專(zhuān)利名稱：通過(guò)添加銅離子來(lái)使植物轉(zhuǎn)化效率提高的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌來(lái)高效地進(jìn)行將基因?qū)氲街参锊?料中的方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)土壤桿菌法的基因?qū)?，是利用土壤桿菌機(jī)能的植物轉(zhuǎn)化方法。土 ;裏細(xì)菌土i裏桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)具有下列才幾能感染植物時(shí)，使 作為與土壤桿菌病原性相關(guān)的Ti(tumor-inducing)質(zhì)粒的一部分的T-DNA重 組到植物基因組中。根據(jù)土壤桿菌法的植物轉(zhuǎn)化方法是下述方法制備將 Ti質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)域置換為希望向植物染色體組中導(dǎo)入的基因的轉(zhuǎn)化用 質(zhì)粒，使用制備成具有該轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒代替了 Ti質(zhì)粒的土壤桿菌，通過(guò)利用 土壤桿菌的上述機(jī)能，將希望向該植物染色體組中導(dǎo)入的基因?qū)氲街参锶?色體組中的方法。
由于認(rèn)為土壤桿菌僅以雙子葉植物為宿主，并不寄生在單子葉植物中， 當(dāng)初，根據(jù)土壤桿菌法的植物轉(zhuǎn)化法主要是作為雙子葉植物轉(zhuǎn)化法來(lái)發(fā)展 的。之后，進(jìn)行了關(guān)于根據(jù)土壤桿菌法向單子葉植物進(jìn)行基因?qū)氲母鞣N各 樣的嘗試，開(kāi)發(fā)了具有強(qiáng)病原性土壤桿菌 一部分病原性基因的超級(jí)雙元載體 (super binary vector),據(jù)報(bào)告，在使用該超級(jí)雙元載體的方法中，在水稻、 玉米等單子葉植物中也穩(wěn)定，可以效率比較高的進(jìn)行轉(zhuǎn)化(例如參考特許
第2, 649， 287號(hào)公報(bào);特許第3， 329, 819號(hào)公報(bào);Hiei,Y.,等，(1994),The Plant Journal, Vol.6,p.271-282;以及Ishida,Y.,等,(1996),Nature Biotechnology, Vol.4,p.745-750)。而且，報(bào)道了根據(jù)土壤桿菌法也在小麥、大麥以及高梁這 樣的單子葉植物中轉(zhuǎn)化的成功例子(例如參考Cheng, M.,等，(1997), Plant Physiol" Vol.115, p.971-980; Tingay，S"等,(1997),Plant J" Vol. 11,p. 1369-1376;以 及Zhao, Z-Y.,等,(2000),Plant Mol.Biol.， Vol.44， p.789-798),達(dá)到了在單子葉植物中也可廣泛進(jìn)行根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化。
根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化法， 一般的具有效率高，被導(dǎo)入的基因復(fù)制數(shù)
少，不用將叫做T-DNA的特定結(jié)構(gòu)域片斷化就可導(dǎo)入，因?yàn)橥ㄟ^(guò)短期培養(yǎng) 就可獲得轉(zhuǎn)化體所以培養(yǎng)變異少等很多優(yōu)異的特征。因此，現(xiàn)在它作為在不 論雙子葉還是單子葉的很多種類(lèi)的植物中最有用的轉(zhuǎn)化手段而廣泛應(yīng)用。
根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化方法，根據(jù)植物種類(lèi)，受試材料、培養(yǎng)的培養(yǎng)基 的組成不同，但共同點(diǎn)是不管是哪種植物，都是使組織材料與土壤桿菌懸 濁液接觸，在共存培養(yǎng)后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選，制備出轉(zhuǎn)化植物。 一般地， 形成材料的植物組織，視需要進(jìn)行滅菌處理，但除此之外沒(méi)有特別的處理， 進(jìn)行土壤桿菌的感染(例如參考Rogers,S，G.，等,(1988), Method for Plant Molecular Biology, p.423-436,CAAcademic Press Inc.;Visser，R.G.F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5:l-9, Kluwer Academic Publishers; McCormick, S,, (1991), Plant Tissue Culture Manual, B6:l-9, Kluwer Academic Publishers;以 及Lindsey, K.，等(1991)， Plant Tissue Culture Ma畫(huà)l， B7:l-13， Kluwer Academic Publishers)。
根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化在很多種類(lèi)的植物中都有報(bào)道，但也存在其轉(zhuǎn)化 效率隨植物的種類(lèi)、基因型以及形成材料的組織而有很大不同(例如參考 Potrykus, L，等，(1998), Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc., p.ll9-159)的問(wèn)題。在培育導(dǎo)入實(shí)用基因的品種時(shí)，制備出很多的轉(zhuǎn)化植物 是必要的，通過(guò)一年而高效率地穩(wěn)定地獲得轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)開(kāi)發(fā)是重要的。 還有，不依賴植物的種類(lèi)或基因型的轉(zhuǎn)化法，在高效率地培育實(shí)用品種方面 是極為有用的。而且，不依賴于形成材料的植物組織的轉(zhuǎn)化法的開(kāi)發(fā)，也在 高效率地促進(jìn)轉(zhuǎn)化方面是必要的。
開(kāi)發(fā)象這樣地使基因?qū)胄侍岣叩姆椒?、或者是基因?qū)肜щy的植物 種類(lèi)或基因型也能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法是重要的。到現(xiàn)在，為了獲得效率良好的 轉(zhuǎn)化植物，培養(yǎng)基組成的研究、標(biāo)記基因或者啟動(dòng)子的改變、受試材料的研 究、受試材料處理方法的研究等各個(gè)側(cè)面的很多技術(shù)都有報(bào)道。例如，在受 試材料的處理方法方面，報(bào)道了通過(guò)破壞組織結(jié)構(gòu)來(lái)提高感染效率的方法， 還有，不破壞組織結(jié)構(gòu)將植物組織離心處理(例如參考國(guó)際公開(kāi)第02/12520 號(hào)小冊(cè)子；特開(kāi)2000-342256)、加熱處理(例如參考特開(kāi)2000-342255;特開(kāi)2000-342253)的方法等。此外，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)了將植物組織加壓處理對(duì) 提高基因?qū)胄适怯杏玫?結(jié)果還未發(fā)表)。
此外，特別是在單子葉植物中，還存在玉米在根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化中 的轉(zhuǎn)化效率與水稻相比較低的問(wèn)題。到目前，為了提高根據(jù)土壤桿菌法的玉 米轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)行了各種各樣的嘗試(例如參考Negrotto,D.,等， (2000), Plant Cell Reports, Vol.l9,p.798-803;Zhao,Z-Y"等，(2001), Mol. Breed., Vol.8, p.323-333; Frame,B,R.，等，(2002)， Plant Physiol.，VoU29,p.13-22;以及 Ishida,Y"等，(2003), Plant Biotechnology，Vol.l4,p.57-66)。作為為了提高土壤 桿菌法的玉米轉(zhuǎn)化效率的種種嘗試，進(jìn)行了在N6基本培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞 篩選(例如參考Zhao,Z-Y.,等,(2001)， Mol.Breed., Vol,8，p.323-333)、在培養(yǎng)基 中添加硝酸銀以及羧千西林(例如參考Zhao,Z-Y,等,(2001)， Mol.Breed.， Vol.8，p.323陽(yáng)333;以及Ishida，Y"等,(2003),Plant Biotechnology，Vol.l4,p.57-66)、 在共存培養(yǎng)基中添加半胱氨酸(例如參考Frame,B.R.,等，(2002)， Plant Physiol.,Vol.l29,p.l3-22)等，但其效果還是較低。對(duì)于象玉米這樣的，是主要 谷物而轉(zhuǎn)化效率低的植物，不只是在制備實(shí)用轉(zhuǎn)化植物的時(shí)候、而且在確認(rèn) 新的基因效果的時(shí)候，也希望有轉(zhuǎn)化效率更高的轉(zhuǎn)化方法。
硫酸銅作為微量無(wú)機(jī)鹽存在于植物組織培養(yǎng)的多種培養(yǎng)基中。通常，在
植物組織培養(yǎng)基中含有的硫酸銅的濃度是O.l)iM。近年來(lái)，有報(bào)道在單子
葉植物的組織培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加比通常高出50-
500倍或500倍以上的硫酸銅顯示出種種效果。Ghaemi們(參考Ghaemi, M.，
等，(1994), Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Vo1.36, p.355-359)報(bào)道，通過(guò)
將小麥的花藥在含有10mg/l的硫酸銅和2.5~5mg/l的硝酸銀的培養(yǎng)基中培
養(yǎng)，提高了胚狀體(embryoid)的形成率。Zhang們(參考Zhang,S.,等，(W99),Plant
Cell Reports, VoU8,p.959-966)報(bào)道，通過(guò)將由完全成熟的大麥種子發(fā)芽的形
成的小苗在含有5pM硫酸銅和30g/l麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提高了苗條
