嗜熱鏈球菌CRISPR-Cas9系統(tǒng)識(shí)別的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，設(shè)及嗜熱鏈球菌CRISPR-化s9系統(tǒng)識(shí)別的祀序列和 SgRNA及它們的相關(guān)應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 獲得性免疫缺陷綜合征（acquiredimmunodeficien巧syn化ome，AIDS)又稱(chēng)艾滋 病，是一種危害性極大的傳染病。自發(fā)現(xiàn)的Ξ十多年來(lái)，AIDS已累計(jì)導(dǎo)致兩千余萬(wàn)人死亡， 一直是一個(gè)巨大的公眾健康難題，影響著全球3, 530萬(wàn)人的生活。AIDS是由人類(lèi)免疫缺陷 病毒（HumanImmunodeficien巧Vi;rus，HIV)感染引起的，HIV是一種感染人類(lèi)免疫系統(tǒng)細(xì) 胞的慢病毒，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，又稱(chēng)為艾滋病毒。HIV可分為HIV-1和HIV-2兩種亞型， HIV-1的致病力強(qiáng)，是引起艾滋病的主要病原體。
[0003]CD4+T細(xì)胞是HIV-1病毒感染過(guò)程的首要祀點(diǎn)，隨后研究又發(fā)現(xiàn)僅有CD4分子并不 能介導(dǎo)HIV-1病毒的侵入，同時(shí)還需要一種或幾種輔助受體（corec巧tor)。1996年證實(shí)， 趨化因子受體CXCR4和CCR5是HIV-1病毒感染的輔助受體。其中，趨化因子CCR5,作為G 蛋白禪聯(lián)受體（G-proteincoupledrec巧tor,GPCR)超家族的細(xì)胞膜蛋白，是HIV-1入侵 機(jī)體細(xì)胞的主要輔助受體之一。CCR5主要在靜止期記憶性T淋己細(xì)胞、單核細(xì)胞和未成熟 的樹(shù)突狀細(xì)胞的膜上表達(dá)，是HIV-1入侵人體時(shí)重要的輔助受體，它作為HIV-1入侵機(jī)體細(xì) 胞的主要輔助受體之一，在治療艾滋病研究中是一個(gè)重要的藥物祀點(diǎn)。
[0004]目前對(duì)艾滋病的治療手段主要是控制HIV-1病毒的感染W(wǎng)及阻礙AIDS的發(fā)展，稱(chēng) 為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療法（hi曲lyactiveantiretroviraltherapy,HAART)，包括一系 列抑制病毒各個(gè)繁殖階段的化合物。HAART是能很大程度上減少細(xì)胞內(nèi)病毒的繁殖和血漿 病毒血癥的發(fā)生，但對(duì)于新的宿主細(xì)胞不被HIV-1感染沒(méi)有作用。為了從源頭上預(yù)防健康 的細(xì)胞被HIV-1感染，新的治療方案需要徹底地破壞病毒的入侵途徑，因而WCCR5為祀點(diǎn) 的HIV-1受體括抗劑越來(lái)越受關(guān)注，主要有趨化因子衍生物、非膚類(lèi)小分子化合物、單克隆 抗體、膚類(lèi)化合物等。經(jīng)典的CCR5括抗劑抑制R5嗜性的HIV-1感染細(xì)胞的機(jī)制是：它們 與CCR5結(jié)合后，使CCR5構(gòu)象改變，導(dǎo)致CCR5的內(nèi)源化作用（internalization)或者不利 于HIV-1的識(shí)別，阻斷HIV-1與細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致HIV-1與CCR5在細(xì)胞表面的結(jié)合 減少，從而起到抗感染的作用。但不幸的是長(zhǎng)期使用一種抑制劑，最終會(huì)使HIV-1產(chǎn)生耐 藥性，隨著耐藥性的不斷出現(xiàn)，使得現(xiàn)有的抗HIV-1藥物難W達(dá)到理想的治療效果。同時(shí)， CCR5括抗劑還存在如下缺點(diǎn)，例如，天然趨化因子的半衰期短和存在潛在的誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答 作用；非膚類(lèi)小分子化合物不能下調(diào)受體表達(dá)；膚類(lèi)化合物不穩(wěn)定、易降解；單克隆抗體存 在人體對(duì)藥物的不適應(yīng)性、潛在的過(guò)敏反應(yīng)等缺點(diǎn)。
[0005] 近年來(lái)，隨著祀向基因編輯技術(shù)的一步步突破，從ZFN(zincfingernuclease) 到后來(lái)的TALEN(transcription曰ctiv曰tor-likeeffectornuclease)W及最新的 CRISPR-化s9技術(shù)，為艾滋病的徹底治愈提供了新的希望。研究表明帶有CCR5編碼基因32 個(gè)核巧酸缺失的實(shí)驗(yàn)者接觸HIV但未檢測(cè)到HIV感染，表明了CCR5影響HIV病毒入侵細(xì)胞， 說(shuō)明CCR5基因是一個(gè)可靠、高效和安全的治療HIV的祀點(diǎn)，因此能夠?qū)崿F(xiàn)CCR5在基因組層 面上的敲除也是可靠、高效和安全的治療HIV的方法。2008年，Sangamo成功地利用ZFNs 在CD4+T細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)CCR5的敲除，然而ZFN祀向敲除CCR5的效率較低，人們期待找到更高 效的CCR5的敲除策略。
