專利名稱：一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提高轉(zhuǎn)基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。
背景技術(shù)：
大豆遺傳轉(zhuǎn)化目前已成為許多難轉(zhuǎn)化植物的模式植物。目前，大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法 較為廣泛認可和應用的主要是根癌農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。目前已經(jīng)商業(yè)化的幾個 轉(zhuǎn)基因大豆品種主要來源于該系統(tǒng)。但是該系統(tǒng)的生根和煉苗兩個階段非常費力費時，而 且移栽的成活率非常低，僅為10%左右，而且從轉(zhuǎn)化到產(chǎn)生11代所用的周期長，約需6-8個 月的時間，這嚴重制約了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究和發(fā)展。本項發(fā)明的一種以大豆子葉節(jié)為受 體不依賴于組織培養(yǎng)的大豆轉(zhuǎn)基因的新方法，可以避開生根和煉苗兩個階段，從轉(zhuǎn)化到產(chǎn) 生T1代所需的時間僅需要4-5個月的時間，顯著地縮短了轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生時間，因為不需 依賴組織培養(yǎng)，減少了接種，繼代等多個步驟，極大的節(jié)約了人力、物力和財力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一套以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化 新方法。其特征在于利用帶有目的基因和選擇標記基因的農(nóng)桿菌或DNA直接轉(zhuǎn)化緩沖液， 對大豆的子葉節(jié)部位進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化植物受體為僅去掉大豆頂芽的萌發(fā)5-7天的大豆幼 苗。該子葉節(jié)被轉(zhuǎn)化后依舊培養(yǎng)在培養(yǎng)基質(zhì)中，依靠胚根吸收水分和礦質(zhì)元素。轉(zhuǎn)化產(chǎn)生 的T。代分枝，依賴選擇標記物質(zhì)進行篩選，去除陰性枝條，對獲得的陽性枝條進行培養(yǎng)至產(chǎn) 生種子。 本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下 a不依賴于組織培養(yǎng)的大豆轉(zhuǎn)化系統(tǒng)選取籽粒飽滿的大豆種子，播種到培養(yǎng)缽 或田間。5-7d后大豆出苗，小心用手術(shù)刀將大豆的頂芽和腋芽去除干凈，造成鍥形傷口，然 后順著脈絡方向輕劃5-6刀。用含有目的基因和選擇性性標記基因的農(nóng)桿菌或DNA的轉(zhuǎn)化 緩沖溶液對大豆子葉節(jié)部位進行侵染。 b子葉節(jié)部分轉(zhuǎn)化和建立芽誘導的適宜的條件侵染后的子葉及子葉節(jié)部位用黑 色袋罩好保濕，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20_25°C ， 5-8天叢生芽生成，此時去掉黑色袋，置光 下進行常規(guī)培養(yǎng)。 c經(jīng)過10-15天培養(yǎng)后，芽體伸長長出1-3片葉片后，利用選擇標記物質(zhì)對葉片進 行噴施或涂抹。2-3天后去除陰性的不定芽，選擇標記物質(zhì)篩選陽性的枝條進行常規(guī)培養(yǎng)。
d提取存留的大豆枝條嫩葉總DNA和種子總DNA，用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆植株 當代和T1代種子的轉(zhuǎn)化特征。 該轉(zhuǎn)化方法是將農(nóng)桿菌或DNA轉(zhuǎn)化緩沖液直接滴加到滅菌過的脫脂棉上至脫脂 棉被轉(zhuǎn)化緩沖液飽和，將脫脂棉置于大豆的子葉節(jié)部位進行侵染，還包括將帶有下胚軸，胚根和子葉的受體整個置于轉(zhuǎn)化緩沖液中完成侵染。為提高緩沖液的附著程度，轉(zhuǎn)化緩沖液 中可添加表面活性劑物質(zhì)；為提高轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效率，一般在轉(zhuǎn)化緩沖液中添加乙酰丁香酮類物 質(zhì)；為提高轉(zhuǎn)化后叢生芽的分化效率，轉(zhuǎn)化緩沖液中可添加6-BA，2，4-D等植物生長調(diào)節(jié)物 質(zhì)。 去掉頂芽的幼苗受體利用農(nóng)桿菌或DNA溶液進行侵染時，該受體可以從培養(yǎng)基質(zhì) 中取出完成轉(zhuǎn)化，然后重新移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中，也可以將受體不從培養(yǎng)基質(zhì)中取出就地轉(zhuǎn) 化。轉(zhuǎn)化后的受體依舊依賴于幼苗的胚根吸收水分和礦質(zhì)元素。 不依賴于培養(yǎng)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化技術(shù)提高轉(zhuǎn)基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法中，將新葉
