專(zhuān)利名稱(chēng)：干擾肌肉特異e3泛素蛋白連接酶基因的干擾rna,包含其的載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及針對(duì)肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因，具 體地Atrogin-l和MuRF 1的干擾RNA，包含所述干擾RNA的載體，由所述載體轉(zhuǎn)錄的干擾 RNA及其在制備用于預(yù)防或治療肌肉萎縮的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
"肌肉萎縮"系指骨骼肌肉體積縮小，肌纖維減少或變細(xì)甚至消失。多種因素均可 導(dǎo)致肌肉萎縮的發(fā)生，嚴(yán)重的疾病如乙肝、糖尿病、艾滋病、腎衰竭等。肌肉萎縮的主要表現(xiàn) 之一是骨骼肌蛋白分解丟失，其降解通過(guò)3類(lèi)蛋白酶途徑溶酶體蛋白酶、鈣依賴(lài)蛋白酶和 泛素-蛋白酶，后者最為重要。Atrogin-l和MuRF 1都屬于肌肉特異性E3泛素連接蛋白 酶，發(fā)生肌肉萎縮時(shí)Atrogin-l和MuRF 1的表達(dá)都升高(Claved et al. 2006) 。 Atrogin — 1基因含有一個(gè)F-box功能結(jié)構(gòu)域，此酶在骨骼肌中特異性地高表達(dá)。多種疾病導(dǎo)致的營(yíng) 養(yǎng)不良和骨骼肌萎縮都伴有Atrogin-l基因表達(dá)上調(diào)(Gomes et al. ，2005)。最新的研究 顯示Atrogin-l的表達(dá)量在肌肉萎縮臨床癥狀出現(xiàn)以前就有所提高，說(shuō)明導(dǎo)致肌肉萎縮， 首先產(chǎn)生Atrogin-l基因表達(dá)量升高，并使肌肉細(xì)胞中蛋白質(zhì)非正常降解(Glass, 2005)。 Atrogin-l蛋白降解途徑可以與細(xì)胞自噬途徑協(xié)同作用，導(dǎo)致更多蛋白的降解。
為了探討小RNA在肌肉萎縮中應(yīng)用的途徑，劉長(zhǎng)梅等研究了用化學(xué)合成的針對(duì) Foxo-l基因的干擾RNA經(jīng)進(jìn)一步研究有抑制鼠肌肉萎縮的作用(Liu et al. ，2007)。劉 長(zhǎng)梅等還研究了化學(xué)合成的針對(duì)Myostatin反義RNA對(duì)小鼠肌肉萎縮有抑制作用(Liu et al. 2008)。通過(guò)大劑量的直接注射經(jīng)過(guò)修飾的耙向GDF-8、F0X0-1基因的有效干擾片段，可 以明顯的觀察到小鼠的肌肉質(zhì)量的改善。由于化學(xué)合成的干擾RNA除價(jià)格昂貴外，其靶向 性差，特異性較低以及作用持續(xù)時(shí)間短等因素，導(dǎo)致干擾效果欠佳。為了探索應(yīng)用性更佳的 藥物施入方式，劉長(zhǎng)梅等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的干擾RNA使GDF-8基因沉默，其治療肌 肉萎縮病的效果更好(Yang etal.2008)。 本發(fā)明的申請(qǐng)人針對(duì)上述問(wèn)題，設(shè)計(jì)了針對(duì)肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因，具 體地Atrogin-l基因和MuRF 1基因的干擾RNA序列，并將其編碼DNA序列構(gòu)建到腺病毒載 體或小環(huán)DNA載體中，申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的干擾RNA序列以及包含其的 載體可以有效地抑制肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因Atrogin-l基因和MuRF 1基因的 表達(dá)，提高疾病發(fā)生時(shí)的肌肉質(zhì)量，同時(shí)所構(gòu)建的腺病毒載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA相比于化學(xué) 合成的干擾RNA靶向性更好，特異性更強(qiáng)，具有更好的穩(wěn)定性，能夠克服化學(xué)合成干擾RNA 的不穩(wěn)定，藥物作用持續(xù)時(shí)間短，吸收量少的特點(diǎn)，相比于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有更好的安全 性，作用效果穩(wěn)定，而小環(huán)DNA系統(tǒng)在此基礎(chǔ)上相比于傳統(tǒng)的腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體還具有更好的安全性，藥物作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可以多次免疫的優(yōu)點(diǎn)。
參考文獻(xiàn) [l]Clavel S， Coldefy AS， Kurkdjian E， et al. Atrophy—related ubiquitinligases， atrogin_land MuRF lare up_regulated in aged rat Tibialis Anterior muscle. Mech Ageing Dev ;127(10) :794-801,2006. [2]Marcelo D. Gomes， Stewart H丄ecker， R. Thomas Jagoe，Ami Navon， andAlfred L Goldberg. Atrogin—l, a muscle—specific F_box protein highlyexpressed during muscle atrophy. PNAS，98(25) : 14440-14445，2001. [3]David J. Glass. Ske 1 eta 1 muscle hypertrophy and atrophy signalingpathways. The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,37: 1974-1984,2005. [4]Chang_Mei Liu，Zhuo Yang，Chao-Wu Liu，Rong Wang，Po Tien，RoderickDale and Um_Quan Sim. Effect of RNA oligonucleotide targeting Foxo_lon muscle growth in normal and cancer cachexia mice. Cancer GeneTher即y. 14 (12) :945-52,2007.
