專利名稱：骨形成蛋白4基因的反轉錄病毒載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及骨組織基因工程技術領域，具體地說及涉及含骨形成蛋白4基因的重組載體，該載體轉化包裝的病毒顆粒以及利用病毒顆粒制備組織工程化骨及其應用。
背景技術：
骨形成蛋白(BMP)屬于轉化生長因子超家族，其中BMP 2、4、5、6、7等與骨、軟骨、肌腱、牙周組織、牙本質的形成有極為密切的關系，均有明確的誘導成骨的作用。但傳統(tǒng)的BMP蛋白制備，無論是從骨基質中提純，還是用基因工程表達，程序復雜，產量低，活性不穩(wěn)定；在修復大面積骨缺損時，BMP的用量大，可能會生毒性反應；BMP作為外源性蛋白植入體內，也可能引起免疫反應。近年有學者探索應用BMP基因治療的方法加速骨缺損的修復。1988年Wozney等首先克隆出hBMP1-4cDNA。隨后陸續(xù)克隆獲得了BMP家族中的其它成員，為骨缺損修復的BMP基因治療奠定了基礎。BMP基因轉移的載體各有特點，反轉錄病毒能將目的基因整合到靶細胞基因組中，可長期表達，腺病毒不論靶細胞增殖狀況均可高效轉移，介導的基因轉移是非整合型的，但目前構建的載體含有許多編碼蛋白質的基因，其產物免疫原性強；裸DNA直接轉導方法簡單，無免疫原性，安全，費用低，缺點是轉導效率低。應用BMP基因治療結合組織工程技術促進新骨的形成已成為目前骨再生領域的研究熱點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于1)選擇pLEGFP(Invitrogen)作為反轉錄病毒載體，成功構建了pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體，2)通過PA317細胞的包裝，獲得了LEGFP-hBMP-4和LEGP反轉錄病毒顆粒，3)以hBMP-4基因修飾的骨髓基質細胞作為組織工程化骨的種子細胞構建組織工程化骨。
pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體，1)利用PCR方法獲取hBMP-4基因；2)hBMP-4基因克隆入pEGFP載體3)pEGFP-hBMP-4、pLEGFP反轉錄病毒載體以BglII/SalI(Promega)雙酶切，回收；4)T4DNA連接酶連接，轉化，抽提pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體。
pLEGFP-hBMP-4病毒顆粒，1)pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體與Lipofectamine有效的體積比，2)pLEGFP-hBMP-4-Lipofectamine復合物與PA317包裝細胞混合，培養(yǎng)，收集pLEGFP-hBMP-4病毒顆粒。
組織工程化骨，1)pLEGFP-hBMP-4病毒顆粒感染體外培養(yǎng)的骨髓基質細胞，2)骨髓基質細胞、生物支架材料構建組織工程化骨。
本發(fā)明的技術要點是選擇新型的反轉錄病毒表達載體pLEGFP，優(yōu)點是，該空白載體本身含有綠色熒光基因，在實驗中可以作為對照，熒光顯微鏡下可以方便的觀察綠色熒光蛋白的表達。更有利的是，該載體還可以用于細胞的標記和追蹤，這在組織工程研究中判斷細胞的來源以及歸宿有著重要的意義。PA317細胞是目前較廣泛使用的第2代包裝細胞，能產生寬宿主譜的雙向性病毒顆粒，而不產生可測出的輔助病毒，本發(fā)明選擇骨髓基質細胞(bone marrow stromalcells，bMSCs)具有來源豐富，采集方便，容易在體外培養(yǎng)、誘導、擴增的特點，并具有明確的成骨潛能，是組織工程化骨理想的種子細胞。該細胞在體外培養(yǎng)具有較強的傳代增殖能力，外源目的基因易于導入，因此也是骨缺損基因治療較為理想的靶細胞。應用bMSCs來表達基因有許多優(yōu)點，bMSCs很容易采集并進行組織培養(yǎng)，其自身具有成骨潛能，轉基因分泌的BMP可以對它們起作用。以天然型無機骨(non-organic bone，NNB)等生物材料為支架構建組織工程化骨，NNB為一種新型的多孔羥基磷灰石材料，其天然網孔，符合生理要求，經生物安全性監(jiān)測，該材料符合國際標準化組織ISO的規(guī)定。


