專利名稱:布雷正青霉變種zjb082702及其發(fā)酵制備布雷菲德菌素a的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明提供了一林布雷菲德菌素A高產(chǎn)菌株——布雷正青霉 (五w;^"/c/肌w,m 6 /e/(i/"m^)變種ZJB082702,及其在發(fā)酵制備布雷菲 德菌素A中的應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù):
布雷菲德菌素A(BrefeldinA)是一種天然存在的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素, 化學(xué)名[(1R,2E,6S,10E,llas,14aR)扁l,6,7,8,9,lla,12,13,14,14a-Decahydro-1 , 13-dihydroxy-6隱methyl-4H-cyclopent[幻oxacyclotridecin-4-one], 分子式為 C16H2404,分子量為280,結(jié)構(gòu)式如下
1958年,首次報道從尸ew/c/〃/ww cfec"m^ra發(fā)酵液中分離得到布雷 菲德菌素A (Singleton等,1958 )。早期研究發(fā)現(xiàn),布雷菲德菌素A抑 制蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體復(fù)合物轉(zhuǎn)運過程,具有抗細菌、抗真菌和抗 病毒性質(zhì)。由于布雷菲德菌素A影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、加工過程,布雷菲德 菌素A已成為細胞生物學(xué)家研究哺乳動物細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要分子 工具。1963年,NCI發(fā)現(xiàn),在小鼠肺瘤模型上布雷菲德菌素A表現(xiàn)出抗 胂瘤活性,小鼠的LDs。大于200 mg/kg。研究發(fā)現(xiàn),布雷菲德菌素A通 過不依賴于p53凋亡機制誘導(dǎo)人前列腺癌細胞凋亡,Akira等聯(lián)合使用低劑量布雷菲德菌素A提高吉西他濱(Gemcitabine)對人胰腺癌細胞MIA PaCa-2細胞線的作用效果,布雷菲德菌素A及其化學(xué)衍生物具有除草活 性。
布雷菲德菌素A生產(chǎn)方法分為化學(xué)合成法和發(fā)酵法,化學(xué)法合成布 雷菲德菌素A具有反應(yīng)步驟冗長、收率低等缺陷;發(fā)酵法生產(chǎn)布雷菲德 菌素A具有高效和環(huán)境友好的特點,但已報道的菌種發(fā)酵水平偏低,難 以滿足商品化生產(chǎn)的要求。文獻報道產(chǎn)布雷菲德菌素A的菌種包括青霉 屬(尸ew/c/〃/w附)、在+臣卜青霉(尸ew/c/〃/ww (iecw附6ews )、藍青霉(戶ew/c/〃/ww c_yawewm )、苜蓿4支盤菌(i^y〃osft'cto mec z'cag/m.s )、殼二孑包屬(爿scoc/zyto )、 擬青霉(A^"7o"y; ces sp.)、 布雷正青霉(五w/ em'a'〃/圃^/^iz'"w謂)、 才奉曲審(yispe^7'〃iw c/m^3 Ms )、 分支孑包屬(C7(3(iaspon'ww sp. )、 4連才各孑包菌 屬(J/temor/a z/w /ae )、莖點霉屬(P/zoma )、 3果節(jié)菌屬(7^/araw_yces sp.)。 目前關(guān)于布雷菲德菌素A生產(chǎn)制備的文獻報道較少,美國專利U.S. 3896002公開了產(chǎn)布雷菲德菌素A的菌抹苜蓿假盤菌(me&cag/m:s)及 布雷菲德菌素A制備過程,尸w^/c"g/m; 25。C發(fā)酵5天,布雷菲德菌素 A濃度達300mg/L。在中試規(guī)才莫上,五.Z)w/e/&am//w ATCC 58665合成布 雷菲德菌素A發(fā)酵單位達到169mg/L(McCloud等,1995 )。趙玉芬等進 行了布雷菲德菌素A產(chǎn)生菌選育和布雷菲德菌素A結(jié)構(gòu)改造工作,她們 報道的布雷菲德菌素A小試發(fā)酵水平為151.6 mg/L。除制備工藝外,改 性是布雷菲德菌素A研究的另一個熱點,美國專利U.S. 6,362,218、 U.S. 5,824,674、 U.S. 5,696,154、 U.S. 5,112,607、 U.S. 4,608,078公開了布雷菲 德菌素A的衍生化反應(yīng)及衍生物的生物學(xué)活性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一林布雷菲德菌素A高產(chǎn)菌抹(布雷菲德菌素A濃度最高可達943.8mg/L發(fā)酵液)-布雷正青霉(五w/^m'c/〃/wm
6w/eW&m/m)變種ZJB082702,及其在發(fā)酵制備布雷菲德菌素A中的應(yīng) 用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
布雷正青霉(五wpem'c/〃/ww 6w/eAi/a"Mw )變種ZJB082702, <呆藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址中國.武漢.武漢大學(xué),430072,保藏曰 期2008年07月31日,保藏編號CCTCCNo: M208113。
