專利名稱：：一種重金屬污染螺旋藻的處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于環(huán)境生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用被重金屬鉛、鎘、砷污染的螺旋藻提取藻藍蛋白，并以其藻渣為主要基質(zhì)吸附清除污染水體中鉛、鎘、砷的方法。
背景技術(shù)：
：我國目前除了新疆和西藏，其他省份幾乎都有螺旋藻保健食品的生產(chǎn)企業(yè)，中國保健協(xié)會保健品市場工作委員會專家王玨說"實力較小的企業(yè)存在重金屬等含量超標的問題。這樣的保健食品不僅起不到螺旋藻應(yīng)有的保健功效，還可能危害消費者的身體健康。"一些學(xué)者也撰文指出"同樣不可忽視的是重金屬污染。如果水中含有汞、鉛等有毒元素，很容易被螺旋藻吸收、富集。"國內(nèi)已有廠家開始在積極探尋應(yīng)對措施，將重金屬污染控制的技術(shù)難題公開招標解決。本發(fā)明人做的相關(guān)試驗也表明，螺旋藻的重金屬污染是確實存在的。其嚴重程度甚至超過文獻報道。2008年昆明市對市面上23種螺旋藻抽査結(jié)果顯示，主要質(zhì)量問題是對食用者的健康和安全構(gòu)成損害和危害的重金屬類的鉛和鎘超標問題。藻粉成品在培養(yǎng)加工過程中確實存在著重金屬污染的可能，其中尤以鉛、砷、鎘等重金屬污染危害最為嚴重。在如下的標準工藝流程中，重金屬污染的渠道有這么幾種可能1)配制培養(yǎng)基的水源被重金屬污染，用工廠廢水養(yǎng)殖螺旋藻，廢氣攪拌培養(yǎng)池，廢水廢氣本身就是重金屬污染，或者水源本身重金屬檢測未超標，但是由于培養(yǎng)液的反復(fù)更換，重金屬累積后培養(yǎng)液污染；2)培養(yǎng)基配制的營養(yǎng)鹽純度不高，重金屬含量超標；3)室外跑道式培養(yǎng)池的開放培養(yǎng)，大氣干濕沉降中所含的重金屬進入池內(nèi)污染培養(yǎng)液；4)采收過程中，聚氯乙烯塑料板材被廣泛應(yīng)用，這種材質(zhì)需要用鉛做穩(wěn)定劑，鉛可以逐漸遷移于藻泥中。質(zhì)量是任何食品，以及動物飼料的生命線，螺旋藻作為一種被廣泛接受的保健品，更需強調(diào)其嚴格的質(zhì)量控制標準。如上分析，重金屬在幾個重要環(huán)節(jié)都可以造成污染，加之螺旋藻本身極易富集重金屬，螺旋藻粗加工產(chǎn)品，即藻粉、膠囊、片劑等，以及高蛋白開口餌料，其鉛、鎘、砷重金屬污染問題都是在不同程度上存在的，當然，就文獻報道，以及發(fā)明人的試驗結(jié)果分析，重金屬污染程度還是比較輕的，也就是超出規(guī)定標準不是很多。鉛、鎘、砷這三種重金屬污染也是目前我國食品安全研究中亟待關(guān)注的熱點。目前大部分中小螺旋藻生產(chǎn)企業(yè)是很難達到嚴格的螺旋藻生產(chǎn)質(zhì)量標準的，商家在物質(zhì)利益的巨大驅(qū)動力下，要使這種被重金屬污染的螺旋藻不進入市場的難度是很大的，縱使不生產(chǎn)成保健品，肯定也將通過各種渠道流入市場，變相成為動物飼料，在下一級生物鏈上間接危害人體健康。那么如何更理性地、從根本上來解決這個問題呢？目前研究表明，螺旋藻主要是細胞壁在吸收重金屬，生物吸附在重金屬累積中占了絕對優(yōu)勢，約為90%;通過生物累積即進入細胞內(nèi)的重金屬是很少量的。