圖1是酶切反應，1分子量標記2pLEGFP載體BglII/SalI雙酶切產物3pEGFP-hBMP-4 BglII/SalI雙酶切產物圖2是酶切鑒定，1分子量標記2pLEGFP-hBMP-4BglII/SalI雙酶切產物圖3是LEGFP反轉錄病毒上清感染NIH3T3細胞，有綠色熒光蛋白表達，(熒光顯微鏡下觀察，放大倍數200)圖4是體外培養(yǎng)4天骨髓基質干細胞在無機骨支架表面增殖(掃描電鏡下觀察，放大倍數300)圖5是LEGFP組術后4周(HE染色，放大倍數100)圖6是LEGFP-hBMP-4組術后4周(HE染色，放大倍數100)圖7是hBMP-4基因修飾的組織工程化骨修復犬頜骨缺損的動物模型具體實施方式
現結合具體實驗及其結果分析和相應的說明書附圖，骨形成蛋白4基因的反轉錄病毒載體及其應用進一步詳細說明。本發(fā)明涉及骨組織基因工程技術領域，具體地說及涉及含骨形成蛋白4基因的重組載體，該載體轉化包裝的病毒顆粒以及利用病毒顆粒制備組織工程化骨及其應用。選擇新型的反轉錄病毒表達載體pLEGFP，這是由Moloney小鼠白血病病毒啟動子(MoMuLV)驅動的綠色熒光表達體系，轉染包裝細胞后能夠瞬時或穩(wěn)定表達包裝信號Ψ，插入目的基因及標志基因neo，包裝的子代病毒顆粒以芽生的方式從包裝細胞膜分泌至培養(yǎng)上清，具有感染性，但無復制能力。反轉錄病毒包膜中含有env基因編碼的糖蛋白，許多哺乳動物細胞具有識別這種糖蛋白的受體，兩者結合可介導反轉錄病毒對靶細胞的有效感染。應用pLEGFP反轉錄病毒載體的優(yōu)點是，該空白載體本身含有綠色熒光基因，在實驗中可以作為對照，熒光顯微鏡下可以方便的觀察綠色熒光蛋白的表達。更有利的是，該載體還可以用于細胞的標記和追蹤，這在組織工程研究中判斷細胞的來源以及歸宿有著重要的意義。
PA317細胞是目前較廣泛使用的第2代包裝細胞，能產生寬宿主譜的雙向性病毒顆粒，而不產生可測出的輔助病毒，用它制備的反轉錄病毒可以感染人和其它哺乳動物細胞，是一種廣泛使用、較安全的包裝細胞。本發(fā)明通過亞克隆法，成功構建了pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體，通過PA317細胞的包裝，獲得了LEGFP-hBMP-4和LEGP反轉錄病毒顆粒。熒光顯微鏡下觀察，NIH3T3(取購自中科院生物化學與細胞生物學研究所)細胞轉染LEGFP后，有明顯的綠色熒光表達，表明取得的病毒顆粒有較強的感染能力。裸鼠肌內注射實驗中，LEGFP-hBMP-4實驗組肌肉注射部位，均出現了異位形成的新骨塊，骨塊中央有骨髓形成，而LEGFP對照組肌肉注射部位，均未見新骨，表明建立的LEGFP-hBMP-4反轉錄病毒體系能夠誘導成骨。病毒顆?？赡苁歉腥玖思∪庵械拈g充質細胞，通過hBMP-4自分泌或旁分泌的作用，誘導了新骨形成。研究還發(fā)現，動物在整個觀察期間均未出現炎癥、腫瘤。組織學觀察，在各組肌肉注射部位均未見異型性細胞，無明顯的炎癥細胞浸潤，顯示該載體較為安全。
選擇合適的靶細胞是基因治療成功與否的一個重要因素。靶細胞應易取出和移植，容易在體外培養(yǎng)，外源目的基因能高效導入，具有較長的壽命。本發(fā)明選擇骨髓基質細胞，具有來源豐富，采集方便，容易在體外培養(yǎng)、誘導、擴增的特點，并具有明確的成骨潛能，是組織工程化骨理想的種子細胞。該細胞在體外培養(yǎng)具有較強的傳代增殖能力，外源目的基因易于導入，因此也是骨缺損基因治療較為理想的靶細胞。應用bMSCs來表達基因有許多優(yōu)點，bMSCs很容易采集并進行組織培養(yǎng)，其自身具有成骨潛能，轉基因分泌的BMP可以對它們起作用。