[0006]規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)blusteredregularlyinterspacedshort palin化omicr巧eat,CRISPR-associated，CRISPR-化s9)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性 的復(fù)合體，是細(xì)菌和古細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種免疫防御體系，用W對(duì)抗外來(lái)病毒 和外源DNA入侵。CRISPR-cas9系統(tǒng)通過(guò)整合外源DNA片段到CRISPR中，利用CRISPR RNA(CRISPR-derivedRNA，crRNA)和反式作用RNA(trans-activatingRNA，tracrRNA)特 異性地識(shí)別祀向序列，并對(duì)序列祀位點(diǎn)進(jìn)行切割。在沒(méi)有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末 端連接（Non-homologousendjoining，畑EJ)，畑EJ修復(fù)的過(guò)程中往往會(huì)產(chǎn)生DNA的插入 或缺失（indel)，造成移碼突變，導(dǎo)致基因敲除?；蛘呤窃谟型茨０宓那闆r下，可通過(guò)另一 條同源重組化omologousrecombination,HR)的修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)祀向基因的 精確編輯，如引入特異突變或定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因。現(xiàn)在已經(jīng)把兩種小RNA(crRNA和tracrRNA)融 合成一條RNA鏈，簡(jiǎn)稱(chēng)sgRNA(singleguideRNA)，因此，能夠設(shè)計(jì)、制備出精確性和特異性 祀向目標(biāo)基因的sgRNA成為CRISPR-化s9基因敲除的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種嗜熱鏈球菌CRISPR-化s9系統(tǒng)識(shí) 另IJ的祀序列W及精確特異地祀向人CCR5基因的SgRNA和它們的有關(guān)應(yīng)用。
[000引因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種CRISPR-化s9系統(tǒng)識(shí)別的 祀序列，所述祀序列如SEQIDNO: 1-88中任意一個(gè)的第n-20位所示且η= 1-5。
[0009] 第二方面，本發(fā)明提供了一種SgRNA,該SgRNA的序列為：5'-識(shí)別序列-招募化s9 蛋白的序列-3'，其中，所述識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的DM序列如SEQIDN0:l-88中任意一個(gè)的第 n-20位所示且η= 1-5。
[0010] 第Ξ方面，本發(fā)明提供了編碼第二方面所述的SgRNA的DM分子。
[0011] 第四方面，本發(fā)明提供了一種CRISPR-Cas9系統(tǒng)，該CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括Cas9 蛋白（StlCas9)和SgRNA、和/或包括攜帶有化s9蛋白的編碼序列和SgRNA的編碼序列 的載體，所述Cas9蛋白的編碼序列和SgRNA的編碼序列位于相同或不同的載體上，其中， 所述SgRNA為第二方面所述的SgRNA且所述化s9蛋白源自嗜熱鏈球菌（Str巧tococ州S thermophilus)。
[0012] 第五方面，本發(fā)明提供了一種編輯CCR5基因的方法，該方法包括：將第四方面所 述的CRISPR-Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入表達(dá)CCR5的細(xì)胞中。
[0013] 第六方面，本發(fā)明提供了第四方面所述的CRISPR-化s9系統(tǒng)在制備用于預(yù)防和/ 或治療HIV感染的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 第屯方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防和/或治療HIV感染的方法，該方法包括將第四 方面所述的CRISPR-化s9系統(tǒng)導(dǎo)入表達(dá)CCR5的細(xì)胞中。
[0015] 本發(fā)明可W實(shí)現(xiàn)人CCR5基因的編輯，進(jìn)而改變CCR5的序列，尤其是和HIV表面蛋 白結(jié)合的序列，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法被HIV感染，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防和/或治療艾滋病的目的。
