專利名稱：：菜豆莢斑駁病毒的一步法實時熒光反轉(zhuǎn)錄pcr檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用一歩法實時熒光反轉(zhuǎn)錄PCR(Real-timefluorescencereversetranscriptasePCR，簡稱實時熒光RT-PCR)技術(shù)檢測寄生于大豆上的菜豆莢斑駁病毒(5m"，dwort/ev/&簡稱BPMV)的方法，屬于豆科作物病毒檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：大豆原產(chǎn)中國，是我國重要的經(jīng)濟作物，菜豆莢斑駁病毒是危害大豆等豆科植物的重要種傳病毒，也是我國規(guī)定禁止進境的檢疫性有害生物，影響種子品質(zhì)，降低商業(yè)價值，引起產(chǎn)量損失，還能導致種質(zhì)調(diào)運上的危險性，造成病毒的泛濫擴散，同時該病毒還可能對保存種子的生活力、遺傳完整性產(chǎn)生不利影響。目前我國無此病毒的分布。菜豆莢斑駁病毒屬豇豆花葉病毒科(Comoviridae)，豇豆花葉病毒屬(Comov/n^)成員，危害植物的階段是在無性生長期、花期、結(jié)莢期以及收獲后，危害植物的部位主要是葉片和種子，受侵染大豆種子種皮可能會出現(xiàn)斑駁癥狀。BPMV單獨危害大豆所造成的產(chǎn)量損失為3。/。52.4。/。[RossJP.Responseofearly-plantedandlate-plantedsoybeanstonaturalinfectionby5eaw/odv7>z^.P/a",Ztoea化，1986,70(3):222-224.]。BPMV和大豆花葉病毒(SMV)復合侵染，產(chǎn)量損失可達66%，且禾中子的斑駁率上升[RossJP.Responseofearly-plantedandlate-plantedsoybeanstonaturalinfectionbySeawpodwC/ew'n^.P/a",D^eaw,1986,70(3):222-224.]。BPMV侵染的大豆植株，也易受到擬莖點霉屬(尸tomo;z&)真菌的危害，擬莖點霉屬真菌侵染大豆后，大豆禾中子品質(zhì)會進一歩降低[AbneyTSandPloperLD.Effectsofpod附ort/evz'rasonsoybeanseedmaturationandseedborne尸/2omo/w^spp.尸/flWZfe,1994,78:33-37.]。BPMV可以通過禾中子攜帶并遠距離傳播，田間擴散可由甲蟲來實現(xiàn)，豆科野生雜草又是BPMV很好的轉(zhuǎn)主寄主，一旦在國內(nèi)定殖下來，將很難根除，檢疫風險很高。針對BPMV的檢測，常采用鑒別寄主進行檢測鑒定，但是實際應(yīng)用上因病毒在寄主上的癥狀受病毒的株系、寄主的品種和接種時的環(huán)境條件(特別是溫度和光照)的影響很大而難于作出準確鑒別[季良.種傳病毒的檢疫.植物檢疫，1993,7(4):288-303.]。近年來，國內(nèi)外較多應(yīng)用分子生物學技術(shù)檢測BPMV。國外主要利用血清學和分子生物學技術(shù)在大豆生長期采取葉片進行檢測，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)和免疫特異電鏡技術(shù)(ISEM)方法適用于對大豆葉片、種子(尤其是種皮)、草本寄主植物和菜豆螢葉甲中病毒的檢測[KartaatmadjaS,SehgalORQuantificationof6e朋pod,"/eviriwinplanttissuebydotimmunobindingassay.f/9/to;a決ofogy，1987,77(12):1765.]。RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-PCR)技術(shù)具有快速、靈敏、特異性強的優(yōu)點。GuH等建立了高靈敏度的RT-PCR方法檢測各種BPMV分離物(GuH,ClarkAJ,deSaPB,Wa/.Diversityamongisolatesof6eawv/z-ws.尸/i[ytop"^70/ogy,2002,92:446-452.);魏梅生等和李彬等建立了直接檢測帶病大豆植株葉片上菜豆莢斑駁病毒的RT-PCR方法[魏梅生，相寧，張春泉，SaidAG.菜豆莢斑駁病毒的RT-PCR檢測.大豆科學,2005,24(4):317-319;李彬，吳新華，粟寒等.進境美國大豆幼苗中菜豆莢斑駁病毒的檢測與鑒定.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2007，30(2):139-141.]。巢式RT-PCR或半巢式RT-PCR是建立在普通RT-PCR方法上的具有更高靈敏度的分子檢測方法，聞偉剛等建立了直接檢測大豆干種子中菜豆莢斑駁病毒的半巢式RT-PCR方法[聞偉剛，崔俊霞，趙秀玲等.半巢式RT-PCR檢測進口大豆中菜豆莢斑駁病毒的研究.植物病理學報,2006,36(4):296-300.]。于翠等建立了直接檢測大豆干種子中菜豆莢斑駁病毒的免疫捕獲巢式RT-PCR方法[于翠，楊翠云，宋紹祎等.進口大豆上菜豆莢斑駁病毒的免疫捕獲巢式RT-PCR檢測.植物檢疫,2006,20(4):201-204.]。最近，我國出入境口岸從進口的美國大豆中多次檢出菜豆莢斑駁病毒，2005年以來天津出入境檢驗檢疫局十幾次通過ELISA方法檢出該病毒，它已對我國的大豆生產(chǎn)構(gòu)成了現(xiàn)實威脅，若此病毒隨進口大豆傳入國內(nèi)并定殖下來，將會對國內(nèi)的大豆生產(chǎn)造成不可估量的損失。