應用hBMP-4反轉錄病毒體外轉染兔、羊、豬、狗等bMSCs，然后將基因修飾的細胞與生物支架材料復合(如天然型無機骨NNB，三磷酸鈣TCP、珊瑚、藻酸鈣、PGA、PLGA、膠原等)可以構建組織工程化骨。以NNB為例，它是一種新型的多孔羥基磷灰石材料，其天然網孔，符合生理要求，經生物安全性監(jiān)測，該材料符合國際標準化組織ISO的規(guī)定。材料可以降解吸收，但較珊瑚慢。兔bMSCs在材料內表面貼壁良好，并擴增，說明NNB是bMSCs較為理想的支架材料。應用LEGFP-hBMP-4基因修飾的bMSCs還可以與支架材料復合，構建大塊組織工程化骨，修復大動物如狗的下頜骨的節(jié)段性缺損。綜上，本發(fā)明成功建立了hBMP-4反轉錄病毒體系，獲得了LEGFP-hBMP-4和LEGFP反轉錄病毒，為骨組織工程中BMP-4基因治療以及種子細胞的標記和追蹤提供了工具。本發(fā)明把BMP基因治療與組織工程方法結合起來，以bMSCs作為基因治療的靶細胞，同時應用其作為組織工程化骨的種子細胞，通過基因修飾bMSCs后的自分泌和旁分泌作用，加速成骨。hBMP-4基因修飾的組織工程化骨植入裸鼠體內后，材料網孔內新骨成骨多，提示hBMP-4基因修飾的組織工程化骨，可望成為骨缺損修復理想的替代材料。
實驗方法一、pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體的構建步驟一、hBMP-4全長目的基因的獲得 從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(american type culture collection，ATCC)獲得了克隆有目的基因的λgt10phage(no.40342)。設計PCR引物，在兩個引物的5’端分別接上BamH1和EcoR1酶切位點，并在下游引物中加入了中止密碼子。序列如下，上游引物5’GGGGGATCCATGATTCCTGGTAACCGAATG；下游引物5’GGGGAATTCTCAGCGGCACCCACATCCCT。PCR產物1％的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠純化試劑盒(Gibco)回收純化。
步驟二、T載體克隆并測序 回收純化后的PCR產物在T4DNA連接酶(Promega)的作用下與pGEM T-easy載體(Promega)反應，連接產物轉染大腸桿菌JM109(取購自中科院生物化學與細胞生物學研究所)，接種含X-GAL的氨芐青霉素平板，挑選白色菌落，擴增后提取質粒DNA(華舜)，送DNA測序。
步驟三、pEGFP-hBMP-4質粒的構建 鑒定目的基因序列完全正確的T-hBMP-4克隆質粒用EcoR I(Promega)單酶切，回收1.3kb條帶。pEGFP載體(Invitrogen)應用EcoR I單酶切，回收4.7kb條帶，SAP酶(Promega)去磷酸化。然后在T4DNA連接酶的作用下以單端相連接，產物接種卡那霉素平板，陽性克隆擴增后提取質粒，酶切鑒定方向。
步驟四、pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體的構建 單端連接成功的pEGFP-hBMP-4以BglII/SalI(Promega)雙酶切，回收全長1.4kb的hBMP-4基因。pLEGFP反轉錄病毒載體(Invitrogen)同樣以BglII/SalI雙酶切，回收6.9kb條帶。以T4DNA連接酶連接16℃過夜，轉化JM109感受態(tài)細菌，鋪卡那霉素平板，挑陽性克隆，搖菌，抽提質粒，并進行酶切鑒定。
