專利名稱：一種口腔鱗狀細(xì)胞癌體外癌變模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于建立口腔鱗狀細(xì)胞癌體外癌變模型，為研究鱗狀細(xì)胞癌多因素、多階段、多步驟癌變提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 背景技術(shù)：
口腔鱗狀細(xì)胞癌占全身惡性腫瘤的4％，由于口腔位于呼吸道與消化道的重要位置，病變結(jié)果嚴(yán)重影響患者的生活和生存質(zhì)量。研究口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是從根本上防治腫瘤的關(guān)鍵。
目前研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的常用方法之一是檢測臨床標(biāo)本中的一些分子標(biāo)記物的表達(dá)情況，從而推測這些分子標(biāo)記物和腫瘤的相關(guān)性；這種方法從靜態(tài)的情況下研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制，受到腫瘤發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)觀察的限制。方法二是以已經(jīng)建立的腫瘤細(xì)胞系為研究對象，也不能觀察腫瘤發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程。有學(xué)者也通過化學(xué)誘導(dǎo)等方法建立體外的惡變腫瘤細(xì)胞系，但其誘變過程描述不夠詳細(xì)，只采用單一的化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)。
雖然癌癥的發(fā)生機(jī)制目前還不十分清楚，但是比較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為癌的形成是一個(gè)多步驟的過程，包括始發(fā)突變、潛伏、促癌和演進(jìn)4個(gè)階段。以往的研究表明，人乳頭狀瘤病毒在口腔正常黏膜、癌前病變和口腔鱗癌標(biāo)本中多有較高的陽性率，且癌前病變和口腔鱗癌標(biāo)本中陽性率明顯高于正常黏膜，提示HPV感染可能在口腔鱗癌的早期發(fā)生中起到重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種口腔鱗狀細(xì)胞癌體外癌變模型包括以下步驟(1)HPV16 E6/E7永生化HIOEC細(xì)胞；(2)苯丙芘體外誘導(dǎo)培養(yǎng)HIOEC細(xì)胞；(3)HIOEC-B(a)P細(xì)胞篩選；(4)HIOEC-B(a)P細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；(5)HIOEC-B(a)P細(xì)胞惡性表型鑒定。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實(shí)現(xiàn)的通過遞增濃度的化學(xué)致癌劑苯丙芘體外誘導(dǎo)HIOEC細(xì)胞，以及與促癌劑佛波酯共培養(yǎng)，篩選得到具有惡性表型的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA。通過相差顯微鏡、HE染色觀察HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞形態(tài)；通過軟瓊脂集落形成率、裸小鼠異體皮下成瘤性鑒定HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞的惡性表型。
本發(fā)明的發(fā)明原理利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染HPV 16 E6/E7可以在體外永生化正?？谇簧掀ぜ?xì)胞，永生化細(xì)胞系的建立可以作為癌變早期的研究模型。
苯丙芘是一種多環(huán)芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)，主要存在于煤煙，香煙，原油和煙熏、烤肉中，是已知的間接致癌物。PAH的代謝中間產(chǎn)物是二醇-環(huán)氧化物，由細(xì)胞色素P-450多功能氧化系統(tǒng)(cytochrome P450，CYPs)經(jīng)過兩輪循環(huán)產(chǎn)生。這些中間體相當(dāng)穩(wěn)定，能夠進(jìn)入細(xì)胞核并與DNA快速反應(yīng)，引起基因突變。由于苯丙芘是香煙或油煎、烤焦食品中常見的間接致癌物質(zhì)，需要通過CYPs代謝而成為致癌物；而在口腔組織中，舌部上皮細(xì)胞中的CYPs含量高，活性強(qiáng)，可以被煙草致癌劑誘導(dǎo)表達(dá)，這也可能是舌鱗狀細(xì)胞癌好發(fā)的原因之一。因此，本研究選擇苯丙芘為口腔化學(xué)致癌物的典型代表，在體外模擬口腔粘膜細(xì)胞接觸致癌因素的可能情況，從而模擬細(xì)胞癌變的可能啟動(dòng)階段。