發(fā)明內(nèi)容針對上述情況，為進一歩適應(yīng)口岸檢疫簡便快速靈敏的要求，本發(fā)明建立了BPMV的一步法實時熒光RT-PCR檢測方法，能將BPMV與大豆上其它9種病毒區(qū)別開來，該方法能夠直接檢測病毒RNA，整個過程在3-4小時內(nèi)完成，可有效在口岸檢測中推廣應(yīng)用。實時熒光PCR是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù)，與常規(guī)PCR技術(shù)相比，具有靈敏度高、特異性強和更簡便的特點，整個擴增和檢測過程都是閉管操作，避免了污染，而且可以有效避免非特異性擴增和假陽性現(xiàn)象，在醫(yī)學上得到了廣泛應(yīng)用，近幾年又被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性和定量檢測、動植物與食品病蟲害的定性檢測。本發(fā)明收集了以大豆為寄主的10種病毒陽性質(zhì)控(購自Agdia公司)，以及本實驗室近年來從美國大豆上截獲的4個BPMV分離物，見表l。具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的目的是提供一種菜豆莢斑駁病毒RNA的一步法實時熒光RT-PCR檢測方法，自行設(shè)計的引物和用途如下針對GenBank中BPMVc;基因序列，設(shè)計檢測BPMV的探針及引物，序列如下探針97PFAM-TTGTGTCACTGGATGGACTGCCACC-TAMRA引物66F:TGAAGCGTACTGGATTTCATTGTG145R:TGTAACCTGAACATCCTGCATTG本方法的具體歩驟如下(1)大豆上菜豆莢斑駁病毒的RNA提??；(2)大豆上菜豆莢斑駁病毒的一歩法實時熒光RT-PCR檢測方法的建立；(3)—歩法實時熒光RT-PCR檢測方法的靈敏度測試。本發(fā)明的另一個目的是使自行設(shè)計的1套探針及引物在檢測大豆種子上菜豆莢斑駁病毒以及其它以大豆為寄主的植物病毒方面得到應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立了大豆上BPMV的快速簡便、特異性強、靈敏度高、準確可靠的一步法實時熒光RT-PCR檢測方法，能將BPMV與大豆上其它9種病毒區(qū)別開來，該方法能夠直接檢測BPMV的RNA，檢測快速，方法可靠，整個過程在3-4小時內(nèi)完成，可有效在口岸檢測中推廣應(yīng)用。下面結(jié)合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一歩詳細描述。圖1:BPMV的實時熒光RT-PCR—歩法檢測；圖2:實時熒光RT-PCR—步法靈敏度測試。具體實施例方式實施例l:大豆上菜豆莢斑駁病毒的RNA提取實驗所涉及的毒株包括購自美國Agdia公司的以大豆為寄主的IO種病毒陽性質(zhì)控，以及本實驗室近年來從美國大豆上截獲的4個BPMV分離物，相關(guān)信息見表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在大豆種子中肉眼挑選種臍周圍帶色斑的種子，用鑷子小心撕取帶色斑的種皮，置于經(jīng)DEPC水處理的干燥1.5mL離心管中，小心將陽性質(zhì)控粉末置于經(jīng)DEPC水處理的干燥1.5mL離心管中，離心管中加液氮充分研磨后按照BioerTechnology有限責任公司的SimplyPTotalRNAExtractionKit(編號是BSC52S2)進行病毒RNA的提取。實施例2:BPMV的一歩法實時熒光RT-PCR檢測方法的建立探針和引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。熒光PCR試劑是TaKaRa公司的￡xr"《TMR-PCRversion2.1試劑盒，實時熒光PCR儀是ABI7000型，熒光PCR管和管蓋購自ABI公司。反轉(zhuǎn)錄試劑是杭州博日科技有限公司的BioRTOneStepRT-PCR試劑盒。(1)反應(yīng)混合液的配制反應(yīng)體系為25pL，包含10xRT-PCRBuffer2.5pL(其中含有終濃度為3mmol/L的MgCl2)，10x￡jc7bgBuffer2.5pL(其中含有終濃度為1.5mmol/L的MgCl2)，濃度各為2.5mmol/L的四種dNTP共lpL，濃度為lOpmol/L的引物各為lpL，濃度為20pmol/L的探針lpL，ljxL脂A酶抑制劑(40U/pL)，lpL模板RNA，0.5pLAMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/pL)，0.5pL￡xr叫DNA聚合酶(5U/pL)，加RNAasefreeH20至25pL。以陽性質(zhì)粒作為陽性對照，以添加RNAasefreeH20為模板作為陰性對照。(2)—步法實時熒光RT-PCR反應(yīng)程序為45°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘；95°C預(yù)變性IO分鐘；95°C變性15秒；60°C退火延伸l分鐘，循環(huán)45次；延伸、退火階段采集數(shù)據(jù)。