在我們的試驗研究中，得到提純的藻藍蛋白的重金屬檢測都未檢出，或者在標準范圍內(nèi)，也就是是符合安全要求和市場準入標準的。因此，得到藻細胞內(nèi)未受重金屬污染的經(jīng)濟價值遠高于藻粉的藻藍蛋白，就是很好的處理重金屬污染螺旋藻的辦法。退一步說，由于藻藍蛋白價格數(shù)百倍地高于螺旋藻粉，如果在提純之后尚存重金屬污染，商家也愿意投資去除污染，還有利潤空間。藻藍蛋白在食品業(yè)可以用來做很有市場吸引力的藍色口香糖，冰激凌，飲料、餅干等等；化妝品業(yè)則用來做高級眼影和唇膏等；尤其值得一提的是，藻藍蛋白已經(jīng)被廣泛接受的具有增強免疫機能和抗癌的藥用功效這一點對商家和消費者而言都很有號召力；高純度的藻藍蛋白可以作為細胞以及生物大分子的熒光標記，廣泛運用于生物醫(yī)學(xué)和高靈敏度熒光技術(shù)的研究。螺旋藻具備很強的重金屬富集能力，發(fā)明人的實驗研究表明受重金屬輕度污染螺旋藻依舊具備很強的富集重金屬能力，破碎細胞壁提取藻藍蛋白藻渣具備同樣好的富集能力。在發(fā)明人的實驗中，受重金屬輕度污染螺旋藻渣的鉛、鎘、砷的富集效率、清除容量都和未受污染完整螺旋藻、未受污染螺旋藻渣在統(tǒng)計分析上無顯著差異。藻類對金屬離子的吸附主要是與藻細胞壁提供的功能基團有關(guān)。羧基多糖在藻類細胞壁中的含量相對較高，在螺旋藻中，多糖是除蛋白質(zhì)外的第二類主要組分，在鹽澤螺旋藻中含量達18%23%，在鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻等藻株中含量占6%~9%。在所有官能團中，多糖提供的羧基最為豐富，也最為重要，占藻細胞表面將近70%的可滴定位點。包括羧基在內(nèi)，這些基團有些可以失去質(zhì)子而帶負電荷，靠靜電引力吸附金屬離子；有的帶孤對電子，可與金屬離子形成配位鍵而絡(luò)合吸附金屬離子，用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜分析表明，鎘與藻細胞表面的羧基基團形成了橋連或二齒狀結(jié)構(gòu)。破碎螺旋藻渣細胞壁基團充分暴露在外，更快、更多地與重金屬離子結(jié)合。這是本專利的理論和實踐基礎(chǔ)。本發(fā)明旨在利用微藻生物技術(shù)，轉(zhuǎn)換被重金屬污染螺旋藻的加工方向，提取藻藍蛋白賦予商家可觀利潤，同時利用已被重金屬污染的，不適宜用于人類保健品，也不應(yīng)當用于動物飼料的螺旋藻渣用于吸附清除重金屬。
發(fā)明內(nèi)容針對目前有相當數(shù)量被重金屬污染螺旋藻的市場生產(chǎn)狀況，以及鮮螺旋藻和螺旋藻干粉在市場上已經(jīng)呈現(xiàn)出供大于求的局面，但是極具商業(yè)開發(fā)價值的藻藍蛋白是深加工螺旋藻的很好出路，以及重金屬污染水體治理困難、成本高昂的現(xiàn)狀，我們在此提供一種先破被重金屬污染螺旋藻壁提取藻藍蛋白，再利用其剩余螺旋藻渣強大的重金屬富集能力，將被重金屬污染的螺旋藻渣固定化制作成重金屬吸附柱用以修復(fù)被重金屬污染水體的方法，涉及重金屬污染螺旋藻的高效利用以及重金屬污染水體修復(fù)技術(shù)，能廣泛應(yīng)用于不能通過市場準入的重金屬污染螺旋藻的無害化、高附加值處理。