本發(fā)明菌抹出發(fā)菌抹是從采集于杭州周邊景區(qū)的植物內(nèi)生真菌樣本 中分離到的布雷正青霉,菌林編號為A1163。
本發(fā)明還涉及布雷正青霉變種ZJB082702在孩i生物發(fā)酵制備布雷菲 德菌素A中的應(yīng)用。
具體的,所述應(yīng)用為將布雷正青霉變種ZJB082702接種至適用于 布雷正青霉的發(fā)酵培養(yǎng)基,20 35。C發(fā)酵3 9天,發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液 經(jīng)分離純化得到所述布雷菲德菌素A。
本發(fā)明設(shè)計的分離工藝如下發(fā)酵液離心,收集沉淀和上清液,上清 液經(jīng)乙酸乙酯充分萃取后收集萃取相;沉淀用乙酸乙酯浸提,離心收集乙 酸乙酯液相;合并萃取液,水洗,無水硫酸鈉脫水,回收乙S臾乙酯,得到 粗提取物用丙酮溶解,過濾,室溫下過夜結(jié)晶,重結(jié)晶,得到布雷菲德菌 素A晶體。
本發(fā)明公開適用于專利保藏菌抹布雷正青霉的發(fā)酵培養(yǎng)基,本發(fā)明中 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下淀粉5 ~ 25.0g/L,葡萄糖10 ~ 40.0 g/L, 酵母膏0.5-2.5 g/L,玉米漿0.5-2.5g/L,黃豆餅粉0.25 ~ 1.0 g/L,麥芽 浸出物0.5-4.0 g/L,硫酸鎂l 5.0g/L,磷酸二氫鉀2 6.0g/L,碳酸鈣2 ~ 8.0 g/L,硝酸鈉0.25 ~ 1.5 g/L,硫酸銅0.5 ~ 4.0x10-2 g/L,吐溫80 0.5 ~ 5.0g/L, pH值4 9。
優(yōu)選的,所述應(yīng)用如下
(1) 布雷正青霉變種ZJB082702接種至PDA斜面培養(yǎng)基,25~35°C 培養(yǎng)2 7天,以生理鹽水洗下孢子,配成孢子懸液;
(2) 孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基,25 35。C培養(yǎng)2-3天,得到種子 液,所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽糖20 40.0g/L,麥芽 浸出粉0.5~ 1.5 g/L,酵母浸出粉1 ~4.0g/L,磷酸二氫鉀1 ~3.0 g/L,碌u酸4美l 3.0g/L,石友酸4丐2~6.0g/L, pH4~9, 121。C高 壓滅菌20分鐘;
(3) 種子液以1 15。/。體積比接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,25 35。C培養(yǎng)4 8天, 得到發(fā)酵液,所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下淀粉5 ~ 25.0g/L, 葡萄糖10-40.0 g/L,酵母膏0.5 2.5g/L,玉米漿0.5 ~ 2.5 g/L, 黃豆餅粉0.25 ~ 1.0 g/L,麥芽浸出物0.5 ~ 4.0 g/L,硫酸鎂1 ~ 5.0 g/L,磷酸二氫鉀2 ~ 6.0 g/L,碳酸鈣2 ~ 6.0g/L,硝酸鈉0.25 ~ 1.5g/L,硫酸銅0.5 ~4.0xl0.2 g/L,吐溫80 0.5 ~ 5.0 g/L, pH值 4-9, 121。C高壓滅菌20分鐘;
(4) 發(fā)酵液離心,收集沉淀和上清液,上清液濃縮,經(jīng)乙酸乙酯充
分萃取后收集萃取相;沉淀用乙酸乙酯浸提,離心收集乙酸乙
酯液相;合并萃取液,水洗,無水;琉酸鈉脫水,減壓蒸餾回收
乙酸乙酯,得到粗提取物用丙酮溶解,過濾,室溫下過夜結(jié)晶、
重結(jié)晶,得到無色棱狀布雷菲德菌素A晶體。 發(fā)酵液中布雷菲德菌素A濃度采用高效液相色譜分析發(fā)酵液振蕩均勻,移取6.0 ml置于10ml離心管中,加入3.0 ml乙S吏乙酯,混合均勻, 充分萃取,吸取1.0 ml萃取液,吹風(fēng)機吹干后加入1.0 ml甲醇溶解樣品, 離心,0.45jim微濾膜過濾,濾液釆用島津HPLC分析;HPLC分析條件 色譜柱,250mm x 4.6mm Rascil C18反相柱;流動相釆用曱醇:水(70 : 30, v/v流速0.6mL/min,進樣量為5.0nL,柱后流出物依次經(jīng)UV檢測;UV 4企測波長為230nm。
本發(fā)明所涉及的抗腫瘤抗生素及其合成微生物是通過以下的程序獲 得的
1) 菌種篩選將采集的植物內(nèi)生真菌樣本接種到含抗細菌抗生素富 集培養(yǎng)基中,富集培養(yǎng)基組成麥芽糖培養(yǎng)基,pH值調(diào)節(jié)至S臾性。在28°C、 150rpm條件下振蕩培養(yǎng)6天。從富集培養(yǎng)物中分離單菌落,單一菌林逐 一接種至新鮮無菌PDA培養(yǎng)基,在28°C , 150rpm搖床上培養(yǎng)6天。發(fā) 酵液8000rpm離心10分鐘,棄沉淀,收集澄清發(fā)酵液,發(fā)酵液經(jīng)處理后, 4。C保藏,備用。選擇白色念珠菌為模型致病菌,考察上述發(fā)酵液的抑菌 活性。抑菌實驗結(jié)果揭示,7林菌林呈陽性,其中編號為A1163菌林抑菌 圈最大,活性最強。