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供下列 第一方面，提供一種用于預(yù)防和治療肌肉萎縮的載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述干擾RNA，其靶向肌特異E3泛素蛋白連接酶基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌 肉特異E3泛素蛋白連接酶基因?yàn)锳trogin-l基因(SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO: 8)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾RNA耙向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中間區(qū)域 序列和/或所述MuRF l基因的3'端、5'端或中間區(qū)域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干 擾RNA的DNA編碼序列是SEQ ID NO :1， SEQ ID NO :2， SEQ IDNO :3， SEQ ID NO :4， SEQ ID N0:5，或SEQ ID NO :6。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是病毒載體或質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述載體是腺病毒載體或小環(huán)DNA質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腺病毒載體 是PDC312載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小環(huán)DNA質(zhì)粒載體是P2 4 C31載體。
第二方面，提供一種干擾RNA，其編碼DNA序列與上述第一方面的干擾RNA的編碼 DNA序列相同。 第三方面，提供一種載體，其包含編碼上述第一方面或第二方面的干擾RNA的DNA 序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾RNA，其靶向肌特異E3泛素蛋白連接酶基因。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因?yàn)锳trogin-l基因(SEQ ID NO :7)或 MuRF l(SEQ ID NO :8)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾RNA靶向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中間區(qū)域序列和/或所述MuRF l基因的3'端、5'端或中間區(qū)域序列。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述干擾RNA的DNA編碼序列是SEQ ID NO :1， SEQID NO :2， SEQ ID NO :3， SEQ ID NO :4， SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是病毒載體或質(zhì)粒 載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是腺病毒載體或小環(huán)DNA質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述腺病毒載體是PDC312載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小環(huán)DNA質(zhì)粒載體是P2 4 C31 載體。 第四方面，提供一種載體，其是一種雙價(jià)載體，包含分別干擾Atrogin-l和MuRF 1 的干擾RNA的DNA編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是病毒載體或質(zhì)粒載體。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是腺病毒載體或小環(huán)DNA質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腺病 毒載體是PDC312載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小環(huán)DNA質(zhì)粒載體是P2 4C31載體。在一 個(gè)實(shí)施方案中，干擾Atrogin-l的干擾RNA的DNA編碼序列是SEQ ID NO:l，MuRF 1的干擾 RNA的DNA編碼序列是SEQ ID NO :4。 第五方面，提供上述第一或第二方面的干擾RNA和/或第三或第四方面的載體在 制備預(yù)防和治療肌肉萎縮的藥物中的應(yīng)用。 第六方面，提供一種預(yù)防和治療肌肉萎縮的藥物，其包含第一或第二方面的干擾 RNA和/或第三或第四方面的載體作為活性成分。 第七方面，提供一種干擾肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因的方法，所述方法包括 下列步驟 a)將干擾肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因的干擾RNA編碼的DNA與載體連接；
b)用所述載體轉(zhuǎn)染包含肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述干擾RNA，其靶向肌特異E3泛素蛋白連接酶基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉 特異E3泛素蛋白連接酶基因?yàn)锳trogin-l基因(SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO :8) 基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾RNA靶向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中間區(qū)域序 列和/或所述MuRF l基因的3'端、5'端或中間區(qū)域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾 RNA的DNA編碼序列是SEQ ID NO:l， SEQ ID NO :2， SEQ ID NO :3， SEQ ID NO :4， SEQ ID N0:5，或SEQ ID NO :6。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是病毒載體或質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述載體是腺病毒載體或小環(huán)DNA質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腺病毒載體 是PDC312載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小環(huán)DNA質(zhì)粒載體是P2 4 C31載體。
