專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)合成白樺脂酸的方法。
背景技術(shù)：
：白樺脂醇(betulin,lup-20(29)-ene-3卩，28-diol)和白樺脂酸(betulinicacid，3(3-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oicacid)屬羽扇烷型三萜類(lèi)化合物，在自然界中廣泛存在，其最豐富的自然資源是白樺樹(shù)(&,w/"印;.)。近年科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇和白樺脂酸是非常有價(jià)值的天然產(chǎn)物。白樺脂醇、白樺脂酸及其衍生物作為生物制劑在抗艾滋病(HIV)和癌癥治療等方面表現(xiàn)出了巨大的潛能，并顯示出了與以往藥物不同的作用機(jī)制。因此，對(duì)白樺脂醇和白樺脂酸及其衍生物的研究已成為近年來(lái)天然有機(jī)藥物研究的熱點(diǎn)。尤其是白樺脂酸，具有寬范圍的生物學(xué)以及藥理學(xué)活性，具有抗癡性、抗炎性和抗腫瘤活性，尤其在抗艾滋病活性及抗各種腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞毒性方面可與一些臨床用藥相比，已被視為最有潛力的新型藥物制劑。在我國(guó)，白樺分布范圍廣，植物資源豐富，但研究開(kāi)發(fā)甚少。研究我國(guó)白樺資源，對(duì)于我國(guó)資源的開(kāi)發(fā)、天然藥物的研究都具有非常重要的意義。生物轉(zhuǎn)化是利用植物離體細(xì)胞或器官、動(dòng)物細(xì)胞、微生物及其細(xì)胞器，以及游離酶對(duì)外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)》務(wù)飾的生化反應(yīng)。一方面天然產(chǎn)物一直是人類(lèi)尋找有效活性成分的源泉；另一方面在開(kāi)發(fā)新藥過(guò)程中，以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物，通過(guò)化學(xué)或生物的手段，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行^務(wù)飾，得到更多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)毒性更低、療效更好的藥物。微生物作為一個(gè)完整個(gè)體，其體積雖小，但也具有一套自身特異性的酶體系。同時(shí)由于微生物資源豐富，種類(lèi)繁多，對(duì)于特異的底物，可供篩選的菌4朱《艮多。以多種不同催化功能的酶系對(duì)天然活性成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，可產(chǎn)生新的組合性的天然化合物庫(kù)，再通過(guò)活性篩選，可尋找新的高效低毒的天然活性先導(dǎo)化合物，或通過(guò)對(duì)活性組分中不同成分結(jié)構(gòu)變化與活性強(qiáng)度消長(zhǎng)關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)關(guān)^T建活性成分。而利用微生物轉(zhuǎn)化可以發(fā)現(xiàn)新一代的先導(dǎo)化合物，已取得了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。生物轉(zhuǎn)化規(guī)律還可以指導(dǎo)新藥的結(jié)構(gòu)修飾，獲得高效長(zhǎng)效的新一代藥物，足以說(shuō)明生物轉(zhuǎn)化對(duì)新藥開(kāi)發(fā)的重要性。微生物轉(zhuǎn)化是通過(guò)微生物整體細(xì)胞或酶將復(fù)雜的底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的某個(gè)或某一系列的酶對(duì)底物進(jìn)行催化反應(yīng)，是近年來(lái)新興起的獲得目標(biāo)產(chǎn)物的又一途徑。；徵生物轉(zhuǎn)化具有許多優(yōu)點(diǎn)，譬如，微生物倍增時(shí)間短，生物量積累快，從而產(chǎn)生的酶量就相應(yīng)較多，轉(zhuǎn)化時(shí)間短；微生物的基因工程研究工作成熟，轉(zhuǎn)化酶的高效表達(dá)成為可能；微生物發(fā)酵工藝成熟，便于工業(yè)化生產(chǎn)。隨著現(xiàn)代提取、分離、鑒定手段的進(jìn)步，使微生物技術(shù)的應(yīng)用不再局限于傳統(tǒng)釀造及小分子化合物的轉(zhuǎn)化，正廣泛地應(yīng)用于藥物前提化合物的轉(zhuǎn)化、生物催化的不對(duì)稱(chēng)合成、光學(xué)活性化合物的拆分、新藥開(kāi)發(fā)、藥物代謝體外模型預(yù)測(cè)等領(lǐng)域，已成為生物轉(zhuǎn)化技術(shù)中發(fā)展最為迅速的分支之一。微生物作為一個(gè)完整的生命體，其體積雖小，但也具有一套自身特異性的酶體系。在它生長(zhǎng)過(guò)程中有許多酶的參與，如合成酶、水解酶、異構(gòu)酶、氧化酶、還原酶等，它們都可能對(duì)加入其中的底物發(fā)生作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同時(shí)由于微生物資源豐富，種類(lèi)繁多，對(duì)于特異的底物可供篩選的菌抹很多。利用微生物還可以模仿生源合成途徑，合成貴重藥品或者其它化學(xué)合成前提，提高原料利用率，有效延緩資源消耗。如，美國(guó)施貴寶公司利用微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行紫杉醇的合成，他們分別從A^caniz'c^esa/6wSC13911,A^carafc/cfe/wtewSC13912,Morace〃a平三種微生物的發(fā)酵液中分離出C-13taxolas,C-7xylosidase，C-10deacetylase,分別將紅豆杉中的幾種紫杉烷的7、10、13位進(jìn)行水解，得到較多而單一的10-去乙酰-BaccatinII,該產(chǎn)物為紫杉醇合成的重要前體化合物，再利用化學(xué)反應(yīng)，連接上13位的側(cè)鏈，即可得到紫杉醇。白樺脂酸在實(shí)際生產(chǎn)中的來(lái)源主要有兩類(lèi)一類(lèi)是從天然植物中提取的；另一類(lèi)是化學(xué)合成的。白樺脂酸廣泛分布于多種植物中，如五加科(刺五加)、樺木科(白樺外皮)、鼠李科(酸棗仁)、柿科(白黑柿葉)等。因此，早期的白樺脂酸提取大多采用直接提取法。