用選擇性標記物質(zhì)進行篩選時，可以用選擇性標記物質(zhì)對產(chǎn)生的枝條進行噴施篩選，也可
以直接涂抹篩選。但一定要保護好子葉及其以下末轉(zhuǎn)化的部分。對于選擇標記陰性的枝條
要即時去除，以有更多的營養(yǎng)物質(zhì)提供給陽性的枝條生長發(fā)育至產(chǎn)生Tl代種子。 對于選擇標記物質(zhì)篩選陽性的枝條，提取DNA和RNA進行分子標記，檢測枝條的轉(zhuǎn)
化特征。 本發(fā)明的優(yōu)點和效果如下 1)目前大豆是公認的難轉(zhuǎn)化作物，制約大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素主要是大豆的分 化效率低和大豆轉(zhuǎn)化植株生根難，煉苗移栽成活率低。目前提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率主要集 中在提高大豆的分化效率上，但是大豆分化效率的提高幅度不是很明顯，而針對大豆轉(zhuǎn)化 植株生根困難，移栽成活低這個限制因素，雖然有人做了大量的工作，但是目前還沒有好的 辦法來克服。通常只能通過提高大豆的分化效率來獲得足夠多的轉(zhuǎn)化植株，以保證轉(zhuǎn)基因 大豆的獲得，但因為大豆的分化主要依賴于組織培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化成本增高，而且無疑增加了大豆 遺傳轉(zhuǎn)化的工作量。本項發(fā)明就不依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法在植株上進行叢生芽的誘 導，在獲得叢生芽之后直接進行抗性篩選，因為保持了轉(zhuǎn)化受體的根系和莖段，通過篩選獲 得完整的轉(zhuǎn)化植株，成功的克服了大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的限制性的因素。應用該種轉(zhuǎn)化技術(shù)優(yōu) 勢非常明顯，首先，不依賴于組織培養(yǎng)，節(jié)約了誘芽成本和勞動力；同時該轉(zhuǎn)化方法減少了 生根和煉苗的步驟，提高了轉(zhuǎn)化植株的成活率；應用直接轉(zhuǎn)化技術(shù)縮短了大豆遺傳轉(zhuǎn)化周 期，比原來依賴組織培養(yǎng)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化6-8個月，可以短短到4-5個月，至少節(jié)省1-3個月 的時間； 直接轉(zhuǎn)化沒有對大豆轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生遺傳突變等負面影響，能夠正常的開花結(jié)實。 大豆直接轉(zhuǎn)化植株，TO代更接近于實生苗，獲得的Tl代種子結(jié)實飽滿、種子數(shù)量多，便于對 Tl代種子的篩選和分析。
實施例一 利用不依賴于組織培養(yǎng)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株
1)材料大豆品種鐵豐31，收于吉林師范大學實驗田。 2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株EHA105為吉林師范大學生態(tài)環(huán)境研究所保存，轉(zhuǎn)化載 體為CaMV 35S為啟動子，將帶有抗除草劑基因(bar基因)的pCAMBIA 3301植物雙元表達 載體(由吉林省農(nóng)業(yè)科學院趙桂蘭研究員饋贈)，導入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA 105，作為基因 工程菌轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)。圖1是雙元載體的結(jié)構(gòu)圖。 3)種苗的獲得將大豆種子播種到土壤基質(zhì)中，5-7天后待子葉變綠展開后，用手 術(shù)刀去凈頂芽和腋芽，然后順著脈絡方向劃5-6刀，約3-4mm長，0. 5mm深。
4)從農(nóng)桿菌EHA105-pCAMBIA 3301平板中挑取單菌落接種到3ml YEB液體培養(yǎng)基
中培養(yǎng)，待生長到OD = 0. 6左右時，離心4000rpm， 10min，收集菌體，待用。 5)轉(zhuǎn)化緩沖液l/2MS+0. 25m/L GA3+1. 67mg/L6-BAP+3 %蔗糖+40mg/L乙酰丁香
酮，pH5.4，菌體用lml轉(zhuǎn)化緩沖液進行懸浮，離心，收集菌體，重懸兩次，菌體的轉(zhuǎn)化緩沖液
懸浮液用作轉(zhuǎn)化用。 6)將轉(zhuǎn)化緩沖液直接滴加到滅菌過的脫脂棉上至脫脂棉被轉(zhuǎn)化緩沖液飽和，將脫 脂棉置于大豆的子葉節(jié)部位進行侵染，侵染后的子葉及子葉節(jié)部位用黑色袋罩好保濕，避 光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20-25°C ， 5-8天叢生芽生成，此時去掉黑色袋，置光下進行常規(guī)培養(yǎng)。
