專利名稱：鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒感染抑制劑的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒感染和復(fù)制抑制劑的組合物和方法。
背景技術(shù)：
靈長類慢病毒包括1型和2型人類免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)和猿免疫缺陷 病毒(SIV) (Barre-Sinoussi, F.，et al. (1983) Science 220 :868_871 ；Clavel, F. (1987) AIDS 1 135-140 ；Daniel, M. D. , et al. (1985)Science 228 1201-1204 ；Desrosiers, R. C. (1990) Ann. Rev. Immunol. 8 557~578 ；Gallo, R. C, et al. (1984) Science 224 500-503)。HIV-1和HIV-2感染人類，HIV-1類病毒感染黑猩猩，SIV變種感染非洲猴。由于 ⑶4-陽性T淋巴細(xì)胞的缺失，受HIV-1和HIV-2感染的人類以及受某些SIV株感染的亞洲 獼猴經(jīng)常發(fā)展成威脅生命的免疫缺陷(Fauci, A.，et al. (1984) Ann. Int. Med. 100 :91_106 ； Letvin, N. L.，et al. (1985)Science 230 :71_739，19)。人類中，HIV感染造成獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，它是一種不可治愈的疾病， 其中機體免疫系統(tǒng)遭到破壞，使感染者易于罹患機會性感染，例如，肺炎和如卡波濟肉瘤的 某些癌癥。AIDS是全球主要的健康問題。聯(lián)合國HIV/AIDS聯(lián)合項目(UNAIDS)估計目前全 球超過3400萬人感染HIV或患有AIDS ；其中約2810萬感染者居住在貧窮的撒哈拉沙漠以 南的非洲。在美國，每500個人中就約有1人感染HIV或患有AIDS。自開始流行以來，全球 已有1900萬人死于AIDS，包括約425000個美國人。AIDS已取代瘧疾和肺結(jié)核成為全球成 人中最致命的傳染性疾病，是全球第四大致死原因。仍需要鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒感染的抑制劑。 為此，仍然需要開發(fā)鑒別這樣的抑制劑的方法。

發(fā)明內(nèi)容
公開了鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的方法，在這些方法中所使用的分離的tRNA片段，以 及包含這些片段的試劑盒。還公開了使用反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑以及包含該抑制劑和藥物 可用載體的藥物組合物來治療和/或預(yù)防反轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。還公開了使用一種或多 種該類抑制劑和第二抗反轉(zhuǎn)錄病毒化合物的組合治療?？梢酝ㄟ^抑制反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄、翻譯中所使用的反轉(zhuǎn)錄病毒引物(人 tRNALys3)的病毒募集(viral recruitment)，通過抑制新病毒體的最終包裝與裝配和通過 抑制宿主細(xì)胞tRNA與靶核酸分子結(jié)合來抑制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖。篩選反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑的方法可以包括形成混合物，其包含tRNA反密碼子 莖環(huán)片段的線性序列、能夠與該tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的核酸分子以及測試化合物。在不存在該測試化合物而使得tRNA反密碼子莖環(huán)片段與核酸分子結(jié)合的情況下孵育該混 合物。然后，可以確定測試化合物是否抑制反轉(zhuǎn)錄病毒的增殖。對tRNA ASL片段與靶核酸 分子結(jié)合的抑制表明該測試化合物是反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的抑制劑。在一個方面，本發(fā)明涉及鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄抑制劑的方法。該方法包括形 成混合物，其包含不能形成莖環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、能夠與tRNA反密碼 子莖環(huán)片段結(jié)合的核酸分子、以及測試化合物。在不存在該測試化合物而使得tRNA反密碼 子莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合的情況下孵育該混合物。然后，可以確定該測試化合物是否 抑制tRNA反密碼子莖環(huán)片段與核酸分子結(jié)合。tRNA ASL片段與靶核酸分子的結(jié)合表明該 測試化合物是反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄的抑制劑。在另一個方面，本發(fā)明涉及鑒別宿主細(xì)胞tRNA與靶核酸分子結(jié)合的抑制劑的方 法。該方法包括形成混合物，其包含不能形成莖環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、 能夠與tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核酸分子、以及測試化合物。在不存在該測試化合 物而使得tRNA反密碼子莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合的情況下孵育該混合物。然后，可以檢 測該測試化合物是否抑制tRNA片段與靶核酸分子結(jié)合。tRNA ASL片段與靶核酸分子的結(jié) 合表明該測試化合物是通過抑制RT復(fù)合物形成的反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄的抑制劑。在另一個方面，本發(fā)明涉及鑒別在病毒RNA翻譯為前體蛋白質(zhì)期間tRNAlys3的HIV 募集抑制劑的方法。該方法包括形成混合物，其包含不能形成莖環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片 段的線性序列、能夠與tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核酸分子、和測試化合物，其中該 靶核酸分子對應(yīng)于參與HIV病毒RNA向前體蛋白質(zhì)翻譯的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分。在 不存在該測試化合物而使得tRNA反密碼子莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合的情況下孵育該混 合物。然后，可以檢測該測試化合物是否抑制tRNA反密碼子莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合。 tRNA ASL片段未與靶核酸分子結(jié)合表明該測試化合物是反轉(zhuǎn)錄病毒翻譯的抑制劑。在另一方面，本發(fā)明涉及鑒別HIV新病毒體最終包裝和裝配抑制劑的方法，其中 這樣的實施例或?qū)嵤┓绞綄罱K病毒包裝所必須的tRNAlys3。該方法包括形成混合物， 其包含不能形成莖環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、能夠與tRNA反密碼子莖環(huán)片 段結(jié)合的靶核酸分子、和測試化合物，其中該靶核酸分子對應(yīng)于參與最終包裝和裝配的反 轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分。在不存在該測試化合物而使得tRNA反密碼子莖環(huán)片段與靶核 酸分子結(jié)合的情況下孵育該混合物。然后，可以檢測該測試化合物是否抑制tRNA反密碼子 莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合。tRNA ASL片段未與靶核酸分子結(jié)合表明該測試化合物是通過 降低病毒出芽(viral budding)從而抑制二次病毒傳播的反轉(zhuǎn)錄病毒新病毒體最終包裝與 裝配的抑制劑。還公開了篩選上述各種過程的抑制劑的試劑盒。該試劑盒包含基本上由tRNA反 密碼子莖環(huán)片段的線性序列組成的核酸分子；和可檢測標(biāo)記。作為上述各種過程抑制劑的化合物可以在治療和/或預(yù)防病毒感染(包括反轉(zhuǎn)錄 病毒感染)的方法中使用。該類方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些方法中可用的藥物組合物 也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該類藥物組合物包含如本文所述的一種或多種抑制劑和藥物可用載 體。還公開了使用通過不同機制起作用的其他抗病毒化合物的組合治療。


圖1提供了合成RNA寡聚物前修飾的核苷酸保護的示意圖。部分A示出了用三氟乙酸 進行保護。部分B示出了用苯甲酰基進行保護。部分C示出了用核糖羥基基團進行常規(guī)保護。圖2A提供了標(biāo)記的tRNA片段和對應(yīng)的靶序列的圖示。圖2B提供了幾種代表性 修飾的核苷的結(jié)構(gòu)。圖3提供了固定化測定的實施例與使用AlphaScreen 的測定之間的比較。圖4A和4B提供了使用HIV測定的實施例對于一種化合物所獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)表。圖5提供了使用HIV測定的實施例對于第二化合物所獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)表。圖6提供了使用HIV測定的實施例對于對照化合物所獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)表。