然而，白樺脂酸在植物中的含量很少，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在白樺樹(shù)皮中也僅含有0.025%。用直接提取法原料消耗量大，成本高，所得到的白樺脂酸雜質(zhì)含量比較高，且不易除去，無(wú)法滿(mǎn)足商業(yè)需要。目前，以白樺脂醇為前體，經(jīng)過(guò)化學(xué)合成法制備白樺脂酸較多地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，雖然合成效果較好，但存在操作復(fù)雜、污染大、合成成本高、安全性低等問(wèn)題，限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。微生物轉(zhuǎn)化法合成白樺脂酸目前研究甚少，但其具有轉(zhuǎn)化條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、不良反應(yīng)少、安全性高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，可預(yù)見(jiàn)其將會(huì)有非常好的研究前景。有關(guān)白樺脂酸的生物法合成目前研究甚少，國(guó)外僅有一些關(guān)于白樺脂酸及其衍生物的微生物轉(zhuǎn)化研究，而國(guó)內(nèi)研究則幾乎空白。Denise等對(duì)白樺脂酸和白樺脂酮酸進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化研究。在研究中，兩種化合物分別經(jīng)過(guò)來(lái)自懸鈴木樹(shù)皮的線蟲(chóng)捕捉菌、腔胞菌、暗色孢屬，和來(lái)自玉米葉片的刺盤(pán)孢四種微生物代謝轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物經(jīng)過(guò)特征表征，確定分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示不同菌林生物轉(zhuǎn)化白樺脂酸或白樺脂酮酸得到不同的衍生物，且都是白樺脂酸或白樺脂酮酸的氧化產(chǎn)物。這表明這些真菌有利于羽扇烷型結(jié)構(gòu)物質(zhì)在C-3，C-7,C-15,C-25和C-30位置有選擇的氧化。另外，Parnali等研究了^"7/mATCC13368菌種生物轉(zhuǎn)化白樺脂酸得到4種相關(guān)衍生物。根據(jù)國(guó)外相關(guān)研究不難看出，通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化，白樺脂酸能被成功氧化為多種衍生物，并且微生物種類(lèi)不同可以氧化白樺脂酸得到不同的衍生物。為此，如果篩選出合適的菌株能有利于白樺脂醇相6應(yīng)碳位的氧化，實(shí)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化合成白樺脂酸，并能建立合適的轉(zhuǎn)化體系和方法，再利用發(fā)酵便可以獲得大量白樺脂酸，這將為進(jìn)一步研究白樺脂酸及其衍生物的藥理作用、臨床實(shí)驗(yàn)，以及白樺脂酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定良好基礎(chǔ)，具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際開(kāi)發(fā)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，利用黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH將白樺脂醇生物轉(zhuǎn)化成白樺脂酸，該方法操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、安全性高、成本低。本發(fā)明所4吏用的黃鄉(xiāng)錄蜜環(huán)菌(」nw7/^7'"/wteo-w>^wSacc.)ZJUQHCGMCCNo1884，在申請(qǐng)?zhí)枮?00610155189.7的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)中詳細(xì)描述了其獲取、培養(yǎng)方法和形態(tài)，并發(fā)現(xiàn)其能在特定培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件下分泌多糖。該菌抹已經(jīng)保藏，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2006年12月08日，保藏號(hào)CGMCCNol884。一種微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括(1)向培養(yǎng)液中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH,得到預(yù)反應(yīng)體系；(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入白樺脂醇溶液，于25~30。C(優(yōu)選28°C)轉(zhuǎn)化反應(yīng)5~7天(優(yōu)選6天)得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，白樺脂醇用量以每升培養(yǎng)液計(jì)為0.01~0.1g(優(yōu)選0.05g);(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。本發(fā)明方法步驟(l)中，為得到預(yù)反應(yīng)體系可采用直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法、靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法或微乳液體系轉(zhuǎn)化法。采用直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法時(shí)所述的培養(yǎng)液選用馬鈴薯葡萄糖液體(即馬鈴薯培養(yǎng)基)，其原料質(zhì)量百分比組成為馬鈴薯20%,葡萄糖2%，余量為水。所述的黃綠密環(huán)菌ZJUQH選用黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液，懸浮液中黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子濃度為1x106個(gè)/毫升~1x108個(gè)/毫升。馬鈴薯葡萄糖液體與黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為6~30。