2) 菌種鑒定菌抹A1163接種于新鮮無菌MEM液體培養(yǎng)基(培養(yǎng) 基組成葡萄糖20.0g/L,麥芽汁2.0g/L,酵母膏2.5 g/L,蛋白胨2.0g/L, 磷酸二氫鉀2.0g/L,水合硫酸鎂2.0g/L,碳酸鉤4.0g/L, pH值自然), 28。C培養(yǎng)6天。發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取次級代謝產(chǎn)物,水洗,無水硫酸鈉 脫水,減壓蒸鎦回收乙酸乙酯,得到粗提取物,用丙酮溶解粗提取物,過 濾,室溫下過夜結(jié)晶,重結(jié)晶,得到無色棱狀結(jié)晶,即菌4朱A1163次級 代謝產(chǎn)物化合物A。該新菌抹的特征如下
菌落形態(tài)菌株A1163在固體PDA、查氏、馬丁氏、沙氏培養(yǎng)基上 生產(chǎn)良好。在固體沙氏培養(yǎng)基上,菌落呈絨毛狀,有絨毛邊緣;中央產(chǎn)生 菌核,早期呈白色,之后菌落中間逐漸變?yōu)橹虚g黃綠色,并稍有隆起,后 期菌落變成灰褐色;菌落有皺褶,菌落不透明,有無色透明滲出液,不合 成水溶性色素;背面棕黃色,培養(yǎng)4天后菌落直徑約4.1cm;顯微觀察發(fā) 現(xiàn),菌絲體有橫隔,分生孢子梗有橫隔,頂端無膨大的頂嚢,但觀察到掃 帚狀的分枝;小梗頂端有串生分生孢子,分生孢子呈橢圓形(見圖l)。
菌林Al 163次級代謝產(chǎn)物化合物A結(jié)構(gòu)鑒定:化合物A結(jié)晶為無色、 棱形晶體,易溶于曱醇、丙酮、乙酸乙酯,不溶于水、氯仿。紅外光譜圖 揭示,樣品在3366 cm"處強烈的-OH伸縮振動吸收峰,在1712 cm"、 1644 cm"、 1257 cm"出現(xiàn)的特征吸收峰分別對應(yīng)于C=0、 C=C、 C-O伸縮振 動。"C-NMR譜(MeOD)揭示該化合物含有16個碳信號C16(5 21.22), C13(S 28.15), C12 (5 33.12), C14 ( 5 35.12), C6 (5 41.99), C8 (5 44.23), C9( 5 45.59), C5 ( 5 53.31), C7 ( 5 73.11), C15(5 73.34), C4 (5 76.76), C2 (5 117.92), Cll (5 131.54), C10 (5 138.27), C3 (5 155.25), Cl(5 168.50), 1H-NMR譜(MeOD)揭示該化合物A含有24 個氫信號,化合物A不飽和度為5。
樣品結(jié)晶TIC色譜分析,在保留時間7.05分鐘處有一個主要的單一 峰。該單一洗脫峰質(zhì)譜分析顯示,化合物A的具有2種準分子離子峰303.2 [M+Na]+、 583.3 [2M+Na]+,因此,化合物A計算分子量為280。
X-射線晶體衍射分析化合物A單晶X-射線衍射分析結(jié)果,晶胞參 數(shù)分別為a=7.3943(3) A, b=l 1.0212(6) A, c=18.8768(8), V=1538.15 A3, P 21 21 21,目標化合物的分子式為C16H2404,分子結(jié)構(gòu)式如圖2所示,化合物A結(jié)構(gòu)為布雷菲德菌素A。
ITS序列分析以提取到的菌抹A1163細胞總DNA為模板,利用引 物ITS1 : 5,-TCCGTAGGTGAACCTGCGG畫3,和 ITS4 : 5', -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3,擴增菌抹A1163的ITS基因,將基因產(chǎn) 物同T載體連接,經(jīng)測序確認該片段實際長度為591bp,將該序列與 GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進行相似性分析發(fā)現(xiàn),該菌與菌(五wpem'c/〃/Mm 6re,W/朋Mm)的同源性最高 (homology, 99.47%, based on ITS )。
綜合上述鑒定結(jié)果,該菌抹A1163屬于布雷正青霉(五《^/^///^附 6;r々Ai/a"簡)。
3) 菌種特性 28°C,野生型布雷正青霉A1163在液體PDA培養(yǎng)基 中培養(yǎng)5天,發(fā)酵液中除了主要的次級代謝產(chǎn)物布雷菲德菌素A以外, 還存在咪唑類核酸物質(zhì)咪唑立賓(Mizoribine, bredinin);發(fā)酵培養(yǎng)基中 補充0-1.0 mol/1乙酸酯和(或)丙二酸酯對菌種布雷菲德菌素A發(fā)酵 單位無顯著影響;37°C,野生型布雷正青霉A1163不能生長繁殖;布雷 正青霉A1163發(fā)酵液具有特征性氣味,發(fā)酵液沒有皂甙水解酶活性;在 最適條件下,布雷菲德菌素A發(fā)酵單位接近5.6 mg/1發(fā)酵液。
4) 菌種誘變鑒于野生型布雷正青霉A1163發(fā)酵水平有限,達不到 工業(yè)化生產(chǎn)的要求,對菌種孢子采用低能離子注入技術(shù)進行誘變育種,低 能離子注入誘變育種程序如下1.孢子懸濁液制備布雷正青霉A1163 接種至PDA固體培養(yǎng)基上,28。C培養(yǎng)至淡形成黃色孢子,使用無菌 0.95。/。(w/v)生理鹽水收集孢子,制備孢子懸液(終濃度105~7孢子/1111);孢 子懸液稀釋102~5倍,移取100pL稀釋過的孢子懸液均勻涂布于干燥的無 菌平板上,置于無菌超凈臺上自然風(fēng)干;2.低能離子注入輻射布雷正 青霉A1163孢子在能量1.5~2.0kV、離子束劑量2.08 ~ 2.6 x 1015 N"7cm2條件下處理8~15s,對處理過的孢子進行全面篩選,選擇基于白色念珠
