基于雙重?cái)U(kuò)增策略構(gòu)建的免標(biāo)記熒光適體傳感器檢測(cè)腺苷的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于外切酶III輔助的DNA循環(huán)和雜交鏈反應(yīng)的雙重?cái)U(kuò)增策略構(gòu) 建的免標(biāo)記焚光適體傳感器檢測(cè)腺苷。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺苷是一種內(nèi)源性核苷，也是ATP降解產(chǎn)物，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和 免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用[1，2]。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明腺苷具有促進(jìn)腫瘤活 性的作用[3-5]。因此，作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，腺苷的靈敏檢測(cè)對(duì)理解其在腫瘤細(xì)胞 增殖和進(jìn)一步說(shuō)明其在癌癥臨床診斷和治療方面功能上具有重要的作用。傳統(tǒng)方法包括高 效液相色譜法（HPLC) [6, 7]、毛細(xì)管電泳法[8]和放射性免疫法[9]，但是這些方法具有一 些局限性，比如繁瑣的樣品前處理、較大的樣品和試劑用量、低靈敏度以及放射性元素的危 害。作為另一種選擇，熒光適體傳感器因其簡(jiǎn)便、快速、高選擇性和靈敏度的優(yōu)勢(shì)引起了越 來(lái)越多的關(guān)注。為了獲得熒光信號(hào)，研宄者建立了一些常見(jiàn)的標(biāo)記為基礎(chǔ)的方法[10-12]。 Dong課題組夠建了一種基于氧化石墨烯和外切酶III輔助信號(hào)擴(kuò)增的熒光適體傳感器 [12]。這種適體傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺苷的靈敏檢測(cè)，但是標(biāo)記的步驟可能會(huì)降低信號(hào)探針的 性能。此外，復(fù)雜性和高成本也會(huì)限制該方法的普遍應(yīng)用。
[0003] 為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)并降低成本，研宄者建立了一些免標(biāo)記的熒光適體傳感器用于檢測(cè) 腺苷[13-15]。Lu課題組建立了一種基于孔雀石綠熒光的適體傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)腺苷的免標(biāo) 記檢測(cè)[13]，但是因?yàn)槟繕?biāo)物與信號(hào)是1 :1的比率，這種方法的靈敏度相對(duì)較低，檢測(cè)限為 2.0Xl(T5m〇lL'為了提高靈敏度，一些信號(hào)擴(kuò)增的策略被引入到免標(biāo)記熒光適體傳感器 的構(gòu)建中，用于腺苷的檢測(cè)分析[16-18]。在這些方法當(dāng)中，我們課題組報(bào)道了一種基于目 標(biāo)物催化發(fā)卡自組裝的免標(biāo)記適體傳感器用于腺苷的擴(kuò)增檢測(cè)[17]，通過(guò)采用信號(hào)擴(kuò)增， 該方法的靈敏度有了一定的提高，檢測(cè)限為6. 0Xl(T6m〇lL'但是這仍然達(dá)不到體液中低 腺苷含量的檢測(cè)水平[19-21]。因此，腺苷檢測(cè)的靈敏度需要進(jìn)一步提高。
[0004] 此外，專(zhuān)利《基于共區(qū)域化觸發(fā)鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)的適體傳感器檢測(cè)腺苷【申請(qǐng)?zhí)枴?20140344669. 2》中報(bào)道了一種通過(guò)共區(qū)域化誘導(dǎo)的鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)為基礎(chǔ)的適體傳感器檢 測(cè)腺苷，其主要是利用HCR和SYBRGreenI產(chǎn)生雙重放大的熒光信號(hào)，同時(shí)結(jié)合共區(qū)域化 和磁球分離作用以實(shí)現(xiàn)低的背景。但是，由于該發(fā)明將識(shí)別腺苷的適體鏈分為兩部分，這就 降低了適體本身的結(jié)合常數(shù)，影響適體與目標(biāo)物的結(jié)合。而本發(fā)明是采用不同原理的熒光 傳感設(shè)計(jì)--ExoIII輔助的DNA循環(huán)和HCR構(gòu)建的新型熒光適體傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)腺苷的 靈敏檢測(cè)；同時(shí)本發(fā)明是采用完整的適體結(jié)構(gòu)，避免了上述結(jié)合常數(shù)低的問(wèn)題。