申請(qǐng)人:分別根據(jù)肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因Atrogin-l基因和MuRF 1基因 的5'端，3'端或中間區(qū)域序列設(shè)計(jì)了干擾RNA序列，并將其構(gòu)建到腺病毒載體和小環(huán)DNA載 體中，對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其可明顯抑制Atrogin-l基因和MuRF 1基因的表達(dá)水 平，提高M(jìn)ygod， myosin, myogenin的表達(dá)量，對(duì)動(dòng)物水平的藥效學(xué)檢測(cè)顯示動(dòng)物的腿部肌 肉質(zhì)量增加，對(duì)Atrogin-1基因和MuRF 1基因的表達(dá)被抑制，肌肉分化的負(fù)調(diào)控因子GDF-8 表達(dá)量下降，小鼠的肌纖維大小增加，肌肉質(zhì)量得到改善。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的載體，由載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA在降低Atrogin-1基因和 MuRF l基因表達(dá)的同時(shí)，顯著提高肌肉分化因子的表達(dá)，降低分化抑制因子的表達(dá)，迅速而 且高效的誘導(dǎo)細(xì)胞分化，抑制I型肌纖維向II型肌纖維的轉(zhuǎn)化，顯著提高肌肉質(zhì)量，說(shuō)明本 發(fā)明的載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA以及包含其的載體可在肌肉萎縮的治療和預(yù)防中起到至關(guān)重 要的作用。并且本文構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA明顯地具有靶向性好，特異性強(qiáng)，更加穩(wěn)定，并且藥物作用效果時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，觀察到由分別干擾Atrogin-l和干擾MuRF 1 基因構(gòu)建的雙價(jià)載體對(duì)預(yù)防和治療肌肉萎縮有增強(qiáng)作用。


圖1.抑制Atrogin-1基因表達(dá)的干擾RNA的序列設(shè)計(jì)及表達(dá)載體的構(gòu)建
圖1A.轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建 圖IB.所設(shè)計(jì)的與siRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列及其雙鏈結(jié)構(gòu)、Sal I和1Xba I的酶切
位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(terminal signal)及其形成的環(huán)結(jié)構(gòu)(loop)。 圖1C. A-3' -IsiRNA重組腺病毒的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 圖2.腺病毒載體轉(zhuǎn)錄的siRNA在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平對(duì)Atrogin-1表達(dá)的抑制 圖2A. A-3' -IsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)Atrogin-1基因轉(zhuǎn)錄成的
mRNA的影響，siRNA有明顯的抑制作用，而無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC無(wú)明顯作用。Control為空
載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖2B. A-3' -IsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)Atrogin-1基因表達(dá)的影 響，siRNA有明顯的抑制作用，而無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC無(wú)明顯作用。Control為空載體重組 腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖2C. A-3' -IsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC對(duì)Atrogin-1基因表達(dá)成為蛋白的影 響，siRNA有明顯的抑制作用，而無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC無(wú)明顯作用。P-actin為內(nèi)參照。為 了檢測(cè)A-3' -1 siRNA有無(wú)脫靶現(xiàn)象，檢測(cè)了 NF k -P65 ， C-F0S轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。Contro 1 為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖2D.饑餓小鼠模型中siRNA對(duì)Atrogin-1基因表達(dá)成為蛋白的影響，siRNA 有明顯的抑制作用。P-actin為內(nèi)參照。為了檢測(cè)A-3'-IsiRNA有無(wú)脫靶現(xiàn)象，檢測(cè)了 NFk -P65，C-F0S轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，證明無(wú)脫靶現(xiàn)象。Mock為空白對(duì)照，saline為生理 鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖2E. A-3'-lsiRNA對(duì)饑餓小鼠模型骨骼肌中Atrogin-1表達(dá)的影響，siRNA有明 顯的抑制作用。Mock為空白對(duì)照，saline為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。
圖2F.Northen blotting檢測(cè)A_3' -IsiRNA在饑餓小鼠模型骨骼肌中的表達(dá)。 Mock為空白對(duì)照，saline為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖2G. Northen blotting檢測(cè)A-3'-lsiRNA在c2c 12細(xì)胞中的表達(dá)。Mock為空
白對(duì)照，saline為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖3. siRNA對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉重量和肌纖維質(zhì)量的影響 圖3A. siRNA實(shí)驗(yàn)組，生理鹽水，空載體對(duì)照組饑餓小鼠及正常飼養(yǎng)對(duì)照組的小鼠 體重變化。實(shí)驗(yàn)證明，siRNA實(shí)驗(yàn)組較生理鹽水，空載體對(duì)照組饑餓小鼠體重有所增加，饑餓 小鼠體重一直處于上升的趨勢(shì)，而饑餓小鼠的體重?zé)o明顯變化。Mock為空白對(duì)照，saline 為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖3B. siRNA對(duì)饑餓小鼠腿部肌肉重量的影響。結(jié)果顯示，siRNA實(shí)驗(yàn)組饑餓小鼠 的腿部肌肉重量與饑餓對(duì)照組小鼠相比有明顯增加。Mock為正常飼養(yǎng)的空白對(duì)照，saline 為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。
0040] 圖3C. siRNA實(shí)驗(yàn)組饑餓小鼠，Mock正常飼養(yǎng)的空白對(duì)照，saline生理鹽水注射饑餓對(duì)照組小鼠，Control空載體腺病毒注射饑餓對(duì)照組小鼠腿部骨骼肌病理切片的H&E染 色。 圖3D.根據(jù)肌肉病理切片計(jì)算的小鼠模型腿部骨骼肌肌纖維橫截面積的變化。注 射siRNA的饑餓實(shí)驗(yàn)組小鼠與saline生理鹽水，Control空載體腺病毒處理的饑餓小鼠對(duì) 照組相比，肌纖維的面積顯著增加。Mock為正常飼養(yǎng)的空白對(duì)照。 圖3E. siRNA處理饑餓小鼠及saline生理鹽水，Control空載體腺病毒對(duì)照組饑