具體實施例方式本發(fā)明涉及用于鑒別可用于抑制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的化合物的組合物和方法，以及 通過抑制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖用于治療病毒感染的藥物組合物和方法。可以通過抑制反轉(zhuǎn)錄、 病毒復(fù)制、病毒RNA向蛋白質(zhì)的翻譯，人tRNAlys3的募集、新病毒體的包裝和裝配和/或抑制 宿主細(xì)胞tRNA與靶核酸分子的結(jié)合來抑制病毒增殖。然而，在進一步詳細(xì)說明本發(fā)明之前，將首先定義以下術(shù)語。定義如本文所用的，“抑制劑”是指能夠預(yù)防、減少或限制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的任何化合 物。抑制劑可以抑制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖，例如通過預(yù)防、減少或限制反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄。 在一些實施方式中，與不存在抑制劑時的增殖相比，該抑制至少為反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的20% (例如，至少 50%,70%,80%,90%,95%,98%,99%,99. 5% )。一方面，抑制劑預(yù)防、減少 或限制tRNA或其片段與靶核酸分子結(jié)合。抑制劑還可以影響人tRNA1”3的募集、病毒RNA 向蛋白質(zhì)的翻譯和/或病毒體的最終包裝和裝配。本文中說明了分析抑制的測定，該測定 是本領(lǐng)域中已知的。"RNA依賴性DNA聚合酶”或“反轉(zhuǎn)錄酶”是可以從RNA模板合成互補DNA拷貝 (“cDNA”)的酶。所有已知的反轉(zhuǎn)錄酶還具有從DNA模板(靶核酸)產(chǎn)生互補DNA拷貝的 能力；因此，它們都是RNA-和DNA依賴性DNA聚合酶。如本文所用的，“標(biāo)記”或“可檢測標(biāo)記”為可檢測的任何組合物，例如，通過分光光 度法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、免疫化學(xué)法或化學(xué)方法直接地或間接地檢測?？捎玫臉?biāo)記包 括，但不限于，放射性同位素(例如，32p、35S和3H)、染料、熒光染料(例如，Cy5和Cy3)、 熒光團(例如，螢光素)、電子致密試劑(或高電子密度試劑，electron dense reagent), 酶和它們的底物(例如，酶聯(lián)免疫測定中常用的，如堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶)、生物 素-抗生蛋白鏈菌素、地高辛或半抗原；和可用于抗血清或單克隆抗體的蛋白質(zhì)。而且，標(biāo) 記或可檢測部分可以包含“親合標(biāo)記物(或親合標(biāo)簽，affinitytag)”，當(dāng)與靶核酸偶聯(lián)并 且與測試化合物或化合物文庫孵育時，使得靶核酸與結(jié)合在該靶核酸上的分子一起被親合 捕獲。根據(jù)定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解結(jié)合在該靶核酸上的親合標(biāo)記物具有結(jié)合于固體 載體上并使其能夠捕獲的互補配體(complimentaryligand)。例如，可用的親合標(biāo)記物和互 補伴侶(complimentarypartners)包括，但不限于，生物素-抗生蛋白鏈菌素、互補核酸片 段(例如，寡聚dT-寡聚dA、寡聚T-寡聚A、寡聚dG-寡聚dC、寡聚G-寡聚C)、適體或半抗原，和可用于抗血清或單克隆抗體的蛋白質(zhì)。標(biāo)記或可檢測部分通常通過連接基團(或連 接子，linker)或化學(xué)結(jié)合共價地與待檢測分子結(jié)合，或通過離子、范德華力或氫鍵與待檢 測分子結(jié)合。I.翻碰躺截___誠可以使用本文所述的方法鑒別病毒增殖(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒增殖)的抑制劑?？?以通過下列方式抑制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖，例如，a)抑制反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄，b)抑制宿主細(xì)胞tRNA與靶核酸分子結(jié)合，c)抑制反轉(zhuǎn)錄病毒引物(人tRNA&3)的病毒募集，d)抑制HIV病毒RNA向前體蛋白質(zhì)的翻譯，和/或e)抑制HIV的最終包裝和裝配。以下討論了這些用于鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑的各種方法。翻G ■艤白版■細(xì)_一方面，該方法可用于鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄的抑制劑。另一方面，該方法可用 于鑒別tRNA與靶核酸分子結(jié)合的抑制劑。另一方面，該方法可以容易地適用于高通量測 定。轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)通過識別反轉(zhuǎn)錄病毒基因組上啟動反轉(zhuǎn)錄的相應(yīng)位點參與反轉(zhuǎn)錄。鑒 別反轉(zhuǎn)錄的抑制劑可能會造成用于治療宿主細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄病毒感染的治療性化合物的鑒別。該方法包括形成混合物，其具有tRNA反密碼子莖-環(huán)(ASL)片段、能夠與該tRNA 片段結(jié)合的靶核酸分子、和測試化合物。一方面，靶核酸分子對應(yīng)于參與反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄病 毒基因組的片段。所得的混合物在不存在該測試化合物而使得tRNA片段與靶核酸分子結(jié) 合的情況下進行孵育。該方法還包括檢測該測試化合物是否抑制tRNA片段與靶核酸結(jié)合， 其中tRNA ASL片段未與靶核酸分子結(jié)合表明該測試化合物為反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄的抑制 劑。一方面，檢測包括使用標(biāo)記檢測對tRNA片段與靶核酸分子結(jié)合的抑制。鑒另i丨宿t細(xì)朐,tRNAmmm^^mmmm^i另一方面，該方法還可以用于鑒別tRNA與靶核酸分子結(jié)合的抑制劑。該方法包括 形成混合物，其包含宿主細(xì)胞tRNAASL片段、能與該tRNA片段結(jié)合的靶核酸分子和測試化 合物。所得的混合物在不存在該測試化合物而使得tRNA片段與靶核酸結(jié)合的情況下進行 孵育。該方法還包括檢測該測試化合物是否抑制tRNA片段與靶核酸結(jié)合，其中tRNA ASL 片段與靶核酸分子的結(jié)合表明該測試化合物是tRNA與靶核酸分子結(jié)合的抑制劑。一方面， 檢測包括使用標(biāo)記檢測對tRNA片段與靶核酸分子結(jié)合的抑制。
_0] 鑒別HIV反轉(zhuǎn)錄(RT)復(fù)合物形成抑制劑的方法另一方面，該方法可用于鑒別HIV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)復(fù)合物形成的抑制劑。該方法包 括形成混合物，其包含tRNA ASL片段、能夠與tRNA片段結(jié)合的靶核酸分子和測試化合物。 所得的混合物在不存在該測試化合物而使得tRNA片段與靶核酸結(jié)合的情況下進行孵育。 該方法還包括檢測該測試化合物是否抑制tRNA片段與靶核酸結(jié)合。一方面，檢測包括使用 標(biāo)記檢測對tRNA片段與靶核酸分子結(jié)合的抑制，其中該抑制表明該測試化合物能夠抑制 RT復(fù)合物的形成。另一方面，該方法可以包括對測試化合物與tRNA片段或與靶核酸，或與tRNA片段 和靶核酸兩者結(jié)合的檢測。一方面，測試化合物的結(jié)合表明該測試化合物是反轉(zhuǎn)錄病毒增
7殖、反轉(zhuǎn)錄病毒感染、反轉(zhuǎn)錄或tRNA結(jié)合的抑制劑。鑒別人tRNA—病毒墓集抑制劑的方法在另一個方面，該方法可用于鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒引物(人tRNA1”3)的HIV募集的抑 制劑。該方法包括形成混合物，其包含不能形成莖環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序 列，能與tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核酸分子、和測試化合物，其中該靶核酸分子對 應(yīng)于參與反轉(zhuǎn)錄病毒引物募集的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分。該混合物在不存在該測試化 合物而使得tRNA反密碼子莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合的情況下進行孵育。然后，可以檢測 該測試化合物是否抑制tRNA反密碼子莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合。tRNAASL片段未與靶核 酸分子結(jié)合表明該測試化合物是反轉(zhuǎn)錄病毒引物募集的抑制劑。鑒別病毒RNA翻譯抑制劑的方法另一方面，提供了鑒別病毒RNA向病毒前體蛋白質(zhì)翻譯的抑制劑的方法。該方法 包括形成混合物，其包含不能形成莖環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、能夠與tRNA 反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核酸分子、和測試化合物；在不存在該測試化合物而使得tRNA 反密碼子莖環(huán)片段與靶核酸分子結(jié)合的情況下孵育該混合物；和檢測該測試化合物是否抑 制tRNA片段與靶核酸分子結(jié)合，其中tRNA ASL片段與靶核酸分子的結(jié)合表明該測試化合 物是病毒RNA向病毒前體蛋白質(zhì)翻譯過程中tRNA募集的抑制劑。通過本文所公開的任何方法鑒別出的抑制劑可以通過抑制病毒生命周期的任何 步驟來抑制反轉(zhuǎn)錄病毒感染，所述生命周期的任何步驟包括，但不限于，反轉(zhuǎn)錄、病毒裝配、 RT復(fù)合物形成、反轉(zhuǎn)錄病毒引物(人tRNA>3)的募集、病毒RNA向前體蛋白質(zhì)的翻譯和最 終包裝與裝配。此外，所鑒別的抑制劑可以抑制反轉(zhuǎn)錄病毒感染、延緩感染或減慢感染進 程。因此，使用抑制劑進行治療的方法也旨在本發(fā)明的范圍內(nèi)。II.增殖可被抑制的反轉(zhuǎn)錄病毒可以通過本文所公開的方法鑒別出抑制劑的反轉(zhuǎn)錄病毒包括以RNA作為其主要 遺傳物質(zhì)的任何病毒并使用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA。該類病毒包括，但不限于，貓免疫缺陷病毒 (FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、禽白血病病毒、貓白血病病毒、大眼梭鱸皮膚肉瘤病毒、人類 嗜T淋巴細(xì)胞病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)。在優(yōu)選的方面，該反轉(zhuǎn)錄病毒為HIV。HIV 可以是HIV家族中的任意株、類型、亞型或變種。