菌抑制作用的高通量篩選模型。分離獲得2株正突變林,其中布雷正青霉 ZJB082702布雷菲德菌素A合成能力較出發(fā)菌抹提高約20倍,培養(yǎng)物中 檢測不到咪唑立賓,發(fā)酵液無皂戒水解酶活性;吐溫80能顯著提高布雷 正青霉ZJB082702發(fā)酵液中布雷菲德菌素A濃度,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0 l.Omol/L乙酸鹽和(或)丙二酸鹽對布雷菲德菌素A濃度沒有顯著影響; 37°C,分離菌種仍能生長繁殖,但不能合成布雷菲德菌素A;這些變化與 低能離子注入導(dǎo)致的代謝流改變有關(guān),因此,布雷正青霉ZJB082702是 菌抹布雷正青霉A1163的一林變種。布雷正青霉變種ZJB082702已于 2008年07月31日保藏于中國典型物培養(yǎng)中心,簡稱CCTCC,保藏編號 為CCTCCNo: M 208113。
表l:布雷正青霉變種ZJB082702與其它專利報道的具有布雷菲德菌素A
合成能力的布雷正青霉菌種比較
相關(guān)專利菌抹菌抹特征專利號
C39686(ATCC 74184)菌落表面呈絨毛狀,邊緣無色,中央 隆起、淡黃色,背面淡黃色;無滲出液, 無可溶性色素;分生孢子結(jié)構(gòu)非常少,分 生孢子短而光滑,單輪生,l-2個短分枝。U. S. 5,284,866
M-2116 (FE腹P-1104), M-2199具有合成咪唑類核酸物質(zhì)咪唑立賓能 力。U. S. 5,442,051; U. S. 5,462,929
PF1226 (FE固BP-7476)在固體麥汁培養(yǎng)基上,菌落白色至淡 棕色,絨毛狀,背面黃棕色;37。C停止生 丞;具有皂甙水解酶活性。U. S. 6,878,535
Dodge (NRRL 2083)分泌有顏色的滲出液,利用乙酸鈉形 成亮黃色色素;布雷菲德菌素A的合成前體 為乙酸酯和(或)丙二酸酯。J. Am. Chem. So", 1977, 99 (23): 7718-7720.野生型布雷正青霉A1163野生型布雷正青霉A1163菌落表面呈 絨毛狀,邊^(qū)^白色,中央隆起、淡黃色, 背面棕黃色;后期菌核呈灰褐色,有無色 透明滲出液,菌落產(chǎn)生無色透明液滴,不 能合成可溶性色素; 37°C,布雷正青霉A1163不能生長繁 逸;布雷正青霉A1163發(fā)酵液具有特征性 氣味,具有咪唑立賓合成能力,無皂甙水 解酶活性;最高布雷菲德菌素A發(fā)酵單位 5.6mg/l發(fā)酵液。本專利菌林
布雷正青霉變種CCTCC No. M 208113布雷正青霉變種CCTCC No. M 208113 菌落表面呈絨毛狀,邊緣白色,中央隆起、 淡黃色,背面棕黃色;后期菌核呈灰褐色, 菌落有皺褶,菌落不透明,產(chǎn)生無色透明 液滴,不能合成水溶性色素;37°C,菌種 仍能生長繁殖,但不能合成布雷菲德菌素 A;布雷正青霉變種CCTCC No. M 208113 發(fā)酵液無特征性氣味,不能合成咪唑立賓, 無皂戒水解酶活性;最高布雷菲德菌素A發(fā) 酵單位943.8 mg/l發(fā)酵液;0 ~ 1.0mol/l乙酸 鹽和(或)丙二酸鹽對菌種布雷菲德菌素A發(fā) 酵單位無顯著效應(yīng),吐溫80能顯著促進布 雷正青霉合成。本專利菌抹
5)布雷正青霉變種CCTCC No. 208113發(fā)酵制備布雷菲德菌素A過程
配制培養(yǎng)基
布雷正青霉變種CCTCCNo. 208113保存于固體PDA培養(yǎng)基上,固體 PDA斜面培養(yǎng)基制備程序馬鈴薯去皮,稱取200.0g去皮馬鈴薯,切成小 塊,加水煮沸30分鐘,使用6層紗布過濾,在濾液中加入20.0g葡萄糖,加 水定容至1000.0ml。煮沸后加入瓊脂15 20.0g,溶解后分裝至小試管, 在121。C滅菌20分鐘。
將菌種布雷正青霉變種CCTCC No. 208113孢子懸液接種到裝有 160ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中,種子培養(yǎng)基終濃度組成如下麥芽 糖20 40.0g/L,麥芽浸出粉0.5 1.5g/L,酵母浸出粉l ~ 4.0 g/L,磷酸二 氬4甲l—3.0g/L,石克酉吏4美1 ~ 3.0 g/L,石友酉吏4丐2 6.0g/L, pH4~9,種子J咅
12養(yǎng)基121。C滅菌20分鐘;培養(yǎng)溫度控制在28 35。C范圍內(nèi)培養(yǎng)2天,獲得種 子液。