[0005] 在過(guò)去的十年里，許多信號(hào)擴(kuò)增策略作為一種有效提高目標(biāo)物檢測(cè)靈敏度的工具 被建立[22-25]。ExoIII輔助的DNA循環(huán)方法便是常用方法之一。不同于切刻內(nèi)切酶， ExoIII無(wú)需特異的識(shí)別位點(diǎn)，能夠選擇性的催化雙鏈DNA，從其3'突出端或嵌入端開(kāi)始逐 步水解成單核苷酸[23, 26-28]。通過(guò)ExoIII輔助的DNA循環(huán)反應(yīng)，可以獲得大量的單鏈 DNA用于信號(hào)擴(kuò)增。但是，采用ExoIII輔助DNA循環(huán)的大多數(shù)工作均涉及標(biāo)記步驟，比如 標(biāo)記有熒光團(tuán)用于光學(xué)檢測(cè)，或標(biāo)記有氧化還原基團(tuán)用于電化學(xué)分析[12, 27, 29, 30]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于雙重?cái)U(kuò)增策略構(gòu)建的 免標(biāo)記熒光適體傳感器，將該適體傳感器用于腺苷的分析檢測(cè)。
[0007] 為了獲得免標(biāo)記的基于ExoIII輔助DNA循環(huán)方法用于檢測(cè)腺苷，結(jié)合了雜交鏈 反應(yīng)（HCR)來(lái)產(chǎn)生大量的G-四分體結(jié)構(gòu)，通過(guò)許多N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)的綁定獲 得有效的信號(hào)輸出和信號(hào)擴(kuò)增[31-33]。通過(guò)這兩種信號(hào)擴(kuò)增策略，構(gòu)建了一種新型免標(biāo) 記和雙重?cái)U(kuò)增的熒光適體傳感器用于靈敏檢測(cè)腺苷。首先，構(gòu)建了一個(gè)包含催化鏈、適體鏈 和鏈霉親和素化磁球的三功能探針。該鏈霉親和素化磁球的功能是對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集和分 離從而獲得低背景信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)物被適體鏈識(shí)別之后，催化鏈會(huì)立即被釋放。然后，催化鏈 觸發(fā)ExoIII輔助的DNA循環(huán)，產(chǎn)生大量的DNA片段，從而獲得第一次擴(kuò)增。隨后，DNA片 段作為觸發(fā)鏈引發(fā)HCR，形成帶有許多G-四分體結(jié)構(gòu)的雙螺旋，獲得了第二次擴(kuò)增。最終， NMM插入到G-四分體結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了免標(biāo)記的檢測(cè)。在該方法中，少 量的腺苷可被轉(zhuǎn)化成大量的DNA觸發(fā)鏈，致使目標(biāo)物的擴(kuò)增。該方法具有高的靈敏度，檢測(cè) 限為4. 2X10_7m〇lL-1，這主要?dú)w功于ExoIII輔助DNA循環(huán)和HCR的雙重?cái)U(kuò)增作用以及鏈 霉親和素化磁球的低背景信號(hào)。更為重要的是，該方法能夠顯著的區(qū)分癌癥病人和正常人 尿樣中腺苷的含量，表明我們的方法能夠?yàn)獒t(yī)學(xué)研宄和早期臨床診斷提供一種新的可靠的 用于腺苷定量的策略。
[0008] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 一種基于雙重?cái)U(kuò)增策略構(gòu)建的免標(biāo)記熒光適體傳感器，包括催化鏈、適體鏈和鏈 霉親和素化磁球三功能探針；
[0010]其中，所述催化鏈（cDNA)為：5'-ACTGCATCGCAATACTCGATTTTTT-3'（核 苷酸序列如SEQIDNO. 2所示）；
[0011]所述適體鏈（Bio-Apt)為：5' -biotin-ITTITTITTACCTGGGGGAGTAITGCG GAGGAAGTT-3'（如SEQIDNO. 1 所示）；
[0012] 所述鏈霉親和素化磁球，為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)產(chǎn)品，密度為1. 343gmL'直徑 為 350nm〇
[0013] 其中，添加的鏈霉親和素磁球呈懸浮液狀態(tài)，濃度為3. 324X10nbeadsml/1，添 加的體積占溶液總體積的1/11，在溶液中，催化鏈的濃度為4. 55yM，適體鏈的濃度為 4. 55uM〇
[0014] 所述基于雙重?cái)U(kuò)增策略構(gòu)建的免標(biāo)記熒光適體傳感器，用于檢測(cè)腺苷的過(guò)程如 下：
[0015] ⑴鏈霉親和素化磁球-探針的制備：因鏈霉親和素化磁球含有大量表面活性劑， 為了防止磁球的聚集，在使用前需將這些表面活性劑洗去，以活化磁球的功能。具體步驟如 下：
[0016] 首先，用TTL緩沖液對(duì)鏈霉親和素化磁球洗滌，得到活化后的鏈霉親和素化磁球。
[0017] 然后，將分裝好的Bio-Apt和cDNA退火，冷卻至室溫；隨后將兩者混合并與活化后 的鏈霉親和素化的磁球混合在室溫下孵育。
[0018] 最后，孵育后的鏈霉親和素化磁球用PBS緩沖液洗滌，以除去多余的cDNA，得到鏈 霉親和素化磁球-探針。本工作中所有的洗滌步驟均是在外加磁場(chǎng)作用下完成的。
[0019] 所述TTL緩沖液的組成為：由Tris-HCl、Tween20、LiCl和水組成，其中，各組分的 濃度為：〇?lmolLlris-HCl，pH8. 0,0? 1% (v/v)Tween-20,1.OmolL-1LiCl〇