HIV病毒包括，但不限于，HIV-I、HIV-II、 HIV-III (也稱為 HTLV-II、LAV-I、LAV-2)、其突變形式等。HIV的抑制劑對乙型肝炎病毒(HBV)也具有活性，并且可以在治療和/或預(yù)防HBV 感染的方法中使用，并且設(shè)計了用于該用途的藥物組合物。III.可用于本文所述方法的tRNA片段在本文所述的篩選方法中使用的tRNA片段(或“工具tRNA片段(tool tRNA fragments)")可以是來自任何tRNA的片段。以下化學(xué)式所說明的具體tRNA片段是本發(fā) 明的另一方面，并且這些片段可以包含在本文所述的試劑盒中。在本發(fā)明所述方法中使用的tRNA片段(或“工具tRNA片段”)可以是來自任何 tRNA的片段。該tRNA片段可以獲得自，或來源于，或?qū)?yīng)于tRNAMa、tRNAAl:g、tRNAAsn、tRNAAsp、 tRNACys、tRNAGln、tRNAGlu、tRNAGly、tRNAHis、tRNAIle、tRNALeu、tRNALys、tRNAMet、tRNAphe、tRNAPro、 tRNASCT、tRNATto、tRNATl\tRNATyl:和 tRNAVa1。一方面，該 tRNA 片段對應(yīng)于 tRNALys。另一方面， 該tRNA片段來源于或?qū)?yīng)于tRNAb反密碼子莖環(huán)(ASL)。另一方面，該tRNA片段對應(yīng)于人tRNALys核苷酸32-43的片段。本文中所用的位置編號表示根據(jù)如Sprinzl，et al. Nucl. Acids. Res.，26，148-153 (1998)中所公開的常規(guī)tRNA編號的核苷酸位置編號。一方面， tRNA片段是來自宿主細(xì)胞(如哺乳動物宿主細(xì)胞，其包括，但不限于，人類、貓和猿宿主細(xì) 胞)tRNA的片段。tRNA片段可以摻入一個或多個修飾的核苷。一方面，該tRNA片段將1個、2個、3 個或更多個修飾的核苷摻入核酸序列。另一方面，tRNA片段將3個修飾的核苷摻入到tRNA 片段核酸分子中?？梢該饺氲絫RNA片段中的修飾的核苷包括任何修飾的核苷酸，其包括， 但不限于，未知的修飾的腺苷(？ A)、I-甲基腺苷(mlA)、2-甲基腺苷(m2A)、N6-異戊烯 基腺苷(i6A)、2_甲硫基-N6-異戊烯基腺苷(ms2i6A)、N6-甲基腺苷(m6A)、N6-蘇氨酰基 氨甲?；佘?t6A)、N6-甲基-N6蘇氨?；奔柞；佘?m6t6A)、2_甲硫基-N6-蘇氨酰 基氨甲?；佘?ms2t6A)、2' -0-甲基腺苷I肌苷(Am)、1-甲基肌苷Ar (p) 2‘ -0-(5-磷 酸基)腺嘌呤核糖苷(mlI)、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷(io6A)、未知修飾的胞苷(？ C)、2-巰基胞苷(s2C)、2' -0-甲基胞苷(Cm)、N4_乙?；?ac4C)、5_甲基胞苷(m5C)、 3-甲基胞苷(m3C)、賴西丁 (k2C)、5-甲酰胞苷(f5C)、2' -0-甲基-5-甲酰胞苷(f5Cm)、 未知修飾的鳥苷(？ G)、2' -0-(5磷酸基)鳥嘌呤核糖苷(Gr(p))、l-甲基鳥苷(mlG)、 N2-甲基鳥苷(m2G)、2' -0-甲基鳥苷(Gm)、N2N2-二甲基鳥苷(m22G)、N2，N2，2‘ -0-三甲基 鳥苷(m22Gm)、7-甲基鳥苷(m7G)、古嘌苷(archaeosine，fa7d7G)、Q苷(Q)、甘露糖基_Q苷 (manQ)、半乳糖基-Q苷(galQ)、3_(3_氨基-3-羧基-丙基)尿苷(wybutosine，yW)、過氧 3_ (3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(peroxywybutosine，02yW)、未知修飾的尿苷(？ U)、5_甲 基氨基甲基尿苷(mnm5U)、2_硫基尿苷(s2U)、2' -0-甲基尿苷(Um)、4_硫基尿苷(s4U)、 5_氨甲?；谆蜍?ncm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5甲基氨基甲基_2_硫 基尿苷(mnm5s2U)、5-甲氧基羰基甲基_2_硫基尿苷(mcm5s2U)、尿苷5-羥乙酸(cmo5U)、 5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-羧基甲基氨基甲基尿苷(Cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫 基尿苷(cmnm5S2U)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、5 (羧基羥基甲基)尿苷甲酯 (mchm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2' -0-甲基尿苷(cmnm5Um)、5_氨甲?；谆?2' -0-甲 基尿苷(ncm5Um)、二氫尿苷(D)、假尿苷(v)、l_甲基假尿苷(ml v)、2' -0-甲基假尿苷 (￥m)、胸腺嘧啶核糖核苷(m5U)、5-甲基_2_硫基尿苷(m5s2U)和5，2' _0_ 二甲基尿苷 (m5Um)。在優(yōu)選的方面，片段tRNA含有對應(yīng)于tRNA反密碼子莖環(huán)中的位置34、37和39的 修飾的核酸。本文中所用的位置編號表示根據(jù)如Sprinzl，et al. Nucl. Acids. Res. ,26, 148-153(1998)中所公開的常規(guī)tRNA編號的核苷酸位置編號。一方面，該tRNA片段包括具 有序列5 ‘ -GCUXUUAYZCUG的分子或由該分子組成，其中X、Y和Z表示修飾或未修飾的核 苷。一方面，X、Y和Z表示修飾的核苷，如mnm5s2U、mcm5s2U、ms2t6A、s2U、￥和t6A。另 一方面，該tRNA片段具有核酸序列5' -CU(mnm5s2U)UU(ms2t6A)A( uOCUGC。另一方面，該 tRNA 片段具有核酸序列 5' -GCU(mnm5s2U)UU(ms2t6A)A( v)CUG。tRNA片段可以對應(yīng)于通過直接或間接與反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)合參與反轉(zhuǎn)錄病毒 增殖的tRNA的任何部分。在優(yōu)選的方面，tRNA片段對應(yīng)于該tRNA的反密碼子莖環(huán)(ASL)。tRNA片段可以對應(yīng)于參與核苷酸結(jié)合(如參與反轉(zhuǎn)錄(RT)復(fù)合物的形成)的宿 主細(xì)胞tRNA的任何部分。例如，tRNA可以參與結(jié)合反轉(zhuǎn)錄病毒基因組以引發(fā)、啟動或輔助反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的反轉(zhuǎn)錄。一方面，片段tRNA對應(yīng)于任何tRNA的反密碼子莖環(huán)的片段。 一方面，片段對應(yīng)于來自tRNA-1”反密碼子莖環(huán)的片段。另一方面，tRNA片段對應(yīng)于來自人 tRNA"1"3反密碼子莖環(huán)的片段。另一方面，tRNA片段對應(yīng)于來自人tRNA s的核苷酸32-43 的片段。tRNA片段也可以為來自tRNA的任何長度的片段。一方面，tRNA片段包含tRNA 9-15連續(xù)核苷酸片段、或tRNA 10-14連續(xù)核苷酸片段、或tRNA 11_13連續(xù)核苷酸片段。另 一方面，該片段為tRNA的8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續(xù)核苷酸片段。另一方面，該 片段為tRNA的12個連續(xù)核苷酸片段。tRNA片段能夠或不能形成二級結(jié)構(gòu)。一方面，tRNA片段不能與自身形成莖環(huán)結(jié) 構(gòu)。另一方面，片段為不能與自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的tRNA線性片段。tRNA片段也可以與其他核酸連接。例如，根據(jù)測定方法，tRNA片段可以與一個或 多個其他核酸連接。一方面，tRNA片段可以與用于將該片段連接到固體載體表面的核苷酸 連接。另一方面，片段tRNA在tRNA片段的一個或兩個末端與其他核酸分子連接。另一方 面，片段tRNA在兩末端均與其他核酸分子連接。其他核酸序列可以為任何長度，優(yōu)選長度 為8至16個核苷酸、10至14個核苷酸，更優(yōu)選為12個核苷酸。一方面，末端序列不允許 tRNA片段形成二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)。靶核酸分子可以對應(yīng)于任何核酸分子，如參與反轉(zhuǎn)錄病毒增殖或反轉(zhuǎn)錄病毒的反 轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA分子。一方面，靶核酸分子對應(yīng)于能夠與tRNA片段結(jié)合并參與反轉(zhuǎn)錄病 毒增殖或反轉(zhuǎn)錄的任何核酸分子。另一方面，靶核酸分子對應(yīng)于參與反轉(zhuǎn)錄病毒基因組反 轉(zhuǎn)錄的核酸分子。另一方面，靶核酸分子對應(yīng)于來自反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的核糖核酸。另一 方面，靶核酸分子對應(yīng)于參與啟動反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄的核酸分子。靶核酸分子可以為任何長度并且可以包含整個反轉(zhuǎn)錄病毒基因組及其片段。一方 面，靶核酸分子包含參與tRNA結(jié)合的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的任何片段，并且包含至少5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸的片段。另一方面，靶核 酸與工具tRNA片段的長度大致相同或相同。另一方面，靶核酸分子對應(yīng)于來自人類免疫缺陷性病毒(HIV)的核酸分子，如 HIV-1或HIV-2。另一方面，靶分子對應(yīng)于HIV-1。另一方面，靶核酸分子對應(yīng)于參與啟動 HIV反轉(zhuǎn)錄的核酸分子。該類靶核酸分子可以來源于或?qū)?yīng)于通過與宿主細(xì)胞tRNA結(jié)合或聯(lián)合而參與 反轉(zhuǎn)錄的HIV基因組的任何部分。一方面，靶核酸分子來源于或?qū)?yīng)于HIV基因組的 5'未翻譯區(qū)域。另一方面，靶核酸分子對應(yīng)于包含HIV-1的5'未翻譯區(qū)域中157至 169殘基的片段。靶核酸序列可以與tRNA片段互補。一方面，靶核酸分子包含核酸序列 5' -GCGGUGUAAAAGo具體分離的tRNA片段一方面，分離的tRNA片段包含序列5 ‘ -GCUXUUAYZCUG，其中X、Y和Z表示修飾的 核苷。代表性的修飾的核苷包括未知的修飾的腺苷(？ A)、I-甲基腺苷(mlA)、2_甲基 腺苷(m2A)、N6-異戊烯基腺苷(i6A)、2_甲硫基-N6-異戊烯基腺苷(ms2i6A)、N6-甲基腺 苷(m6A)、N6-蘇氨?；奔柞；佘?t6A)、N6-甲基-N6蘇氨?；奔柞；佘?m6t6A)、