二、病毒顆粒的包裝及滴度測定步驟一、病毒顆粒的包裝在六孔板中進行，通過預初實驗取得了優(yōu)化的轉染條件。PA317(取購自中科院生物化學與細胞研究所)包裝細胞的接種密度為每孔2×105，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)18～24h，待細胞50～80％匯合時在Lipofectamine(Invitrogen)介導下，分別轉染pLEGFP-hBMP-4及pLEGFP。具體方法如下，在無菌管中配制溶液A質粒1μg，溶于100μl無血清培養(yǎng)液；溶液B8μlLipofectamine(Invitrogen)溶于100μl無血清培養(yǎng)液中?；旌先芤篈和溶液B，室溫放置30min后，加0.8ml無血清培養(yǎng)液。吸盡培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)液洗滌后將質粒-Lipofectamine復合物滴加到細胞表面，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，置換完全培養(yǎng)基。800μg/ml的G418(Sigma)篩選陽性克隆，2周后，每組各挑選6個克隆繼續(xù)擴增培養(yǎng)，至細胞融和，收獲病毒上清，步驟二、進行病毒滴度測定。具體方法為，將病毒上清液梯度稀釋后加入Polybrene至8μg/mL，感染NIH3T3細胞(取購自中科院生物化學與細胞研究所)，然后用含500μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液篩選抗性克隆，病毒滴度＝抗性克隆數×病毒稀釋倍數/病毒上清液體積。篩選高滴度的病毒上清液，抽濾，置-70℃凍存?zhèn)溆谩晒怙@微鏡觀察NIH3T3細胞感染LEGFP對照基因后，綠色熒光蛋白的表達。
三裸鼠肌內成骨試驗取6周齡BALB-C裸小鼠4只，LEGFP-hBMP-4實驗組及LEGFP對照組病毒均以無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到5×104pfu/ml，加入Polybrene(Sigma)至8ug/mL，分別在裸鼠雙側股部肌肉內注射100μl稀釋的病毒液。術后8周取材，40％福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE(蘇木素伊紅)染色，組織學觀察。
四、組織工程化骨的構建第一種方法步驟一、兔bMSCs的培養(yǎng)無菌條件下抽取兔股骨大轉子處骨髓2～4ml，按培養(yǎng)液3×109個/L有核細胞接種，4～6d半量換液，7d換液2次。等細胞融合后首次傳代。培養(yǎng)液為DMEM(GibcoBRL)，含10％胎牛血清(Hyclone)，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉(Sigma)，50mg/L維生素C(Sigma)，2mmol/L谷氨酰胺(Sigma)，108mol/L地塞米松(Sigma)。
步驟二、病毒顆粒轉染在優(yōu)化的轉染條件下應用lipofectamine進行基因轉染。原代細胞傳代至10cm培養(yǎng)皿，等生長至50～70％匯合時，棄培養(yǎng)基，分別加入2ml含8ug/mlPolybrene的培養(yǎng)基，實驗組加入30ulLEGFP-hBMP-4，對準組加入約30ulLEGFP，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6小時后，更換新鮮培養(yǎng)基。
步驟三、組織工程化骨的構建轉染目的基因、對照基因3d后的細胞，以及空白組bMSCs，分別以50×109/L的密度與生物支架材料復合(如天然型無機骨NNB，三磷酸鈣TCP、珊瑚、藻酸鈣、PGA、PLGA、膠原等)。以NNB為例，細胞接種到直徑6mm、厚3mm的圓柱體NNB中。使得材料濕潤，而液體不流出。
步驟四、組織工程化骨體外培養(yǎng)及掃描電鏡檢測制備的組織工程化骨續(xù)在養(yǎng)液中培養(yǎng)，4d后取材，戊二醛固定，臨界點干燥，鍍金后掃描電鏡觀察材料與細胞貼附情況。