餓小鼠腿部骨骼肌病理切片的ATPase染色，Mock為正常飼養(yǎng)的空白對(duì)照。 圖3F.小鼠腿部骨骼肌I型肌纖維橫截面積的變化。siRNA實(shí)驗(yàn)組饑餓小鼠與
saline生理鹽水，Control空載體腺病毒處理的饑餓小鼠對(duì)照組相比，I型肌纖維的面積顯
著增加，且II型肌纖維的數(shù)目較少。Mock為正常飼養(yǎng)的空白對(duì)照。 圖4.抑制Atrogin-l對(duì)c2cl2細(xì)朐和肌萎縮小鼠牛肌分化的影響 圖4A. A-3' -lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞分化標(biāo)志物，myosin，
myogenin， a -actin表達(dá)的影響。siRNA會(huì)g夠明顯的提高myosin,myogenin， a -actin的表
達(dá)量，從而說(shuō)明siRNA能夠顯著的提高c2cl2細(xì)胞的分化，而無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC， Control
空載體重組腺病毒均無(wú)明顯作用。P-actin為內(nèi)參照。 圖4B.A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞分化標(biāo)志物myosin表
達(dá)影響的定量計(jì)算。Control為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖4C. A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞分化標(biāo)志物a -actin
表達(dá)影響的定量計(jì)算。Control為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖4D. A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞分化標(biāo)志物myogenin
表達(dá)影響的定量計(jì)算。Control為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖4E. A-3' -IsiRNA對(duì)小鼠模型腿部骨骼肌肌細(xì)胞分化水平的影響。siRNA夠
明顯的提高小鼠骨骼肌肌細(xì)胞中myosin和a -actin的表達(dá)量，從而說(shuō)明siRNA能夠顯
著的提高小鼠骨骼肌肌細(xì)胞的分化，Mock空白對(duì)照，生理鹽水，Control組均無(wú)明顯作用。
P-tublin為內(nèi)參照。 圖4F. A-3' -IsiRNA對(duì)小鼠模型腿部骨骼肌肌細(xì)胞中myosin表達(dá)影響的定量計(jì)
算。Mock為空白對(duì)照，saline為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖4G. A-3'-lsiRNA對(duì)小鼠模型腿部骨骼肌肌細(xì)胞中a -actin表達(dá)影響的定量計(jì)
算。Mock為空白對(duì)照，saline為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖5. c2cl2細(xì)胞和肌萎縮小鼠模型中抑制Atrogin-1的表達(dá)對(duì)Myod和GDF-8基
因表達(dá)的影響 圖5A. A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)GDF-8基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA 的影響，siRNA有明顯的抑制作用，而無(wú)關(guān)干擾RNASiHBC無(wú)明顯作用。Control為空載體重 組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖5B. A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)Myod基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA的 影響，siRNA可以顯著的提高M(jìn)yod基因的轉(zhuǎn)錄，而無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC無(wú)明顯作用。Contro1 為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖5C. A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)GDF-8和Myod基因表達(dá)的 影響。Control為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。
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圖5D. A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)GDF-8基因表達(dá)影響的定量 計(jì)算。siRNA可以顯著的降低GDF-8基因表達(dá)，而無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC無(wú)明顯作用。Control 為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖5E. A-3'-lsiRNA和無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC在細(xì)胞中對(duì)Myod基因表達(dá)影響的定量 計(jì)算。siRNA可以顯著的升高M(jìn)yod基因表達(dá)，而無(wú)關(guān)干擾RNA SiHBC無(wú)明顯作用。Control 為空載體重組腺病毒、Mock為空白對(duì)照。 圖5F. A-3'-lsiRNA對(duì)小鼠模型腿部骨骼肌肌細(xì)胞中GDF-8和Myod基因表達(dá)的影
響。siRNA夠明顯的降低小鼠骨骼肌肌細(xì)胞中GDF-8，同時(shí)提高M(jìn)yod的表達(dá)量。Mock空白
對(duì)照，Saline為生理鹽水，Control為空載體重組腺病毒。P -tublin為內(nèi)參照。 圖5G. A-3' -lsiRNA對(duì)小鼠模型腿部骨骼肌肌細(xì)胞中GDF-8基因表達(dá)影響的定量
計(jì)算。Mock為空白對(duì)照，saline為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖5H. A-3'-lsiRNA對(duì)小鼠模型腿部骨骼肌肌細(xì)胞中Myod基因表達(dá)影響的定量計(jì)
算。Mock為空白對(duì)照，saline為生理鹽水，Control為空載體腺病毒。 圖6pSUPER-Hl載體的圖譜。 圖7p2 4C31載體的圖譜。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明，所述實(shí)施例不限制在權(quán)利要求中描述的本 發(fā)明的范圍。 下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版， 1999年，J.薩姆布魯克，E.F弗里奇，科學(xué)出版社。) 實(shí)施例一、靶向Atrogin-l基因的干擾RNA序列的設(shè)計(jì)，載體構(gòu)建及細(xì)胞和動(dòng)物水 平藥效學(xué)柃測(cè)l。 一、抑制Atrogin-l基因表達(dá)的干擾RNA的序列設(shè)計(jì)及表達(dá)載體的構(gòu)建