(3)檢測結(jié)果對2個大豆種皮上的BPMV毒株和10個病毒陽性質(zhì)控的RNA進行一步法實時熒光RT-PCR擴增，以^基因的陽性質(zhì)粒作為陽性對照，以添加RNAasefreeH20為模板作為陰性對照。在ABI公司的分析軟件SDSversion2.0的Analyze界面下選擇FAM熒光標記，陽性質(zhì)粒、BPMV的陽性質(zhì)控(TJ5)、TJ1、TJ2的ARn曲線出現(xiàn)陽性增長，TJ6-14及陰性對照的ARn曲線沒有出現(xiàn)增長，為一條平的直線，表明該探針對BPMV是特異的，能很好檢測大豆上的BPMV(見圖1)。圖1中縱坐標代表ARn，橫坐標代表循環(huán)數(shù)(Cycles)。曲線部分按右側(cè)端從上至下分別為陽性質(zhì)粒、TJ1、TJ2和BPMV的陽性質(zhì)控，與橫軸平行的曲線為TJ6-14及陰性對照。實施例3:—歩法實時熒光RT-PCR檢測方法的靈敏度測試將BPMVcp基因的克隆質(zhì)粒溶液測定濃度并定為200ng&L，然后按10倍等比稀釋，進行一歩法實時熒光RT-PCR檢測方法的靈敏度測試。(1)反應(yīng)混合液的配制反應(yīng)體系為25pL，包含10x￡xBuffer2.5pL(其中含有終濃度為1.5mmol/L的MgCl2)，濃度各為2.5mmol/L的四種dNTP共lpL，濃度為lOpmol/L的引物各為lpL，濃度為20mmol/L的探針lpL，lpL質(zhì)粒溶液，0.5pL￡xT叫DNA聚合酶(5U4iL)，加無菌水至(2)實時熒光PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性10分鐘；95°C變性15秒；60°C退火延伸1分鐘，循環(huán)45次；延伸、退火階段采集數(shù)據(jù)。(3)檢測結(jié)果實時熒光PCR檢測方法的檢測下限為10—7，即20fg&L，見圖2。圖2中縱坐標代表ARn，橫坐標代表循環(huán)數(shù)(Cycles)。曲線部分按右側(cè)端從上至下分別為10"、l(T2、10-3、IO"4、10-6、l(T7、10-5，10-8、l(T9、10-10、10-11。與橫軸平行的曲線為陰性對照。序列列表SEQUENCELISTING<110>天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心<120>菜豆莢斑駁病毒的一歩法實時熒光反轉(zhuǎn)錄PCR檢測<130>200S0808<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>1tgtaacctgaacatcctgcattg23<210>2<211〉23<212>DNA<213〉人工合成<400>2tgtaacctgaacatcctgcattg23<210>3<211〉23<212>DNA<213>人工合成<400>3tgtaacctgaacatcctgcattg2權(quán)利要求1.一種用一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，簡稱BPMV)RNA的方法，其特征在于，針對GenBank中BPMVcp基因序列設(shè)計Taqman探針及引物，序列如下探針97PFAM-TTGTGTCACTGGATGGACTGCCACC-TAMRA引物66FTGAAGCGTACTGGATTTCATTGTG145RTGTAACCTGAACATCCTGCATTG。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運用一歩法實時熒光RT-PCR對大豆上菜豆莢斑駁病毒進行檢測的方法，其特征在于，該方法包括以下歩驟(1)大豆上菜豆莢斑駁病毒的RNA提取；(2)大豆上菜豆莢斑駁病毒的一歩法實時熒光RT-PCR檢測方法的建立；(3)—歩法實時熒光RT-PCR檢測方法的靈敏度測試。3.權(quán)利要求1所述的一步法實時熒光RT-PCR檢測方法以及一條Taqman探針和一對引物在檢測大豆種子上菜豆莢斑駁病毒以及其它以大豆為寄主的植物病毒方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及使用一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，簡稱BPMV)的檢測方法，屬于豆科作物病毒檢測領(lǐng)域。本發(fā)明針對GenBank中BPMVcp基因序列設(shè)計并合成1套Taqman探針及其引物，建立了用一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測菜豆莢斑駁病毒的方法，該方法具有簡便快捷、特異性強和靈敏度高的特點，檢測下限是20fg/μL，檢測時間為3-4小時。文檔編號C12Q1/68GK101392300SQ20081015250公開日2009年3月25日申請日期2008年10月28日優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日發(fā)明者鵬劉,芳廖,張裕君,郭京澤,黃國明,黃慶林申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心