102-甲硫基-N6-蘇氨?；奔柞；佘?ms2t6A)、2' -0-甲基腺苷I肌苷(Am)、l_甲基 肌苷Ar(p)2' -0-(5-磷酸基)腺嘌呤核糖苷(mlI)、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷 (io6A)、未知修飾的胞苷(？ C)、2_巰基胞苷(s2C)、2' -0-甲基胞苷(Cm)、N4-乙酰基 胞苷(ac4C)、5-甲基胞苷(m5C)、3-甲基胞苷(m3C)、賴西丁(k2C)、5_甲酰胞苷(f5C)、 2' -0-甲基-5-甲酰胞苷(f5Cm)、未知修飾的鳥苷(？ G)、2' _0_(5磷酸基)鳥嘌呤核 糖苷(Gr (p))、1_甲基鳥苷(mlG)、N2-甲基鳥苷(m2G)、2' ~0~甲基鳥苷(Gm)、N2N2- 二甲 基鳥苷(m22G)、N2，N2，2' _0_三甲基鳥苷(m22Gm)、7_甲基鳥苷(m7G)、古嘌苷(fa7d7G)、 Q苷(Q)、甘露糖基-Q苷(manQ)、半乳糖基-Q苷(galQ)、3_(3_氨基-3-羧基-丙基)尿 苷(yW)、過氧3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(02yW)、未知修飾的尿苷(？ U)、5_甲基 氨基甲基尿苷(mnm5U)、2-硫基尿苷(s2U)、2' -0-甲基尿苷(Um)、4_硫基尿苷(s4U)、 5_氨甲酰基甲基尿苷(ncm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5甲基氨基甲基_2_硫 基尿苷(mnm5s2U)、5-甲氧基羰基甲基_2_硫基尿苷(mcm5s2U)、尿苷5-羥乙酸(cmo5U)、 5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-羧基甲基氨基甲基尿苷(Cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫 基尿苷(cmnm5S2U)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、5 (羧基羥基甲基)尿苷甲酯 (mchm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2' -0-甲基尿苷(cmnm5Um)、5_氨甲酰基甲基-2' -0-甲 基尿苷(ncm5Um)、二氫尿苷(D)、假尿苷(v)、l_甲基假尿苷(ml v)、2' -0-甲基假尿苷 (￥m)、胸腺嘧啶核糖核苷(m5U)、5-甲基_2_硫基尿苷(m5s2U)和5，2' _0_ 二甲基尿苷 (m5Um)。在一種實施方式中，該修飾的核苷為mnm5s2U、mcm5s2U、ms2t6A、s2U、￥或t6A。一個具體的 tRNA 片段包含核酸序列 5 ‘ -CU(mnm5s2U)UU(ms2t6A)A( ‘ 1') CUGC。另一個具體的tRNA 片段包括核酸序列 5' -GCU(mnm5s2U)UU(ms2t6A)A(‘ 1') CUG。任何這些tRNA片段還可包含標(biāo)記。該標(biāo)記可以直接地或間接地通過分光光度法、 光化學(xué)法、生物化學(xué)法、免疫化學(xué)法或化學(xué)方法進行檢測。代表性標(biāo)記包括放射性同位素(例如，32p、35S和3H)、染料、熒光染料(例如，Cy5和 Cy3)、熒光團(例如，螢光素)、電子致密試劑、酶和它們的底物(例如，酶聯(lián)免疫測定中常用 的，如堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶)、生物素_抗生蛋白鏈菌素、地高辛或半抗原；和可用 于抗血清或單克隆抗體的蛋白質(zhì)。該標(biāo)記還可以是“親和標(biāo)記物”。在標(biāo)記包含親合標(biāo)記物的情況下，可以用結(jié)合于固體載體使得能夠捕獲親和標(biāo)記 物標(biāo)記的tRNA片段的互補配體來捕獲該分離的tRNA片段。代表性的親合標(biāo)記物和互補伴 侶包括生物素_抗生蛋白鏈菌素、互補的核酸片段(例如，寡聚dT-寡聚dA、寡聚T-寡聚 A、寡聚dG-寡聚dC、寡聚G-寡聚C)、適體、或半抗原以及可用于抗血清或單克隆抗體的蛋 白質(zhì)。當(dāng)生物相互作用使珠聚集在一起時，級聯(lián)化學(xué)反應(yīng)起作用以產(chǎn)生大幅放大的信 號。經(jīng)激光激發(fā)，“供體”珠中的光敏劑將環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)換為更加激發(fā)的單線態(tài)。單線態(tài)氧 分子四處擴散以與受體珠中的二甲基噻吩衍生物反應(yīng)從而在370nm處產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，其進 一步活化包含在相同珠中的熒光團。該熒光團隨后在520-620nm處發(fā)光。在可商購的a珠的一個實施例中，供體珠包含生物素或直接與RNA結(jié)合。受體珠包含His6標(biāo)記物、血球凝集素(HA)、地高辛/地高新配基(DIG)或螢光素(FITC)。IV.產(chǎn)牛分離的核糖核苷酸的合成方法用于制備具有特定序列或含有特定核酸堿基、糖、核苷間鍵合、化學(xué)部分以及其他 成分和特征的核酸的各種方法在本領(lǐng)域中是已知的。這些方法中的任何一個或任何組合 可用于制備本發(fā)明的核酸、多核苷酸或寡核苷酸。所述方法包括，但不限于(1)化學(xué)合成 (通常，但不總是，使用核酸合成儀器)；(2)合成后化學(xué)修飾或衍生化；(3)在核酸克隆載 體中克隆天然存在的或合成的核酸(例如，參見Sambrook，et al.，Molecular Cloning A LaboratoryApproach 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),所述載 體如，但不限于，質(zhì)粒、噬菌體(例如，mB或入)、噬菌粒、粘粒、F粘粒(fosmid)、YAC或BAC 克隆載體，包括產(chǎn)生單鏈DNA的載體；(4)使用具有DNA模板依賴性DNA聚合酶活力的酶 進行引物延伸，所述的酶如，但不限于，klenOW、T4、T7、rBSt、Taq、Tfl或Tth DNA聚合酶， 包括突變的、截短的(例如，外-負(fù)(exo-minus))或該類酶的化學(xué)修飾形式；(5)PCR(例 如，參見 Dieffenbach, C. ff. , and Dveksler, eds. , PCR Primer :A LaboratoryManual, 1995, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y.) ； (6)使用具 有反轉(zhuǎn)錄酶活力的酶進行反轉(zhuǎn)錄(包括等溫合成和RT-PCR)，所述的酶如，但不限于，來源 于禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)、莫洛尼鼠白血病毒(MMLV)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus，rBst)、嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus,Tth)的反轉(zhuǎn)錄酶；(7)使 用具有RNA聚合酶活力的酶進行體外轉(zhuǎn)錄，所述的酶如，但不限于，SP6、T3或T7RNA聚合酶、 Tth RNA聚合酶、大腸桿菌RNA聚合酶或另一種酶；(8)限制性酶和/或修飾酶的使用，包 括，但不限于，核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶、激酶、連接酶、磷酸酶、甲基酶、糖基化酶、末端轉(zhuǎn) 移酶，包括包含用于在核酸中進行特定修飾的該類修飾酶和其他試劑的試劑盒；(9)使用 多核苷酸磷酸化酶制備新的隨機化核酸；(10)其他組合物，如，但不限于，連接RNA分子的 核糖酶連接酶；和/或(11)任何上述內(nèi)容的任何組合或本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)?？缮藤彨@ 得寡核苷酸和多核苷酸，包含具有非天然存在的堿基、糖和核苷間連接的嵌合(即復(fù)合)分 子和寡核苷酸(例如，參見2000Productand Service Catalog,TriLink Biotechnologies, San Diego, Calif. , USA)。tRNA片段或靶核酸，或tRNA片段和靶核酸兩者均可以被可檢測地標(biāo)記以便于檢 測。在優(yōu)選的方面，用熒光團標(biāo)記tRNA片段以便于檢測。另一方面，用生物素標(biāo)記靶核酸 分子以便于檢測。在另一優(yōu)選的方面，用熒光團標(biāo)記tRNA片段并且用生物素標(biāo)記靶核酸分子。可以在，例如，5'末端、3'-末端或5'-末端和3'末端的組合處標(biāo)記tRNA片 段和靶核酸分子以便于檢測。另外，也可以標(biāo)記測試化合物。在另一實施方式中，tRNA片 段和靶核酸分子可以具有連接至該分子內(nèi)部位置的可檢測標(biāo)記以便于檢測。V.檢測靶RNA與tRNA結(jié)合(或?qū)ζ湟种?的方法可以通過使用用于該檢測的任何方法來執(zhí)行檢測靶RNA與tRNA結(jié)合或?qū)υ摻Y(jié) 合抑制的方法。例如，AlphaScreen 測定(Packard Instrument Company, Meriden, Conn.)。AlphaScreen 技術(shù)是利用含有光敏劑(供體珠)或化學(xué)發(fā)光基團和熒光受 體分子(受體珠)的乳膠微珠(250nm直徑)的“擴增發(fā)光接近均相測定法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)”。在用 680nm 的激光照射后，供體珠中的光敏劑將環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)換為單線態(tài)氧。在快速衰減前，激發(fā)的單線態(tài)氧分子約擴散250nm( — 個珠直徑)。如果受體珠與供體珠的位置緊密接近(即，依靠靶RNA和tRNA片段的相互作 用)，則單線態(tài)氧分子與受體珠上的化學(xué)發(fā)光基團反應(yīng)，其立即將能量傳遞給同一珠上的 熒光受體。這些熒光受體將發(fā)射波長遷移至520-620nm，從而得到可檢測信號。靶RNA與 tRNA片段間相互作用的拮抗劑將因此抑制發(fā)射波長的遷移，而該相互作用的增效劑(或激 動劑，agonists)將會提高該遷移?？梢酝ㄟ^以任何順序或同時混合組分核苷酸(例如，工具tRNA和靶RNA)和測試 化合物來執(zhí)行所公開的方法。例如，靶RNA可以首先與測試化合物結(jié)合以形成第一混合物， 然后可以加入工具tRNA片段以形成第二混合物。在另一實施例中，靶RNA、工具tRNA和測 試化合物均可以在孵育前同時混合。一方面，在不存在該測試化合物而使得tRNA片段與靶 核酸結(jié)合的條件下孵育所述混合物?？梢允褂靡种茩z測可用的任何方法用測試化合物檢測對tRNA片段與靶核酸分子 結(jié)合的抑制。一方面，可以使用以下方法執(zhí)行確定步驟，所述方法包括，但不限于，凝膠遷移 測定、化學(xué)和酶印記法、圓二色和核磁共振光譜法、平衡透析或以探針或測試化合物組合文 庫中常規(guī)使用的任何結(jié)合檢測機制。結(jié)合的抑制表明該測試化合物可以用于抑制宿主中病