啟動(dòng)化合物產(chǎn)生的遺傳性改變需要借助于促癌物激發(fā)的細(xì)胞增殖過程，從單個(gè)具有瘤性潛能的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成多細(xì)胞腫瘤。因?yàn)榇侔┪镔|(zhì)本身引起細(xì)胞增殖的變化，不能產(chǎn)生癌癥，所以細(xì)胞除了擴(kuò)增被激活外，還需要進(jìn)一步的變化。佛波酯(tetradecanoyl phorbol acetate，TPA)是巴豆油中的一種成份，是一種促癌劑。它的作用機(jī)制是可依次與細(xì)胞膜上的表皮生長因子受體和蛋白激酶C結(jié)合，模擬表皮生長因子的致有絲分裂活性，激活胞漿中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和細(xì)胞增殖。雖然TPA在口腔環(huán)境中不常見，但其作用機(jī)理同表皮生長因子等相同，可模擬該信號傳導(dǎo)通路起作用。因此，TPA在本研究中起到促癌的作用；同時(shí)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)和血清中生長因子的作用也可能起到促癌作用。
因此通過HPV16 E6/E7永生化正?？谇簧掀ぜ?xì)胞，口腔常見的化學(xué)致癌劑B(a)P誘導(dǎo)，啟動(dòng)腫瘤發(fā)生，再通過TPA促癌和連續(xù)傳代培養(yǎng)，逐步篩選得到具有惡性表型的HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞。這個(gè)過程中包含了生物因素(HPV)、化學(xué)因素(BaP、TPA)和可能的生長因子(FBS)作用因素；經(jīng)歷了從正常到永生化，到逐步惡變的過程。這樣一個(gè)多因素、多步驟、多階段的長期體外惡變過程可以在一定程度上反映口腔上皮細(xì)胞的癌變發(fā)生、發(fā)展，可以為進(jìn)一步研究口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 本發(fā)明所公開一種口腔鱗狀細(xì)胞癌多步驟、多階段癌變的體外模型其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)首先通過轉(zhuǎn)染HPV 16 E6/E7使口腔上皮細(xì)胞永生化，采用化學(xué)致癌劑苯丙芘誘導(dǎo)永生化細(xì)胞，同時(shí)復(fù)合促癌劑佛波酯誘導(dǎo)細(xì)胞惡變；這樣在生物因素(人乳頭狀瘤病毒)，化學(xué)致癌因素(苯丙芘)，促癌因素(佛波酯)以及含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)等方面體現(xiàn)了癌變過程中多因素作用的過程；(2)苯丙芘誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中采用遞增濃度，不僅避免了細(xì)胞在誘導(dǎo)過程中受細(xì)胞毒性死亡，而且充分發(fā)揮了誘導(dǎo)劑的作用效果；(3)通過連續(xù)接種不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)胞至裸鼠皮下觀察到細(xì)胞在逐步惡變過程中的成瘤能力的不同，反映了細(xì)胞惡變過程中的多階段、多步驟現(xiàn)象。


圖1顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)早期細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖2顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑和促癌劑誘導(dǎo)早期細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖3顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖4顯示永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑和促癌劑作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
圖5顯示HIOEC-B(a)P細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力。
圖6顯示HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力。
圖7顯示顯微鏡放大200倍觀察第55代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖8顯示顯微鏡放大400倍觀察第55代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖9顯示顯微鏡放大200倍觀察第69代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖10顯示顯微鏡放大400倍觀察第69代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖11顯示顯微鏡放大200倍觀察第96代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