技術(shù)方案如下1)將被重金屬污染螺旋藻鮮藻或藻粉利用反復(fù)凍融方法獲得藻藍蛋白粗提液，離心獲得藻藍蛋白上清液，上清液經(jīng)硫酸銨分級沉淀，離子交換樹脂純化后，依照不同純度等級供不同目的的商業(yè)利用，剩余螺旋藻渣干燥備用；2)將螺旋藻渣和粉碎花生殼以100:1比例混合，然后用海藻酸鈉固定化螺旋藻渣，制成螺旋藻重金屬吸附劑，處理重金屬污染廢水，此技術(shù)改變了藻體的存在形式以便其像離子交換樹脂或是活性炭一樣能被方便使用，并使得改善后的藻渣具有一定的顆粒尺寸，足夠的粒子強度、多孔性、親水性和化學(xué)惰性，提高了重金屬污染廢水處理效率，提高了處理負荷，固液分離效果好，且可用1MNaCl溶液洗脫方式很方便地將重金屬回收，重新利用，有效防止了二次污染。技術(shù)方案之1)中利用螺旋藻鮮藻泥較之螺旋藻粉能獲得純度更高的藻藍蛋白粗提液，如附圖1重金屬污染螺旋藻粉和鮮藻藻藍蛋白粗提液吸收光譜，藻藍蛋白粗提物的吸收光譜的主峰在618nm，和藻藍蛋白的特征光譜相符，但是最通常的情況獲得的大量原材料是藻粉，發(fā)明人的實驗表明，二者均可以用于提取藻藍蛋白，如附圖2重金屬污染螺旋藻粉純化過程吸收光譜，附圖3重金屬污染螺旋藻鮮藻藻藍蛋白純化過程吸收光譜；最終鮮藻泥和藻粉都可以獲得試劑純的藻藍蛋白，如附圖4藻藍蛋白質(zhì)譜所示，質(zhì)譜是純物質(zhì)鑒定的最強有力的工具。質(zhì)譜分析藻藍蛋白的a和(3亞基，分子量分別是18，122和19，202kDa;技術(shù)方案之l)中利用反復(fù)凍融法只是獲得藻藍蛋白粗提物的一種方法。藻藍蛋白的粗提物的獲得還可以利用以下傳統(tǒng)方法溶菌酶破碎法，超聲波破碎法，玻璃珠攪拌研磨破碎法，硅鹽破碎，高壓勻漿器機械破碎等每種方法都有其優(yōu)點，也有其不足，可以因地制宜采取合適方法，或者聯(lián)合應(yīng)用，比如反復(fù)凍融配合微波破碎等；技術(shù)方案之1)中剩余螺旋藻渣干燥備用之干燥方法，在不造成二次污染的前提下，可以采取最經(jīng)濟簡便的干燥方法，晾干、風干都可以，該發(fā)明技術(shù)方案對干燥程度要求不嚴格；技術(shù)方案之2)中花生殼就是普通食用花生殼，可以從食品加工企業(yè)獲得，將花生殼用粉碎機粉碎到40目的粒度后即可作為藻渣重金屬吸附柱的輔料。本專利的特色和創(chuàng)新之處主要在于另辟蹊徑，換一個思路處理重金屬污染螺旋藻，變廢為寶，最大化其經(jīng)濟效益，從根本上提供了一種杜絕受污染螺旋藻進入食品和詞料市場的可能方案。巧妙利用輕度重金屬污染僅只停留在細胞壁上的特點從而獲得符合安全標準的，同時有更高經(jīng)濟價值的螺旋藻深加工產(chǎn)品。巧妙變害為寶，將原本可能危害人類健康的受到重金屬污染的螺旋藻回收利用，而且是高值利用，每克藻粉可以提取藻藍蛋白50毫克，高度提純的藻藍蛋白價格十分昂貴，1996年價格為110美元/毫克，1998年價格上漲到147.2美元/毫克，近年價格波動在150美元/毫克到180美元/毫克區(qū)間，這給商家很大的利潤空間；本專利的創(chuàng)新點之二就是利用低成本每克藻粉可以吸附100-120毫克重金屬，吸附的重金屬解吸后，重金屬可以回收利用，不會產(chǎn)生二次污染，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益;本專利制作的螺旋藻重金屬吸附劑在低濃度的重金屬污染水體中依舊可以選擇性去除重金屬離子；本專利處理效率高，pH值和溫度條件范圍寬，反應(yīng)迅速，可以處理大容量廢水，吸附容量大，去除率高，吸附容量鉛〉160mg/g，鎘〉180mg/g,砷〉100mg/g，而且整個吸附過程可以在很寬的物理化學(xué)條件(如溫度、pH值)下操作，吸附的金屬易于洗脫，利于吸附材料的重復(fù)利用和金屬的回收。