分裂組織培養(yǎng)(shoot meristematic cultures:SMCs)的誘導(dǎo)率。認(rèn)為麥芽糖在減
少褐變組織方面具有效果，硫酸銅在促進(jìn)苗條分裂組織培養(yǎng)被誘導(dǎo)時(shí)的小苗
發(fā)育方面具有效果。此外，在通過(guò)將未成熟胚在含有硫酸銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)
而得的愈傷組織中，再分化率和每個(gè)愈傷組織的再分化植物數(shù)增大，這在大
麥(例如參考Dahleen， L.S.， (1995), Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Vol. 43,p.267-269;以及Cho， M-J,等，(1998)， Plant Science, Vo1.138， p.229-244)和水 稻(例如參考Sah畫(huà)at， A.K.和Chand, S., (1999), J. Plant Physiol" Vol. 154, p.517-522)中有報(bào)告。而且，用含有硫酸銅的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的具有綠色再分化 能力的組織，被認(rèn)為是適合作為轉(zhuǎn)化材料(例如參考Visser， R.G.F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5:l-9, Kluwer Academic Publishers; 以及 McCormick, S.， (1991)， Plant Tissue Culture Manual, B6:l-9， Kluwer Academic Publishers)。
Ishida們(參考Ishida,Y.，等,(2003)，Plant Biotechnology，Vol.l4，p.57-66)將接
種了土壤桿菌、進(jìn)行了共存培養(yǎng)的玉米(品種是H99)未成熟胚，在含有1~ 100nM硫酸銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，考察從未成熟胚形成的愈傷組織。用含有 1 ~ 10 p M硫酸銅的培養(yǎng)基，愈傷組織形成率提高，但其效果很微弱。
象上述那樣通過(guò)在培養(yǎng)基中添加高濃度的硫酸銅，在單子葉植物的組織 培養(yǎng)中可見(jiàn)種種效果的情況有所報(bào)道。然而，添加含銅離子的金屬鹽對(duì)基因
導(dǎo)入效率以及/或轉(zhuǎn)化效率帶來(lái)的效果的調(diào)查報(bào)告，現(xiàn)在還沒(méi)有。 專(zhuān)利文獻(xiàn)l:特許第2，649,287號(hào)乂>凈艮 專(zhuān)利文獻(xiàn)2:特許第3,329,819號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開(kāi)第02/12520號(hào)小冊(cè)子 專(zhuān)利文獻(xiàn)4:特開(kāi)2000-342256 專(zhuān)利文獻(xiàn)5:特開(kāi)2000-342255 專(zhuān)利文獻(xiàn)6:特開(kāi)2000-342253 專(zhuān)利文獻(xiàn)7:美國(guó)專(zhuān)利第6,235,529號(hào)說(shuō)明書(shū) 專(zhuān)利文獻(xiàn)8:美國(guó)專(zhuān)利第6,541,257號(hào)說(shuō)明書(shū) 專(zhuān)利文獻(xiàn)9:國(guó)際公開(kāi)第95/06722號(hào)小冊(cè)子
非專(zhuān)利文獻(xiàn)l: Hiei，Y.,等，(1994)， The Plant Journal, Vol.6， p.271-282. 非專(zhuān)利文獻(xiàn)2: Ishida, Y.,等，(1996), Nature Biotechnology, Vol. 4， p.745-750.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)3: Cheng, M.,等，(1997), Plant Physiol.， Vol.115, p.971-980. 非專(zhuān)利文獻(xiàn)4: Tingay, S"等，(1997), Plant J" Vol.11, p.1369-1376. 非專(zhuān)利文獻(xiàn)5: Zhao， Z-Y.，等，(2000)， Plant Mol. Biol" Vol. 44, p.789-798. 非專(zhuān)利文獻(xiàn)6: Rogers, S, G"等，(19S8), Method for Plant MolecularBiology, p.423-436, CA:Academic Press Inc.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)7: Vlsser，R.G.R，(1991),Plant Tissue Culture Manual,B5:l-9, Kluwer Academic Publishers.
非專(zhuān)利丈獻(xiàn)8: McCormick,S.,(1991)， Plant Tissue Culture Manual,B6:I誦9， Kluwer Academic Publishers.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)9: Lindsey，K.，等(1991), Plant Tissue Culture Manual,B7:l-13， Kluwer Academic Publishers.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)10: Potrykus，I.，等,(1998),Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc.,p. 119-159.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)11: Negrotto，D.，等,(2000),Plant Cell Reports, Vol. 19，p.798-803.
Zhao,Z-Y"等，(2001), Mol.Breed.， Vol.8，p.323-333. Frame,B.R.,等，(2002), Plant Physiol.,Vol.l29，p. 13-22. Ishida,Y.,等,(2003),Plant Biotechnology, VoU4,p.57-66. Ghaemi,M.，等,(1994)，Plant Cell,Tissue and Organ Culture,
非專(zhuān)利文獻(xiàn)12: 非專(zhuān)利文獻(xiàn)13: 非專(zhuān)利文獻(xiàn)14: 非專(zhuān)利文獻(xiàn)15: Vol.36,p.355-359.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)16: Zhang，S"等,(1999),Plant Cell Reports，Vol.l8,p.959-966.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)17: Dahleen,L.S"(1995), Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Vol.43，p,267-269.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)18: Cho,M-J,等,(1998),Plant Science,Vol.l38,p.229-244.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)19: Sahrawat,A.K.和Chand,S.,(1999)，J.Plant Physiol., Vol.l54， p.517-522.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)20: Trick，H.N.和Finer,J丄,(1997)，Transgenic Research, Vol.6, p.329-336.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)21: Amoah，B.，等，(2001), Journal of Experimental Botany, Vol.52，p.ll35-1142.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)22: Hoekema,A,等,(1983),Nature，Vo1.303, p.179-180.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)23: Komari,T.和Kubo T.,(1999)， Methods of Genetic Transformation:Agrobacteriuni tumefaciens. In Vasil, I.K.(ed.)Molecular improvement of cereal crops.,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,p.43-82.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
本發(fā)明所要解決的課題在于，開(kāi)發(fā)與現(xiàn)有的通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌向植物 中導(dǎo)入基因的方法中的植物基因?qū)胄氏啾龋咝实剡M(jìn)行基因?qū)氲?方法。還有，開(kāi)發(fā)與現(xiàn)有的通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌向植物中導(dǎo)入基因的方法中 的由植物受試組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖率相比，更高效率地進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖的 方法。還有，本發(fā)明所要解決的課題在于開(kāi)發(fā)使用前述方法制作出轉(zhuǎn)化植物 的方法。
解決課題的手段