毒的增殖。VI.評價化合物抑制結(jié)合的能力可以使用本文中所述的方法測試任何化合物以鑒別能夠抑制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的 化合物。可以用本發(fā)明方法篩選出的測試化合物包括，但不限于，多肽、轉(zhuǎn)角模擬物 (beta-turn minetics)、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳族化合物、雜環(huán)化合物、苯 (并)二氮卓類、寡聚N-取代甘氨酸、寡聚氨基甲酸酯、多肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧 啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或它們的組合。一些測試化合物為合成分子，而其它的為天然分子。可以從包含合成或天然化合物文庫的多種來源獲得測試化合物。可以對可以通 過逐步方式合成的多種類型化合物產(chǎn)生組合文庫(combinatorial library)。通過TO 95/12608、WO 93/06121、W094/08051、WO 95/35503 和 W0 95/30642 中所述的編碼合成文 庫(ESL)方法，可以構(gòu)建大型化合物組合文庫。也可以通過噬菌體展示方法(參見，例如， Devlin,W0 91/18980)生產(chǎn)肽文庫?？梢詮纳虡I(yè)來源獲得或從野外采集以細(xì)菌、真菌、植物 和動物提取物形式的天然化合物文庫。已知的藥理學(xué)試劑可以經(jīng)受定向或隨機的化學(xué)修 飾，如?；饔谩⑼榛饔?、酯化作用、酰胺化作用(amidification)以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。肽或其他化合物的組合文庫可以完全隨機化，它在任何位置沒有序列偏好或恒定 序列。可替代地，文庫可以是有偏向性的，例如，序列內(nèi)的一些位置保持不變，或選自有限 數(shù)目的可能性。例如，一些情況下，核苷酸或氨基酸殘基在限定的種類內(nèi)，例如，疏水性氨 基酸、親水性殘基、空間偏向(小或大)殘基，對于交聯(lián)，向產(chǎn)生半胱氨酸的方向，對于SH-3 域，向產(chǎn)生脯氨酸的方向隨機化，對于磷酸化作用位點，向產(chǎn)生絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或組 氨酸的方向隨機化，或向產(chǎn)生嘌呤的方向隨機化。另一方面，測試化合物可以是天然存在的蛋白質(zhì)或它們的片段。該類測試化合物 可以從天然來源獲得，例如，細(xì)胞或組織的溶胞產(chǎn)物。也可以制備多肽試劑文庫，例如，從可 商購的或用常規(guī)方法產(chǎn)生的cDNA文庫制備。測試化合物也可以是肽，例如，約5至約30個 氨基酸的肽，優(yōu)選約5至約20個氨基酸的肽，特別優(yōu)選約7至約15個氨基酸的肽。肽可以
13是天然存在的蛋白質(zhì)的消化物、隨機肽或“偏向”的隨機肽。一些方法中，測試化合物為多 肽或蛋白質(zhì)。另一方面，測試化合物可以是核酸。核酸測試化合物可以是天然存在的核酸、隨機 核酸、或“偏向”的隨機核酸。例如，原核或真核基因組的消化物可以如上述用于蛋白質(zhì)的 方法相似地使用。在一些優(yōu)選的方法中，測試化合物為小分子，例如，分子量不超過約500或1000的 分子。優(yōu)選地，調(diào)整高通量測定并用于篩選該類小分子。在一些方法中，可以容易地使用如 上所述的小分子測試化合物組合文庫以篩選反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的小分子調(diào)節(jié)劑。多種測定對 該類篩選有效，例如，如Schultz et al. Bioorg Med Chem Lett8 =2409-2414,1998 ；ffeller et al. ,Mol Divers. 3 :61_70,1997 ；Fernandeset al. ,Curr Opin Chem Biol 2 :597_603, 1998 禾口 Sittampalam et al.，Curr Op in Chem Biol 1 :384_91，1997 中所述的。本發(fā)明的方法還可以適用于篩選反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑(如反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)的 高通量測定。該類高通量(HTS)測定可以包括將tRNA片段或靶核酸分子連接或結(jié)合至固 體載體上?！肮腆w載體”可以是分子通過共價或非共價鍵可以連接的任何表面。這包括，但 不限于，膜、塑料、磁性珠、帶電紙、尼龍、朗繆爾-布洛杰特膜(Langmuir-Bodgett film)、 功能化玻璃、鍺、硅、PTFE、聚苯乙烯、砷化鎵、金和銀。還考慮了本領(lǐng)域已知的能夠?qū)⑾铝泄?能團摻入至其表面上的任何其他材料，所述官能團如氨基、羧基、巰基或羥基。這包括具有 任何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表面，其包括，但不限于，球面和凹槽表面。HTS方法一般指能夠，例如，通過 抑制tRNA片段與靶核酸分子結(jié)合從而快速測定測試化合物的治療潛能的技術(shù)。HTS技術(shù)采 用測試材料的機器處理、陽性信號檢測以及數(shù)據(jù)解釋?？梢酝ㄟ^使用放射性或通過依賴于 吸光度、熒光或發(fā)光性作為讀數(shù)的光學(xué)測定經(jīng)檢測是否發(fā)光來鑒別測試化合物。Gonzalez， J. E. et al.，(1998)Curro Opin. Biotech. 9 :624_631.。本發(fā)明還包括用于本發(fā)明方法的試劑盒和組合物(例如，反應(yīng)混合物等)。試劑盒 是可用于或足以執(zhí)行本發(fā)明方法的一步或多步步驟的各個組合物的組合，其中為了在該方 法中一同使用，對組合物進行了優(yōu)化。組合物包括用于本發(fā)明方法中至少一步的各個組分。 本發(fā)明還提供了用于篩選反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄抑制劑的試劑盒，其包括tRNA反密碼子莖 環(huán)片段的線性序列和用于檢測與靶序列結(jié)合的試劑，如標(biāo)記。在一些實施方式中，試劑盒還 包括能夠與tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的一種或多種靶核酸分子。在一些實施方式中，試 劑盒還包括執(zhí)行篩選方法的其他試劑。在一些實施方式中，試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄病毒的反 轉(zhuǎn)錄的多種抑制劑。在一些實施方式中，試劑包括與核酸結(jié)合后經(jīng)歷熒光增強的染料(例 如，該染料為 RIBOGREEN、SYBR Gold、SYBR Green I 或 SYBER Greenll)。在一些實施方式 中，試劑盒還包括對照試劑(例如，陽性對照的樣品聚合酶和/或抑制劑，陰性對照的聚合 酶和/或抑制劑負(fù)樣品(inhibitor minus samples)等)。在一些實施方式中，試劑盒還包 括說明執(zhí)行該方法的說明書。在一些實施方式中，該說明書包含在協(xié)助用戶獲得、分析、顯 示和/或存儲該方法結(jié)果的計算機軟件中。該軟件還可以包含與科學(xué)儀器(例如，檢測儀 器)等集成的樣品信息管理說明書。VII.鑒別抑制劑的試劑盒還提供了用于鑒別本文所述各種過程的抑制劑的試劑盒，所述抑制劑即反轉(zhuǎn)錄病 毒增殖、反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄、與宿主細(xì)胞tRNA和靶核酸分子結(jié)合、病毒RNA翻譯和最終病毒包裝與裝配的抑制劑。一方面，該試劑盒包含如本文所述的tRNA片段和能夠與該tRNA片段結(jié)合的核酸 分子。本發(fā)明的試劑盒還可以包含靶核酸序列和/或用于進行測定的試劑。該試劑盒還可 以包含用于檢測測試化合物是否抑制片段tRNA與核酸分子結(jié)合的標(biāo)記組分。VIII.治療方法如本文所公開的，例如，在以下實施例中，已經(jīng)鑒別了能夠抑制病毒增殖的幾種化 合物?？梢酝ㄟ^抑制反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄、翻譯中所用的反轉(zhuǎn)錄病毒引物(人tRNA_l@)的 病毒募集、抑制新病毒體的最終包裝與裝配和/或抑制宿主細(xì)胞tRNA與靶核酸分子結(jié)合來 抑制反轉(zhuǎn)錄病毒增殖。因此，這些化合物可以在治療患有反轉(zhuǎn)錄病毒感染的患者的方法中使用。也就是 說，可以通過給予一種或多種反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑來治療或預(yù)防反轉(zhuǎn)錄病毒的病毒感 染，所述反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑例如，反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄抑制劑、結(jié)合宿主細(xì)胞tRNA和 靶核酸分子的抑制劑、反轉(zhuǎn)錄病毒引物(人tRNA>3)募集抑制劑、病毒RNA向病毒蛋白質(zhì) 翻譯的抑制劑以及病毒體最終病毒包裝與裝配的抑制劑。迄今為止，還沒有使用該類抑制 劑完成病毒疾病的治療。該類化合物可用于治療或預(yù)防病毒感染(包括反轉(zhuǎn)錄病毒感染)和/或抑制病毒 復(fù)制、增殖、反轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯和/或最終病毒包裝與裝配?？梢酝ㄟ^本文所公開的方法鑒 別出抑制劑的反轉(zhuǎn)錄病毒包括以RNA作為其主要遺傳物質(zhì)的任何病毒并使用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 DNA。該類病毒包括，但不限于，貓免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、禽白血病 病毒、貓白血病病毒、大眼梭鱸皮膚肉瘤病毒、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒和人類免疫缺陷病毒 (HIV)。在優(yōu)選的方面，反轉(zhuǎn)錄病毒為HIV。HIV可以是HIV家族中的任何株、類型、亞型或 變種。HIV 病毒包括，但不限于，HIV-I、HIV-II、HIV-III(也稱為 HTLV-II、LAV-I、LAV-2)寸。