圖12顯示顯微鏡放大400倍觀察第96代HIOEC-B(a)P細(xì)胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1.HPV16 E6/E7永生化HIOEC細(xì)胞1.1無血清改良低鈣MCDB153培養(yǎng)基MCDB153基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Sigma，USA)中補(bǔ)充10mg/L人重組表皮生長因子(Sigma，USA)，5mg/L胰島素(Novo Nordisk,USA)，0.5mg/L氫化可的松，Ca2+濃度為0.1mmol/L。
1.2正常口腔粘膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)正?？谇徽衬と∽?個(gè)月齡唇裂術(shù)中切除的口腔粘膜，PBS沖洗，II型分散酶4℃消化24小時(shí)。分離上皮層，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，以1×106/30000mm2的密度接種培養(yǎng)。
1.3正?？谇簧掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)染HPV16E6、E7開放讀碼框架重組逆轉(zhuǎn)錄病毒LXSNE6/LXSNE7以及LXSN空白在體由哈佛大學(xué)饋贈。正?？谇簧掀ぜ?xì)胞首次傳代，待細(xì)胞生長至50-70％匯合，轉(zhuǎn)染HPV16E7，G418篩選，同樣的方法再轉(zhuǎn)染HPV16E6，連續(xù)傳代培養(yǎng)建系。以轉(zhuǎn)染空白逆轉(zhuǎn)錄載體和未轉(zhuǎn)染的正常口腔上皮細(xì)胞為對照。
1.4細(xì)胞傳代細(xì)胞長至70％-80％匯合，0.05％胰蛋白和0.02％EDTA消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。
2.HIOEC細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與篩選2.1 HIOEC細(xì)胞采用Defined keratinocyte-SFM培養(yǎng)液(GIBOCO，USA)培養(yǎng)。苯丙芘(benzo(a)pyrene，B(a)P)(Sigma，USA)溶解于二甲基亞砜DMSO(Sigma，USA)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)液中B(a)P的濃度為0.1-1.2μg/ml，DMSO終濃度均為0.01％；TPA溶解于DMSO中，誘導(dǎo)濃度為0.1μg/ml，DMSO終濃度均為0.01％。體外遞增濃度、間歇誘導(dǎo)培養(yǎng)(間歇、遞增溶度培養(yǎng)細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)劑會對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，由此細(xì)胞會受到不同程度的損傷。HIOEC細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，B(a)P總體的誘導(dǎo)溶度是從0.2-1.2μg/ml遞增的，當(dāng)細(xì)胞生長受損，就適當(dāng)調(diào)整誘導(dǎo)劑溶度(降低溶度或改用正常培養(yǎng)液培養(yǎng))，待細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6個(gè)月；在第4代、第10代分別與佛波酯(tetradecanoyl phorbol acetate，TPA)共培養(yǎng)，每次作用時(shí)間24小時(shí)；誘導(dǎo)細(xì)胞第18代克隆培養(yǎng)，第21代改用含10％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM(Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium GIBOCO，USA)培養(yǎng)液培養(yǎng)。體外連續(xù)傳代培養(yǎng)1年。分別命名為HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA。
HIOEC細(xì)胞在B(a)P以及TPA誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中生長緩慢，細(xì)胞形態(tài)、生長特性均發(fā)生多次改變。在第18代篩選到一生長旺盛的克隆，改用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)，得到可以在正常生理鈣離子濃度1.5Mm、含10％FBS DMEM培養(yǎng)液中生長的細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)1年后命名為HIOEC-B(a)P。第4代、第10代HIOEC-B(a)P細(xì)胞分別與TPA共培養(yǎng)，細(xì)胞在第23代開始改用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)，得到可以在正常生理鈣離子濃度1.5Mm、含10％FBS DMEM培養(yǎng)液中生長的細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)1年。