本發(fā)明者們?yōu)榻鉀Q上述問(wèn)題銳意研究努力的結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用提高 了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基以土壤桿菌屬細(xì)菌向植物進(jìn)行基因?qū)?，與使用含有 通常濃度的金屬鹽的培養(yǎng)基時(shí)相比，獲得穩(wěn)定高效率的基因?qū)?，以及由?因?qū)氲慕M織的穩(wěn)定高效率的細(xì)胞增殖。而且，發(fā)現(xiàn)使用提高了金屬鹽濃度 的培養(yǎng)基進(jìn)行基因?qū)耄偌由显谑雇寥罈U菌屬細(xì)菌感染植物材料之前，進(jìn) 行加熱、離心處理的話，獲得穩(wěn)定更高效率的基因?qū)?。此外，就基因?qū)?了的植物材料，進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的篩選，發(fā)現(xiàn)使用提高了金屬鹽濃度的培 養(yǎng)基進(jìn)行基因?qū)肓说闹参锊牧?，與使用含有通常濃度的金屬鹽的培養(yǎng)基時(shí) 相比，轉(zhuǎn)化效率飛躍性地提高。
因此，本發(fā)明是關(guān)于下述方法，其包括
1) 將植物材料進(jìn)行處理，
2) 使土壤桿菌感染植物材料，
通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌來(lái)進(jìn)行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒?，其特征?br> 于，在上述1)以及/或2)的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培 養(yǎng)基。
在本發(fā)明方法中，在培養(yǎng)基中高濃度添加的金屬鹽是含銅離子的金屬 鹽。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選金屬鹽是硫酸銅或葡糖酸銅，最優(yōu)選疏酸銅。辟u(mài) 酸銅中包括無(wú)水鹽以及含水鹽，不限定于任何一種。
在本發(fā)明方法中，所說(shuō)提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基是指與作為本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員熟知的N6基本培養(yǎng)基、MS(LS)基本培養(yǎng)基、B5基本培養(yǎng)基、NN基本培養(yǎng)基、NT基本培養(yǎng)基、Kao的基本培養(yǎng)基、White的基本培養(yǎng)基 等基本培養(yǎng)基中含有的金屬鹽的濃度相比，含有高濃度的金屬鹽的培養(yǎng)基。 所說(shuō)高濃度是指，比該基本培養(yǎng)基中含有的金屬鹽濃度還要高。
具體地，各基本培養(yǎng)基的金屬鹽濃度例如CuS04 5H20濃度是N6基 本培養(yǎng)基中為0mg/1， MS(LS)基本培養(yǎng)基中為0.025 mg/1， B5基本培養(yǎng)基中 為0.025 mg/1， NN基本培養(yǎng)基中為0.025 mg/1， NT基本培養(yǎng)基中為0.025 mg/1, Kao的基本培養(yǎng)基中為0.025 mg/1, White的基本培養(yǎng)基中為0mg/1， 在以這些基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)制備的培養(yǎng)基中，含有與該培養(yǎng)基中含有的硫酸 銅濃度相比更高濃度的硫酸銅時(shí)，該培養(yǎng)基就是提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng) 基。
本發(fā)明中的所謂含銅離子的金屬鹽是指，在所例舉的基本培養(yǎng)基中，一 般不含有具有銅離子的金屬鹽，或者是含有微量的銅離子的金屬鹽。
列舉優(yōu)選濃度的例子的話，硫酸銅以及葡糖酸銅是1 ~ 100 nM,優(yōu)選1 -50 juM，更優(yōu)選1 ~ IOmM。
在本發(fā)明的方法中，使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基的工序是l)制備植 物材料的工序，以及/或2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中的任何工序。 優(yōu)選至少在2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中使用提高了金屬鹽濃度的 培養(yǎng)基。更優(yōu)選至少在2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中包含，在共存培 養(yǎng)階段使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的方法中，為了進(jìn)一步提高基因?qū)胄?，在制備植物材料?工序1)、以及/或在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中，也可以還包括對(duì) 植物材料進(jìn)行選自加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理的至少l 種處理。植物材料的加壓處理是將該植物在液體培養(yǎng)基中以1.7 ~ 10atm進(jìn)行 加壓0.1秒~ 4小時(shí)，優(yōu)選以2.4 ~ 8atm進(jìn)4亍加壓1秒~ 30分4t。才直物才才津牛 的熱處理可以根據(jù)文獻(xiàn)(特開(kāi)2000-342255;以及特開(kāi)2000-342253)所述的方 法將植物材料進(jìn)行處理，例如在33 60。C加熱5秒~24小時(shí)，優(yōu)選在46°C 加熱3分鐘來(lái)進(jìn)行。植物材料的離心處理，可以根據(jù)Hiei們的方法(國(guó)際公 開(kāi)第02/12520號(hào)小冊(cè)子；以及特開(kāi)2000-342256)將植物材料進(jìn)行處理，例如 以100G ~ 25萬(wàn)G離心1秒-4小時(shí)，優(yōu)選以2萬(wàn)G離心10分鐘來(lái)進(jìn)4亍。 關(guān)于超聲波處理，可以根據(jù)文獻(xiàn)(例如Trick， H.N.和Finer, J丄，(1997),Transgenic Research, Vol.6, p.329-336; 以及Amoah, B.,等，(2001)， Journal of Experimental Botany, Vol.52, p.ll35-1142.)所述的方法來(lái)進(jìn)行處理。
這些加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理可以任意進(jìn)行l(wèi)種， 或者也可以多種組合進(jìn)行。
本發(fā)明的方法，在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之后，還可以包括 以下工序
3) 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，
4) 根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化。
此外，本發(fā)明的方法，在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之后，還可 以包括以下工序，而且在以下的至少1個(gè)工序中使用提高了含銅離子的金屬 鹽濃度的培養(yǎng)基
3) 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，
4) 根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化。'
本發(fā)明的基因?qū)敕椒?，在提高基因?qū)胄实耐瑫r(shí)，提高轉(zhuǎn)化效率， 其結(jié)果是可以高效地得到轉(zhuǎn)化植物。因此，本發(fā)明是關(guān)于以使用本發(fā)明基因 導(dǎo)入方法為特征的轉(zhuǎn)化植物的制造方法。
進(jìn)一步，本發(fā)明者們就轉(zhuǎn)化植物材料方面發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用提高了含銅離 子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基使轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化，與使用通常濃度的含銅離子 的金屬鹽的培養(yǎng)基時(shí)相比，促進(jìn)再分化植物的生長(zhǎng)。
因此，本發(fā)明是關(guān)于下述方法，它是進(jìn)一步包括
1) 制備植物材料，
2) 使土壤桿菌感染植物材料，
3) 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，
4) 將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化，
以土壤桿菌屬細(xì)菌來(lái)進(jìn)行植物材料轉(zhuǎn)化從而得到轉(zhuǎn)化植物的制備方法， 其特征在于，在上述4)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng) 基。
此外，本發(fā)明是關(guān)于促進(jìn)再分化植物生長(zhǎng)的方法，其特征在于，在由脫
分化的植物細(xì)胞使植物體再分化的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃
度的培養(yǎng)基。在這種情況下，脫分化的植物細(xì)胞，是不是轉(zhuǎn)化細(xì)胞都可以，此外，如果是轉(zhuǎn)牝細(xì)胞的情況下，是不是通過(guò)土壤桿菌法轉(zhuǎn)化的都可以。
使用土^a桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行的基因?qū)胍约稗D(zhuǎn)化方法
使用土壤桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行的基因?qū)耄?一般地包括以下工序
a) 制備植物材料的工序；
b) 制備含有具有期望導(dǎo)入基因的載體的土壤桿菌屬細(xì)菌的工序；
c) 使b)制備的土壤桿菌屬細(xì)菌感染工程a)制備的植物材料的工序； 進(jìn)一步，為了得到轉(zhuǎn)化體，在上述工序c)之后也可以實(shí)施
d) 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的工序；以及
e) 根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化的工序。