所述的黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液是將馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)的黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH菌抹刮入無(wú)菌水后振搖制得的。所述的預(yù)反應(yīng)體系是在馬鈴薯培養(yǎng)基中接入黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液后于253(TC(優(yōu)選28。C)培養(yǎng)1~3天(優(yōu)選3天)得到的。采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法時(shí)所述的培養(yǎng)液選用含有葡萄糖的磷酸緩沖液(pH6)，其中葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%;所述的黃綠密環(huán)菌ZJUQH選用黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞；其中培養(yǎng)液的毫升數(shù)黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的克數(shù)=5~6。采用微乳液體系轉(zhuǎn)化法時(shí)所述的培養(yǎng)液為葡萄糖水溶液，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%，自然pH;所述的黃綠密環(huán)菌ZJUQH選用黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞；其中培養(yǎng)液的毫升數(shù)黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的克數(shù)=5~6。本發(fā)明方法所述的黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞，可通過(guò)如下方法制備將活化的黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基一般選用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)，于28。C、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中培養(yǎng)3天后停止發(fā)酵，通過(guò)冷凍離心或無(wú)菌過(guò)濾方法除去發(fā)酵液，得到黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞。本發(fā)明方法步驟(2)中的白樺脂醇溶液為白樺脂醇的二甲基亞砜溶液，即該溶液的溶劑為二甲基亞砜。白樺脂醇溶液中白樺脂醇的濃度為7.5mg/ml，白樺脂醇用量以每升培養(yǎng)液計(jì)為0.05g，選擇該添加濃度是為了保證所加的有機(jī)溶劑二曱基亞砜和白樺脂醇對(duì)水相培養(yǎng)液中的菌體細(xì)胞無(wú)負(fù)面影響。白樺脂醇溶液中的白樺脂醇一般可采用市售商品，白樺脂醇的純度為880%~95%,優(yōu)選純度為90%的白樺脂醇。因?yàn)楣I(yè)化生產(chǎn)中，多以白樺樹(shù)皮中提取的白樺脂醇為底物制取白樺脂酸，而一般從白樺樹(shù)皮中提取白樺脂醇并經(jīng)過(guò)初步純化，可以得到純度90%左右的白樺脂醇提取物，申請(qǐng)?zhí)枮?00810063260.8的中國(guó)申請(qǐng)專(zhuān)利已公開(kāi)了純度90%左右的白樺脂醇提取物的制備方法。采用純度為90%的白樺脂醇作為微生物轉(zhuǎn)化底物對(duì)研究白樺脂酸的合成更有現(xiàn)實(shí)意義，可以降低生產(chǎn)成本和綜合利用資源。另外，步驟(l)中采用微乳液體系轉(zhuǎn)化法時(shí)，在隨后加入白樺脂醇溶液時(shí)，白樺脂醇溶液中還可以添加無(wú)水乙醇和吐溫80。由于白樺脂醇不溶于水，底物中添加無(wú)水乙醇和吐溫80,形成的微乳化體系更有利于白樺脂醇在水相培養(yǎng)液中的分散和溶解，提高微生物細(xì)胞和底物接觸轉(zhuǎn)化的可能。按體積比無(wú)水乙醇吐溫80:白樺脂醇的二曱基亞砜溶液=8:l:2.25。本發(fā)明方法步驟(3)中的后處理包括將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理得到上清液，調(diào)節(jié)至pH3~4，用乙酸乙酯萃取后得到萃取液，經(jīng)濃縮得到白樺脂酸，得到的白樺脂酸可以根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行提純。調(diào)節(jié)pH值時(shí)可采用通用的酸、堿，如氫氧化鈉、鹽酸等。本發(fā)明中白樺脂醇、白樺脂酸含量檢測(cè)方法取10ml上清液，調(diào)節(jié)至pH34,用等量的乙酸乙酯萃取2~3次，合并有機(jī)層(即萃取液)，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用曱醇定容于10ml容量瓶，用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測(cè)所得物中白樺脂醇、白樺脂酸的含量。RP-HPLC色譜條件色譜柱為DiamonsilC18(250mmx4.6mm,5jum);流動(dòng)相為乙腈/水(體積比)=91/9;流速1.0ml/min;4企測(cè)波長(zhǎng)210.1nm;柱溫25。C;進(jìn)樣量10m1;跑樣時(shí)間30~45min。RP-HPLC主要步驟準(zhǔn)確稱(chēng)取2mg白樺脂酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100ml容量瓶中，用曱醇溶解定容，制成0.02mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次準(zhǔn)確取5ml，lml上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于lOmL容量瓶中，用曱醇稀釋定容，與儲(chǔ)備液共同形成濃度分別為0.002mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取配制好的白樺脂酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各lml,分別于離心管中離心5min,取150jLU上清液于潔凈千燥的進(jìn)樣瓶中。