上述制備的種子液按照體積比1~10% (v/v)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)基組成淀粉5 25.0g/L,葡萄糖IO ~ 40.0 g/L,酵母膏0.5 ~ 2.5 g/L, 玉米漿0.5 ~ 2.5 g/L,黃豆餅粉0.25 ~ 1.0 g/L,麥芽浸出物0.5 ~ 4.0 g/L,硫 酸鎂l ~ 5.0 g/L,磷酸二氫鉀2 ~ 6.0 g/L,碳酸4丐2 ~ 8.0 g/L,硝酸鈉0.25 ~ 1.5g/L,石克酸銅0.5 ~ 4.0 x IO-2g/L,吐溫-80 0.5 ~ 5.0 g/L, pH值4 ~ 9。發(fā) 酵培養(yǎng)的裝量為160ml/500ml搖瓶,搖瓶為帶擋板發(fā)酵瓶,將種子液轉(zhuǎn)接 于無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中,在20 35。C下培養(yǎng)3 9天。
發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)4000 ~ 12000rpm離心4 ~ IO分鐘,分別收集沉 淀和上清液。上清液經(jīng)減壓濃縮20倍,加入l/2體積乙酸乙酯萃取,充分 萃取后收集萃取相;固體沉淀直接采用乙酸乙酯浸提,離心收集液相;合 并萃取液,水洗,無水硫酸鈉脫水,減壓蒸餾回收乙酸乙酯,得到粗提取 物,用丙酮溶解粗提取物,過濾,室溫下過夜結(jié)晶,重結(jié)晶,得到無色棱 狀結(jié)晶。
本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在提供了 一抹布雷菲德菌素A高產(chǎn)菌抹
-布雷正青霉(£wpe"/c/〃z'ww ^e/e/cfewwm )變種ZJB082702,及其在發(fā)
酵制備布雷菲德菌素A中的應(yīng)用;利用該菌林發(fā)酵制備布雷菲德菌素A, 產(chǎn)率較高,布雷菲德菌素A濃度最高可達943.8mg/L發(fā)酵液。
(四)
圖1為菌抹A1163光學(xué)顯微照片(x 1000); 圖2為X-射線衍射測定的化合物A分子結(jié)構(gòu);
(五)
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一 步描述,但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此
配制培養(yǎng)基
(1 )斜面培養(yǎng)基,布雷正青霉變種CCTCC No. 208113保存于固體 PDA培養(yǎng)基上,固體PDA斜面培養(yǎng)基制備馬鈴薯去皮,稱取200.0g 去皮馬鈴薯,切成小塊,加水煮沸30分鐘,使用6層紗布過濾,在濾液 中加入20.0g葡萄糖,加水定容至1000ml。煮沸后加入瓊脂20.0g,溶解 后分裝至小試管,在12rC滅菌20分鐘,冷卻,得斜面,接種CCTCCNo. 208113, 32 35。C培養(yǎng)3天,以無菌水洗下孢子,配成孢子懸液(孢子濃 度約4.7x 1()6孢子/ml),備用。
(2)種子培養(yǎng)基終濃度組成麥芽糖20 40g/L,麥芽浸出粉(市 售)0.5-1.5 g/L,酵母浸出4分(市售)1 ~4.0g/L,磷酸二氫鉀1 ~3.0g/L, 硫酸鎂l 3.0g/L,石友酸鉤2-6.0 g/L,溶劑為蒸餾水,pH4 9;
(3 )發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成g/L:淀粉5-25.0g/L,葡萄糖10-40.0 g/L,酵母膏0.5 ~ 2.5 g/L,玉米漿(市售)0.5 ~ 2.5 g/L,黃豆餅粉(市售) 0.25 ~ 1.0 g/L,麥芽浸出物(市售)0.5-4.0 g/L,硫酸鎂l 5.0g/L,磷 酉吏二氬4甲2 ~ 6.0 g/L,石灰酸4丐2 ~ 8.0 g/L,硝'酉交4內(nèi)0.25 ~ 1.5,石克酉吏4同0.5 ~ 4.0x10-2 g/L,草酰乙酸0.5 — 5.0 g/L,吐溫80 0.5 — 5.0 g/L,溶劑為蒸餾 水,pH值4 9。
實施例1:布雷正青霉變種CCTCCNo.208113發(fā)酵制備布雷菲德菌素A 將菌種布雷正青霉CCTCC No. 208113孢子懸液接種到裝有160.0ml 種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中,28。C培養(yǎng)2天,獲得種子液。種子培養(yǎng) 基配制麥芽糖30.0g,麥芽浸出粉1.5g,酵母浸出粉2.5g,磷酸二氫鉀2.0g,硫酸鎂2.0g,碳酸鈣4.0g,蒸餾水1000.0mL, pH7.0,種子培養(yǎng)基 121。C滅菌20分鐘;
為了考察培養(yǎng)基復(fù)合氮源對布雷菲德菌素A發(fā)酵水平的影響,設(shè)計 了 5種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基,生物反應(yīng)器采用帶擋板的搖瓶,裝液量均為 160mL/500mL搖瓶,發(fā)酵培養(yǎng)基組成分別為
培養(yǎng)基I:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5g/L,酵母 膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,磷酸二氫鉀2.0g/L,硫 酸鎂2.0g/L,碳酸鈣4.0g/L,溶劑為蒸鎦水,pH自然;
培養(yǎng)基II:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5 g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.5g/L,磷酸 二氬鉀2.0g/L,硫酸鎂2.0g/L,碳酸鈣4.0g/L,溶劑為蒸餾水,pH自 然;