具體地，在單子葉植物中，可以采用如文獻(xiàn)(特許第2,649,287號(hào)公報(bào)) 所述的那樣，特征在于，如下的方法上述a)工序中用含有植物生長(zhǎng)激素(例 如2，4-D2,4-(二氯苯氧基乙酸))或者細(xì)胞分裂素等的培養(yǎng)基培養(yǎng)，將植物材料 弄成脫分化的狀態(tài)或者在脫分化過(guò)程中的狀態(tài)，在上述c)工序中，使土壤桿 菌感染植物材料；或者是采用如文獻(xiàn)(特許第3,329,819號(hào)公報(bào))所述的那樣， 特征在于如下的方法以該植物的未成熟胚作為植物材料，在上述a)工序中 不對(duì)未成熟胚進(jìn)行脫分化處理，在上述c)工序中用含有才直物生長(zhǎng)激素(例如 2,4-D)或者細(xì)胞分裂素等的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
關(guān)于工序a)
在本說(shuō)明書(shū)中，供基因?qū)氲?植物，，是單子葉植物以及雙子葉植物都 包括。在單子葉植物中包括水稻、玉米、大麥、小麥、石刁柏(7 7,，力' 只)、高梁和其他，但并不限于這些。雙子葉植物中包括煙草、大豆、馬鈴 薯、棉花、向日葵和其他，但并不限于這些。優(yōu)選植物是單子葉植物，最優(yōu) 選是玉米。
此外，所說(shuō)"植物材料"非限定性的包括為以土壤桿菌法進(jìn)行的轉(zhuǎn)化而 提供的該植物的細(xì)胞、葉、根、莖、果實(shí)、及其他的任何部位的植物組織， 未成熟胚，愈傷組織或者不定胚樣組織(以下在本說(shuō)明書(shū)中稱作愈傷組織等， 或者簡(jiǎn)稱為愈傷組織)，或者整個(gè)植物體等植物所有的形態(tài)。
作為本發(fā)明方法中使用的植物形態(tài)，優(yōu)選未成熟胚和愈傷組織，最優(yōu)選未成熟胚。在本說(shuō)明書(shū)中，所說(shuō)的植物的細(xì)胞、組織、整個(gè)植物體采用的是 在本技術(shù)領(lǐng)域中一般采用的意義。在本說(shuō)明書(shū)中，所謂的未成熟胚是受粉后 處于成熟過(guò)程的未成熟種子的胚。此外，供本發(fā)明方法所用的未成熟胚的階 段(熟期)，沒(méi)有特別的限制，在受粉后的任何時(shí)期采摘的都可以。最優(yōu)選受 粉后2天以后的未成熟胚。后述的轉(zhuǎn)化之后，以后述的方法，脫分化，優(yōu)選 使用能夠誘導(dǎo)具有再長(zhǎng)生成正常個(gè)體能力的愈傷組織的未成熟胚胚盤(pán)。此 外，未成熟胚優(yōu)選近親交配、近親交配之間的Fl、近親交配與自然受粉品
種之間的F1、市售F1品種的未成熟胚。在本說(shuō)明書(shū)中，所謂愈傷組織是指 無(wú)秩序增殖的未分化狀態(tài)的細(xì)胞塊。為了得到愈傷組織，可以將植物組織分 化的細(xì)胞置于含有植物生長(zhǎng)激素(例如2,4-D)或者細(xì)胞分裂素等植物生長(zhǎng)調(diào) 節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基(叫做脫分化培養(yǎng)基)中培養(yǎng)得到。該為得到愈傷組織而做的 處理叫做脫分化處理，該過(guò)程叫做脫分化過(guò)程。
在工序a)中，根據(jù)需要，將植物組織、未成熟胚等從植物體、種子等中 取出，制備成轉(zhuǎn)化的適合材料。此外，根據(jù)期望，也可以將植物材料在用土 壤桿菌感染之前培養(yǎng)。
本發(fā)明中，在工序a)中的植物材料制備過(guò)程以及/或工序c)中的使土i裹 桿菌感染過(guò)程中，以使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基為特征。此 外，在工序a)中的植物材料制備過(guò)程中也可以進(jìn)行加壓處理。
關(guān)于工序b)
4艮久以前就已知土壤細(xì)菌的土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起S艮 多雙子葉植物的冠癭病(crown gall disease),在二十世紀(jì)70年代，發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì) 粒與病原性相關(guān)，而且作為T(mén)i質(zhì)粒的一部分的T-DNA纟皮重組到植物染色體 組。之后明白了該T-DNA上存在與合成誘發(fā)腫瘤所必要的荷爾蒙(細(xì)胞分裂 素和植物生長(zhǎng)激素)相關(guān)的基因，盡管是細(xì)菌基因卻在植物中發(fā)現(xiàn)了。在切 割T-DNA與向植物的傳遞中，在Ti質(zhì)粒上的病毒結(jié)構(gòu)域(vir結(jié)構(gòu)域)中存在 的基因組是必要的，此外為了將T-DNA切出得到，T-DNA兩端上存在的邊 界序列(水-夕、、-配列)是必要的。作為其他的土壤桿菌屬細(xì)菌的毛根土壤桿菌 (Agrobacterium rhizogenes)也具有根據(jù)Ri質(zhì)粒的同樣的系統(tǒng)(例如特開(kāi) 2000-342256的圖3和圖4)。因?yàn)橛捎谕寥罈U菌的感染，T-DNA可以重組才直物染色體組中，因此在 T-DNA上插入期望的基因的話，期望能將該基因重組到植物染色體中。然而， 因?yàn)門(mén)i質(zhì)粒是190kb或190kb以上非常大，用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程方法在質(zhì)粒 上的T-DNA上插入基因是困難的。因此，開(kāi)發(fā)了為在T-DNA上插入外源基 因的方法。
首先，制備了從胂瘤性Ti質(zhì)粒的T-DNA上去除了荷爾蒙合成基因的解 除型菌系(disarmed strains) LBA4404 (參考Hoekema， A.，等，(1983)， Nature, Vol. 303,p.l79-180)、 C58Cl(pGV3850)、 GV3TillSE等。通過(guò)使用這些，開(kāi) 發(fā)了2種方法將期望的基因?qū)氲酵寥罈U菌的Ti質(zhì)粒T-DNA中，或者將 具有期望基因的T-DNA導(dǎo)入到土壤桿菌中。其中的一種是進(jìn)行容易的基因 操作就可能插入期望的基因方法，該方法通過(guò)三系雜交法(triparental mating),通過(guò)同源重組，將在大腸桿菌中能夠復(fù)制的中間載體導(dǎo)入到土壤桿 菌的解除型Ti質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)域中，稱作中間載體法。
還有一種是稱作雙元載體(binary vector)法，該法是基于在將T-DNA重 組到植物中時(shí)，需要有病毒(vir)結(jié)構(gòu)域，但沒(méi)有必要為了機(jī)能而存在于同一 質(zhì)粒上。在該vir結(jié)構(gòu)域中存在有virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG, (植物生物技術(shù)事典(工乂夕7° ， 4 X抹式會(huì)社發(fā)行(1989)))，所謂vir結(jié)構(gòu)域， 是指包含全部virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG。因此，雙元載體是 將T-DNA重組到可在土壤桿菌和大腸菌雙方中復(fù)制的小質(zhì)粒中的東西，將 其導(dǎo)入到具有解除型Ti質(zhì)粒的土壤桿菌中來(lái)使用。
在向土壤桿菌導(dǎo)入雙元載體時(shí)，可以通過(guò)電穿孔法和三系雜交法等公知 的方法進(jìn)行。在雙元載體中，有pBIN19、 pBI121、 pGA482等，以這些為基 礎(chǔ)，構(gòu)建了大量的新型雙元載體用于轉(zhuǎn)化。此外，在Ri質(zhì)粒系統(tǒng)中，也構(gòu) 建了同樣的載體用于轉(zhuǎn)化。
土壤桿菌A281是強(qiáng)病原性(super-virulent)菌系，其宿主范圍廣，轉(zhuǎn)化效 率比其他菌系高。該特性是由于A281具有的Ti質(zhì)粒的pTiBo542。 ^使用 pTiBo542到目前開(kāi)發(fā)了 2種新系統(tǒng)。 一種是使用了具有pTiBo542解除型Ti 質(zhì)粒的菌系EHA101以及EHA105,由于適用于上述雙元載體系統(tǒng)，這些作 為轉(zhuǎn)化能力高的系統(tǒng)而在各種植物的轉(zhuǎn)化中被利用。
還有一種是超級(jí)雙元載體("super-binary"vector)(參考Hiei, Y.,等，(1994)，The Plant Journal, Vol.6， p.271-282; Ishida， Y"等，(1996)， Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750 ; Komari, T.和Kubo T.,(1999), Methods of Genetic Transformation: Agrobacterium tumefaciens. In Vasil， I.K. (ed.) Molecular improvement of cereal crops" Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p,43-82; 以及國(guó)際公開(kāi)第95/06722號(hào)小冊(cè)子)系統(tǒng)(例如特開(kāi)2000-342256的圖4)。由 于該系統(tǒng)是由具有vir結(jié)構(gòu)域(virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG(以下 也將這些各叫做"vir片斷結(jié)構(gòu)域"))的解除型Ti質(zhì)粒以及具有T-DNA的質(zhì) 粒組成，因此是雙元載體系統(tǒng)的一種。但在使用超級(jí)雙元載體這點(diǎn)上是不同 的，超級(jí)雙元載體是在具有T-DNA的端的質(zhì)粒上，即在雙元載體上，重組 了基本上去除了 vir片斷結(jié)構(gòu)域中至少一種vir片斷結(jié)構(gòu)域的vir結(jié)構(gòu)域片斷 (其中優(yōu)選至少含有virB或virG的片斷，更優(yōu)選含有virB和virG的片斷)。 此外，在具有超級(jí)雙元載體的土壤桿菌中導(dǎo)入重組了期望基因的T-DNA結(jié) 構(gòu)域時(shí)，通過(guò)三系雜交法的同源重組可作為容易的手法來(lái)利用。
在本發(fā)明方法中，作為成為宿主的的土壤桿菌屬細(xì)菌，沒(méi)有特別的限制， 可以優(yōu)選使用土 i裏桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(例如上述的土 i裏桿菌 LBA4404(參考Hoekema, A,等，(1983)， Nature, Vol. 303, p.l79-180)以及 EHAIOI。