進(jìn)樣，在色譜^r測(cè)條件下測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積值(A)，以峰面積值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，白樺脂酸濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理求得白樺脂酸的線性回歸方程為y=4E+06x+3383.5403(R2=0.9975)。相同色譜條件下，按照同樣方法可得白樺脂醇的線性回歸方程為y=4E+06x-602.7339(=0.9999)。本發(fā)明方法白樺脂醇轉(zhuǎn)化率高，能有效合成白樺脂酸，與現(xiàn)有的化學(xué)合成法或從植物中直接提取白樺脂酸的方法相比，具有微生物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、易于控制，整個(gè)生物轉(zhuǎn)化周期較短，轉(zhuǎn)化過(guò)程安全可靠，成本低的特點(diǎn)，適于工業(yè)化生產(chǎn)；為生物轉(zhuǎn)化合成白樺脂酸的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)前提，同時(shí)為解決白樺脂酸工業(yè)化生產(chǎn)難題提供新思路圖1為本發(fā)明方法的流程示意圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1采用直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸(1)向滅菌過(guò)的馬鈴薯葡萄糖液體中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液，于28。C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中培養(yǎng)3天得到預(yù)反應(yīng)體系；其中馬鈴薯葡萄糖液體與黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為30,黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液中孢子濃度為1x106個(gè)/毫升；(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入白樺脂醇溶液(其中白樺脂醇濃度為7.5mg/ml)，于28°C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中轉(zhuǎn)化反應(yīng)6天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，白樺脂醇用量以每升馬鈴薯葡萄糖液體計(jì)為0.05g;(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。10對(duì)比例1~5將實(shí)施例1中的黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液分別用青海黑曲霉ZJU、康氏木霉、黑曲霉、白樺降解菌、米曲霉替代，其余步驟相同，將白樺脂醇轉(zhuǎn)化成白樺脂酸。對(duì)實(shí)施例1、對(duì)比例1~5中得到的白樺脂酸及對(duì)照組(未經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化)中的白樺脂酸進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1:表l不同菌抹轉(zhuǎn)化能力測(cè)定與比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表1中可見(jiàn)，黃綠密環(huán)菌、黑曲霉和米曲霉這三抹菌抹生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸的能力相對(duì)較強(qiáng)。分別對(duì)實(shí)施例1、對(duì)比例3和對(duì)比例5中得到的白樺脂酸的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果見(jiàn)表2:表2三種菌抹轉(zhuǎn)化能力測(cè)定與比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表2可看出，本發(fā)明釆用黃綠密環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸，白樺脂酸產(chǎn)率有很大的提高。實(shí)施例2采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸(1)向滅菌過(guò)的含葡萄糖的磷酸緩沖液(pH為6,其中葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%)中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞，得到預(yù)反應(yīng)體系；其中磷酸緩沖液的毫升數(shù)與黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的克數(shù)之比為5;(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入白樺脂醇溶液(其中白樺脂醇的濃度為7.5mg/ml)，于28。C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中轉(zhuǎn)化反應(yīng)6天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，白樺脂醇用量以每升培養(yǎng)液計(jì)為0.05g;(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。實(shí)施例3采用微乳液體系轉(zhuǎn)化法生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸(1)向滅菌過(guò)的葡萄糖水溶液(葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%)中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞，得到預(yù)反應(yīng)體系；其中葡萄糖水溶液的毫升數(shù)與黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的克數(shù)之比為5;(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入含有無(wú)水乙醇和吐溫80的白樺脂醇溶液(以體積比計(jì)，無(wú)水乙醇吐溫80:白樺脂醇的二曱基亞砜溶液=8:1:2.25，白樺脂醇的二曱基亞砜溶液中白樺脂醇濃度為7.5mg/ml)，于28°C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中轉(zhuǎn)化反應(yīng)6天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，白樺脂醇用量以每升培養(yǎng)液計(jì)為0.05g;(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。