7) 10-20天后，待芽體長出1-3片葉片時，將0. 5% Basta除草劑用脫脂棉均勻涂 抹于葉片的表面，一周后觀察葉片狀態(tài)，葉片黃化枯焦斑點的，則為陰性枝，去除陰性枝，保 留陽性枝。提取轉(zhuǎn)化材料嫩葉和Tl代種子DNA進行PCR擴增，初步證明外源基因已經(jīng)整合 到大豆基因組中。 8)應用直接轉(zhuǎn)化技術(shù)縮短了大豆遺傳轉(zhuǎn)化周期，比原來依賴組織培養(yǎng)的子葉節(jié)轉(zhuǎn) 化6-7個月，可以短短到4個月，至少節(jié)省2-3個月的時間。 9)直接轉(zhuǎn)化沒有對大豆轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生遺傳突變等負面影響，能夠正常的開花結(jié) 實。 轉(zhuǎn)化大豆實生苗127株，共獲得Basta陽性TO代植株8株，獲得的172粒Tl代種
子結(jié)實飽滿。
實施例二 GUS基因通過不依賴于組織培養(yǎng)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化大豆
1)材料大豆品種鐵豐31，收于吉林師范大學實驗田。 2)菌株和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株LBA4404-PBI121為吉林師范大學生態(tài)環(huán)境研究所保 存，雙元載體pBI121-GUS，含有35s啟動子，GUS報告基因，卡拉霉素為選擇抗性基因。
3)種苗的獲得將于5月1日將大豆種子播種到土壤基質(zhì)中，5-7天后待子葉變綠 展開后，用手術(shù)刀去凈頂芽和腋芽，然后順著脈絡方向劃5-6刀，約3-4mm長，0. 5mm深。
4)從農(nóng)桿菌LBA4404-PBI121-GUS平板中挑取單菌落，接種于含有抗生素的YEB培 養(yǎng)基中，于28t:和250rpm條件下?lián)u動培養(yǎng)至生長對數(shù)期(菌液吸光度0D550為1. 8_2. 0); ③將培養(yǎng)好的菌液在5000rpm條件下離心10min，然后菌體重新懸浮于轉(zhuǎn)化緩沖液中 (1/2MS液體培養(yǎng)基+200p mol/L乙酰丁香酮)+1. 67mg/L6-BAP+0. 01 %的Dow corning Q2-5211+40mmol/L的CaCl2) ， pH5. 4，稀釋后的菌液濃度約2X 108cfu/ml
5)將菌液轉(zhuǎn)化緩沖液直接滴加到滅菌過的脫脂棉上至脫脂棉被轉(zhuǎn)化緩沖液飽和， 將脫脂棉置于大豆的子葉節(jié)部位進行侵染，侵染后的子葉及子葉節(jié)部位用黑色袋罩好保 濕，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20_25°C ， 5-8天叢生芽生成，此時去掉黑色袋，置光下進行常規(guī) 培養(yǎng)。 6) 10-20天后，待芽體長出l-3片葉片時，將100mg/mL卡拉霉素用棉花均勻涂抹于 葉片的表面，一周后觀察葉片狀態(tài)，葉片有黃化枯焦斑點的，則為陰性枝，去除陰性枝，保留 陽性枝。 7)剪取陽性植株的葉片少許置于PCR管中，利用X-gluc對陽性葉片進行染色，然 后置于37t:培養(yǎng)箱中1-12個小時，通過乙醇脫色后，于體視顯微鏡下觀察記錄GUS基因的表達情況。 8)借助于這種轉(zhuǎn)基因方法對105株大豆幼苗進行轉(zhuǎn)化， 一個月后對TO代叢生枝進 行檢測，結(jié)果有5株表現(xiàn)為卡拉霉素抗性，其中有4株表現(xiàn)為GUS染色陽性，去除陰性枝，保 留抗卡拉霉素和GUS染色陽性枝條，于2007年10月2日收獲T1代種子，平均每個陽性T0 代植株收獲種子21粒，通過不依賴于組織培養(yǎng)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法，將大豆遺傳轉(zhuǎn)化周 期縮短至不到5個月的時間。 對1\代種子播種后，得到57株抗卡拉霉素和GUS染色陽性的Tl代植株。



圖1是雙元載體pCAMBIA3301的結(jié)構(gòu)圖。
權(quán)利要求
一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方法，其特征在于采用了以下步驟a.不依賴組織培養(yǎng)的大豆轉(zhuǎn)化系統(tǒng)選取籽粒飽滿的大豆種子，播種到培養(yǎng)缽或田間。5-7d后大豆出苗，小心用手術(shù)刀將大豆的頂芽和腋芽去除干凈，造成鍥形傷口，然后順著脈絡方向輕劃5-6刀。用含有目的基因和選擇標記基因的農(nóng)桿菌或DNA的轉(zhuǎn)化緩沖溶液對大豆子葉節(jié)部位進行侵染。b.建立共培養(yǎng)和芽誘導的適宜的條件侵染后的子葉及子葉節(jié)部位用黑色袋罩好保濕，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20-25℃，5-8天叢生芽生成，此時去掉黑色袋，置光下進行常規(guī)培養(yǎng)。c.經(jīng)過10-15天培養(yǎng)后，芽體伸長長出1-3片葉片后，利用一定濃度的選擇標記物質(zhì)對葉片進行噴施或涂抹。2-3天后去除陰性的不定芽，選擇標記物質(zhì)篩選陽性的枝條進行常規(guī)培養(yǎng)。d.提取存留的大豆枝條嫩葉總DNA和種子總DNA，用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆植株當代和T1代種子的轉(zhuǎn)化特征。