根據(jù)本發(fā)明的方法，只要是基于土壤桿菌屬細(xì)菌中病原性(vir)結(jié)構(gòu)域的 基因組的表達(dá)的基因?qū)胂?，可以沒(méi)有特別的限制就得到有意義的效果。因 此，對(duì)于上述的中間載體、雙元載體、強(qiáng)病原性雙元載體、超級(jí)雙元載體等 中的任何載體系統(tǒng)都可以使用，可以取得本發(fā)明的效果。在使用將這些載體 改變的不同載體系統(tǒng)時(shí)，也是同樣的(例如將土壤桿菌屬細(xì)菌vir結(jié)構(gòu)域的一 部分或者全部切除，然后重組到質(zhì)粒中，將vir結(jié)構(gòu)域的一部分或者全部切 除，作為新的質(zhì)粒的一部分導(dǎo)入到土壤桿菌中等)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方 法，在野生型的土壤桿菌屬細(xì)菌中，也可以提高野生型T-DNA結(jié)構(gòu)域向植 物的導(dǎo)入效率，事實(shí)上提高感染效率。
期望向植物中導(dǎo)入的基因可以基于以下適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇可以通 過(guò)常規(guī)方法重組到上述質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)域中的限制酶部位中，對(duì)在該質(zhì) 粒上同時(shí)或者是以別的途徑重組的卡那霉素、巴龍霉素等藥物具有耐藥性的 基因等。由于體積大，具有多數(shù)限制部位的，以通常亞克隆手法將期望的DNA導(dǎo)入到T-DNA結(jié)構(gòu)域內(nèi)不是都容易。在這樣的情況下，可以通過(guò)三系 雜交法，利用土壤桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的同源重組，將目的DNA導(dǎo)入。盡管 沒(méi)有限定，但被導(dǎo)入的基因的大小優(yōu)選是大約lOObp-200kbp。
此外，將質(zhì)粒導(dǎo)入到Agrobactorium tumefaciens等土壤桿菌屬細(xì)菌中的 操作可以通過(guò)現(xiàn)有方法進(jìn)行，舉例的話包括上述的三系雜交法和電穿孔法、 電子注射法、PEG等化學(xué)處理的方法。
要導(dǎo)入到植物中的基因，與現(xiàn)有技術(shù)一樣，基本上是配置在T-DNA的 左右邊界序列之間的。然而，因?yàn)橘|(zhì)粒是環(huán)狀的，邊界序列的數(shù)可以是l， 在要將多個(gè)的基因配置在不同部位上時(shí)，邊界序列也可以是3個(gè)或3個(gè)以上。
此外，在土壤桿菌屬細(xì)菌中，可以配置在Ti和Ri質(zhì)粒上，或者也可以配置 在其他質(zhì)粒上。甚至，也可以配置在多種類(lèi)的質(zhì)粒上。
關(guān)于工序c)
通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行基因?qū)氲姆椒ǎ梢酝ㄟ^(guò)使植物材料與土壤 桿菌屬細(xì)菌單獨(dú)的接觸來(lái)進(jìn)行。例如，可以通過(guò)制備大約106~ 10"細(xì)胞/ml 程度的細(xì)胞濃度的土壤桿菌屬細(xì)菌懸濁液，將植物材料在該懸濁液中浸漬 3-10分鐘左右，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行數(shù)日的共存培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行。
優(yōu)選在使土壤桿菌感染植物材料的同時(shí)，或者感染之后除去土i裏桿菌之 前，將植物材料與土壤桿菌共存培養(yǎng)。在共存培養(yǎng)中使用公知的培養(yǎng)基。例 如，在實(shí)施例中使用的LS-AS培養(yǎng)基、nN6-As培養(yǎng)基、或者其他、N6S3-AS 培養(yǎng)基、2N6-AS培養(yǎng)基(參考Hiei，Y.,等，(1994),The Plant Journal, Vol.6，p.271 -282)等培養(yǎng)基是已知的。
在本發(fā)明中，在使土壤桿菌感染植物材料的工序c)之前或者進(jìn)行中時(shí)， 也可以對(duì)植物材料進(jìn)行選自以下的至少一種處理加壓處理、熱處理、離心 處理、以及超聲波處理。已知這些處理在通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌向植物材料導(dǎo) 入基因的方法中也會(huì)提高基因的導(dǎo)入效率。例如，關(guān)于離心處理，在文獻(xiàn)(例 如國(guó)際公開(kāi)第02/12520號(hào)小冊(cè)子；以及特開(kāi)2000-342256)中被記載，優(yōu)選以 100G-25萬(wàn)G、進(jìn)行離心1秒~4小時(shí)。關(guān)于熱處理，在文獻(xiàn)(例如特開(kāi) 2000-342255)中被記載，優(yōu)選在33°C ~ 60。C的溫度范圍內(nèi)，進(jìn)行熱處理5秒-24小時(shí)。進(jìn) 一 步，關(guān)于超聲波處理，在文獻(xiàn)(例如Trick,H.N.和Finer,J丄，(1997),Transgenic Research, Vol.6， p.329-336 ; 以及Amoah,B., 等,(2001), Journal of Experimental Botany, Vol.52, p.ll35-1142)中4皮記載。
這些加壓、加熱、離心、以及超聲波處理，可以進(jìn)行任意l種，也可以 多種組合來(lái)進(jìn)行。例如Rogers,S,G"等,(1988),Method for Plant Molecular Biology, p.423-436,CA:Academic Press Inc.記載了關(guān)于將熱處理和離心處理 組合來(lái)進(jìn)行。
關(guān)于工序d)以及e)
進(jìn)一步根據(jù)期望，為了得到轉(zhuǎn)化體，在上述工序c)之后，必需進(jìn)行
d) 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的工序；以及
e) 根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化的工序
即， 一般地，為了進(jìn)行植物的轉(zhuǎn)化，在將外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞后，篩選 外源基因穩(wěn)定地重組到染色體上的植物細(xì)胞是必要的。
在本發(fā)明中，在工序d)中的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的工序，以及/或在工序e)中 的根據(jù)期望將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化的工序中，也可以使用提高了含銅離 子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的工序是指,通過(guò)表型的數(shù)據(jù)以及/或者物理數(shù)據(jù)，篩選 具有目的性狀的細(xì)胞。
表型的數(shù)據(jù)例如轉(zhuǎn)化效率可以通過(guò)進(jìn)行以下評(píng)價(jià)來(lái)得到與期望導(dǎo)入到 植物中的基因一起，導(dǎo)入標(biāo)記基因以及/和選擇標(biāo)記基因，評(píng)價(jià)其表達(dá)。作為 標(biāo)記基因以及/和選擇標(biāo)記基因，可以使用例如GUS( |3 -葡糖醛酸酶)基因， 以及/或耐抗生素基因(例如耐PPT(7才,74乂7，^f少乂)基因，耐卡那霉 素基因)等。作為標(biāo)記基因使用GUS時(shí)，轉(zhuǎn)化的評(píng)價(jià)可以通過(guò)由X-gulc(5-溴-4-氯-3-吲咮基-(3-D-葡糖醛酸)的GUS的切割而伴隨的顯色來(lái)評(píng)價(jià)。作為 選擇標(biāo)記基因使用耐抗生素基因時(shí)，在轉(zhuǎn)化后，可以由在加有抗生素的選擇 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況來(lái)評(píng)價(jià)。
進(jìn)一步，為了確認(rèn)外源基因穩(wěn)定地重組到染色體上，也可以得到 等的DNA印跡物理數(shù)據(jù)。此外，也可以進(jìn)行向有性生殖后代的傳遞的工序、 以及基于向后代基團(tuán)的遺傳性以及分子性分析的選擇的工序。
也可以根據(jù)期望進(jìn)行篩選的轉(zhuǎn)化體的再分化，培育再分化個(gè)體，然后得到完整的植物體。在由篩選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生長(zhǎng)成完整的植物體中，可以根據(jù)
公知的方法(例如Hiei,Y.,等,(1994),The Plant Journal, Vol.6, p.271-282;以及 Ishida,Y.，等，(1996), Nature Biotechnology,Vol.4,p.745畫(huà)750)進(jìn)行。
本發(fā)明方法，與使用含有通常濃度金屬鹽的培養(yǎng)基的情況相比較，提高 了基因?qū)胄室约?或轉(zhuǎn)化效率，以及/或促進(jìn)再分化植物的生長(zhǎng)。基因?qū)?入效率可以通過(guò)例如評(píng)價(jià)導(dǎo)入到基因的暫時(shí)性表達(dá)(一過(guò)的発現(xiàn))范圍來(lái)進(jìn) 行評(píng)價(jià)。在后面的實(shí)施例中，將未成熟胚的胚盤(pán)中的GUS基因的暫時(shí)性表 達(dá)評(píng)價(jià)為l(分散地看到點(diǎn)狀的表達(dá))~ 5(整個(gè)胚盤(pán)均見(jiàn)表達(dá))的5個(gè)階段指數(shù)。 或者，在全體的表達(dá)量較低的情況下，也可以通過(guò)數(shù)所有的點(diǎn)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。
轉(zhuǎn)化效率可以通過(guò)例如將由接種的未成熟胚得到的再分化植物中顯示 了 GUS基因表達(dá)的作為轉(zhuǎn)化體來(lái)計(jì)數(shù)，以接種的未成熟胚的數(shù)除其總數(shù)來(lái) 算出?；蛘咭部梢酝ㄟ^(guò)將再分化植物中對(duì)于篩選壓力顯示出抵抗性的作為轉(zhuǎn) 化體來(lái)計(jì)數(shù)，以接種的未成熟胚的數(shù)除其總數(shù)來(lái)算出。
再分化植物的生長(zhǎng)促進(jìn)可以通過(guò)例如在使用含有通常濃度金屬鹽的培 養(yǎng)基的情況與使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基的情況時(shí)，比較其再分化植物 的葉長(zhǎng)、葉面積、以^/或重量來(lái)評(píng)價(jià)。
