1. 2. 3)、重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI單酶切線性化，通過(guò)切膠回收得到的線性重組質(zhì)粒經(jīng)紫外分光 光度計(jì)測(cè)定濃度與純度，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 所述的單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，所述hly基因的引物l (hlyl)的序列為
5'-ACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGA-3，，產(chǎn)物大小188bp;引物2 ( hly2 )的序列為5'-
GGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT -3'; 探針 1 (probel) 的序歹ij 為
5' -TCG ATC ACTCTGGAGG ATACGTTGCTC-3'。
所述的單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，所述ipaH基因的引物2 (ipaHl)的序列
為5'- TGCCTCTGCGGAGCTTCG -3'， 產(chǎn)物大小129bp ;弓|物2 ( ipaH2 )的序列為5'-
CCTTCTGATGCCTGATGGACCA-3' ; 探針 2 ( probe2 ) 的 序 歹U 為
5 ， -TTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGA-3'。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明運(yùn)用雙重?zé)晒舛縋CR (T叫M肌探針)同步定暈檢測(cè)單增李斯特菌hly 基閔和志賀氏菌ipaH基因，為食品衛(wèi)生行業(yè)提供一種特異、快速、定量準(zhǔn)確的同步定量檢測(cè)單增李斯特 菌和志賀氏菌的方法。


4圖1是本發(fā)明的pGEM-T Vector (T載體)圖譜示意圖2是本發(fā)明的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)單增李斯特菌重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖3是本發(fā)明的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)志賀氏菌重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖4是本發(fā)明的雙重?zé)晒舛縋CR同步檢測(cè)單增李斯特菌與志賀氏菌重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增曲線與標(biāo) 準(zhǔn)曲線圖5是本發(fā)明的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)人工污染脫脂滅菌乳的擴(kuò)增曲線圖；
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì) 描述
這種單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1. 1)、 PCR模板DNA提取
(1. 1. 1)、待測(cè)樣品DNA提取取lml待測(cè)樣品進(jìn)行DNA提取，取其中4個(gè)稀釋度的0.1ml 菌液涂布BHI平板，于37'C培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落記數(shù)；1ml待測(cè)樣品-12000rpm， 2min，棄上清-沉淀用PBS 洗兩次-200pl TE重懸-加入8nl溶菌酶(10mg/ml)及2^RNaseA(10mg/ml) ，37。C水浴30min-按照UNIQ-10 DNA提取試劑盒加入裂解液與蛋白酶K， 55'C水浴30min-后參照UNIQ-10 DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取 DNA;
(1. 1. 2)、菌液DNA提取取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，采用UNIQ-10DNA提取試劑盒提?。?br> (1. 2)、 hly與ipaH質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建:
(1. 2. 1)、分別通過(guò)hly與ipaH引物擴(kuò)增單增李斯特菌hly與志賀氏菌ipaH基因，擴(kuò)增體系 (25(Al):模板DNA 1^1; 10xT叫緩沖液2pl; Mg2+ 1.5mmol/L; dNTPs 0,25mmol/L;上、下游引物50Onmol/L; TaqDNA聚合酶2U;加滅菌超純水至25pl，反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 4min;變性94°C 30s;退火59°C 30s; 延伸72'C 20s;共35個(gè)循環(huán)，最后72'C 10min;
(1.2. 2)、擴(kuò)增產(chǎn)物先進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，將其連入 pGEM-T載體(圖1 ，購(gòu)自Promega公司)，將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a菌(空質(zhì)粒大腸桿菌，感受態(tài)細(xì)胞)， 挑單克隆菌落培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)、電泳鑒定，DNA測(cè)序；DNA測(cè)序結(jié)果 與GenBank序列比對(duì)顯示，重組質(zhì)粒所含的hly基因序列與Genbank公布的DQ844159進(jìn)行核酸序列比對(duì)， 同源性為100%,而ipaH基因序列與Genbank公布的CP000035同源性為99%。通過(guò)DNAMAN軟件分析 EcoRI酶切位點(diǎn)，顯示在hly及ipaH擴(kuò)增片段中均沒(méi)有該位點(diǎn)，可以進(jìn)行酶切線性化。
(1. 2. 3)、重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI單酶切線性化，通過(guò)切膠回收得到的線性重組質(zhì)粒經(jīng)紫外分光光度
計(jì)測(cè)定濃度與純度，-20^保存?zhèn)溆谩?br> (1.3)、熒光定量PCR擴(kuò)增及分析將已經(jīng)計(jì)算出原始拷貝數(shù)的單增李斯特菌與志賀氏菌質(zhì)粒DNA，
5按10倍梯度稀釋，取數(shù)量級(jí)105copies/nl到10、opies/nl作為模板加入25^1反應(yīng)體系，在IQTM5熒光定量
PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25^1):模板DNA各l^il; 2xPremixEx
TaqTM 12.5^1; 10nmol/L引物各10|iimol/L探針各0.5^1;加滅菌超純水至25nl，反應(yīng)條件95°C 3min;