3.HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察3.1通過相差顯微鏡觀察HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞形態(tài)在誘導(dǎo)過程中發(fā)生多種變化，HIOEC-B(a)P細(xì)胞最后HIOEC-B(a)P穩(wěn)定為多角形鋪路石樣上皮細(xì)胞，HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞則以成纖維樣細(xì)胞為主；細(xì)胞均表現(xiàn)為核漿比例增加，有多個(gè)核仁，核分裂多，可見散在瘤巨細(xì)胞。
3.2制備無菌蓋玻片細(xì)胞爬片，預(yù)冷10％中性甲醛固定30min，按常規(guī)HE染色，光鏡下觀察HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞形態(tài)。永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)早期細(xì)胞形態(tài)學(xué)(永生化細(xì)胞B(a)P誘導(dǎo)早期)見圖1；永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑和促癌劑誘導(dǎo)早期細(xì)胞形態(tài)學(xué)(永生化細(xì)胞B(a)P復(fù)合TPA誘導(dǎo)早期)見圖2；永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)(HIOEC-B(a)P細(xì)胞)見圖3；永生化上皮細(xì)胞在化學(xué)致癌劑和促癌劑作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)(HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞見圖4。
4.HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞惡性表型鑒定4.1軟瓊脂集落形成率2×DMEM培養(yǎng)液40℃保溫，收集HIOEC細(xì)胞、HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)；待1.2％瓊脂(Sigma，USA)冷卻至50-60℃，以1∶1比例與2×DMEM培養(yǎng)液混勻，鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)；待培養(yǎng)皿內(nèi)的瓊脂凝固后，同上方法將0.7％瓊脂冷卻至50-60℃，以1∶1比例與2×DMEM培養(yǎng)液混勻，加入10,000細(xì)胞/培養(yǎng)皿，混勻，鋪于下層已凝固的瓊脂上，室溫凝固后，放置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24天。加入MTT共培養(yǎng)24小時(shí)，集落顯示藍(lán)色終止培養(yǎng)，分別計(jì)數(shù)集落數(shù)，根據(jù)公式(集落形成率＝集落數(shù)/10,000×100％)計(jì)算各細(xì)胞系的軟瓊脂集落形成率。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
第70代HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞在軟瓊脂中培養(yǎng)至第8天可見有散在集落形成，生長至第12代形成較大集落，而Tca8113細(xì)胞(是一株人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，由上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立并保存)第8天即形成明顯的集落；第93代HIOEC-B(a)P細(xì)胞開始具有軟瓊脂集落形成能力。HIOEC-B(a)P細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力見圖5；HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力見圖6。
4.2免疫缺陷小鼠皮下成瘤性同細(xì)胞傳代分別消化、離心、收集HIOEC細(xì)胞、第38、50、55、69、74、96代HIOEC-B(a)P細(xì)胞和第40、49、60、65、70代HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞懸液，分別接種至6只SPF級nu/nu裸小鼠腋下皮下，每只裸鼠接種2點(diǎn)，每點(diǎn)接種8×106細(xì)胞/0.2ml。每周觀察裸鼠1次，連續(xù)觀察3個(gè)月，處死裸鼠，解剖腫瘤，計(jì)算成瘤率；標(biāo)本用10％中性甲醛固定，按常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。