培養(yǎng)基III:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.5g/L,磷酸 二氬鉀2.0 g/L,硫酸銅l.Oxl(T2 g/L,硫酸鎂2.0 g/L,碳酸鈣4.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH自然;
培養(yǎng)基IV:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.75 g/L,磷酸 二氫鉀2.0g/L,硫酸銅l.Oxl(T2 g/L,硫酸鎂2.0g/L,碳酸鈣4 .Og/L, 溶劑為蒸餾水,pH自然;
培養(yǎng)基V:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉2.5g/L,磷酸 二氫鉀2.0 g/L,硫酸銅1.0xl0-2 g/L,硫酸鎂2.0 g/L,碳酸鈣4.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH值自然;發(fā)酵培養(yǎng)基均在121。C菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)的裝量為160ml/500ml 搖瓶,搖瓶為帶擋板發(fā)酵瓶將種子液按照體積比3.0%轉(zhuǎn)接于5種無菌發(fā) 酵培養(yǎng)基中,在28。C下培養(yǎng)4天。
發(fā)酵結(jié)束后,移取5ml發(fā)酵液,加入2.5ml乙酸乙酯,室溫萃取30 分鐘;收集上層萃取相,吹風(fēng)機吹干萃取液,加入500ial曱醇,10000 rpm 離心10分鐘,上清液經(jīng)0.45 um微濾膜過濾,濾液采用島津HPLC分析。 HPLC分析條件色譜柱,250mmx4.6mm RascilC18反相柱;流動相 采用曱醇水(70:30, v/v流速0.6mL/min,進樣量為5.0(iL,柱后流出 物依次經(jīng)UV檢測;UV;險測波長為230nm。發(fā)酵液I、 II、 III、 IV、 V中 布雷菲德菌素A的濃度分別為324mg/L、 426.3mg/L、 537.1mg/L、 651.3mg/L、 298.5mg/L。
實施例2:布雷正青霉變種CCTCCNo. 208113發(fā)酵制備布雷菲德菌素A 將菌種布雷正青霉ZJB082702 (CCTCCNo. 208113 )孢子懸液接種 到裝有160.0ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中,種子培養(yǎng)基按如下組成配 制麥芽糖30.0g,麥芽浸出粉1.5g,酵母浸出粉2.5g,磷酸二氫鉀2.0g, 硫酸鎂2.0g,碳酸鈣4.0g,蒸餾水1000.0mL, pH7.0,種子培養(yǎng)基121°C 滅菌20分鐘;28。C培養(yǎng)2天,獲得種子液。
為了考察培養(yǎng)基中碳酸鈣用量對布雷菲德菌素A發(fā)酵水平的影響,
本專利設(shè)計了 4種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基,生物反應(yīng)器采用帶擋板的搖瓶,裝 液量均為160mL/500mL搖瓶,發(fā)酵培養(yǎng)基組成分別為
培養(yǎng)基a:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5g/L,酵母 膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.50 g/L,磷酸二 氬鉀2.0 g/L,硫酸銅l.Oxl(T2 g/L,硫酸鎂2.0 g/L,溶劑為蒸餾水,pH值自然;
培養(yǎng)基b:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5 g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.50 g/L,磷酸 二氬鉀2.0 g/L,硫酸銅l.OxlO-2 g/L,硫酸鎂2.0 g/L,碳酸4丐4.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH值自然;
培養(yǎng)基c:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5 g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.50 g/L,磷酸 二氫鉀2.0 g/L,硫酸銅l.Oxl(T2 g/L,硫酸鎂2.0 g/L,碳酸鈣6.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH值自然;
培養(yǎng)基d:葡萄糖20.0g/L,淀粉10.0g/L,麥芽浸出物1.5 g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.50 g/L,磷酸 二氫鉀2.0g/L,硫酸銅l.Oxl(T2g/L,硫酸鎂2.0g/L,碳酸4丐10.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH值自然;