具體實施例方式實施例-樣品來源市售螺旋藻，隨機取樣；檢測方法原子吸收和原子熒光光譜測定，標準按照《食品衛(wèi)生檢驗方法-理化部分》，《實用螺旋藻粉國家標準》(GB/T16919-1997)20份市售不同品牌螺旋藻的檢驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1)將檢測的到的重金屬超標的螺旋藻粉，一般均為鈍頂螺旋藻，加入適量去離子水，用反復(fù)凍融方法破壁，破壁后離心，取上清繼續(xù)藻藍蛋白純化，沉淀則干燥待用；2)上清液10，000g離心，30min。離心后上清用20%固體硫酸銨鹽析沉淀，細心充分攪拌30min，然后10，OOOXg離心10min，傾倒掉黃綠色的沉淀，亮藍的上清再放入固體硫酸銨，達到50%的飽和度，加入時動作要輕，要緩慢，然后輕柔攪拌10min后，靜置2小時，10，OOOXg離心10min，棄去黃綠色上清，藍色沉淀用0.1M冰醋酸溶液溶解(pH4.8)，控制整個體積不要超過200ml,然后再離心10，OOOxg10min，棄去沉淀，上清快速通過SephadexG-25的柱子脫鹽，脫鹽后的藻藍蛋白溶液用0.001M的磷酸緩沖液稀釋到100ml，加入固體硫酸銨到25%飽和度，緩慢攪拌30min，然后10，OOOxg離心lOmin，棄去沉淀，上清繼續(xù)加硫酸銨到40%的飽和度，靜置兩小時之后，最后一次IO,OOOxg離心10min，沉淀就是中純度的藻藍蛋白，用不超過20ml的磷酸緩沖液(O.OOIM，pH7.0)溶解后，用SephadexG-25柱子快速脫鹽；3)柱長(1.6xl0cm)的DEAE-SepharoseFastFlow,用O.OOIMK-phosphate磷酸緩沖液(pH7.0)預(yù)平衡，脫鹽后的藻藍蛋白上樣。在用40ml同樣的緩沖液沖洗柱子之后，用梯度混合的方式線性增加洗脫液濃度，從0到0.25M的NaCl洗脫藻藍蛋白，與此同時，洗脫液的pH值從7.0降低到5.3，pH的變化用pH211(Hana，America)嚴格監(jiān)測，洗脫速度是2ml/min，整個洗脫過程通過Pharmaciaproteinfastpurificationsystem(a，Sweden)控制，藻藍蛋白組分在NaCI濃度0.10到0.20M之間時洗脫出來，蛋白質(zhì)快速純化系統(tǒng)統(tǒng)步掃描記錄各洗脫組分的吸收光譜，掃描范圍從200nmto800nm，通過這個數(shù)據(jù)監(jiān)測，可以監(jiān)測洗脫組分的純度。收集A615/28G〉4.0的組分，用SephadexG-25柱子再次脫鹽，然后用聚乙二醇濃縮，凍干保存。