該類化合物還可以結(jié)合現(xiàn)有的治療方法在處理上述病毒感染類型中作為輔助療 法使用。在該類情況下，優(yōu)選地以對病毒(包括突變的、多種藥物抗性病毒)作用最優(yōu)化而 對正常細(xì)胞類型作用最小的方式向患者給予活性成分。盡管這主要是依靠化合物本身的作 用完成的，但這也可以通過靶向施藥和/或通過調(diào)節(jié)劑量來完成，從而在未達到出現(xiàn)顯著 副作用的閾值劑量而獲得所需效果。IX.藥物組合物可以將如本文所述的抑制性化合物摻入藥物組合物并用于治療或預(yù)防病毒感染， 如反轉(zhuǎn)錄病毒感染。本文所述的藥物組合物包括如本文所述的抑制性化合物和藥物可用載 體和/或賦形劑。該類化合物的給予方式可以是不同的。優(yōu)選地，該類組合物為口服給予(例如，以 液體形式包含在如水性或非水液體的溶劑中，或包含在固體載體中)?？诜o予的優(yōu)選組合 物包括丸劑、片劑、膠囊、囊片、糖漿和溶液，包括硬膠囊和定時釋放膠囊?？梢詫⒔M合物配 制為單位劑量形式，或多個或亞單位劑量。優(yōu)選的組合物為液態(tài)或半固態(tài)形式?？梢允褂?包含液體藥物惰性載體(如水或其他藥物相容的液體或半固體)的組合物。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員熟知該類液體和半固體的使用。也可以通過注射，即靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射和腦室內(nèi)注射給予該類組合物。靜脈內(nèi)給予為優(yōu)選的注射方法。本領(lǐng)域那些技術(shù) 人員熟知用于注射的適合載液，其包括5%的右旋糖溶液、鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水。還可以 作為輸注液或注射液給予該類化合物(例如，作為懸浮液或作為藥物可用液體或液體混合 物中的乳狀液)。還可以使用其他方法給予該類劑型，例如，直腸給予。本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知用 于直腸給予的劑型，如栓劑。也可以通過吸入法給予該類化合物(例如，以鼻腔氣霧劑的形 式或使用授權(quán)Brooks等人的美國專利No. 4922901中所述輸送物件類型的氣霧劑形式，該 專利公開整體并入本文)；局部給予(例如，以洗液的形式)；或經(jīng)皮給予(例如，使用皮膚 貼，使用可商購自Novartis and AlzaCorporation的技術(shù))。盡管可能以散裝活性化學(xué)品 的形式給予該類化合物，但是為了高效和有效給予，每種化合物優(yōu)選地以藥物組合物或劑 型的形式存在。對于熟練的技術(shù)人員來說，給予該類化合物的示例性方法將是顯而易見的。這些 劑型的有用性可以取決于所用的特定組合物和接受治療的特定受試者。這些劑型可以包含 油性的、水性的、乳化的液體載體或包含適合給予模式的某些溶劑。可以間歇地，或以逐步、連續(xù)、恒定或受控的速率向恒溫動物(例如，哺乳動物，如 小鼠、大鼠、貓、兔、狗、豬、?；蚝?給予該類組合物，但有利地將該類組合物給予人類。另 外，藥物劑型給予的天數(shù)以及每天給予的次數(shù)可以是不同的。優(yōu)選地，給予該類組合物從而使活性成分與病毒感染區(qū)域相互作用。本文所述的 化合物對治療這些病毒感染非常有效。在某些情況下，本文所述的化合物可以作為藥物組合物的一部分與設(shè)計用于預(yù)防 或治療特定病毒感染的其他化合物一同使用，即組合治療。除本文所述的有效量的化合物 之外，該類藥物組合物還可以包含作為添加劑或輔助劑的各種其他組分。組合治療可以以下列方式給予組合治療，(a)作為單一藥物組合物，其包含如本文所述的 抑制性化合物、本文所述的至少一種其他藥物試劑和藥物可用的賦形劑、稀釋劑或載體；或 (b)作為兩種不同的藥物組合物，其包含(i)第一組合物，其包含如本文所述的抑制性化合 物和藥物可用的賦形劑、稀釋劑或載體，和(ii)第二組合物，其包含本文所述的至少一種 其他藥物試劑和藥物可用的賦形劑、稀釋劑或載體。可以同時或以任何順序順次給予該類 藥物組合物。在治療或預(yù)防病毒疾病中使用時，(一種或多種)抑制性化合物可以與作為單一 藥物組合物一部分的至少一種其他抗病毒試劑一同給予。可替代地，它可以不與其他抗病 毒試劑一同給予。在該實施方式中，基本上同時給予抑制性化合物和至少一種其他抗病毒 試劑，即同時或相繼給予該類化合物，只要該類化合物在血液中達到治療水平一段時間。組合治療包括結(jié)合至少一種抗病毒試劑一同給予如本文所述的抑制性化合物，或 該抑制性化合物的藥物可用鹽或藥物前體，理想地，所述至少一種抗病毒試劑通過不同于 本文所述的病毒增殖抑制劑的機制起作用。代表性抗病毒試劑可用于組合治療的一些抗病毒試劑包括干擾病毒滲入靶細(xì)胞能力的試劑。病毒必 須經(jīng)歷一系列步驟來進行該過程，其開始于與宿主細(xì)胞表面上的特異“受體”分子結(jié)合，而結(jié)束于病毒在細(xì)胞內(nèi)部“脫殼”并釋放其內(nèi)容物。在可以脫殼之前，具有脂包膜的病毒還必 須將它們的包膜與靶細(xì)胞融合，或與將它們運送入細(xì)胞的囊融合。抑制病毒復(fù)制這一階段的活性劑有兩種類型。一種類型包括模擬病毒相關(guān)蛋白質(zhì) (VAP)并與細(xì)胞受體結(jié)合的試劑，其包括VAP抗個體基因型抗體、受體的天然配體和抗受體 抗體、受體抗個體基因型抗體、外源受體和合成受體模擬物。另一種類型包括抑制病毒進入 的試劑，例如，在病毒附著并進入宿主細(xì)胞時，抑制病毒進入。例如，正在開發(fā)用于抗HIV的 多種“進入_抑制”或“進入_阻斷”藥物，其靶向稱為“輔助性T細(xì)胞”的免疫系統(tǒng)白血球 并通過表示為“CRX4”和“CCR5”的T細(xì)胞表面受體鑒別這些靶細(xì)胞。因此，如金剛烷胺和 金剛乙胺的CRX4和CCR5受體抑制劑可用于抑制病毒感染，如HIV、流感、乙肝和丙肝病毒感 染。另一種進入-阻斷劑為普來可那立(pleconaril)，其通過阻斷控制脫殼過程的病毒表 面上的袋(pocket)來抵抗導(dǎo)致感冒的鼻病毒?？梢越Y(jié)合本文所述的抑制性化合物使用的其他抗病毒試劑包括在病毒侵入細(xì)胞 后干擾合成病毒組分的病毒過程的試劑。代表性試劑包括核苷酸和核苷類似物，其類似RNA 或DNA的結(jié)構(gòu)單元，但一旦摻入該類似物后會使合成RNA或DNA的酶失活。阿昔洛韋是核 苷類似物并對皰疹病毒感染有效。還可以使用齊多夫定(AZT)、3TC、FTC和其他核苷反轉(zhuǎn)錄 酶抑制劑(NRTI)以及非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)。也可以使用整合酶抑制劑。一旦病毒基因組開始在宿主細(xì)胞中運行，那么它將產(chǎn)生指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)合成的信 使RNA(mRNA)分子。mRNA的產(chǎn)生由被稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)引發(fā)，并且某些活性劑阻斷了 轉(zhuǎn)錄因子與病毒DNA的連接。其他活性劑包括反義寡核苷酸和核糖酶(在選中的位點將病毒RNA或DNA切開的 酶)。如HIV的一些病毒包含蛋白酶酶類，其切割病毒蛋白質(zhì)鏈從而使它們可以裝配為 最終的構(gòu)形。蛋白酶抑制劑是另一類抗病毒試劑，其可以結(jié)合本文所述的抑制性化合物使用。病毒生命周期中的最后階段為從宿主細(xì)胞中釋放完整的病毒。如扎那米韋 (Relenza)和奧塞米韋(Tamiflu)的一些活性劑通過阻斷位于流感病毒表面上的名為神經(jīng) 氨酸酶的分子來阻止病毒顆粒的釋放從而治療流感。其他的活性劑通過刺激患者的免疫系統(tǒng)起作用。包括聚乙二醇干擾素在內(nèi)的干擾 素是這一類中的代表性化合物。干擾素a用于，例如，治療乙型肝炎和丙型肝炎。包括單 克隆抗體在內(nèi)的多種抗體也可以用于靶向病毒。任何上述化合物可以與本文所述的抑制劑一同用于組合治療?；衔锏倪m當(dāng)劑量為有效預(yù)防疾病癥狀發(fā)生或治療病人所患疾病的一些癥狀的 量。“有效量”、“治療量”或“有效劑量”表示足以獲得所需的藥理學(xué)或治療效果并因此疾病 得到有效預(yù)防或治療的量。治療病毒感染時，抑制性化合物的有效量為足以抑制病毒生長和增殖的量?？梢?通過以預(yù)防方式給予本文所述的化合物在一開始時或從復(fù)發(fā)時預(yù)防病毒感染。優(yōu)選地，有 效量為足以獲得所需結(jié)果但不足以產(chǎn)生明顯副作用的量。根據(jù)如患者狀況、病毒感染嚴(yán)重程度和藥物組合物的給予方式等因素，有效劑量 可以是不同的。對于不同的患者，化合物的有效劑量當(dāng)然也將不同，但是一般說來，有效劑
17量在產(chǎn)生所需治療效果的量之上而在觀察到顯著副作用的量之下。當(dāng)根據(jù)本文所述方法以有效量使用時，化合物對抑制某些病毒的增殖有效而不顯 著影響正常細(xì)胞。對于人類患者，典型化合物的有效劑量通常需要以至少約1 P g/24小時/患者的 量給予，通常以至少約10 y g/24小時/患者的量給予，并且經(jīng)常以至少約25 y g/24小時/ 患者的量給予。有效劑量通常不超過約500 y g/24小時/患者，通常不超過約400 y g/24 小時/患者，并且經(jīng)常不超過約300 u g/24小時/患者。另外，給予有效劑量從而使得患者 血漿中的化合物濃度一般不超過500ng/ml并且經(jīng)常不超過lOOng/ml。本發(fā)明將通過以下示例性實施例進一步進行解釋，這些實施例不旨在進行限制。實施例 實施例I線性tRNA反密碼子莖環(huán)序列的合成產(chǎn)生片段tRNA反密碼子莖環(huán)(ASL)序列的第一步為合成修飾的核苷酸，也稱為 亞磷酰胺(Agris et.al Biochimie. (1995)77(1-2) 125-34)。然后，在 RNA 寡聚物合成時 使用該修飾的核苷酸(Ogilvie et.al. Proc Natl Acad Sci USA. (1988)85:5764-8)。合 成方法克服了獲得足夠量天然產(chǎn)品用于功能性表征研究的基本阻礙。除提供用于表征片段 tRNA 靶核苷酸結(jié)合的完全修飾的ASL外，該合成方法使得能夠制備修飾材料的中間步驟/ 形式，其可以進一步闡明每個修飾步驟在提高tRNA結(jié)合中各自的貢獻。使用合成、摻入和純化ASLlys3人tRNA中所發(fā)現(xiàn)的所有修飾的核苷酸的方法組合 制備了修飾的堿基核酸分子。使用如Ogiliveet. al.，1988中公開的那些已知的方法制備 了修飾的堿基亞磷酰胺。ASLLys3含有表示為mcm5S2U、mS2t6A和假尿苷的3個修飾的堿基。 以下詳細(xì)說明了制備合成模擬物所需的磷酰胺的合成。聚合物合成方案遵循為自動RNA合 成(Ogilive et. al,1988)所開發(fā)的那些方法，并針對下述ASLlys3模擬物的合成做出改變。 該說明包括自動合成所需的保護基團的除去方法和測定中使用的最終產(chǎn)品的純化方法。接著在合成RNA寡聚物之后除去保護基。說明了向每個修飾的堿基和核糖中加入 保護基團。盡管在標(biāo)準(zhǔn)RNA合成方案中2位的硫-基團可以被氧化，但這已經(jīng)通過使用過 氧化氫叔丁酯(10%的乙腈溶液)氧化劑(Kumar and Davis, 1997)得到克服。這些合成的 RNA寡聚物已用于功能(Yarian 2002和Phelps 2004)和結(jié)構(gòu)研究(Stuart 2000和Murphy 2004)。實施例IA 保護的單體亞磷酰胺mcm5S2U的合成按照公開的方法(Reese和Sanghvi 1984)制備了 mcm5S2U核苷。簡要地，將2硫 尿核苷與均為5摩爾當(dāng)量的吡咯烷和甲醛水溶液回流加熱1小時從而得到2' ,3' -0異亞 丙基-5-吡咯烷甲基-2-硫尿核苷。隨后，在室溫下用10摩爾當(dāng)量的甲基碘乙腈溶液處理 該堿基。16小時后，減壓濃縮該產(chǎn)物以得到推定的甲碘化物，然后將該甲碘化物溶于乙腈并 使其與3摩爾當(dāng)量的甘氨酸叔丁酯在室溫下反應(yīng)16小時。然后，純化該產(chǎn)物并按照如下所 述的常規(guī)方案保護核糖和亞磷?；?phosphitylation)。ms2t6A在消除氨基酸外消旋的情況下，通過ms2A的2' ,3' ,5' _0_三乙酰衍生物與 來源于L-蘇氨酸-0-叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)-對硝基苯乙基酯的異氰酸酯之 間的縮合反應(yīng)獲得該單體。選擇性地對該產(chǎn)物的糖基部分脫保護。采用標(biāo)準(zhǔn)程序，分別用