95°C 15s; 58.5'C lmin， 45個(gè)循環(huán)。
將10倍梯度稀釋至終濃度10Scopies爾l到10Vopies4d的單增李斯特菌和志賀氏菌線性重組質(zhì)粒DNA進(jìn) 行雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后IQm5熒光定量PCR儀進(jìn)行結(jié)果分析，分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根 據(jù)各反應(yīng)管所測(cè)Ct值00與所含質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度(x)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得到雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè) 單增李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.4821ogO) +41.275 (i 2 = 0.999)見圖l;雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)志賀氏菌 的標(biāo)準(zhǔn)曲線_^=-3.577log(;c) +41.494 (f = 0.999)見圖2;雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)同步檢測(cè)單增李斯特菌 與志賀氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為尸-3.7801og( jc) + 43.320 (i 2 = 0.998);產(chǎn)-3.574Iog(x) + 42.068 (i 2 - 0.999) 見圖3。雙重?zé)晒舛縋CR同步檢測(cè)單增李斯特菌與志賀氏菌的擴(kuò)增效率、檢測(cè)低限及定量線性范圍與雙重 熒光定量PCR單獨(dú)檢測(cè)其中一種細(xì)菌相當(dāng)，并且10、鄰ies的C詢〈40，只有單增李斯特齒hty基因的擴(kuò)增效 率有所下降，但檢測(cè)低限及定量線性范圍未受到影響。
圖2雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)單增李斯特菌重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線1-5: 105; 104; 103; 102; 104考貝數(shù)FAM單增李斯特菌為熒光標(biāo)記。
圖3雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)志賀氏菌重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線1-5: 105; 104; 103; 102; 10!拷貝數(shù)HEX為志賀氏菌為熒光標(biāo)記。
圖4雙重?zé)晒舛縋CR同步檢測(cè)單增李斯特菌與忐賀氏菌重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線 1-5: 105; 104; 103; 102; 10]拷貝數(shù)FAM單增李斯特菌為熒光標(biāo)記HEX為志賀氏菌為熒光標(biāo)記。
人工污染的脫脂滅菌乳雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè) 將菌量為10、1(^CFU/ml的人工脫脂滅菌乳提取DNA進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)，結(jié)果顯示雙重?zé)晒舛?量PCR檢測(cè)單增李斯特菌與志賀氏菌的檢測(cè)低限均為1(^CFU/ml，而10'CFU/ml及陰性對(duì)照未見熒光信號(hào) 產(chǎn)生，見圖5，雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)人工污染脫脂滅菌乳的擴(kuò)增曲線1-5: 106; 105; 104; 103; 102CFU/ml; 6: lO'CFU/ml; 7:陰性對(duì)照，PCR base line subtracted Curve Fit RFU , Cycle循環(huán)數(shù)
引物與探針
根據(jù)Genbank公布的單增李斯特菌Wy基因(單增李斯特菌溶血素O基因)序列(序列號(hào)DQ844159) 和志賀氏菌ipaH基因(志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒抗原H基因)序列(序列號(hào)CP000035),利用Beacon Designer 2.0設(shè)計(jì)引物和探針，均由上海生工合成。hly探針5'端標(biāo)記FAM， 3'端標(biāo)記TAMRA; ipaH探針5'端 標(biāo)記HEX, 3，端標(biāo)記TAMRA，設(shè)計(jì)的引物和探針序列見表1。 表1引物、探針序列及擴(kuò)增產(chǎn)物
擴(kuò)增 序列 序列 產(chǎn)物
基因 名稱 大小(序列)(bp)
hlyhlyl5'-ACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGA-3'188
基因(引物l)
hly25，- GGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT -3'
(引物2)
probe15'-TCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTC-3'
(探針l)
ipaHipaHl5'- TGCCTCTGCGGAGCTTCG -3'129
基因(引物1)
ipaH25，- CCTTCTGATGCCTGATGGACCA -3'
(引物2)
probe25'-TTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGA-3'
(探針2)
在實(shí)驗(yàn)中待測(cè)樣品中制作方法如下
1、 細(xì)菌培養(yǎng)
將-70'C保存于15%甘油中的單增李斯特菌和志賀氏菌接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中復(fù)蘇培養(yǎng)16h。單增李斯特菌 劃線接種于PALCAM瓊脂，志賀氏菌劃線接種于SS瓊脂，37°C, 48h。分別挑取單增李斯特菌、忐賀氏 菌單菌落接種于LB1和LB， 37°C、 200r/min振蕩培養(yǎng)12-16h收集菌體用于DNA提取。
PALCAM瓊脂、SS瓊脂、LB1和LB均為專用培養(yǎng)基名稱。其中，PALCAM瓊脂培養(yǎng)基用F單增李 氏菌的選擇性分離(FDA'BAM、 ISO); SS瓊脂用于沙門氏菌，志賀氏菌的選擇性分離培養(yǎng)；LB1用丁-李 氏菌二步增菌；LB肉湯用于細(xì)菌培養(yǎng)。
2、 人工污染樣品
用0.9%生理鹽水將過(guò)夜培養(yǎng)的單增李斯特菌與志賀氏菌菌液10倍梯度稀釋，將各個(gè)稀釋菌液人工污 染食品(購(gòu)自當(dāng)?shù)爻械拿撝瑴缇?，取lml脫脂滅菌乳進(jìn)行DNA提取，取其中4個(gè)稀釋度的0.1ml菌 液涂布BH1平板，于37'C培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌落記數(shù)。