1、干擾RNA序列的設(shè)計(jì) (1)、靶向Atrogin-l基因3'端的干擾RNA序列的設(shè)計(jì) 應(yīng)用干擾序列設(shè)計(jì)軟件(siRNA design)設(shè)計(jì)耙向?yàn)锳trogin-l基因(SEQ ID NO : 7)3'端的干擾RNA序列所設(shè)計(jì)的與干擾RNA對(duì)應(yīng)的DNA序列如圖1B，干擾序列均為人鼠 同源，轉(zhuǎn)錄后自身能夠形成小發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以便能成功的被dicer酶識(shí)別并剪切，并導(dǎo)致mRNA 的降解，。以 Atrogin-3' _1的序列為例，其DNA序列為
A_3， _1 :
3， (SEQ ID NO :1) 以下敘述中A-3' -IsiRNA在實(shí)施例1中簡(jiǎn)稱(chēng)為siRNA。
(2)、靶向Atrogin-l基因5'端干擾RNA序列的設(shè)計(jì) 應(yīng)用干擾序列設(shè)計(jì)軟件(siRNA design)設(shè)計(jì)耙向Atrogin-l基因5'端的干擾序 列，設(shè)計(jì)原則同上。以A-5' -1為例，其DNA序列為
A-5' -13， (SEQ ID NO :2) (3)、靶向Atrogin-1某閔中間區(qū)域序列的干擾RNA的設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)原則同上。應(yīng)用干擾序列設(shè)計(jì)軟件(siRNA design)設(shè)計(jì)耙向Atrogin-l基 因中間區(qū)域的干擾序列，設(shè)計(jì)原則同上。其DNA序列為
A-M-l :
3' (SEQ ID NO :3) (4)為了檢測(cè)所設(shè)計(jì)的靶向Atrogin-1的干擾序列的特異性，設(shè)計(jì)了靶向 乙肝病毒核心抗原的干擾序列siHBC，與其干擾RNA對(duì)應(yīng)的DNA序列為SiHBC :5'GATCAAAA AGCCTCCAAGCTGTGCCTTGTTCAAGAGACAAGGCACAGCTTGGAGG TTTTT 3' (SEQ ID NO :9)
2、干擾RNA載體的構(gòu)建
(1)、腺病毒載體的構(gòu)建 將上述與干擾序列siRNA， siHBC相對(duì)應(yīng)的DNA片段95。C加熱10分鐘后37。C退 火半小時(shí)。然后根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版，1999年，J.薩姆布魯克，E.F弗里奇，科 學(xué)出版社)和(Baer M et al， 1990)，在pSUPER-Hl (購(gòu)自O(shè)ligoengine)載體(圖6)上 后面反向插入一個(gè)U6啟動(dòng)子獲得pSUPER-Hl+U6載體，將上述退火的與干擾序列siRNA相 對(duì)應(yīng)的DNA片段(其帶有Sail和Xbal酶切位點(diǎn))與所述pSUPER-Hl+U6載體上的相應(yīng)位 點(diǎn)連接，得到pSUPER-Hl+siRNA+U6載體，用Kpnl和EcoRI切下含有Hl+U6雙啟動(dòng)子的表 達(dá)盒(Hl+siRNA+U6)連接PUC18載體(購(gòu)自科寧公司)，得到PUC18+Hl+siRNA+U6重組質(zhì) 粒。再由重組后的PUC18+Hl+siRNA+U6載體中將Hl+siRNA+U6切下并將其和PDC312載 體(購(gòu)自本元正陽(yáng))連接，從而將所述表達(dá)盒重組到腺病毒載體PDC312上(圖1A)得到 PDC312+Hl+siRNA+U6。 PDC312+Hl+siHBC+U6的構(gòu)建方法同上。PCR擴(kuò)增目的片段，測(cè)定序 列(奧科測(cè)序)證實(shí)其可靠性。測(cè)序檢測(cè)，所合成的與干擾序列相對(duì)應(yīng)的DNA片段準(zhǔn)確插 入PDC312載體的適當(dāng)位點(diǎn)，腺病毒載體構(gòu)建成功。 10% DMEM液(100 ii g/ml潮霉素，1 y g/ml嘌呤霉素)培養(yǎng)M293 (購(gòu)自本元正陽(yáng)) 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天，分細(xì)胞到六孔板，37°C ， 5% C02培養(yǎng)細(xì)胞18小時(shí)，待細(xì)胞80%聯(lián)會(huì)后， 用fugen轉(zhuǎn)染試劑(羅氏公司)，分別按質(zhì)粒(重量)/轉(zhuǎn)染試劑(微升)2/4的比例將腺 病毒骨架質(zhì)粒與所構(gòu)建的PDC312+Hl+siRNA+U6， PDC312+Hl+siHBC+U6， PDC312+H1+U6共轉(zhuǎn) 染M293細(xì)胞系(轉(zhuǎn)染方法200微升opti-MEM(購(gòu)自GIBC0)加入2微克重組質(zhì)粒，O. 2微 克骨架質(zhì)粒，充分混勻后，加入8微升fugen轉(zhuǎn)染試劑，震蕩后，室溫放置15分鐘，緩慢加入 六孔板中)，轉(zhuǎn)染一天后換液，繼續(xù)培養(yǎng)，至病毒噬斑出現(xiàn)，待50%細(xì)胞漂浮，吹下細(xì)胞，將 含細(xì)胞的培養(yǎng)液凍融3次，800G離心，取上清用PCR擴(kuò)增目的片段(圖1C)，并測(cè)序，上清 置-7(TC保存。應(yīng)用225cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)M293細(xì)胞，按每瓶接種lml的劑量接種重組病毒， 每種病毒接種6瓶。培養(yǎng)3天后，50%細(xì)胞懸浮，吹下細(xì)胞，應(yīng)用腺病毒純化試劑盒(購(gòu)自 吉美公司)純化重組腺病毒，濃縮病毒至lml， _701:保存。
3、小環(huán)DNA載體的構(gòu)建 將合成的相對(duì)應(yīng)的干擾序列siRNA的DNA片段95t:加熱10分鐘后，37。C退火半小 時(shí)。根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版，1999年，J.薩姆布魯克，E.F弗里奇，科學(xué)出版社) 和(Baer M et al， 1990)，在pSUPER-Hl (購(gòu)自oligoengine)載體上后面反向插入一個(gè)U6啟動(dòng)子獲得pSUPER-Hl+U6載體，所述重組載體經(jīng)Sail和Xbal雙酶切后，與上述退火的所 述合成的相對(duì)應(yīng)的干擾序列siRNA的DNA片段相連接構(gòu)建成pSUPER-Hl+siRNA+U6重組質(zhì) 粒，從所述pSUPER-Hl+U6載體上用Kpnl和Sacl切下含有H1+干擾序列+U6雙啟動(dòng)子的表 達(dá)盒與Kpnl和Sacl雙酶切的小環(huán)DNA載體(P2 4 C31載體)(人內(nèi)皮抑素小環(huán)載體的構(gòu)建 及其在真核細(xì)胞的表達(dá)，中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，6)(圖7)(獲自武漢大學(xué)分子病毒與免疫實(shí) 驗(yàn)室)使用Kpnl和Sacl連接，產(chǎn)生重組質(zhì)粒。并測(cè)定序列。經(jīng)測(cè)序檢測(cè)，所合成的與干擾 序列相對(duì)應(yīng)的DNA片段準(zhǔn)確插入小環(huán)DNA載體的適當(dāng)位點(diǎn)，小環(huán)DNA載體構(gòu)建成功。
二、 siRNA重組腺病毒在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平對(duì)Atrogin-1表汰的抑制
