專利名稱：一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的領(lǐng)域，具體涉及一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織(Oralsquamous cell carcinomas，OSCC)的檢測(cè)試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)：
口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是人類最常見腫瘤之一，也是發(fā)展中國家重要的健康問題之一[Weinberg MA，Estefan DJ.Assessing oral malignancies.AmFam Physician.2002，65(7)1379-1384；Mehrotra R，Gupta A，Singh M，et al.Application ofcytology and molecular biology in diagnosing premalignant or malignant oral lesions.Mol Cancer.2006，5(11)1-9]?？谇话┖冒l(fā)于中老年人，且發(fā)病率隨年齡的增長而增長，但近年來也有年輕化的趨勢(shì)[Neville B W，Day TA.Oral cancer and precancerous lesions.CA Cancer J Clin.2002，52(4)195-215]，90％的口腔癌為OSCC[Neville BW，Day TA.Oral cancer and precancerouslesions.CA Cancer J Clin.2002，52(4)195-215]。口腔粘膜癌前病變是一種已有形態(tài)學(xué)上改變的組織，它與外觀相應(yīng)正常的口腔粘膜相比較具有更大的癌變可能。口腔粘膜癌前病變現(xiàn)已知的有口腔白斑(oral leukoplakia)，口腔紅斑(oral erythroplakia，OEP)，口腔扁平苔蘚(oral lichenplanus，OLP)，口腔粘膜下纖維化(oral submucous fibrosis，OSF)，上皮異常增生等。
在我國，OSCC的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，白斑、扁平苔蘚等癌前病變的癌變率相當(dāng)高。目前，OSCC的五年生存率為30％，這與30年前相比并沒有明顯增高[Weinberg MA，Estefan DJ.Assessing oral malignancies.Am Fam Physician.2002，65(7)1379-1384；Neville BW，Day TA.Oral cancer and precancerous lesions.CA Cancer J Clin.2002，52(4)195-215；Caulin C，Nguyen T，Longley MA，et al.Inducible activation of oncogenic K-ras results in tumor formation in the oralcavity.Cancer Res.2004，64(15)5054-5058]。60％的口腔癌被發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期[Weinberg MA，Estefan DJ.Assessing oral malignancies.Am Fam Physician.2002，65(7)1379-1384.]。OSCC直到晚期才能被確診和治療是口腔癌的診斷率和存活率不能提高的主要原因。降低OSCC死亡率的關(guān)鍵是預(yù)防和早期診斷。如能在早期對(duì)OSCC進(jìn)行診斷和治療，其五年生存率可達(dá)80％[Mehrotra R，Gupta A，Singh M，et al.Application of cytology and molecular biology indiagnosing premalignant or malignant oral lesions.Mol Cancer.2006，5(11)1-9]。OSCC的早期檢測(cè)及判別癌前病變是否已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)镺SCC對(duì)提高病人生存率有重要意義。口腔內(nèi)的異常增生和病變?cè)皆绫粶?zhǔn)確判別為OSCC并得到及時(shí)的診治，患者存活的幾率就越大。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的早期檢測(cè)及判別，提供了一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c和試劑III-d。
其中，試劑I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNase Free dH2O、dNTP Mixture、RNase Ihibitor、AMV Reverse Transcriptase XL組成； 試劑II由Tris-HCL+KCL、滅菌蒸餾水、TaKaRa EX Taq HS組成； 試劑III-a為基因GDF-15的PCR引物，試劑III-b為基因BCL-2的PCR引物，試劑III-c為基因CTNNB-1的PCR引物，試劑III-d為基因β-actin的PCR引物。
上述各試劑的配比如下表1～表4所述表1試劑盒的組成 注本表所列試劑的量為10個(gè)樣本反應(yīng) 表2試劑I的組份
表3試劑II的組份