18二甲氧三苯甲基(DMTr)和TBDMS基團對5 ‘ -0-和2‘ -0-官能進行最終保護，以及進行 3' -0-亞磷酸化(Agris et al. 1995)。S2U在這一合成中，硫基基團不被保護。核糖和亞磷?；谋Ｗo遵循圖1中部分C的 常規(guī)方案。核糖和亞磷?；谋Ｗo遵循下述常規(guī)方案。從1-0-乙酰-2，3，5-三-0-苯甲酰呋喃核糖合成了 t6A核苷的糖-保護的氨基 甲酸苯酯6。使用Hong和Chheda提出的方法，用L-蘇氨酸處理氨基甲酸酯以提供糖-保 護的t6A核苷。剩余的合成變換遵循下述的常規(guī)方案。實施例IB 核糖保護和亞磷酰化的一般步驟。提供了在合成RNA寡聚物之前用于保護修飾的核苷酸堿基的方法(圖1)。圖1的 部分A示出了用三氟乙酸進行保護。部分B示出了用苯甲?；谋Ｗo，而部分C示出了核 糖羥基基團的常規(guī)保護。堿基保護后，對于兩種修飾的核苷酸來說，5' -0-(4,4' - 二甲氧三苯甲 基)_2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基-修飾的核糖核苷-3' -0-(2-氰基乙基-N-二異丙 基)亞磷酰胺的合成方法是相同的(圖1，部分C)。通過與吡啶進行兩次共蒸發(fā)對保護的 核苷進行干燥并溶于吡啶。加入叔_丁基二甲基氯硅烷和咪唑并在室溫下反應(yīng)4小時。用 水和二氯甲烷分解過量的甲硅烷基氯。用二氯甲烷萃取水層兩次，并與有機層合并。真空 蒸發(fā)溶劑得到膠狀物，隨后將其溶于醚并在攪拌的情況下通過緩慢倒入石油醚(40-60°C ) 進行沉淀。收集沉淀物并用石油醚清洗兩次。此時，粗產(chǎn)物含有三種成分；2'，3' 二甲硅 烷基化的、2'甲硅烷基化的(主要產(chǎn)物)和3'甲硅烷基化的異構(gòu)體。用硅膠柱色譜法純 化出純2'保護的異構(gòu)體。然后，該產(chǎn)物準(zhǔn)備在亞磷?；惺褂?。通過與無水吡啶和THF進行兩次共蒸發(fā)使N-保護-5' _0_ 二甲氧三苯甲 基-2' -0-叔-丁基二甲基甲硅烷基核糖核苷干燥。然后在氬氣下將殘余物溶于無水THF。 通過橡膠隔片加入二甲基氨吡啶、N，N, N-乙基二異丙胺和氰-乙氧基二異丙基氨基-氯 膦。2小時后，用乙酸乙酯淬滅該反應(yīng)混合物，并先用5%的碳酸氫鈉清洗再用水清洗。再 用乙酸乙酯萃取水清洗液。用硫酸鈉干燥合并的有機層。蒸發(fā)溶劑后得到粘稠的油。將該 產(chǎn)物與甲苯共蒸發(fā)兩次，并用快速硅膠色譜法純化該淺黃色的亞磷酰胺產(chǎn)物。實施例IC 合成修飾的RNA聚合物的方案。按照通過用2' -0TBDMS保護(Usman et al.，1987)和N_4_叔丁基苯氧基乙?；?(tac)保護A、G和C單體(Sinha et al.，1993)的固相b_氰基乙基亞磷酰胺化學(xué)的1摩 爾水平標(biāo)準(zhǔn)方案合成RNA。用tac和2 ‘ -0-TBDMS保護的A、G、C和U單體和rC (tac)-琥 珀?？刂频木呖撞Ａ?pore glass) (CPG)支持以下變化形式。在存在0. 3M的5_(苯甲硫 基)-IH-四唑的乙腈溶液的情況下，加入的未修飾的A、C、G和U單體以5倍摩爾過量的情 況偶聯(lián)6分鐘，而mcm5S2U和ms2t6A單體則以3倍過量的情況使用并偶聯(lián)10分鐘。偶聯(lián) 后，用tac酐(tac anhydride)封端2分鐘，然后用1M異丙基苯過氧化氫的甲苯溶液氧化 3分鐘。合成結(jié)束時，5' 二甲氧三苯甲基基團保留在適當(dāng)位置。實施例ID 中間體脫保護的方案以如下3個步驟進行RNA脫保護。在45°C，用20毫升完全無水的10%的1，8_ 二 氮雜雙環(huán)[5. 4. 0]十一烷-7-烯(DBU)的四氫呋喃溶液處理帶有完全保護RNA的用氬氣干燥的CPG 45分鐘以去除p-硝基苯乙基和2-氰基乙基保護基團。在氬氣層下除去上清液， 并用干THF沖洗CPG兩次。然后，在室溫并且在氬氣下，用20mL 10%的DBU干甲醇溶液處 理帶有部分脫保護RNA的CPG18h以從CPG上切割核堿基保護基團和切割RNA。在Speedvac 中用Falcon管干燥上清液和甲醇清洗液，然后在高真空度(10)3托)情況下用五氧化二 磷干燥3天以除去殘留的DBU。使用12mL的三乙胺三氫氟酸鹽在室溫并且劇烈攪拌下對 2' -0-TBDMS保護的RNA進行脫甲硅烷基(Gasparutto et al.，1992) 24小時。在該步驟 中，還從5'末端G殘基上除去了 DMT基團。通過添加無菌水(1. 2ml)結(jié)束反應(yīng)，用丁醇使 粗RNA沉淀并在20°C保持24小時以完全沉淀。通過離心收集RNA并用丁醇清洗。實施例IE :RNA聚合物的純化通過HPLC純化合成的RNA聚合物產(chǎn)物。使用C18SEP-PAK對脫保護材料脫鹽，并 通過使用氯化鈉梯度的制備型陰離子交換HPLC進行純化。一些情況下，需要使用反相色譜 法的其他純化步驟。為確保該聚合物產(chǎn)物是正確的，通過電噴霧質(zhì)譜法和核苷組成分析法 對其進行分析。實施例II.抑制劑篩選測定使用工具和靶RNA開展了兩個測定，分別為固定化測定和Alphascreen測定(圖 3)。兩個測定均使用了相同的兩個RNA組分(靶RNA和tRNA片段)。在該實施例中，HIV 病毒RNA靶標(biāo)為具有3'生物素的12聚體(12mer)，而人tRNA模擬物為含有天然修飾的核 苷酸和3'熒光素的合成12聚體。這兩個RNA模擬了 HIV復(fù)制復(fù)合體的必要復(fù)合物。如以下更詳細(xì)地說明的，固定化測定使用了三步驟方法，該方法首先包括靶RNA 與抗生物素蛋白涂敷的微量滴定板的結(jié)合。然后，用星號表示的測試化合物(藥物/小分 子)與靶序列一同孵育30分鐘。然后，加入tRNA模擬物以確定是否形成或抑制了復(fù)合物。 在這一測定中，磷酸鹽緩沖液可以與1M的NaCl —同使用以改善這兩種RNA的親合力。復(fù) 合物的穩(wěn)定性依賴于濃度，因此使用了 P m濃度并且在4°C進行該測定。通過向各個孔中加入150 ill的靶溶液將5 ‘標(biāo)記的靶RNA序列 (5' -CGGUGUAAAAGC)結(jié)合到抗生物素蛋白微量滴定板(Roche高載量板，96-孔抗生物素蛋 白微量滴定板)上(圖3，步驟A)。將該板在37°C下覆蓋并孵育1小時。然后，用結(jié)合緩沖 液漂洗該板兩次，并在37°C孵育第二漂洗液5分鐘。然后，用結(jié)合緩沖液再將該板漂洗兩 次，覆蓋后備用。通過將化合物溶液解凍至室溫制備測試化合物。通過用二甲亞砜稀釋并震蕩1小 時制備了測試化合物的稀釋液(1 10和1 500)。通過向板上的各個孔中加入98. 5 ill的上樣緩沖液(pH 7. 5，100mM的Tris HC1、 150mM的NaCl和0. 1 %的Tween 20，用10M的NaOH將pH從約4. 5調(diào)節(jié)至7. 5)進行該測 定。分別向各個孔中加入測試化合物(每個孔1.5 yl)，并將板混合1小時(圖3，步驟B)。然后，將含有工具tRNA (5 ‘ -GCUXUUAYZCUG;其中X、Y和Z獨立地選自修飾的核苷 mnm5s2U、mcm5s2U、ms2t6A，s2U、￥和t6A)的50微升溶液加入至各個孔中并將板在4°C下 震蕩孵育1小時(圖3，步驟C)。然后除去反應(yīng)混合物，在該混合物仍為冷的時，還除去了 剩余的化合物溶液。除去剩余溶液后，再向各個孔中加入讀數(shù)緩沖液(pH 7. 5，50mM&Ifepes、100mMm NaCl, PEG(40mg/200ml))并使用板讀數(shù)器讀取結(jié)果。
如圖3所示，陽性(+)反應(yīng)表明測試化合物抑制工具tRNA與靶核酸結(jié)合(例如， 測試化合物與工具tRNA或靶核酸分子結(jié)合，或與工具tRNA和靶核酸分子兩者結(jié)合)。陰 性(_)反應(yīng)表明測試化合物未抑制工具tRNA與靶核酸結(jié)合(例如，測試化合物既不與工具 tRNA結(jié)合也不與靶核酸結(jié)合)。在a篩選配置中(圖3)，在溶液中使用與固定化測定相同的RNA進行測定。供體 和受體珠與它們各自的RNA結(jié)合。在篩選期間，RNA和測試藥物/小分子一同孵育并使用 a篩選檢測條件測量復(fù)合物的形成。利用a篩選測定可使得該測定能夠在室溫并且在較 低RNA濃度下進行，并提高了該復(fù)合物的穩(wěn)定性。實施例III. HIV篩選測定的驗證驗證HIV篩選測定以證實陽性和陰性對照將按照預(yù)期起作用，并且測試小化合物 文庫以證實可以檢測出差異抑制。分別用4275和4616種化合物完成兩種驗證，每種驗證 使用17塊板。兩種測定之間有3961種化合物相同，并且僅使用這些化合物以及陽性和陰 性對照完成統(tǒng)計分析。每塊板含有約30個陽性和30個陰性對照，這些對照的表現(xiàn)與預(yù)期 相同。當(dāng)分析發(fā)光性時，觀察到了驗證運行之間的差異；然而，當(dāng)評價在兩次運行中均具有 活性的化合物(命中，hit)的抑制百分?jǐn)?shù)時，這些差異被最小化或消除了。基于陽性和陰 性對照的結(jié)果，該測定滿足了功能性要求。為評價在篩選這一小化合物文庫中所表現(xiàn)出的抑制，將截止點設(shè)定在42. 96%抑 制，即平均值加上化合物抑制百分?jǐn)?shù)(％ )標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍。使用該截止點，鑒別出34種 重復(fù)化合物(命中)。通過使用99. 75%抑制作為截止點，即平均值減去陽性對照(工具+ 靶標(biāo))抑制百分?jǐn)?shù)(％ )標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍，只有1個重復(fù)命中。