[0020] 所述PBS緩沖液的組成為：由NaCl、NaH2P04、Na2HP04，和水組成，其中，各組分的濃 度為：0? 15molLWaCl，7. 6mmolL 2. 4mmolL丨似巧卩。*，pH7. 4〇
[0021] 進(jìn)一步地，用TTL緩沖液對(duì)鏈霉親和素化磁球洗滌的次數(shù)為5次。
[0022] 進(jìn)一步地，退火溫度為95°C，時(shí)間為5min。
[0023] 進(jìn)一步地，孵育時(shí)間為2h。
[0024] 進(jìn)一步地，鏈霉親和素化磁球用PBS緩沖液洗滌的次數(shù)為2次。
[0025] (2)ExoIII輔助的DNA循環(huán)和HCR反應(yīng)：
[0026] 首先，將含有腺苷的待檢測(cè)物與TNaK緩沖液加入到試管中，在室溫下孵育；隨后， 在磁場(chǎng)作用下分離出鏈霉親和素化磁球，并保留反應(yīng)液至新離心管中。
[0027] 然后，分別取探針HP，ExoIII和lOXExoIII緩沖液加入到離心管中?；靹蚝筮M(jìn) 行ExoIII輔助DNA循環(huán)反應(yīng)。水解完成之后，加熱以終止酶的活性。
[0028] 最后，加入發(fā)卡探針H1和H2,混勻進(jìn)行HCR反應(yīng)。
[0029] 所述探針HP為：5'-GCAATACTCGAACACGITACC-3'（核苷酸序列如SEQID NO. 3所示）；
[0030] 所述探針HI為：5'-CTCGAACACGITACCGGGTAGGGCGITAGGAGGTAACGT GITCGAGTAITGC-3'（核苷酸序列如SEQIDNO. 11 所示）。
[0031] 所述探針H2 為：5'-TGGGTTCCTAACGCCCTACCCGGTAACGTGTTCGAGGCA ATACTCGAACACGITACCGGGTAGGGCGGG-3'（核苷酸序列如SEQIDNO. 12 所示）。
[0032] 所述TNaK緩沖液的組成為：Tris、NaCl、KC1和水組成，其中各組分的濃度為： 20mmolI^TrisJOOmmolI^NaCljmmolL-1KCl，pH7.5。添加量為 15yL。
[0033] 所述lOXExoIII緩沖液的組成為：Tris_HCl、MgCl2、DTT和水組成，其中，各組分 的濃度為：〇? 5molL^ris-HCl, 50mmolLMgCl^，lOmmolLiTT。
[0034] 所述探針HP的濃度為5yM，用量為5yL。
[0035] 所述ExoIII的用量為 0? 20 ~0? 40UmL'
[0036] 所述發(fā)卡探針HI的濃度為0. 8X1(T6~1. 2X1(T6M，優(yōu)選濃度1.OX1(T6M，用量為 5uL〇
[0037] 所述發(fā)卡探針H2的濃度為1. 2X1(T6~1. 8X1(T6M，優(yōu)選濃度1. 5X1(T6M，用量為 5uL〇
[0038] 進(jìn)一步地，所述含有腺苷的待檢測(cè)物為人的尿液，添加量為5yL。
[0039] 進(jìn)一步地，孵育時(shí)間為2h。
[0040] 進(jìn)一步地，混勻后放至37°C進(jìn)行ExoIII輔助DNA循環(huán)反應(yīng)。
[0041] 進(jìn)一步地，探針HP、H1和H2在使用之前進(jìn)行退火，目的是確保發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。 退火的步驟是：探針HP、Hl、H2在95°C下退火5min，并冷卻至室溫。
[0042] 進(jìn)一步地，水解完成之后，加熱以終止酶的活性的加熱時(shí)間為20min，溫度為 75。。。
[0043] 進(jìn)一步地，HCR反應(yīng)的溫度是37°C。
[0044] (3)熒光測(cè)量：
[0045]HCR反應(yīng)完成后，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入NMM和KC1，孵育后進(jìn)行熒光測(cè)量，得熒光值。
[0046] 所述NMM的濃度為1. 5X10_6~2. 5X10 _6M，優(yōu)選濃度為2. 0X10_6M，用量為2yL。
[0047] 所述KC1的濃度為1M，用量為8yL。
[0048] 進(jìn)一步地，孵育的溫度是37°C，時(shí)間是20~40min。
[0049] 進(jìn)一步地，所述熒光測(cè)量中熒光光度計(jì)的基本設(shè)置是：室溫條件下，激發(fā)波長(zhǎng)為 399nm，掃描范圍為550~680nm，狹縫寬度均為10nm，PMT電壓700V。
[0050] (4)計(jì)算：根據(jù)上述所測(cè)得的熒光值，利用下述線性方程計(jì)算含有腺苷的待檢測(cè) 物中腺苷的濃度。
[0051] 進(jìn)一步地，利用下述線性方程計(jì)算得到腺苷的濃度：
[0052] A F= 15. 12+143. 58X105C,r= 0. 998 ；
[0053] 其中，AF表不焚光凈信號(hào)值，C表不腺苷的濃度，單位為mol LS該線性方程的線 性范圍是1.OXl(T6mol L-1~1.OXl(T4mol L-1之間。
[0054] 本發(fā)明基于雙重?cái)U(kuò)增策略構(gòu)建的免標(biāo)記熒光適體傳感器的設(shè)