表4試劑III的組份 所述的用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于步驟如下 1)、樣本的制備和貯存； 2)、同時(shí)進(jìn)行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作； 3)、GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的瓊脂糖凝膠電泳； 4)、使用Kodak Digital Science1D軟件對(duì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行定量分析，將GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相對(duì)表達(dá)量帶入方程“組織性質(zhì)判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”計(jì)算組織性質(zhì)判定值P； 5)、組織的判定值P與0比較判定該組織是否為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織，大于0為非口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織，小于0為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織。
所述的GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作的退火溫度為54℃。
本發(fā)明具有如下有益效果使用本試劑盒提供的試劑和使用方法可在同一反應(yīng)中進(jìn)行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin四個(gè)基因的RT-PCR反應(yīng)，并可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)組織樣本是否為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的判定；判定時(shí)間短，準(zhǔn)確性高；對(duì)于準(zhǔn)確檢測(cè)OSCC、及時(shí)阻斷OSCC的發(fā)展、預(yù)防OSCC的轉(zhuǎn)移等具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。



圖1使用本發(fā)明方法獲得的12例組織RT-PCR電泳圖。
圖中泳道1、6、7、10、11、15、16、20均為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)例中使用的是DL-2000；泳道2、3、4、5、14、19為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織，共6例不同病例的組織；泳道8、9、12、13、16、18為非口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織，共6例不同病例的組織；bp為base pair的簡寫，即為堿基對(duì)，下方的數(shù)字顯示為該電泳條帶的bp值。

具體實(shí)施例方式 一、試劑盒包含的試劑及說明 本發(fā)明包括以下試劑共11種，分別為TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c和試劑III-d。其中，TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇為組織總RNA提取試劑，Oligo(dT)15和試劑I為mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA試劑，試劑II為TaKaRa公司PCR操作試劑，試劑III-a為基因GDF-15的PCR引物，試劑III-b為基因BCL-2的PCR引物，試劑III-c為基因CTNNB-1的PCR引物，試劑III-d為基因β-actin的PCR引物。
具體如表1′所示，其中試劑I、試劑III和試劑IV的具體組份見表2′～表4′。表1′本發(fā)明試劑盒所包含的試劑 注本表所列試劑的量為10個(gè)樣本反應(yīng) 表2′試劑I的組份
表3′試劑II的組份
表4′試劑III的組份 注GDF-15，英文全稱是Growth differentiation factor 15，在Genebank中的基因編號(hào)是NM_004864；BCL-2，英文全稱是B-cell CLL/lymphoma 2，在Genebank中的基因編號(hào)是NM_000633；CTNNB-1，英文說明是Cadherin-associated protein beta 1，在Genebank中的基因編號(hào)是NM_001904；β-actin，英文全稱是Homosapiens actin beta(ACTB)，在Genebank中的基因編號(hào)是NM_001101.2。
上述各基因引物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員通過現(xiàn)有基因合成儀合成，其基本信息表述如下 (1)一般信息 (ii)發(fā)明名稱一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒及其使用方法 (iii)序列數(shù)目8 (2)SEQ ID NO1的信息 (i)序列特征 (A)長度22bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO1 CGCTCCAGACCTATGATGACTT 22 (3)SEQ ID NO2的信息 (i)序列特征 (A)長度18bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO2 CCTTGAGCCCATTCCACA 18 (4)SEQ ID NO3的信息 (i)序列特征 (A)長度18bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO3 TGGGATCGTTGCCTTATG 18 (5)SEQ ID NO4的信息 (i)序列特征 (A)長度22bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO4 GCTATTTTATTGGATGTGCTTT 22 (6)SEQ ID NO5的信息 (i)序列特征 (A)長度19bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO5 CCAAGTGGGTGGTATAGAG 19 (7)SEQ ID NO6的信息 (i)序列特征 (A)長度16bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO6 GGGACAAAGGGCAAGA 16 (8)SEQ ID NO7的信息 (i)序列特征 (A)長度19bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO7 AGCGCAAGTACTCCGTGTG 19 (9)SEQ ID NO8的信息 (i)序列特征 (A)長度19bp (B)類型核酸 (C)鏈性單鏈 (D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO8 AAGCAATGCTATCACCTCC 19 二、操作步驟 本步驟包括樣本的制備和貯存、RT-PCR反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)操作和口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的判定。
(一)樣本的制備和貯存 對(duì)疑似白斑組織的確切部位、大小、包膜狀況、與周圍關(guān)系、色澤、形狀、質(zhì)地以及標(biāo)本數(shù)目等登記后，經(jīng)碘酒、酒精消毒局部后取組織，一般大小為1.5-2×1×0.3cm。對(duì)于面積較大的組織可在周邊采用“三點(diǎn)法”分別取樣，并分別標(biāo)記。取樣深度不超過0.3cm，質(zhì)量約50-60mg。獲取的標(biāo)本若在短時(shí)間檢驗(yàn)可貯存于-20℃，若在三日后檢驗(yàn)可貯存于-80℃或液氮中備用。
(二)RT-PCR反應(yīng) 本方法適用于一個(gè)組織標(biāo)本的處理，多個(gè)組織標(biāo)本可同時(shí)平行操作。
1、用1.5ml的EP管取一個(gè)組織標(biāo)本，加入1ml的TRIZOL試劑，手動(dòng)勻漿，于15-30℃孵育3-5min。
2、加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋，手動(dòng)劇烈振蕩管體15sec后，15-30℃孵育2-3min。4℃下12,000×g離心15min。
3、將上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入異丙醇0.5ml，混勻后15-30℃孵育10min，于4℃下12,000×g離心10min。
4、移去上清液，加入75％乙醇1ml，適度振蕩后，4℃下7,500×g離心5min。
5、小心去除上層溶液后，EP管于通風(fēng)廚中干燥5-10min。
6、先加入無RNA酶的水20μl，用槍反復(fù)吹打幾次，然后55-60℃孵育10min?；靹蚝?μl/支(≤500ng total RNA)分裝6支(分別編號(hào)為A、B、C和D1、D2、D3)可直接進(jìn)行以下操作，其余RNA溶液保存于-70℃?zhèn)溆谩?br> 7、依次于PCR反應(yīng)管A、B、C和D1、D2、D3中各加入試劑I 8.5μl后，再加入Oligo(dT)15 0.5μl，將其置于PCR儀內(nèi)，設(shè)置程序如表5所示。表5基因反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件
8、于第7步的PCR反應(yīng)管A、B、C和D1、D2、D3中分別再加入試劑II 39μl，A中加入試劑III-a 1μl，B中加入試劑III-b 1μl，C中加入試劑III-c 1μl，D1、D2、D3中各加入試劑III-d 1μl，分別輕輕混勻，按表6所示條件同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
表6標(biāo)志性基因的PCR反應(yīng)條件
(三)瓊脂糖凝膠電泳 1、試劑配制和準(zhǔn)備 常規(guī)配制2.0％的瓊脂糖凝膠電泳緩沖液等，具體如下 (1)電泳緩沖液(TBE)的配制。先配制0.5mol/L(pH 8.0)的EDTA溶液將37.2g EDTA-Na加入160ml蒸餾水中，在攪拌器上劇烈攪拌；再用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0(約需4g NaOH)；用蒸餾水定容至200ml；后送至高壓滅菌；室溫保存。
(2)再配制5×TBE溶液在0.6L蒸餾水中溶解54g Tris堿，加入27.5ml冰乙酸和20ml0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸餾水定容至1L，室溫保存。
(3)2.0％瓊脂糖溶液的配制。取5×TBE溶液2ml，稀釋成20ml 0.5×TBE，溶解0.4g瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊脂物冷卻至60℃左右時(shí)加入10mg/ml Glodview Na核酸染料2μl，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置30min左右后進(jìn)行電泳備用。
(4)加樣緩沖液(Loading Buffer)的配制常規(guī)配制6×Loading Buffer。
2、步驟 (1)取55ml 5×TBE，用dH2O稀釋成550ml，取20ml溶解0.4g瓊脂糖，沸后稍冷卻，加入Glodview Na核酸染料2μl，另外530ml TBE倒入電泳槽中。
(2)瓊脂糖溶液冷卻至溫?zé)釙r(shí)，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中。