步驟五、裸鼠體內植入實驗及組織學檢查制備的組織工程化骨，LEGFP-hBMP-4組、pLEGFP組和bMSCs組每組6例，并取2塊NNB作為空白對照分別植入BALBC裸小鼠皮下。4周取材，30％甲酸脫鈣后，常規(guī)HE染色觀察。
第二種方法步驟一、狗bMSCs的培養(yǎng)無菌條件下抽取兔股骨大轉子處骨髓2～4ml，按培養(yǎng)液3×109個/L有核細胞接種，4～6d半量換液，7d換液2次。等細胞融合后首次傳代。培養(yǎng)液為DMEM(GibcoBRL)，含10％胎牛血清(Hyclone)，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉(Sigma)，50mg/L維生素C(Sigma)，2mmol/L谷氨酰胺(Sigma)，108mol/L地塞米松(Sigma)。
步驟二、病毒顆粒轉染在優(yōu)化的轉染條件下應用lipofectamine進行基因轉染。原代細胞傳代至10cm培養(yǎng)皿，等生長至50～70％匯合時，棄培養(yǎng)基，分別加入2ml含8ug/mlPolybrene的培養(yǎng)基，實驗組加入30ulLEGFP-hBMP-4，對準組加入約30ulLEGFP，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6小時后，更換新鮮培養(yǎng)基。
步驟三、組織工程化骨的構建轉染目的基因、對照基因3d后的細胞，以及空白組bMSCs，分別以50×109/L的密度與2cm×1cm×0.5cm的TCP材料復合。使得材料濕潤，而液體不流出。
步驟四、組織工程化骨體外培養(yǎng)及掃描電鏡檢測制備的組織工程化骨續(xù)在養(yǎng)液中培養(yǎng)，4d后取材，戊二醛固定，臨界點干燥，鍍金后掃描電鏡觀察材料與細胞貼附情況。
步驟五、狗下頜骨缺損修復實驗制備的組織工程化骨，LEGFP-hBMP-4組、pLEGFP組和bMSCs組每組3例，用以修復犬下頜骨的缺損(圖7)。
實驗結果一、成功構建了pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體PCR從λgt10phage載體中拉出1.3kb單一條帶，回收后與T-easy載體連接，通過藍白斑試驗挑選白色陽性克隆，擴增后提取質粒，經3個測序反應，測通全長DNA序列，與Genebank公布的序列(M22490)比對，證實獲得序列完全正確的hBMP-4全長基因。然后把測序確認的1.3kb hBMP-4全長基因用EcoR I單酶切，并插入真核表達載體pEGFP的相應的去磷酸化位點中，通過酶切反應驗證，取得了正向插入的陽性克隆pEGFP-hBMP-4。該質粒進一步擴增后以BglII/SalI雙酶切，回收全長約1.4kb的hBMP-4基因。pLEGFP反轉錄病毒載體也以BglII/SalI雙酶切，回收約6.9kb條帶(圖1)。經雙粘端連接后，酶切鑒定(圖2)，證實獲得了pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體。
二、病毒顆粒的包裝和滴度測定優(yōu)化的條件下以Lipofectamine包裹pLEGFP-hBMP-4及pLEGFP質粒，轉染PA317包裝細胞，經G418篩選2周后，獲得了陽性克隆。兩組分別挑選6個克隆，進一步擴增，收集上清液。通過滴度測定，獲得了較高滴度的病毒上清液，LEGFP-hBMP-4組為3.7×105pfu/ml，LEGFP組為3.9×105pfu/ml，過濾，備用。在熒光顯微鏡下，LEGFP對照組病毒上清感染NIH/3T3細胞后，可見較強的綠色熒光蛋白表達(圖3)，提示獲得的病毒滴度較高。
三、裸鼠體內實驗所有動物在整個觀察期內均未出現炎癥、腫瘤。組織學檢查，LEGFP-hBMP-4實驗組肌肉注射部位，均出現了異位形成的新骨塊，骨塊中央有骨髓形成。而對照組均未見新骨。各標本均未見異型性細胞，無明顯的驗證細胞浸潤。