1、 siRNA重組腺病毒在細(xì)胞水平對(duì)Atrogin-1表汰的抑制 應(yīng)用腺病毒滴度檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自本元正陽(yáng))檢測(cè)重組腺病毒滴度。用含15% FBS (胎牛血清)的DMEM液(100 y g/ml潮霉素，1 y g/ml嘌呤霉素)培養(yǎng)c2cl2 (購(gòu)自協(xié)和 醫(yī)學(xué)院)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，100微升2.5%胰酶消化所述細(xì)胞并按每孔104個(gè)細(xì)胞的 數(shù)量接種于六孔板中。按細(xì)胞數(shù)/病毒數(shù)=1 : 100的比例將siRNA，siHBC，Mock (空載體 腺病毒)重組腺病毒感染c2cl2細(xì)胞，感染后12小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為含2%馬血清的DMEM 液，剌激所述細(xì)胞分化24小時(shí)后，吸掉上清，將其冰浴用PBS輕輕洗滌3次，其中一板每孔 各加0. 5mL的RTIZOL試劑(invitrogin)，并提取細(xì)胞總RNA，用DEPC(焦碳酸二乙脂)水 充分溶解后，通過(guò)1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度。采用 TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用SYBgreen方法，將其在ABI7000 型REAL-TME PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Ct值計(jì)算RNA水平Atrogin-1的表達(dá)。
此外，在剌激所述c2cl2細(xì)胞分化24小時(shí)后，吸掉上清，冰浴用PBS輕輕洗滌 3次，加入150微升細(xì)胞裂解液，待至細(xì)胞裂解完全后，吸入1. 5ml離心管中，12000轉(zhuǎn)/ 分，4。C離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到離心管中，應(yīng)用Biorad公司的AXB液測(cè)量蛋白濃度， 12% SDS-PAGE，80V電泳2小時(shí)，將所述蛋白通過(guò)半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Amersham) 上(27mA、45min)，考馬斯亮藍(lán)染色確定轉(zhuǎn)膜效率，脫色后TBST(Tris-HCI緩沖液(0. 5M pH7. 6) 100ml NaCl 8. 5 9g(0. 15mol/L) ， lml/L的triton-20)洗滌3次，5%脫脂奶粉封 閉過(guò)夜，TBST洗滌3次后，加入Atrogin-l抗體(1%脫脂奶粉，抗體1/1000稀釋)，37。C孵 育1小時(shí)，TBST洗滌3次(每次10分鐘)后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(購(gòu)買(mǎi)自中衫 金橋)(1%脫脂奶粉，抗體1/3000稀釋)，37t:孵育45分鐘，TBST洗滌3次后(每次10分 鐘)，再用超敏發(fā)光液顯色，壓片，洗片。 熒光定量PCR結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，siRNA對(duì)c2cl2細(xì)胞中Atrogin-l基因 RNA水平的抑制效率達(dá)到了60X (圖2A)，與蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果一致(圖2B)同時(shí)分 析了轉(zhuǎn)錄因子NF k -P65， C-FOS的表達(dá)量變化，證明無(wú)脫靶現(xiàn)象(圖2C)。
2、 siRNA重組腺病毒在動(dòng)物水平對(duì)Atrogin-1表達(dá)的抑制 本實(shí)驗(yàn)所采用的肌萎縮動(dòng)物模型為饑餓處理的BALB/C小鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué) 院)。4周齡的BALB/C雌性小鼠飼養(yǎng)一周(按照中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法)后，饑餓 l天。 將饑餓處理的BALB/C雌性小鼠分為A、 B、 C、 D四組，每組5只。A組按109/只的 劑量注射siRNA重組腺病毒，B組按107只的劑量注射Pdc312重組腺病毒，C組注射生理 鹽水，D組注射生理鹽水。A、B、C三組按5g/只的進(jìn)食量飼養(yǎng)，D組正常飼養(yǎng)，注射后飼養(yǎng)一
10周，處死小鼠。 取一定量的小鼠肌肉組織(小鼠骨骼肌)，加RIPA(全組織)裂解液(BI0MED)，加 入全蛋白酶抑制劑(羅氏公司)，于冰上勻漿，至細(xì)胞完全裂解，離心，取上清，稀釋后測(cè)量 蛋白濃度，即刻上樣分析(方法同細(xì)胞水平一致)。動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肌萎縮小 鼠模型中，siRNA重組腺病毒對(duì)Atrogin-1的抑制效率達(dá)到了 60%以上(圖2E)，為檢測(cè)有 無(wú)脫靶現(xiàn)象，檢測(cè)了 c-Fos和nfkB-P65的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量并沒(méi)有 明顯變化圖(2C)。 Northen blotting檢測(cè)所構(gòu)建的重組腺病毒在細(xì)胞(圖2F)和動(dòng)物肌肉組織中 (圖2G)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在c2cl2細(xì)胞和動(dòng)物肌肉組織中，siRNA都有較高的表達(dá) 綜上所述，細(xì)胞水平和動(dòng)物水平檢測(cè)指標(biāo)顯示，siRNA能夠有效的降低Atrogin-l 基因的表達(dá)。 3、小環(huán)DNA干擾系統(tǒng)在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平對(duì)Atrogin-l的抑制
將構(gòu)建的含有干擾序列表達(dá)盒siRNA的小環(huán)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，挑取單 克隆，接于3ml LB液體培養(yǎng)基中，37。C，200RPM培養(yǎng)過(guò)夜，按1 : 100接于200ml LB液體 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)，用質(zhì)粒大提試劑盒(威格拉斯)提取質(zhì)粒，測(cè)濃度，應(yīng)用fugen轉(zhuǎn) 染試劑(羅氏公司)，按質(zhì)粒(重量)/轉(zhuǎn)染試劑(微升)2/4的比例轉(zhuǎn)染c2cl2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 6小時(shí)后，將培養(yǎng)基由15% FBS的DMEM液中更換為含2%馬血清的DMEM液中，剌激分化24 小時(shí)后，進(jìn)行western blot分析(方法同上)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在c2cl2細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染重 組小環(huán)DNA后(包含siRNA)，有效的抑制了 Atrogin-l基因的表達(dá)，其抑制效率達(dá)60%以 上。將所提質(zhì)粒按2 0. 5微克/只的劑量注射饑餓處理1天的BALB/C小鼠，每天定