(3)DL2,000 Marker 2μl加入孔中。
(4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物液A 5μl+1μl Loading Bμffer，再加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物液D1 5μl混合，同時(shí)加入一個(gè)上樣孔中。PCR反應(yīng)產(chǎn)物液B和C分別與5μl D2、5μl D3混合后，再分別與1μlLoading Bμffer混合，并A、B、C同時(shí)進(jìn)行電泳操作。
(5)接上電源，電壓100V，電流20mA進(jìn)行電泳45min。
(6)紫外燈檢測(cè)，并用柯達(dá)凝膠成像分析系統(tǒng)初步判定A、B和C的bp大小。A的堿基對(duì)數(shù)量為128bp和501bp；B的堿基對(duì)數(shù)量為257bp和501bp；C的堿基對(duì)數(shù)量為247bp和501bp。
(7)用柯達(dá)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行基因的表達(dá)量分析。
三、結(jié)果分析 本結(jié)果分析包括瓊脂糖凝膠電泳圖的分析方法和口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的判定方法。
(一)瓊脂糖凝膠電泳圖的分析方法 下面，以某基因的RT-PCR結(jié)果為例說明對(duì)瓊脂糖凝膠電泳圖的定量分析過程。
1、打開Kodak Digital Science1D軟件。
2、從菜單欄中“file”中的“open”打開待處理的文件。
3、將目標(biāo)文件打開后，軟件直接將待處理的圖片顯示在窗口的中間位置。
4、點(diǎn)整個(gè)頁面最左側(cè)的方框選擇標(biāo)志，將待處理的范圍選中，可適當(dāng)裁減多余部分，通過“Edit”菜單中的“Crop”來完成。
5、點(diǎn)圖片左側(cè)的“find lanes”可顯示圖片中的各列。若顯示的豎線不位于泳帶的中間位置可點(diǎn)擊圖片左側(cè)的箭頭圖標(biāo)，將豎線移動(dòng)至各條帶的中間位置。
6、點(diǎn)擊“find bands”按鈕，軟件將會(huì)顯示出目的基因條帶的位置和寬度?？墒褂谩癉el鍵”刪除不存在的泳帶顯示。
7、在菜單欄中，找到“Show”中的下拉菜單，選擇“Image Display”。點(diǎn)擊后出現(xiàn)對(duì)話框，點(diǎn)擊對(duì)話框右下角的“Auto”鍵，軟件將自動(dòng)找到最適合的顯示對(duì)比度。
8、找到菜單中的“show”下拉菜單，點(diǎn)擊“Lands/Bands”的次級(jí)下拉菜單中的“Lane AnalysisData”。而后，出現(xiàn)表格窗口。
9、點(diǎn)擊最新出現(xiàn)的對(duì)話框中菜單欄的“Display”，勾選“mean”和“area”。然后點(diǎn)擊“確定”，即可出現(xiàn)每個(gè)泳帶的灰度值和面積值。
10、目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。例如，GDF-15的電泳圖中存在兩個(gè)電泳條帶，分別為小于200bp大于100bp的GDF-15條帶(128bp)和基本與500bp平行的β-actin條帶(501bp)，經(jīng)柯達(dá)凝膠成像分析系統(tǒng)分析后GDF-15的mean＝101.29、area＝702.00，而β-actin的mean＝107.03、area＝390.00。利用“目的基因表達(dá)的灰度值＝mean×area”計(jì)算得GDF-15得灰度值為71105.58，β-actin的灰度值為41741.70。再利用“目的基因的相對(duì)表達(dá)量＝β-actin的灰度值×目的基因表達(dá)的灰度值/100”計(jì)算得GDF-15的相對(duì)表達(dá)量為170.35。同樣，可計(jì)算獲得BCL-2和CTNNB-1的相對(duì)表達(dá)量。此值即可用于進(jìn)行口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的判定。
(二)口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的判定方法 將GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相對(duì)表達(dá)量帶入“組織性質(zhì)判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”即可計(jì)算出組織性質(zhì)判定值P。例如，若GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相對(duì)表達(dá)量為分別170.35、77.28和74.13，則該組織的性質(zhì)判定值P＝-16.099+0.044×170.35-0.082×77.28+0.234×74.13＝-16.099+7.4954-6.33696+17.147122＝2.406562。
判定如果判定值P小于0為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌，如果判定值P大于0為暫不能判定為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌。上例中，判定值P＝2.406562>0，所以暫不能判定該組織為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織。
方程“組織性質(zhì)判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”以及判別界值0通過SPSS.11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件的二項(xiàng)判別分析方法獲得。