針對(duì)不同轉(zhuǎn)化體系下黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH生物合成白樺脂酸的效果對(duì)比比較實(shí)施例1~3中黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH生物合成白樺脂酸的能力，結(jié)果見(jiàn)表3:表3不同轉(zhuǎn)化體系下黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH生物合成白樺脂酸的能力序號(hào)轉(zhuǎn)化體系白樺脂醇轉(zhuǎn)化率(％)白樺脂酸產(chǎn)率(％)實(shí)施例1直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法93.9327.21實(shí)施例2靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法96.4910.00實(shí)施例3微乳液體系轉(zhuǎn)化法89.1514,84從表3中可看出，采用直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法合成白樺脂酸的能力最強(qiáng)，白樺脂酸的產(chǎn)率可達(dá)到27.21°/。，采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法、微乳液體系轉(zhuǎn)化法合成白樺脂酸的能力相對(duì)較弱，但白樺脂酸的產(chǎn)率也可達(dá)到10~15%。實(shí)施例4(1)向滅菌過(guò)的馬鈴薯葡萄糖液體中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液，于25。C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中培養(yǎng)2天得到預(yù)反應(yīng)體系；其中馬鈴薯葡萄糖液體與黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為15，黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液中孢子濃度為1x107個(gè)/毫升；(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入白樺脂醇溶液(其中白樺脂醇的濃度為7.5mg/ml)，于25。C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中轉(zhuǎn)化反應(yīng)7天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，白樺脂醇用量以每升馬鈴薯葡萄糖液體計(jì)為0.1g;(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。實(shí)施例5(1)向滅菌過(guò)的馬鈴薯葡萄糖液體中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液，于30°C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中培養(yǎng)1天得到預(yù)反應(yīng)體系；其中馬鈴薯葡萄糖液體與黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為6，黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液中孢子濃度為1x108個(gè)/毫升；(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入白樺脂醇溶液(其中白樺脂醇的濃度為7.5mg/ml)，于3(TC、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中轉(zhuǎn)化反應(yīng)5天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，白樺脂醇用量以每升馬鈴薯葡萄糖液體計(jì)為0.0113g;(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。實(shí)施例6(1)向滅菌過(guò)的馬鈴薯葡萄糖液體中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液，于28。C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中培養(yǎng)3天得到預(yù)反應(yīng)體系；其中馬鈴薯葡萄糖液體與黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為10，黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液中孢子濃度為1x107個(gè)/毫升；(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入白樺脂醇溶液(其中白樺脂醇濃度為7.5mg/ml)，于28°C、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中轉(zhuǎn)化反應(yīng)6天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，白樺脂醇用量以每升馬鈴薯葡萄糖液體計(jì)為0.06g;(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。