[0016] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0018] 圖1為表達(dá)sgRNA的重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0019] 圖2為表達(dá)StlCas9的重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020] 圖3為同時(shí)表達(dá)SgRNA和Stl化s9的重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021] 圖4為根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式對(duì)肥K293T細(xì)胞的CCR5基因進(jìn)行敲除后的測(cè) 序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022] W下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[002引在本發(fā)明中，在未做相反說(shuō)明的情況下，使用的術(shù)語(yǔ)"基因敲除"或"基因編輯"是 指對(duì)生物的基因組DNA進(jìn)行刪除、插入或者替換，從而達(dá)到對(duì)目的序列修改的目的；本發(fā) 明設(shè)及的SgRNA和CRISPR-(^is9系統(tǒng)均為人工改造而成的（engineering,non-naturally occurring)。
[0024] 在第一方面中，本發(fā)明提供的CRISPR-化s9系統(tǒng)識(shí)別的祀序列如SEQIDNO: 1-88 中任意一個(gè)的第n-20位所示且η= 1-5 (整數(shù)，1、2、3、4或5)。
[0025] 在第二方面中，本發(fā)明提供的SgRNA的序列為：5' -識(shí)別序列-招募化s9蛋白的 序列-3'，其特征在于，所述識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQID NO:1-88中任意一個(gè)的第 n-20位所示且n= 1-5(整數(shù)，1、2、3、4或5)。其中，表示多核巧酸元件（識(shí)別序列和 招募化s9蛋白的序列）W有功能的方式連接，互不干設(shè)表達(dá)或性能，被連接的多核巧酸序 列是連續(xù)的。
[0026] 所述招募化s9蛋白的序列為能夠招募化s9蛋白的序列，即結(jié)合化s9蛋白并使其 活化而能夠切割目標(biāo)基因的序列，通常具有特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)）。優(yōu)選地，所述 招募化s9蛋白的序列如SEQIDNO:89所示。
[0027]所述化s9蛋白可W來(lái)源于嗜熱鏈球菌僅thermo地ilus)，如在化iProt中 的化tryName為CAS9_STRTR的蛋白。化s9蛋白的氨基酸序列也可參見(jiàn)NCBI中 WP_011680957. 1、WP_023909534. 1、WP_024704047. 1、EWM59572. 1、WP_014621379. 1、 WP_014608134. 1或ETW90462. 1等。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列如沈QIDN0:99所示。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQ ID NO: 1 所示且招募化s9蛋白的序列如SEQ ID NO:89所示。該優(yōu)選的SgRNA能夠更有效地編輯 (敲除）CCR5基因。
[0029] 在第Ξ方面中，本發(fā)明提供了編碼第二方面所述的SgRNA的DNA分子。
[0030]CRISPR-Cas9 系統(tǒng)可W由tracrRNA、crRNA和Cas9 蛋白構(gòu)成，例如，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)可W包括化s9蛋白、tracrRNA(如序列為沈QIDN0:90的RNA)和crRNA(如序列為 SEQIDN0:91的RNA)、和/或包括攜帶有化s9蛋白的編碼序列、tracrRNA的編碼序列和crRNA的編碼序列的載體，所述化s9蛋白的編碼序列、tracrRNA的編碼序列和crRNA的編 碼序列分別位于相同或不同的載體上。而在第四方面中，本發(fā)明提供的CRISPR-Cas9系統(tǒng) 包括化s9蛋白和sgRNA、和/或包括攜帶有化s9蛋白的編碼序列和sgRNA的編碼序列的載 體，所述化s9蛋白的編碼序列和sgRNA的編碼序列位于相同或不同的載體上，所述sgRNA 為第二方面所述的sgRNA且所述化s9蛋白源自嗜熱鏈球菌。
[0031] 所述載體為能夠傳遞所攜帶的核酸（編碼序列）的核酸分子。所述載體可W為質(zhì) 粒、λ隧菌體、柯氏質(zhì)粒、YAC載體等。在特定的實(shí)施方式中，所述載體為真核表達(dá)載體，如 pcDNASo
[0032] 攜帶有sgRNA的編碼序列的載體的結(jié)構(gòu)可W如圖1所示。攜帶有化s9蛋白的編 碼序列的載體的結(jié)構(gòu)可W如圖2所示。同時(shí)攜帶有Cas9蛋白的編碼序列和sgRNA的編碼 序列的載體的結(jié)構(gòu)可W如圖3所示。
[0033] 如上所述，所述化s9蛋白