2. 按權(quán)利要求1所述的一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新 方法，其特征是帶有下胚軸、胚根和子葉的子葉節(jié)作為轉(zhuǎn)化受體，子葉節(jié)受體被轉(zhuǎn)染后移種 到培養(yǎng)基質(zhì)后能夠依靠其根系完成植株吸收無機成分完成整個生長的需要。
3. 權(quán)利要求2所述的以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方法，其 中子葉節(jié)轉(zhuǎn)化受體利用農(nóng)桿菌或DNA溶液進行侵染時，該受體可以從培養(yǎng)基質(zhì)中取出完成 轉(zhuǎn)化，然后重新移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中，也可以將受體不從培養(yǎng)基質(zhì)中取出就地轉(zhuǎn)化。
4. 權(quán)利要求1所述的一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方 法，包括將農(nóng)桿菌或DNA轉(zhuǎn)化緩沖液直接滴加到滅菌過的脫脂棉上至脫脂棉被轉(zhuǎn)化緩沖液 飽和，將脫脂棉置于大豆的子葉節(jié)部位進行侵染，或者將帶有下胚軸，胚根和子葉的受體整 個置于轉(zhuǎn)化緩沖液中完成侵染。
5. 權(quán)利要求1所述的一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方 法，將新葉用選擇性標記物質(zhì)進行篩選時，要保護子葉及其下末轉(zhuǎn)化的部分。
6. 權(quán)利要求1所述的一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方 法，其中轉(zhuǎn)化緩沖液中可添加表面活性劑物質(zhì)以提高緩沖液的附著程度。
7. 權(quán)利要求1所述的一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方 法，其中轉(zhuǎn)化緩沖液中可添加乙酰丁香酮類物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。
8. 權(quán)利要求1所述的一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方 法，其中轉(zhuǎn)化緩沖液中可添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化后叢生芽的分化效率。
全文摘要
一種以大豆子葉節(jié)為受體不依賴組織培養(yǎng)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化新方法，應用于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在傳統(tǒng)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化基礎上，以不依賴組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法對大豆的遺傳轉(zhuǎn)化進行完善。在篩選有效的大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)的基礎上，突出了不依賴組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體系。通過常規(guī)大豆品種的轉(zhuǎn)化驗證，在田間栽培情況下進行直接轉(zhuǎn)化，可促進轉(zhuǎn)化部位叢生芽的萌發(fā)與生長。通過葉片噴施或涂抹，可有效對陽性枝進行篩選。陽性植株不需要經(jīng)過生根過程，于轉(zhuǎn)化后5個月可以直接獲得轉(zhuǎn)基因后代，很大程度上提高了大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率，顯著縮短了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的周期。該轉(zhuǎn)基因方法將改變大豆遺傳轉(zhuǎn)化難的現(xiàn)狀，促進大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
文檔編號C12Q1/68GK101736028SQ20081018151
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者劉劍鋒, 程云清, 趙桂蘭, 陳智文 申請人:吉林師范大學