發(fā)酵培養(yǎng)基均在121。C菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)的裝量為160ml/500ml 搖瓶,搖瓶為帶擋板發(fā)酵瓶將種子培養(yǎng)物按照體積比3.0%轉(zhuǎn)接于4種無 菌發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28。C下培養(yǎng)4天。
發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理、HPLC分析,發(fā)酵液a、 b、 c、 d中 布雷菲德菌素A的濃度分別為151.6mg/L、 667mg/L、 710mg/L、 521mg/L。
實施例3:布雷正青霉變種CCTCC No. 208113發(fā)酵制備布雷菲德菌素A 將菌種布雷正青霉CCTCC No. 208113孢子懸液4妄種到裝有160mL 種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中,種子培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽糖 30.0g,麥芽浸出粉1.5g,酵母浸出粉2.5g,磷酸二氫鉀2.0g,硫酸鎂2.0g, 碳酸釣4.0g,蒸餾水1000.0mL, pH7.0,種子培養(yǎng)基121。C滅菌20分鐘;28。C培養(yǎng)2天,獲得種子液。
為了考察不同培養(yǎng)基起始pH值對布雷菲德菌素A發(fā)酵水平的影響, 本專利設(shè)計了 4種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基,生物反應(yīng)器采用帶擋板的搖瓶,裝 液量均為160mL/500 mL搖瓶,發(fā)酵培養(yǎng)基組成分別為
培養(yǎng)基A,葡萄糖26.7g/L,淀粉13.3g/L,麥芽浸出物2.5g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.75 g/L,磷酸 二氫鉀4.0g/L,硫酸銅l.Oxl0-2 g/L,硫酸鎂3.0g/L,碳酸鈣6.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH5.0;
培養(yǎng)基B,葡萄糖26.7g/L,淀粉13.3g/L,麥芽浸出物2.5g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.75 g/L,磷酸 二氳鉀4.0g/L,硫酸銅l.Oxl0-2 g/L,硫酸鎂3.0g/L,碳酸鈣6.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH6.0;
培養(yǎng)基C,葡萄糖26.7g/L,淀粉13.3g/L,麥芽浸出物2.5g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.75 g/L,磷酸 二氫鉀4.0g/L,硫酸銅1.0xl0-2 g/L,硫酸鎂3.0g/L,碳酸鈣6.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH7.0;
培養(yǎng)基D,葡萄糖26.7g/L,淀粉13.3g/L,麥芽浸出物2.5g/L,酵 母膏1.0g/L,玉米漿1.0g/L,黃豆餅粉0.50g/L,硝酸鈉0.75 g/L,磷酸 二氬鉀4.0 g/L,硫酸銅l.Oxl(T2 g/L,硫酸鎂3.0 g/L,碳酸鈣6.0 g/L, 溶劑為蒸餾水,pH8.0;
發(fā)酵培養(yǎng)基均在121。C滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)的裝量為160ml/500ml, 搖瓶為帶擋板發(fā)酵瓶將種子培養(yǎng)物按照體積比3.0%轉(zhuǎn)接于4種無菌發(fā)酵 培養(yǎng)基中,在28。C下培養(yǎng)4天。
發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理、HPLC分析,發(fā)酵液A、 B、 C、 D
18中布雷菲德菌素A的濃度分別為749.3mg/L、 943.8mg/L、 731.1mg/L、 682.6.1mg/L。
實施例4:從布雷正青霉變種CCTCC No. 208113發(fā)酵液中l(wèi)是煉布雷菲德 菌素A結(jié)晶
收集3.0L布雷正青霉ZJB082702發(fā)酵液,發(fā)酵液經(jīng)12000rpm離心 IO分鐘,分別收集沉淀和上清液。上清液經(jīng)減壓濃縮至1/20原始體積, 再加入體積為濃縮液體積1/2的乙酸乙酯萃取,充分萃取后收集萃取相; 固體沉淀直接采用乙酸乙酯浸提,離心收集液相;合并萃取液,水洗兩次, 無水硫酸鈉脫水,減壓蒸餾回收乙酸乙酯,得粗提取物2.96g,用丙酮溶 解粗提取物,過濾,室溫下過夜結(jié)晶,重結(jié)晶,得2.07g無色棱狀晶體, 純度99.07%。
權(quán)利要求