四、方法評(píng)價(jià) 取12例口腔黏膜組織，經(jīng)專家進(jìn)行組織病理學(xué)鑒定，分別為正?？谇火つそM織3例、口腔黏膜白斑組織3例、口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織6例。采用本發(fā)明所示的方法進(jìn)行操作后，再采用Cross-validated(a)法對(duì)本判別方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織共6個(gè)組織，有5例判斷正確，有1例判斷錯(cuò)誤，總判別符合率為83.3％；非口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織6個(gè)組織，均判斷正確，交互判別符合率為(12-1)/12＝91.67％，靈敏度為6/(6+1)＝85.71％，特異度為5/(5+0))＝100％。結(jié)果如圖1、表7所示。表7采用Cross-validated(a)法對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行評(píng)價(jià)

權(quán)利要求
1.一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c和試劑III-d，
其中，試劑I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNase Free dH2O、dNTP Mixture、RNase Ihibitor、AMV Reverse Transcriptase XL組成；
試劑II由Tris-HCL+KCL、滅菌蒸餾水、TaKaRa EXTaq HS組成；
試劑III-a為基因GDF-15的PCR引物，試劑III-b為基因BCL-2的PCR引物，試劑III-c為基因CTNNB-1的PCR引物，試劑III-d為基因β-actin的PCR引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒，其特征在于由表1所述配比的試劑組成。
表1
注本表所列試劑的量為10個(gè)樣本反應(yīng)
表2試劑I的組份
表3試劑II的組份
表4試劑III的組份
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于步驟如下
1)、樣本的制備和貯存；
2)、同時(shí)進(jìn)行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作；
3)、GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的瓊脂糖凝膠電泳；
4)、使用Kodak Digital Science1D軟件對(duì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行定量分析，將GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相對(duì)表達(dá)量帶入方程“組織性質(zhì)判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”計(jì)算組織性質(zhì)判定值P；
5)、組織的判定值P與0比較判定該組織是否為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織，大于0為非口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織，小于0為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于所述的GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作的退火溫度為54℃。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的領(lǐng)域，具體是一種用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒及其使用方法，實(shí)現(xiàn)了口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的早期檢測(cè)及判別。用于口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織的檢測(cè)試劑盒，由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c和試劑III-d。其使用方法樣本的制備和貯存；各基因的RT-PCR操作和瓊脂糖凝膠電泳；對(duì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行定量分析，判定組織是否為口腔磷狀上皮細(xì)胞癌組織。本發(fā)明具有如下有益效果可在同一反應(yīng)中進(jìn)行四個(gè)基因的RT-PCR反應(yīng)，并可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)組織樣本是否為OSCC的判定；判定時(shí)間短，準(zhǔn)確性高；對(duì)于準(zhǔn)確檢測(cè)OSCC、及時(shí)阻斷OSCC的發(fā)展、預(yù)防OSCC的轉(zhuǎn)移等具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101368211SQ20081016720
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者郭劍津, 張?zhí)旃? 史培榮, 陳顯久, 劉瑋瑋, 冰 李, 軍 解, 勃 牛, 程牛亮, 趙榮瑞, 郭巍偉 申請(qǐng)人:陳顯久