時(shí)稱(chēng)量小鼠體重，l周后檢測(cè)肌肉重量。結(jié)果顯示，在肌萎縮小鼠模型中，siRNA重組小環(huán)
DNA載體對(duì)Atrogin-l的抑制效率達(dá)到了 50%以上。 三、siRNA對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉重暈和肌纖維質(zhì)暈的影響 1、 siRNA重組腺病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉重暈和肌纖維質(zhì)暈的影響將饑餓處理的BALB/C雌性小鼠分為A、 B、 C、 D四組，每組5只。A組按109/只的
劑量注射siRNA重組腺病毒，B組按107只的劑量注射Pdc312重組腺病毒，C組注射生理
鹽水，D組注射生理鹽水。A、B、C三組按5g/只的進(jìn)食量飼養(yǎng)，D組正常飼養(yǎng)，觀察小鼠體重
變化(圖3A)。注射后飼養(yǎng)一周，處死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。 處死小鼠后，稱(chēng)量其前大腿，和小腿，后大腿，和小腿重量。比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小
鼠腿部肌肉重量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射siRNA重組腺病毒的小鼠前肢大
腿，后肢大腿腿部肌肉重量與對(duì)照組相比增加20-30% (圖3B)。 取小鼠后肢大腿，于液氮冷卻的異戊烷中迅速冷凍，并儲(chǔ)存于液氮中，制作石蠟切 片，并用蘇木精和伊紅(H&E)染色在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照(圖3C)。纖維計(jì)數(shù)和橫截面 積計(jì)量運(yùn)用ImagePro5. 0. 1軟件(MediaCybe潔tics， Silver Spring, MD， USA)進(jìn)行分析， 纖維的大小為測(cè)量的肌纖維橫截面積的平均值，每個(gè)肌肉組織樣品測(cè)量了大約500-700個(gè) 肌纖維。結(jié)果顯示，注射siRNA重組腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纖維橫截面積比注射生 理鹽水和Mock的對(duì)照組增加約25% (圖3D)，從而說(shuō)明在降低Atrogin-1基因表達(dá)的情況下，促進(jìn)肌纖維的生肌分化的同時(shí)，能夠增加肌纖維的大小，提高肌肉質(zhì)量。
新鮮獲取的肌肉樣品(小鼠腿部骨骼肌)在液氮冷卻的異戊烷中冷凍，保存于液 氮中。將樣品在恒冷切片機(jī)中切片，隨后進(jìn)行三磷酸腺苷酶(ATPase)染色切片首先孵育 (37°C )在酸性預(yù)培養(yǎng)液中(95mM CH3C00Na， 99mM KC1， pH 4. 2)，然后孵育在ATP培養(yǎng)液中 (2.8mM ATP，47. 5mMNa0H，65mM NaCl，52.75mM glycine, 37. 8mM CaCl2，pH 9.4)。肌纖維類(lèi) 型通過(guò)著色深淺來(lái)區(qū)分(typel > type II)，分析平均纖維面積和纖維類(lèi)型(圖3E)。纖維 橫截面積計(jì)量運(yùn)用ImagePro 5.0. 1軟件(MediaCybe潔tics， SilverSpring， MD， USA)進(jìn) 行分析，纖維的大小為測(cè)量的肌纖維橫截面積的平均值，每個(gè)肌肉組織樣品測(cè)量了大約500 個(gè)肌纖維。結(jié)果顯示， 一型肌纖維的橫截面積沒(méi)有顯著差異，二型肌纖維的橫截面積與對(duì)照 組相比明顯增大(圖3F)。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明含有siRNA干擾序列的重組腺病毒能夠精確的靶向Atrogin-l
基因，在降低Atrogin-l基因的表達(dá)的同時(shí)，抑制I型肌纖維向II型肌纖維的轉(zhuǎn)化，增加肌
纖維的大小，顯著提高肌纖維的質(zhì)量，從而提高肌肉的重量。 2、 siRNA小環(huán)DNA載體系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉重量和肌纖維質(zhì)量的影響將所提質(zhì)粒按2 0. 5微克/只的劑量注射饑餓處理1天的BALB/C小鼠，每天定
時(shí)稱(chēng)量小鼠體重，1周后檢測(cè)肌肉重量，檢測(cè)指標(biāo)同前，結(jié)果顯示，注射siRNA小環(huán)DNA載體
的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量增加20-25 % 。，注射siRNA重組腺病毒的小鼠大
腿腿部肌肉肌纖維橫截面積比注射生理鹽水和Mock的對(duì)照組增加約20%，一型肌纖維的
橫截面積沒(méi)有顯著差異，二型肌纖維的橫截面積與對(duì)照組相比明顯增大。四、抑制Atrogin-l對(duì)c2cl2細(xì)胞和肌萎縮小鼠生肌分化的影響 在有效抑制Atrogin-l基因的表達(dá)量的同時(shí)，western blotting檢測(cè)了肌細(xì)胞
分化標(biāo)志物a -actin、 myosin、 myogenin的表達(dá)量變化(圖4A)。結(jié)果顯示，細(xì)胞分化標(biāo)
志物a -actin的表達(dá)量提高近10倍(圖4B) ， myosin的表達(dá)量提高了近10倍(圖4C)，
myogenin的表達(dá)量提高7倍以上(圖4D)，從而證明在降低Atrogin-1基因的表達(dá)后，能夠
迅速而且高效的誘導(dǎo)細(xì)胞生肌分化。 在小鼠饑餓肌萎縮模型中，western blotting檢測(cè)了肌細(xì)胞分化標(biāo)志物 a -actin、 myosin的表達(dá)量變化(圖4E)，檢測(cè)到Atrogin-l基因的表達(dá)量下降的同時(shí)，細(xì)
胞分化因子a-actin的表達(dá)量提高近30% (圖4F) ， myosin的表達(dá)量提高了近30% (圖
4G)。 五，c2cl2細(xì)胞和肌萎縮小鼠模型中抑制Atrogin-l的表達(dá)對(duì)Myod和GDF-8基因 表汰的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在c2cl2細(xì)胞系和小鼠模型中，siRNA能夠有效降低GDF-8基因和 提高M(jìn)yod基因的表達(dá)。在c2c 12細(xì)胞中，siRNA使GDF-8基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平降低了 20% (圖5A)，同時(shí)使Myod基因mRNA水平升高了 30% (圖5B)。在蛋白表達(dá)水平(圖5C)， siRNA使細(xì)胞的生肌負(fù)調(diào)控因子GDF-8表達(dá)量下降了 30% (圖5D)，生肌正調(diào)控因子Myod 的表達(dá)量提高了 40% (圖5E)。在小鼠饑餓肌萎縮模型中，檢測(cè)了 GDF-8和Myod基因表達(dá) 量的變化(圖5F)。注射siRNA重組腺病毒的實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組相比myod的表達(dá)量提高20% 以上(圖5G)，肌肉分化的負(fù)調(diào)控因子GDF-8表達(dá)量下降了 20% (圖5H)。
實(shí)施例二、靶向MuRF 1基因干擾序列的設(shè)計(jì)，載體構(gòu)建及細(xì)胞和動(dòng)物水平藥效學(xué)