以下通過(guò)實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不被這些實(shí)施例所限制。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于本說(shuō)明書(shū)的描述可以容易的在本發(fā)明上追加修飾、 變更，這些也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明


圖1為顯示通過(guò)向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅，對(duì)玉米(A188)的GUS基 因的暫時(shí)性表達(dá)方面帶來(lái)的效果圖?？v軸是將顯示出GUS基因暫時(shí)性表達(dá) 的部位的范圍進(jìn)行數(shù)值化了的值，在O(沒(méi)有表達(dá))~ 4(幾乎全部的胚盤(pán)都表達(dá)) 的范圍內(nèi)進(jìn)行數(shù)值化。圖的橫軸中顯示的"Cu x"(此處，x表示數(shù)字)，是 表示共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度是x juM。
圖2為顯示對(duì)共存培養(yǎng)后玉米(H99)的愈傷組織形成方面，共存培養(yǎng)基 中的硫酸銅濃度帶來(lái)的效果圖。在圖的橫軸中的"Agx"以及"Cux，，(此處， x表示數(shù)字)，是分別表示共存培養(yǎng)基中硝酸銀以及硫酸銅的濃度是x pM。
圖3為顯示對(duì)共存培養(yǎng)后玉米(A188)的抗:7才只74乂7，4、〉>(PPT)的愈傷組織形成方面，共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度帶來(lái)的效果圖?？v 軸是將愈傷組織形成進(jìn)行數(shù)值化了的值，在O(沒(méi)有愈傷組織形成)~ 3(整個(gè)胚
盤(pán)都愈傷組織化)階段進(jìn)行數(shù)值化。圖的橫軸中顯示的"Cu x"(此處，x表 示數(shù)字)，是表示共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度是x nM。
圖4為顯示通過(guò)向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅，對(duì)水稻(IR64)的GUS基因 的暫時(shí)性表達(dá)方面帶來(lái)的效果圖?？v軸是將顯示出GUS基因暫時(shí)性表達(dá)的 部位的范圍進(jìn)行數(shù)值化了的值，在0(沒(méi)有表達(dá)) 4(幾乎整個(gè)胚盤(pán)都表達(dá))范 圍內(nèi)進(jìn)行數(shù)值化。圖的橫軸中顯示的"Cu5"是表示共存培養(yǎng)基中的硫酸銅 濃度是5 jLJ M。
圖5為顯示通過(guò)向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅，對(duì)玉米(A188)的GUS 基因的暫時(shí)性表達(dá)方面帶來(lái)的效果圖?？v軸是將顯示出GUS基因暫時(shí)性表 達(dá)的部位的范圍進(jìn)行數(shù)值化了的值，在O(沒(méi)有表達(dá))~ 4(幾乎整個(gè)胚盤(pán)都有表 達(dá))內(nèi)進(jìn)行數(shù)值化。
圖6為顯示通過(guò)向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅，對(duì)玉米(A188)形成愈傷 組織方面帶來(lái)的效果圖?？v軸是將愈傷組織形成進(jìn)行數(shù)值化了的值，在O(沒(méi) 有愈傷組織形成)~ 3(胚盤(pán)全部都愈傷組織化)的階段進(jìn)行數(shù)值化。
圖7為顯示通過(guò)向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅，對(duì)水稻"雪光，，品種的 未成熟胚的增殖方面帶來(lái)的效果圖?？v軸是愈傷組織化的未成熟胚的重量， 為每1個(gè)未成熟胚的平均值。橫軸的實(shí)驗(yàn)l、 2、 3是顯示各自獨(dú)立進(jìn)行的實(shí) 驗(yàn)。cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對(duì)照、Cu表示硫酸銅、CG表示葡糖 酸銅。Cu以及CG后面的數(shù)值表示各自共存培養(yǎng)基中的濃度(M M)。
圖8為顯示通過(guò)向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅或者葡糖酸銅，對(duì)從玉米 (A188)轉(zhuǎn)化愈傷組織再分化生長(zhǎng)成轉(zhuǎn)化植物方面帶來(lái)的效果圖?？v軸是再分 化植物的葉長(zhǎng)平均值。橫軸cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對(duì)照、Cu表 示硫酸銅、CG表示葡糖酸銅。硫酸銅以及葡糖酸銅在各自共存培養(yǎng)基中的 濃度中以10pM添加。
圖9為顯示通過(guò)向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅或者葡糖酸銅，對(duì)從水稻 "雪光"品種轉(zhuǎn)化愈傷組織再分化生長(zhǎng)成轉(zhuǎn)化植物方面帶來(lái)的效果圖。縱軸 是再分化植物的葉長(zhǎng)平均值。橫軸cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對(duì)照、 Cu表示硫酸銅、CG表示葡糖酸銅。硫酸銅以及葡糖酸銅在各自共存培養(yǎng)基中的濃度中以10juM添加。 實(shí)施例
實(shí)施例1向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅對(duì)玉米的轉(zhuǎn)化帶來(lái)的效果 才才泮牛禾。方法
無(wú)菌方式摘取受粉后第7天-第14天的玉米(品種A188、 H99)的未成 熟胚(大小為1.0 1.5mm)，用LS-inf液體培養(yǎng)基(LS無(wú)機(jī)鹽、0.5mg/L煙酸、 0.5mg/L鹽酸吡哆醇、lmg/L鹽酸硫胺素、100mg/L肌醇、lg/L酪蛋白水解 物、1.5mg/L2,4-D、 68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖、pH5.2;參考Ishida，Y.,等， (1996), Nature Biotechnology,Vol.4，p.745-750)洗凈1次。在一部分的未成熟 胚中進(jìn)行為了提高基因?qū)胄实那疤幚?46。C、 3分鐘的熱處理以及 15，000rpm、 IO分鐘的離心處理)。在含有l(wèi)OOpM乙酰丁香酚(7七卜少卩> :3、、乂)的LS-inf液體培養(yǎng)基中，混懸入大約1.0 x 109cfo/mL的Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131)(具有在T-DNA結(jié)構(gòu)域中以菜花花葉病毒35S 啟動(dòng)子驅(qū)使的PPT(7才只:74乂久，4* 7)耐性基因，以及在菜花花葉病 毒35S啟動(dòng)子上結(jié)合有蓖麻過(guò)氧化氫酶內(nèi)含子的GUS基因；參考Ishida，Y., 等,(1996), Nature Biotechnology，Vol.4,p.745-750)作為接種源。向摘取、洗凈 的未成熟胚以及熱、離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒后，于 室溫靜置5分鐘。在含有5pM的AgN03的LS-AS培養(yǎng)基(LS無(wú)機(jī)鹽、0.5mg/L 煙酸、0.5mg/L鹽酸吡口多醇、lmg/L鹽酸石克胺素、100mg/L肌醇、700mg/LL-脯氨酸、1.5mg/L2,4-D、 20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、500mg/LMES、 100(iM 乙酰丁香酚、8g/L瓊脂、pH5.8;參考Ishida,Y.,等,(1996), Nature Biotechnology, Vol. 4, p.745-750，固化劑是8g/L瓊月旨)中添加了 0 - 10|iM濃度CuS04.5H20 的共存培養(yǎng)基中，使接種了土壤桿菌的未成熟胚胚盤(pán)朝上地接種。
于25。C黑暗下培養(yǎng)3天后，將一部分的未成熟胚于含有0.1 %的Triton X-100的0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)中浸漬，37。C靜止1小時(shí)。用磷酸緩沖液 除去土壤桿菌后，添加含有l(wèi).OmM 5-溴-4-氯-3-口引咮基-(3-D-葡糖醛酸(X-gluc)
以及20%曱醇的磷酸緩沖液。于37。C處理24小時(shí)后，于顯孩i鏡下觀察，考 察呈藍(lán)色的組織的范圍。
將在共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的未成熟胚于LSD1.5培養(yǎng)基(LS無(wú)機(jī)鹽、L鹽酸硫胺素、100mg/L肌醇 700mg/L L-脯氨酸、1.5mg/L2,4-D、 20g/L蔗糖、500mg/LMES、 8g/L瓊脂、 pH5.8;參考Ishida,Y.，等,(1996), Nature Biotechnology,Vol.4,p.745-750)上接種，
于25。C黑暗下培養(yǎng)大約4周后，測(cè)定增殖的愈傷組織的直徑。另外，將在共 存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了7天的未成熟胚在含有5mg/L的:7才X:7 4 乂 7 ， O > (PPT)的LSD1.5培養(yǎng)基上接種，于25。C黑暗下培養(yǎng)1周后，于顯微鏡下觀察， 考察愈傷組織形成的程度。進(jìn)一步，將這些愈傷組織在含有10mg/L PPT的 同樣培養(yǎng)基中，以同樣的條件培養(yǎng)6周。將增殖的抗PPT的愈傷組織在LSZ 再分化培養(yǎng)基(從LSD1.5培養(yǎng)基中除去2,4-D,添加5mg/L玉米素)上接種， 于25。C照明下培養(yǎng)2 3周。切取再分化的植物葉片，通過(guò)X-gluc考察GUS 基因表達(dá)。 結(jié)果
將在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 3天的未成熟胚(品種A188)通過(guò)X-gluc染色， 將顯示GUS基因的暫時(shí)性表達(dá)的部位(呈藍(lán)色的部位)的范圍以O(shè)(沒(méi)有表 達(dá))~ 4(幾乎全部胚盤(pán)都有表達(dá))5個(gè)階段來(lái)評(píng)價(jià)。