1. 布雷正青霉(Eupenicilliumbrefeldianum)變種ZJB082702,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址中國.武漢.武漢大學(xué),430072,保藏日期2008年07月31日,保藏編號CCTCC NoM208113。
2. 布雷正青霉變種ZJB082702在微生物發(fā)酵制備布雷菲德菌素A中的應(yīng) 用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述應(yīng)用為將布雷正青霉變 種ZJB082702接種至適用于布雷正青霉的發(fā)酵培養(yǎng)基,20 ~ 35。C發(fā)酵 3~9天,發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液經(jīng)分離純化得到所述布雷菲德菌素A。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于所述布雷菲德菌素A分離純化 方法如下發(fā)酵液離心,收集沉淀和上清液,上清液經(jīng)乙酸乙酯充分 萃取后收集萃取相;沉淀用乙酸乙酯浸提,離心收集乙酸乙酯液相; 合并萃取相和乙酸乙酯液相,水洗,無水石克酸鈉脫水,回收乙酸乙酯, 得到粗提取物用丙酮溶解,過濾,室溫下過夜結(jié)晶,重結(jié)晶,得到布 雷菲德菌素A晶體。
5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于,所述適用于布雷正青霉的發(fā) 酵培養(yǎng)基終濃度組成如下淀粉5 25g/L,葡萄糖10-40 g/L,酵母 膏0.5 2.5g/L,玉米漿0.5 2.5g/L,黃豆餅粉0.25 ~ 1 g/L,麥芽浸出 物0.5 ~ 4 g/L,硫酸鎂1 ~ 5 g/L,磷酸二氫鉀2 ~ 6 g/L,碳酸鈣2 ~ 8 g/L, 硝'酸鈉0.25 ~ 1.5 g/L,碌u酸銅0.5 ~ 4.0x10-2 g/L,吐溫-80 0.5 ~ 5 g/L, pH值4 9。
6. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述應(yīng)用如下(1 )布雷正青霉變種ZJB082702接種至PDA斜面培養(yǎng)基,25 ~ 35°C 培養(yǎng)2 7天,以生理鹽水洗下孢子,配成孢子懸液;(2)孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基,25 35。C培養(yǎng)2 3天,得到種子 液,所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽糖20 40g/L,麥芽浸 出4分0.5~ 1.5g/L,酵母f旻出4分1 ~4g/L,石壽酉吏二氫4甲1 ~3 g/L, 硫酸鎂1 ~ 3 g/L,碳酸鈣2 ~ 6 g/L, pH4 ~ 9, 121 。C高壓滅菌20 分鐘;(3 )種子液以體積比1~15%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,25 35。C培養(yǎng)4 8天, 得到發(fā)酵液,所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下淀粉5 25g/L, 葡萄糖10 40g/L,酵母膏0.5 2.5g/L,玉米漿0.5 ~ 2.5 g/L, 黃豆餅粉0.25~ 1 g/L,麥芽浸出物0.5 4g/L,硫酸鎂l 5g/L, 磷酸二氬鉀2 ~ 6 g/L,碳酸釣2 ~ 6g/L,硝酸鈉0.25 ~ 1.5 g/L, 硫酸銅0.005 —0.04 g/L,吐溫-80 0.5 5g/L, pH值4 9, 121°C 高壓滅菌20分鐘;(4)發(fā)酵液離心,收集沉淀和上清液,上清液濃縮,經(jīng)乙酸乙酯充分 萃取后收集萃取相;沉淀用乙酸乙酯浸提,離心收集乙酸乙酯液 相;合并萃取相和乙酸乙酯液相,水洗,無水硫酸鈉脫水,減壓 蒸餾回收乙酸乙酯,得到粗提取物用丙酮溶解,過濾,室溫下過 夜結(jié)晶、重結(jié)晶,得到布雷菲德菌素A晶體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種布雷菲德菌素A高產(chǎn)菌株——布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)變種ZJB082702,及其在發(fā)酵制備布雷菲德菌素A中的應(yīng)用。布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)變種ZJB082702,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址中國武漢武漢大學(xué),430072,保藏日期2008年07月31日,保藏編號CCTCC NoM 208113。利用該菌株發(fā)酵制備布雷菲德菌素A,產(chǎn)率較高,布雷菲德菌素A濃度最高可達943.8mg/L發(fā)酵液。
文檔編號C12N1/14GK101445784SQ20081016377
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者沈寅初, 王亞軍, 鋒 薛, 薛亞平, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)