分別對(duì)實(shí)施例4~6中得到的白樺脂酸進(jìn)行檢測(cè)，分析結(jié)果見(jiàn)表4:表4不同轉(zhuǎn)化條件黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH生物合成白樺脂酸的能力序號(hào)轉(zhuǎn)化體系白樺脂醇轉(zhuǎn)化率(％)白樺脂酸產(chǎn)率(％)實(shí)施例4直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法92.1527.63實(shí)施例5直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法93.5827.04實(shí)施例6直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法94.3028.19本發(fā)明實(shí)施例中采用的菌種均是首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的20多抹菌種(包括細(xì)菌、霉菌、酵母)進(jìn)行生長(zhǎng)情況觀察后，發(fā)現(xiàn)在含有白樺脂醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，霉菌生長(zhǎng)普遍較好，而細(xì)菌和酵母幾乎不能生長(zhǎng)。因此，初步選取的6~8抹菌林為青海黑曲霉ZJU、黑曲霉、康氏木霉、米曲霉、黃綠密環(huán)菌、白樺降解菌等，再對(duì)初步篩選出的6-8抹菌抹進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，選出適合的菌種。1權(quán)利要求1、一種微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括(1)向培養(yǎng)液中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH，得到預(yù)反應(yīng)體系；(2)向步驟(1)得到的預(yù)反應(yīng)體系中加入白樺脂醇溶液，于25～30℃轉(zhuǎn)化反應(yīng)5～7天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液；其中白樺脂醇用量以每升培養(yǎng)液計(jì)為0.01～0.1g；(3)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度優(yōu)選28。C;所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選6天；所述的白樺脂醇溶液為白樺脂醇的二曱基亞砜溶液，白樺脂醇溶液中的白樺脂醇的濃度為7.5mg/ml;白樺脂醇用量以每升培養(yǎng)液計(jì)為0.05g。3、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的培養(yǎng)液為馬鈴薯葡萄糖液體；所述的黃綠密環(huán)菌ZJUQH為黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液，培養(yǎng)液與黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為6~30;接入菌種后于25~30。C培養(yǎng)1~3天得到預(yù)反應(yīng)體系。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液中黃綠密環(huán)菌ZJUQH孢子濃度為1x106個(gè)/毫升~1x108個(gè)/毫升；接入菌種后于28。C培養(yǎng)3天得到預(yù)反應(yīng)體系。5、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的培養(yǎng)液為含有葡萄糖的磷酸緩沖液，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%,該緩沖液的pH為6;所述黃綠密環(huán)菌ZJUQH為黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞，其中培養(yǎng)液的毫升數(shù)黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的克數(shù)=5~6。6、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的培養(yǎng)液為葡萄糖水溶液，葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為2%,自然pH;所述黃綠密環(huán)菌ZJUQH為黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞，其中培養(yǎng)液的毫升數(shù)黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的克數(shù)=5~6。7、如權(quán)利要求1、2或6所述的方法，其特征在于.'步驟(2)所述的白樺脂醇溶液中添加有無(wú)水乙醇和吐溫80,各物質(zhì)體積比為無(wú)水乙醇吐溫80:白樺脂醇溶液=8:i:2.25。8、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中后處理包括將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理得到上清液，調(diào)節(jié)至pH3~4,用乙酸乙酯萃取后得到萃取液，經(jīng)濃縮得到白樺脂酸。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括向滅菌過(guò)的培養(yǎng)液中接入黃綠密環(huán)菌ZJUQH，得到預(yù)反應(yīng)體系；再加入含有白樺脂醇的底物溶液，于25～30℃轉(zhuǎn)化反應(yīng)5～7天得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，經(jīng)后處理得到白樺脂酸，其中白樺脂醇用量以每升培養(yǎng)液計(jì)為0.01～0.1g。該方法與直接植物提取白樺脂酸法和化學(xué)合成白樺脂酸法相比，主要優(yōu)點(diǎn)是微生物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、易于控制，整個(gè)生物轉(zhuǎn)化周期較短，轉(zhuǎn)化過(guò)程安全可靠，成本低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12P33/00GK101457250SQ200810163820公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2008年12月25日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者何國(guó)慶,傅明亮,婧劉,章海鋒,陳啟和申請(qǐng)人:浙江大學(xué)