四、組織工程化骨的構建以第一種方法的兔bMSCs與NNB復合構建組織工程化骨為例，bMSCs可以在NNB支架網孔內表面貼壁生長擴增，呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)(圖4)裸鼠體內實驗實驗動物無1例死亡，皮下植入部位傷口無感染，植入物無排出。各組標本均未見明顯的炎癥反應，HE切片見NNB空白組材料中無新骨形成；bMSCs組或轉染PLEGFP基因組，材料中有部分新骨形成(圖5)；而轉染LEGFP-hBMP-4基因組材料中已大部由新生骨充滿(圖6)。
權利要求
1.pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體，其特征在于1)利用PCR方法獲取hBMP-4基因；2)hBMP-4基因克隆入pEGFP載體3)pEGFP-hBMP-4、pLEGFP反轉錄病毒載體以BglII/SalI(Promega)雙酶切，回收；4)T4DNA連接酶連接，轉化，抽提pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體。
2.如權利要求1所述的pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體，其特征在于上游引物5’GGGGGATCCATGATTCCTGGTAACCGAATG；下游引物5’GGGGAATTCTCAGCGGCACCCACATCCCT。
3.如權利要求1所述的pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體，其特征在于回收6.9kb條帶。
4.pLEGFP-hBMP-4病毒顆粒，其特征在于1)如權利要求1所述的pLEGFP-hBMP-4反轉錄病毒載體與Lipofectamine有效的體積比，2)pLEGFP-hBMP-4-Lipofectamine復合物與PA317包裝細胞混合，培養(yǎng)，收集pLEGFP-hBMP-4病毒顆粒。
5.如權利要求4所述的pLEGFP-hBMP-4病毒顆粒，其特征在于pLEGFP-hBMP-4-Lipofectamine復合物與PA317包裝細胞混合，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h。
6.組織工程化骨，其特征在于1)如權利要求4所述的pLEGFP-hBMP-4病毒顆粒感染體外培養(yǎng)的骨髓基質細胞，2)骨髓基質細胞、生物支架材料構建組織工程化骨。
7.如權利要求6所述的組織工程化骨，其特征在于生物支架材料是多孔羥基磷灰石、三磷酸鈣、珊瑚、藻酸鈣、膠原。
8.如權利要求7所述的組織工程化骨，其特征在于多孔羥基磷灰石是天然型無機骨。
9.如權利要求6所述的組織工程化骨，其特征在于骨髓基質細胞來源兔羊、豬、狗骨髓基質細胞。
10.如權利要求9所述的組織工程化骨，其特征在于骨髓基質細胞來源兔骨髓基質細胞、狗骨髓基質細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨組織基因工程技術領域，具體地說及涉及含骨形成蛋白4基因的重組載體，該載體轉化包裝的病毒顆粒以及利用病毒顆粒制備組織工程化骨及其應用。本發(fā)明選擇pLEGFP作為反轉錄病毒載體，成功構建了pLEGFP－h(huán)BMP－4反轉錄病毒載體，通過PA317細胞的包裝，獲得了LEGFP－h(huán)BMP－4和LEGP反轉錄病毒顆粒，以hBMP－4基因修飾的骨髓基質細胞作為組織工程化骨的種子細胞構建組織工程化骨。
文檔編號A61F2/28GK1664108SQ20041008924
公開日2005年9月7日 申請日期2004年12月8日 優(yōu)先權日2004年12月8日
發(fā)明者蔣欣泉, 張志愿, 陳建國, 常慶, 王麗珍, 潘紅芽, 袁榮濤, 張秀麗, 張瀕 申請人:上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院