4)3%藻酸鈉和藻渣、40目粒度花生殼以200:100:1的體積比混合均勻，用硅膠管和蠕動泵相接，勻速滴入0.05mol/lCaCl2溶液中，CaCl2溶液中放一個大轉(zhuǎn)子，用磁力攪拌器勻速攪拌，傾去溶液，用去離子水沖洗1次，重新加入0.05mol/lCaCl2溶液，于室溫平衡6小時，傾去CaCl2溶液，用去離子水清洗2次后待用；5)將制備待用的藻渣顆粒填充入玻璃過濾柱體內(nèi)(5X45cm)，將不同重金屬鎘、鉛、砷污染度的水經(jīng)蠕動泵勻速通過柱體，在柱體下端出口處收集清潔水體，利用原子熒光光譜法測定水體中重金屬含量，實驗結(jié)果表明，此重金屬柱的重金屬吸附率高效快捷，吸附容量鉛〉160mg/g，鎘〉180mg/g，砷〉100mg/g，多數(shù)狀態(tài)下10mg/L鎘能降低到0.01mg/L，達到國家污水排放標準，試驗中平均指標如下表鎘鉛砷清除率％959278最佳起始清除濃度mg/g10126吸附容量mg/g1801601006)柱子在連續(xù)使用10小時左右可進行清洗再生，用2MNaCl溶液勻速洗脫，洗脫液統(tǒng)一回收處理；7)也可以將制備好的藻渣顆粒用大網(wǎng)袋裝上，投入污染水體中，30min后撈起網(wǎng)袋，反復(fù)多次，也可以達到清潔效果。8權(quán)利要求1.一種重金屬污染螺旋藻的處理方法，其主要過程包括確定重金屬鉛、鎘、砷主要吸附在受污染螺旋藻藻壁，可提取出不受污染的藻藍蛋白，剩余藻渣用于重金屬污染污水處理的生物吸附劑；其特征是(1)用反復(fù)凍融、超聲破碎等傳統(tǒng)方法獲取受污染螺旋藻藻藍蛋白粗提液，用改進的硫酸銨分級鹽析技術(shù)，以及離子交換層析柱純化獲得高純度藻藍蛋白；(2)用海藻酸鈉固定化破壁后剩余藻渣與粉碎花生殼混合物，獲得螺旋藻渣生物吸附劑，用于重金屬鉛、鎘、砷單一或復(fù)合污染水體的清潔處理；2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的螺旋藻，其中螺旋藻為兩大經(jīng)濟螺旋藻種之鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻，同時該螺旋藻在生產(chǎn)、收獲、包裝、運輸?shù)冗^程中被重金屬輕度污染，略超過中國食品重金屬標準；3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生殼，其中花生殼為普通市售花生的外殼。全文摘要一種利用被重金屬輕度污染的螺旋藻提取藻藍蛋白，并以其藻渣為主要基質(zhì)吸附清除污染水體中鉛、砷、鎘的方法，屬于環(huán)境生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法可廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)而未達到市場準入標準的輕度重金屬污染螺旋藻的無害化處理。本方法的主要特點在于利用輕度重金屬污染僅只停留在細胞壁上的特點，用改進純化方法獲得符合安全標準的，同時有更高經(jīng)濟價值的螺旋藻深加工產(chǎn)品藻藍蛋白，附圖為提取出藻藍蛋白的質(zhì)譜圖；并固定化其藻渣，制備獲得鉛、砷、鎘等重金屬生物吸附劑。文檔編號A23L1/015GK101455285SQ200810182500公開日2009年6月17日申請日期2008年12月9日優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日發(fā)明者丁淮劍,季宏兵,毅朱,朱先芳,江用彬申請人:首都師范大學(xué)