在含有1、 5以及10pM的硫酸銅的共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了 3天的未成熟 胚，與在對(duì)照培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟胚相比，在胚盤(pán)的大部分范圍內(nèi)顯示出 GUS基因的一過(guò)性發(fā)現(xiàn)。認(rèn)為由于在共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅而顯示GUS 基因的一過(guò)性發(fā)現(xiàn)的范圍的增大是與有沒(méi)有熱、離心的前處理無(wú)關(guān)(圖1)。 由這些可知，通過(guò)在共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅可提高基因?qū)胄省?br> 將在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 3天的未成熟胚(品種H99)在不含選擇壓力的 培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約4周后，考察形成的愈傷組織的直徑。在含有5pM硝酸 銀的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚，顯示與在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的幾乎同樣 的愈傷組織增殖。與此相對(duì)比的，在添加了 10pM硫酸酮以及5|_iM硝酸銀 的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚顯示，直徑的平均值比在對(duì)照共存培養(yǎng)基中 培養(yǎng)的未成熟胚的大2mm或2mm以上，通過(guò)添加硫酸銅促進(jìn)愈傷組織的增 殖(圖2)。
在共存培養(yǎng)i周后，將在含有PPT的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 1周的未成熟 胚(品種A188)以0(沒(méi)有愈傷組織形成)-3(胚盤(pán)全部都愈傷組織化)4個(gè)階段 來(lái)評(píng)價(jià)增殖的愈傷組織。在添加了硫酸銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚，與在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚相比，顯示高的愈傷組織形成，可知通過(guò)添加 硫酸銅可提高轉(zhuǎn)化愈傷組織形成的效率(圖3)。進(jìn)一步，通過(guò)將在含有PPT
的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇得到的愈傷組織，在含有PPT的再分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 得到抗PPT性植物。切取這些植物的葉片，研究GUS基因的表達(dá)。其結(jié)果 為，在含有5以及10pM硫酸酮的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚中，與在不 含硫酸銅的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚相比較，顯示2-3倍高的轉(zhuǎn)化效 率。
_表l在共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅對(duì)轉(zhuǎn)化效率帶來(lái)的效果_
CuS04 接種的未成熟胚數(shù)再分化植 GUS陽(yáng)性植物數(shù) 轉(zhuǎn)化效率
丄M)_^}_^__(B/A,%)
0 13 2 2 15.4
1 13 2 2 15.4 5 13 6 6 46.2 10 14 6 5 35.7
如上所示，向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅，具有提高通過(guò)土壤桿菌法的基 因?qū)胄?、促進(jìn)愈傷組織形成以及增殖、提高轉(zhuǎn)化效率的效果。
實(shí)施例2 向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅對(duì)向水稻導(dǎo)入基因帶來(lái)的效果 材料及方法
將在含有50mg/L潮霉素(乂、 4 / 口 7 ^ 、〉 >)和50mg/L壯觀霉素(X 、 夕f 乂 t <少7)的AB培養(yǎng)基(3g/L KH2P04、 lg/L NaH2P04、 lg/L NH4C1、 300 mg/LMgS04.7H20、 150 mg/LKCl、 10 mg/L CaCl2、 2.5 mg/LFeS04.7H20、 5g/L葡萄糖、15g/L瓊脂、pH7.0;參考Chilton,M.-D.,等，(1974), Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，71: 3672-3676)上培養(yǎng)了 3 ~ ^天的Agrobacterium tumefaciens超級(jí)雙元載體LBA4404(pSB134)(具有在T-DNA結(jié)構(gòu)域上結(jié)合 有玉米泛激素啟動(dòng)子驅(qū)使的泛激素(工匕'《千乂)內(nèi)含子的HPT基因(潮霉素 耐性基因)，以及具有結(jié)合了以菜花花葉病毒35S啟動(dòng)子驅(qū)使的蓖麻過(guò)氧化 氬酶內(nèi)含子的GUS基因；pSB134的制備是在pKY205(參考WO 03/027290)上，通過(guò)將作為表達(dá)標(biāo)記的由pSB32得來(lái)的35S-intron GUS-nos片斷插入到 HindIII部位中來(lái)進(jìn)行的)以白金接種環(huán)挑取，混懸于含有l(wèi)OOpM乙酰丁香酚 的大約109cfU/ml濃度的AA1液體培養(yǎng)基(AA主要無(wú)機(jī)鹽、LS微量無(wú)機(jī)鹽、 MS維生素、AA氨基酸、0.2g/L酪蛋白水解物、4g/L蔗糖、2g/L葡萄糖， pH5.2) lml中。向放入了無(wú)菌摘取的未成熟胚(品種IR64)的埃彭道夫管中加 入土壤桿菌懸濁液lml,用旋渦混合器攪拌30秒后，于室溫靜置5分鐘。 將未成熟胚在nN6-As培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽、N6維生素、0.5g/L酪蛋白水解物、 0.5g/LL-脯氨酸、lmg/L2,4-D、 0.5 mg/L NAA、 0.1mg/L6BA、 20g/L蔗糖、 10g/L葡萄糖、10pM AgN03、 lOO(iM乙酰丁香酚、8g/L瓊脂糖、pH5.2)以 及含有5pM的CuS04.5H20的nN6-As培養(yǎng)基上接種，于黑暗下在25。C培 養(yǎng)1周。 結(jié)果
將共存培養(yǎng)后的未成熟胚通過(guò)X-gluc染色，將顯示GUS基因的一過(guò)性 發(fā)現(xiàn)的部位(呈藍(lán)色的部位)的范圍以O(shè)(沒(méi)有表達(dá))-4(幾乎全部胚盤(pán)都有表 達(dá))5個(gè)階段來(lái)評(píng)價(jià)。
在含有5pM的硫酸銅的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 l周的未成熟胚，與在對(duì) 照培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟胚相比，在胚盤(pán)的大部分范圍內(nèi)顯示出GUS基因
的一過(guò)性發(fā)現(xiàn)(圖4)。由這些可知，通過(guò)向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅提高基 因?qū)胄剩粌H是在玉米中而且在水稻中也可見(jiàn)。
實(shí)施例3 向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅對(duì)向玉米導(dǎo)入基因帶來(lái)的影響 材料及方法
無(wú)菌方式摘取受粉后第7天-第14天的玉米(品種A188)的未成熟胚 大小1.0 1.5mm,用LS-inf液體培養(yǎng)基洗凈1次。進(jìn)行為了提高基因?qū)?效率的前處理(46。C、 3分鐘的熱處理以及15,000rpm、 IO分鐘的離心處理)。 在含有100pM乙酰丁香酚的LS-inf液體培養(yǎng)基中，混懸入大約1.0 x 109cfu/mL的Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB13 l)作為接種源。向熱、 離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒后，于室溫靜置5分鐘。在 含有5pM的AgN03的LS-AS培養(yǎng)差、中添加了 0 ~ 10pM濃度葡糖酸酮的共 存培養(yǎng)基中，使接種了 土壤桿菌的未成熟胚胚盤(pán)向上接種。于25。C黑暗下培養(yǎng)3天后，將一部分的未成熟胚于含有0.1 %的Triton X-100的0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)中浸漬，于37。C靜置1小時(shí)。在磷酸緩沖 液中除去土壤桿菌后，添加含有l(wèi).OmM 5-溴-4-氯-3-吲咮基-(3-D-葡糖醛酸 (X-gluc)以及20%曱醇的磷酸緩沖液。于37。C處理24小時(shí)后，于顯微鏡下 7見(jiàn)察，考察呈藍(lán)色的組織的范圍。
另外，將在共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了 7天的未成熟胚中的愈傷組織形成，以 O(無(wú)愈傷組織形成)、l(胚盤(pán)的一部分愈傷組織化)、2(胚盤(pán)的大約一半愈傷組 織化)、3(胚盤(pán)的3/4以上愈傷組織化)的指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
結(jié)果
將在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 3天的未成熟胚(品種A188)通過(guò)X-gluc染色， 將顯示GUS基因的一過(guò)性發(fā)現(xiàn)的部位(呈藍(lán)色的部位)的范圍以O(shè)(沒(méi)有表 達(dá))-4(在胚盤(pán)的幾乎全部都有表達(dá))5個(gè)階段來(lái)評(píng)價(jià)。在含有1、 5以及10nM 的葡糖酸酮的共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了 3天的未成熟胚，與在對(duì)照培養(yǎng)基上培養(yǎng) 的未成熟胚相比，在胚盤(pán)的大部分范圍內(nèi)顯示出GUS基因的暫時(shí)性表達(dá)(圖 5)。