如果將29. 02%定義為截止 點，即平均值加上陰性對照(工具)抑制百分?jǐn)?shù)(％)標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍，則在所分析的3961 種化合物中有51個重復(fù)命中。這些結(jié)果與評價小型隨機化合物文庫時的預(yù)期相符。為選擇在第二 HIV測定中使用以證實該測定能夠鑒別出具有生物活性的HIV特異 化合物的化合物，在兩種驗證運行其中至少一種中將截止點設(shè)定為大于60%抑制。這導(dǎo)致 選擇了 29種化合物。在新鮮采集的PBMC細(xì)胞中分析了這些化合物的抗HIV活性。在30 種所測試的化合物中，有15種在濃度小于100 M(最高測試濃度)時有活性。在這15種 化合物中，有9種在100 M濃度下對PBMC細(xì)胞無毒性；因此，對這9種化合物不能絕對地 認(rèn)為它們對HIV和PBMC細(xì)胞具有毒性差異。兩種其他化合物具有可接受的大于25的抗病 毒指數(shù)(抑制HIV細(xì)胞而不抑制PBMC細(xì)胞)。兩種鑒別的化合物為 萘并[2',3'，4，5]咪唑并[l，2_a]吡啶-6，11_ 二酮；和 4，5_雙(二甲基氨基)-1_萘醛。這兩種化合物在0. 63和0. 022 ii M時顯示出了抗HIV活力，并且抗病毒指數(shù)大于 25。一個化合物在反轉(zhuǎn)錄酶測定中無活性，表明該化合物對該酶無抑制，還表明該化合物抑 制該測定設(shè)計用于模擬的RNA:RNA相互作用。圖4、圖5和圖6中示出了這兩種化合物以及 對照化合物的測定結(jié)果。盡管出于使理解清楚的目的，已經(jīng)通過例證說明和實施例詳細(xì)說明了上述發(fā)明， 但顯然可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)進行某些變化和改進。
權(quán)利要求
一種鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄抑制劑的方法，所述方法包含形成混合物，所述混合物包含不能形成莖-環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、能夠與所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核酸分子、和測試化合物，其中所述靶核酸分子對應(yīng)于參與反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分；在不存在所述測試化合物而使得所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段與所述靶核酸分子結(jié)合的條件下孵育所述混合物；以及檢測所述測試化合物是否抑制所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段與所述靶核酸分子的結(jié)合，其中所述tRNAASL片段未與所述靶核酸分子結(jié)合表明所述測試化合物是反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄的抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段在對應(yīng)于全長tRNA 的位置34、37或39處包含修飾的核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段為具有10至14個 核苷酸的線性片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段為具有11到13個 核苷酸的線性片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段為具有12個核苷酸 的線性片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段對應(yīng)于tRNAlys的片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段包含至少一個修飾 的核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段基本上由對應(yīng)于反 密碼子莖環(huán)的核酸序列組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸分子包含對應(yīng)于來自反轉(zhuǎn)錄病毒基 因組的核酸的核酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸分子包含具有序列 5 ‘ -GCGGUGUAAAAG 的核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，形成所述混合物的步驟包括向所述混合物中加 入一種或多種測試化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述測試化合物選自由肽、肽類似物、核酸、核 酸類似物、抗體、激素、天然或合成的化合物、有機化合物和它們的組合所構(gòu)成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述核酸選自反義寡聚物、siRNA、RNAi、和 dsRNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，檢測對結(jié)合的抑制表明所述測試化合物對抑制 反轉(zhuǎn)錄是有效的。
15.一種篩選反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑的方法，所述方法包含形成混合物，所述混合物 包含tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、能夠與所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核 酸分子、和測試化合物，其中所述靶核酸分子對應(yīng)于參與反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的反轉(zhuǎn)錄病毒基 因組的一部分；在不存在所述測試化合物而使得所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段與所述靶核 酸分子結(jié)合的條件下孵育所述混合物；以及檢測所述測試化合物是否與所述tRNAASL片段 或所述靶核酸分子結(jié)合，其中所述結(jié)合表明所述測試化合物是反轉(zhuǎn)錄病毒增殖的抑制劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述方法包含篩選反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄的抑制劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述方法包含檢測所述測試化合物是否抑制 所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段與所述靶核酸分子的結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列不能 形成莖-環(huán)。
19.一種鑒別tRNAASL與靶核酸分子結(jié)合的抑制劑的方法，所述方法包含形成混合 物，所述混合物包含不能形成莖環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、能夠與所述tRNA 反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核酸分子、和測試化合物，其中所述靶核酸分子對應(yīng)于參與反 轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分；在不存在所述測試化合物而使得所述tRNA反密碼子 莖環(huán)片段與所述靶核酸分子結(jié)合的條件下孵育所述混合物；以及檢測所述測試化合物是否 抑制所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段與所述靶核酸分子的結(jié)合，其中所述tRNA未與所述靶核 酸分子結(jié)合表明所述測試化合物是反轉(zhuǎn)錄的抑制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段在對應(yīng)于全長 tRNA的位置34、37、或39處包含修飾的核苷酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段為具有10到14 個核苷酸的線性片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段基本上由對應(yīng)于 反密碼子莖環(huán)片段的核酸序列組成。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述靶核酸分子包含對應(yīng)于反轉(zhuǎn)錄病毒基因 組片段的核酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述靶核酸分子包含具有序列GCGGUGUAAAAG 的核酸。
25.一種篩選反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄抑制劑的試劑盒，包含基本上由tRNA反密碼子莖 環(huán)片段的線性序列組成的核酸分子；和可檢測標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明披露了鑒別反轉(zhuǎn)錄病毒增殖抑制劑的方法、所述方法中使用的tRNA以及可以在所述方法中使用的包含所述tRNA的試劑盒。本發(fā)明還披露了通過給予有效量的所述抑制劑以及包含所述抑制劑的藥物組合物治療或預(yù)防反轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。所述方法包括形成混合物，其包含不能形成莖-環(huán)的tRNA反密碼子莖環(huán)片段的線性序列、能夠與所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段結(jié)合的靶核酸分子和測試化合物。在不存在所述測試化合物而使得所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段和所述靶核酸分子結(jié)合的條件下孵育所述混合物。然后，可以進行檢測所述測試化合物是否抑制所述tRNA反密碼子莖環(huán)片段與所述靶核酸分子結(jié)合的測定。
文檔編號C12Q1/68GK101854938SQ200880115974
公開日2010年10月6日 申請日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者保羅·F·阿格里斯, 理查德·H·京特 申請人:北卡羅來納州立大學(xué)