上述實(shí)施例用來(lái)解釋說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍
內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1. 1)、PCR模板DNA提取(1. 1.1)、待測(cè)樣品DNA提取取1ml待測(cè)樣品進(jìn)行DNA提取，取其中4個(gè)稀釋度的0.1ml菌液涂布BHI平板，于37℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落記數(shù)；1ml待測(cè)樣品-12000rpm，2min，棄上清-沉淀用PBS洗兩次-200μl TE重懸-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min-按照UNIQ-10 DNA提取試劑盒加入裂解液與蛋白酶K，55℃水浴30min-后參照UNIQ-10 DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA；(1. 1.2)、菌液DNA提取取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，采用UNIQ-10DNA提取試劑盒提?。?1. 2)、hly與ipaH質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建(1. 3)、熒光定量PCR擴(kuò)增及分析將已經(jīng)計(jì)算出原始拷貝數(shù)的單增李斯特菌與志賀氏菌質(zhì)粒DNA，按10倍梯度稀釋，取數(shù)量級(jí)105copies/μl到101copies/μl作為模板加入25μl反應(yīng)體系，在IQTM5熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μl)模板DNA各1μl；2×Premix ExTaqTM12.5μl；10μmol/L引物各1μl；10μmol/L探針各0.5μl；加滅菌超純水至25μl，反應(yīng)條件95℃ 3min；95℃ 15s；58.5℃ 1min，45個(gè)循環(huán)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述的hly與ipaH質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建，具體步驟為(1. 2. 1)、分別通過(guò)hly與ipaH引物擴(kuò)增單增李斯特菌hly與志賀氏菌ipaH基因，擴(kuò)增體系 (25mJ):模板DNA l|il; 10xT叫緩沖液2^1; Mg2+ 1.5mmol/L; dNTPs 0.25mmol/L;上、下游引物500nmol/L; TaqDNA聚合酶2U;加滅菌超純水至25^il，反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 4min;變性94°C 30s;退火59°C 30s; 延伸72。C 20s;共35個(gè)循環(huán)，最后72'C 10min;(1. 2. 2)、擴(kuò)增產(chǎn)物先進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，將其連 入pGEM-T載體，將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a菌(空質(zhì)粒大腸桿菌，感受態(tài)細(xì)胞)，挑單克隆菌落培養(yǎng)， 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)、電泳鑒定，DNA測(cè)序；(1. 2. 3)、重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI單酶切線性化，通過(guò)切膠回收得到的線性重組質(zhì)粒經(jīng)紫外分 光光度計(jì)測(cè)定濃度與純度，-20'C保存?zhèn)溆谩?br> 3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述hly基因的引物l (hlyl)的序列為5'-ACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGA-3'，產(chǎn)物大小188bp;引物2 (hly2 )的序列為5'- GGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT -3';探針1 ( probel )的序列為 5 ， -TCGATC ACTCTGG AGGATACGTTGCTC-3'。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述ipaH 基因的引物2 (ipaHl)的序列為5，-TGCCTCTGCGGAGCTTCG-3',產(chǎn)物大小129bp;引物2 (ipaH2) 的序列為5'- CCTTCTGATGCCTGATGGACCA-3';探針 2 ( probe2 )的序列為 5，-TTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGA-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單增李斯特菌與志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)PCR模板DNA提取(1.1)待測(cè)樣品DNA提取取1ml待測(cè)樣品進(jìn)行DNA提取，1ml待測(cè)樣品-12000rpm，2min，棄上清-沉淀用PBS洗兩次-200μl TE重懸-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min-按照UNIQ-10DNA提取試劑盒加入裂解液與蛋白酶K，55℃水浴30min-后參照UNIQ-10DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA；(1.2)菌液DNA提?。?2)hly與ipaH質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建(3)熒光定量PCR擴(kuò)增及分析。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明運(yùn)用雙重?zé)晒舛縋CR(TaqMan探針)同步定量檢測(cè)單增李斯特菌hly基因和志賀氏菌ipaH基因，為食品衛(wèi)生行業(yè)提供一種特異、快速、定量準(zhǔn)確的同步定量檢測(cè)單增李斯特菌和志賀氏菌的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101434992SQ20081012142
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日
發(fā)明者軍 劉, 偉 徐, 李素芳 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院;李素芳