HIOEC-B(a)P細(xì)胞在第55代之前接種到裸小鼠皮下均無腫塊生長，第55代細(xì)胞有腫塊形成，質(zhì)硬，直徑0.3cm左右，HE染色鏡下表現(xiàn)為有完整包膜腫塊，由大量角化物和角化細(xì)胞組成，部分細(xì)胞角化不全，包膜下有2-3層上皮細(xì)胞，局部細(xì)胞增生成團(tuán)，細(xì)胞表現(xiàn)一定的異型性；第69代細(xì)胞形成腫塊直徑0.5cm左右，HE染色鏡下表現(xiàn)為鱗狀細(xì)胞癌，腫瘤界限清楚，周邊由數(shù)層上皮細(xì)胞組成，局部細(xì)胞增生成乳頭狀，細(xì)胞分化較好，異型性明顯，病理核分裂像多見，角化部分細(xì)胞成分多，多為角化不全。第74代細(xì)胞形成的腫瘤大小與第69代無明顯差異，鏡下表現(xiàn)為典型鱗狀細(xì)胞癌，細(xì)胞分化較差，增生活躍，異型性明顯，核分裂像多見。第96代細(xì)胞接種15天后形成直徑1cm腫瘤，HE染色鏡下表現(xiàn)為典型鱗狀細(xì)胞癌，細(xì)胞分化較差，增生活躍，異型性明顯，核分裂像多見。顯微鏡放大200倍觀察第55代HIOEC-B(a)P細(xì)胞可以形成角化腫塊，細(xì)胞多為角化不全見圖7；顯微鏡放大400倍觀察第55代HIOEC-B(a)P細(xì)胞可以形成角化腫塊，細(xì)胞多為角化不全見圖8；顯微鏡放大200倍觀察第69代HIOEC-B(a)P細(xì)胞形成乳頭狀增生的腫瘤，細(xì)胞異型性明顯，核分裂像較多，其余為角化不全見圖9；顯微鏡放大400倍觀察第69代HIOEC-B(a)P細(xì)胞形成乳頭狀增生的腫瘤，細(xì)胞異型性明顯，核分裂像較多，其余為角化不全見圖10；顯微鏡放大200倍觀察第96代HIOEC-B(a)P細(xì)胞形成典型鱗狀細(xì)胞癌，角化成分明顯減少，異型性明顯，核分裂像多見圖11；顯微鏡放大400倍觀察第96代HIOEC-B(a)P細(xì)胞形成典型鱗狀細(xì)胞癌，角化成分明顯減少，異型性明顯，核分裂像多見圖12。HIOEC-B(a)P-TPA細(xì)胞目前尚未觀察到裸鼠皮下成瘤性。
權(quán)利要求
1.一種口腔鱗狀細(xì)胞癌體外癌變模型包括以下步驟(1)HPV16E6/E7永生化HIOEC細(xì)胞；(2)苯丙芘體外誘導(dǎo)培養(yǎng)HIOEC細(xì)胞；(3)HIOEC-B(a)P細(xì)胞篩選；(4)HIOEC-B(a)P細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；(5)HIOEC-B(a)P細(xì)胞惡性表型鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模型，其特征在于(2)步驟誘導(dǎo)培養(yǎng)液中苯丙芘的濃度為0.1-1.2μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模型，其特征在于(3)步驟用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模型，其特征在于(5)步驟用軟瓊脂集落形成率鑒定HIOEC-B(a)P細(xì)胞惡性表型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模型，其特征在于(5)步驟用免疫缺陷裸小鼠皮下成瘤性鑒定HIOEC-B(a)P細(xì)胞惡性表型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外模型，其特征在于(4)步驟中HIOEC-B(a)P穩(wěn)定為多角形鋪路石樣上皮細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外模型，其特征在于第93代HIOEC-B(a)P細(xì)胞開始具有軟瓊脂集落形成能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外模型，其特征在于HIOEC-B(a)P細(xì)胞在第55代有腫塊形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外模型，其特征在于HIOEC-B(a)P細(xì)胞在第69代有腫塊，HE染色鏡下表現(xiàn)為鱗狀細(xì)胞癌。
全文摘要
本發(fā)明的提供一種口腔鱗狀細(xì)胞癌體外癌變模型包括以下步驟(1)HPV16 E6/E7永生化HIOEC細(xì)胞；(2)苯丙芘體外誘導(dǎo)培養(yǎng)HIOEC細(xì)胞；(3)HIOEC－B(a)P細(xì)胞篩選；(4)HIOEC－B(a)P細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；(5)HIOEC－B(a)P細(xì)胞惡性表型鑒定。本發(fā)明在體外模擬口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生建立癌變模型；為進(jìn)一步研究口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 文檔編號A61K49/00GK1730102SQ200510028308
公開日2006年2月8日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者潘紅芽, 張志愿, 曹俊, 帕提曼, 周曉健, 陳萬濤, 李江, 張萍, 何榮根 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院