考察了在共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了 1周的未成熟胚的愈傷組織形成。在含有 1、 5以及10^M的葡糖酸酮的共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟胚，與在不含葡糖 酸銅的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)的未成熟胚相比，每種都顯示高愈傷組織形成。尤其 是在含5以及10)jM的葡糖酸酮的共存培養(yǎng)基中的，與對(duì)照相比，顯示有意 義的高愈傷組織形成(圖6)。
由這些可知，通過(guò)在共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸S同，與添加硫酸銅時(shí)一樣， 可提高基因?qū)胄室约坝鷤M織形成率。
實(shí)施例4 向接種源液體培養(yǎng)基中添加硫酸銅以及葡糖酸銅對(duì)向水稻導(dǎo) 入基因帶來(lái)的影響 材料及方法
將在含有50mg/L潮霉素和50mg/L壯觀霉素的AB培養(yǎng)基上培養(yǎng)了 3 ~ 4天的Agrobacterium tumefaciens超級(jí)雙元載體LBA4404(pSB134)以白金接 種環(huán)挑取，混懸于含有100pM乙酰丁香酚以及0 ~ 50pM的CuS04.5H20或 者葡糖酸銅的大約109cfWml濃度的AA1液體培^1^T^7 T放入了無(wú)菌摘取的未成熟胚(品種"雪光")的埃彭道夫管中加入土壤桿菌懸濁液lml,
用旋渦混合器攪拌30秒后，于室溫靜置5分鐘。將未成熟胚在nN6-As培養(yǎng) 基上接種，于黑暗下在25。C培養(yǎng)1周。 結(jié)果
測(cè)定了共存培養(yǎng)后未成熟胚的重量。盡管進(jìn)行了 3次試驗(yàn)，但在每個(gè)試 驗(yàn)中，當(dāng)在接種源液體培養(yǎng)基中加入硫酸銅或者葡糖酸銅的情況下，與沒(méi)有 添加的對(duì)照未成熟胚相比，顯示出旺盛的增殖(圖7)?？芍?，通過(guò)添加^e克酸 銅以及葡糖酸銅對(duì)愈傷組織增殖的促進(jìn)，不只是在共存培養(yǎng)基而且是在接種 源的液體培養(yǎng)基中添加時(shí)也同樣可見(jiàn)。
實(shí)施例5 向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅、葡糖酸銅對(duì)玉米轉(zhuǎn)化植物的 生長(zhǎng)帶來(lái)的影響 材津十和方法
在玉米(品種A188)的未成熟胚(大小1.0- 1.5mm)上4妾種Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131),通過(guò)在含有PPT的LSD1.5培養(yǎng)基中培養(yǎng)得 到轉(zhuǎn)化愈傷組織。將轉(zhuǎn)化愈傷組織切碎為大約2mm的大小，于含有10pM 的CuS04.5H20或者葡糖酸銅以及PPT的LSZ再分化培養(yǎng)基上接種。在照明 下，于25。C培養(yǎng)3周，測(cè)定再分化植物的葉長(zhǎng)。
結(jié)果
在含有硫酸銅或者葡糖酸銅的再分化培養(yǎng)基中再分化的植物的葉長(zhǎng)，與 在對(duì)照再分化培養(yǎng)基中再分化的植物相比，顯示有意義的加長(zhǎng)，硫酸銅或者 葡糖酸銅顯示促進(jìn)再分化植物生長(zhǎng)的效果(圖8)。
實(shí)施例6 向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅、葡糖酸銅對(duì)水稻轉(zhuǎn)化植物的 生長(zhǎng)帶來(lái)的影響 材j^和方法
在水稻(品種"雪光，，)的未成熟胚上接種Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB134)，通過(guò)在含有潮霉素的nN6CC培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽、N6維 生素、0.5g/ L酪蛋白水解物、0.5g/ L L-脯氨酸、lmg/L 2,4-D、 0.5 mg/L NAA、 0.1mg/L6BA、 20g/L蔗糖、55g/L山梨醇、250mg/L頭孢噻肟(七7才夕^夕厶)、250 mg/L羧卡西林、5g/L凝膠劑(少VL，4卜)、pH5.8)中培養(yǎng)得到 轉(zhuǎn)化愈傷組織。將轉(zhuǎn)化愈傷組織切碎為大約2mm的大小，于含有l(wèi)O(iM的 CuS04.5H20或者葡糖酸銅以及潮霉素的N6R再分化培養(yǎng)基(主要無(wú)機(jī)鹽減 到1/2的N6無(wú)機(jī)鹽、N6維生素、AA氨基酸、lg/L酪蛋白水解物、0.5 mg/L 激動(dòng)素、20g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、4g/L凝膠劑(y》，4卜)、pH5.8) 上接種。在照明下，于25。C培養(yǎng)3周，測(cè)定再分化植物的葉子長(zhǎng)度。 結(jié)果
在含有硫酸銅或者葡糖酸銅的再分化培養(yǎng)基中再分化的植物的葉長(zhǎng)，與 在對(duì)照再分化培養(yǎng)基中再分化的植物相比，顯示有意義的加長(zhǎng)，硫酸銅或者 葡糖酸銅具有促進(jìn)再分化植物生長(zhǎng)的效果，在水稻中也顯示出來(lái)(圖9)。
產(chǎn)業(yè)上的利用性
本發(fā)明開(kāi)發(fā)了比現(xiàn)有土壤桿菌法更高效率地進(jìn)行基因?qū)氲牧畠r(jià)簡(jiǎn)單 的方法。此外，提供對(duì)認(rèn)為用現(xiàn)有土壤桿菌法進(jìn)行基因?qū)肜щy的植物種以 及品種也適用的方法。本發(fā)明的方法，與使用含有通常濃度的金屬鹽的培養(yǎng) 基的情況相比，可提高基因?qū)胄室约?或轉(zhuǎn)化效率，以及/或可促進(jìn)再分 化植物的生長(zhǎng)。
如圖l顯示的，通過(guò)使用含有高濃度硫酸銅的共存培養(yǎng)基，關(guān)于單子葉 植物玉米的基因?qū)胄?，與使用不含硫酸銅的培養(yǎng)基相比較，提高了2-2.5倍。此外，還由于增加了加熱、離心處理，與使用不含硫酸銅的培養(yǎng)基 以及未處理的植物材料時(shí)相比，基因?qū)胄侍岣吡?1.5 ~ 3倍。
根據(jù)本發(fā)明，從提高植物土壤桿菌法的基因?qū)胄蔬@點(diǎn)，對(duì)以下估文出 了貢獻(xiàn)可以高效地得到多種轉(zhuǎn)化植物，容易地有效地培育導(dǎo)入有實(shí)用基因 的品種。尤其，單子葉植物其中有玉米，由于用現(xiàn)有土壤桿菌法轉(zhuǎn)化效率低， 通過(guò)本發(fā)明方法提高了轉(zhuǎn)化效率，意義很大。
權(quán)利要求
1. 一種以土壤桿菌屬細(xì)菌來(lái)進(jìn)行植物材料轉(zhuǎn)化從而得到轉(zhuǎn)化植物的制備方法，包含1)制備植物材料，2)使土壤桿菌感染植物材料，3)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且4)將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化，其特征在于，在上述4)的工序中使用含銅離子的金屬鹽濃度為1-100μM的培養(yǎng)基。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中金屬鹽是^L酸銅或葡糖酸銅。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中金屬鹽濃度是1 ~ 50pM。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中金屬鹽濃度是1 ~ 10|iM。
5. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中植物是單子葉植物。
6，權(quán)利要求1或2所述的方法，其中植物是玉米。
7. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中植物是水稻。
8. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中植物材料是未成熟胚。
9. 一種促進(jìn)再分化植物生長(zhǎng)的方法，其特征在于，在由脫分化植物細(xì) 胞再分化成植物體的工序中，使用含銅離子的金屬鹽濃度為l-lOOpM的培養(yǎng) 基。
10. —種通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌來(lái)進(jìn)行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒ǎ?該方法包括(1) 制備植物材料，(2) 使土壤桿菌感染植物材料，(3) 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且(4) 將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化，其特征在于，在上述2)和4)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
11. 一種通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌來(lái)進(jìn)行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒ǎ?該方法包括1) 制備植物材料，2) 使土壤桿菌感染植物材料，3) 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且4) 將篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行再分化，其特征在于，在上述2)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過(guò)添加銅離子來(lái)使植物轉(zhuǎn)化效率提高的方法，包含1)將植物材料進(jìn)行處理，然后2)使土壤桿菌感染植物材料，通過(guò)土壤桿菌屬細(xì)菌來(lái)進(jìn)行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒?，其特征在于在上?)以及/或2)的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供以采用基因?qū)敕樘卣鞯霓D(zhuǎn)化植物的制造方法。
文檔編號(hào)C12N5/14GK101429522SQ20081018183
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2004年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者石田佑二 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社