一、抑制MuRF 1某因表汰的干擾RNA某因表汰載體的構(gòu)建 1、干擾RNA序列的設(shè)i十 (1)、靶向MuRF 1某閔3'端的干擾RNA序列的設(shè)計(jì) 應(yīng)用干擾序列設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)靶向MuRF 1基因(SEQ ID NO :8) 3'端的RNA干擾序 列，其DNA的序列如下 M-3' -1 5' TCGAAAAAAGGACAGATGAGGAGGAGGATCAACAG TCCTCCTCCTCATCTGTCCTTTTT 3， (SEQ ID NO :4) 以下敘述中M-3' -IsiRNA在實(shí)施例2中簡(jiǎn)稱(chēng)為siRNA (2)、靶向MuRF 1某因5'端干擾RNA序列的設(shè)計(jì) 方法同實(shí)施例l。 M_5， _1 :
3， (SEQ ID NO :5) (3)、靶向MuRF 1某閔中間區(qū)域的干擾RNA序列的設(shè)計(jì) 方法同實(shí)施例l。 M-M-l :
3， (SEQ ID NO :6) 2、干擾RNA載體的構(gòu)建 (1)、腺病毒載體的構(gòu)建 構(gòu)建方法同上。 3、小環(huán)DNA載體的構(gòu)建 構(gòu)建方法同上。 二、 siRNA重組腺病毒在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平對(duì)MuRF 1表達(dá)的抑制
1、 siRNA重組腺病毒在細(xì)胞水平對(duì)MuRF 1表達(dá)的抑制 檢測(cè)方法同上，熒光定量PCR結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，siRNA對(duì)c2cl2細(xì)胞中 MuRF 1基因RNA水平的抑制效率達(dá)到了 30%，與蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果一致同時(shí)分析了 轉(zhuǎn)錄因子NF k B-P65, c-Fos的表達(dá)量變化，證明無(wú)脫靶現(xiàn)象。
2、 siRNA重組腺病毒在動(dòng)物水平對(duì)MuRF 1表達(dá)的抑制 所用小鼠模型及檢測(cè)指標(biāo)同上。動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肌萎縮小鼠模型中， siRNA重組腺病毒對(duì)MuRF 1的抑制效率達(dá)到了 30%以上，為檢測(cè)有無(wú)脫耙現(xiàn)象，檢測(cè)了 c-Fos和nF k B-P65的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量并沒(méi)有明顯變化。
綜上所述，細(xì)胞水平和動(dòng)物水平檢測(cè)顯示，靶向MuRF 1基因的siRNA能夠有效的 降低MuRF 1基因的表達(dá)。 3、小環(huán)DNA干擾系統(tǒng)在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平對(duì)MuRF 1的抑制
含有耙向MuRF l基因的siRNA重組小環(huán)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染c2cl2細(xì)胞，檢測(cè)方法同上，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示，在c2cl2細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染siRNA重組小環(huán)DNA后，有效的抑制了 MuRF 1基因的 表達(dá)，其抑制效率達(dá)60%以上。
將所提質(zhì)粒按2 0. 5微克/只的劑量注射饑餓處理1天的BALB/C小鼠，每天定
時(shí)稱(chēng)量小鼠體重，l周后檢測(cè)肌肉重量。結(jié)果顯示，在肌萎縮小鼠模型中，siRNA重組小環(huán)
DNA載體對(duì)MuRF 1的抑制效率達(dá)到了 50%以上。 H、 siRNA X寸輔云M纖歸慰口朋纖歸白條卩向 1、 siRNA翻鵬動(dòng)寸輔云M纖歸慰口朋纖歸白條口向 將饑餓處理的BALB/C雌性小鼠分為A、 B、 C、 D四組，每組5只。A組按101QIU/只
的劑量注射siRNA重組腺病毒，B組按101QIU/只的劑量注射Pdc312空載體重組腺病毒，C
組注射生理鹽水，D組注射生理鹽水。A、B、C三組按5g/只的進(jìn)食量飼養(yǎng)，D組正常飼養(yǎng)，觀
察小鼠體重變化。注射后飼養(yǎng)一周，處死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。 處死小鼠后，稱(chēng)量其前大腿，和小腿，后大腿，和小腿重量。比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小
鼠腿部肌肉重量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射siRNA重組腺病毒的小鼠前肢大
腿，后肢大腿腿部肌肉重量與對(duì)照組相比增加10-15%。 伊紅(H&E)染色和三磷酸腺苷酶(ATPase)染色操作同上。試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射 siRNA重組腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纖維橫截面積比注射生理鹽水和Mock的對(duì)照組 增加約10X，從而說(shuō)明在降低MuRF l基因表達(dá)的情況下，促進(jìn)肌纖維的生肌分化的同時(shí)， 能夠增加肌纖維的大小，提高肌肉質(zhì)量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)一型肌纖維的橫截面積沒(méi)有顯著差異，二 型肌纖維的橫截面積與對(duì)照組相比明顯增大。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明含有siRNA干擾序列的重組腺病毒能夠精確的靶向MuRF 1基 因，在降低MuRF 1基因的表達(dá)的同時(shí)，抑制I型肌纖維向II型肌纖維的轉(zhuǎn)化，增加肌纖維 的大小，顯著提高肌纖維的質(zhì)量，從而提高肌肉的重量。 2、 siRNA小環(huán)DNA載體系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉重暈和肌纖維質(zhì)暈的影響 試驗(yàn)操作及檢測(cè)指標(biāo)同前，結(jié)果顯示，注射siRNA小環(huán)DNA載體的小鼠前肢大腿，
后肢大腿腿部肌肉重量增加10-15%。，注射siRNA重組腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纖維
橫截面積比注射生理鹽水和Mock的對(duì)照組增加約10%，一型肌纖維的橫截面積沒(méi)有顯著
差異，二型肌纖維的橫截面積與對(duì)照組相比明顯增大。 四、抑制MuRF 1對(duì)c2cl2細(xì)胞和肌萎縮小鼠生肌分化的影響 在有效抑制MuRF 1基因的表達(dá)量的同時(shí)，western blotting檢測(cè)到了細(xì)胞分化
標(biāo)志物a-actin的表達(dá)量提高近5倍，myosin的表達(dá)量提高了近5倍，myogenin的表達(dá)量
提高6倍以上，從而證明在降低MuRF 1基因的表達(dá)后，能夠迅速而且高效的誘導(dǎo)細(xì)胞生肌分化。 在小鼠饑餓肌萎縮模型中，檢測(cè)到MuRF 1基因的表達(dá)量下降的同時(shí)，細(xì)胞分化因 子a-actin的表達(dá)量提高近15%， myosin的表達(dá)量提高了近17%。 五，c2cl2細(xì)胞和肌萎縮小鼠模型中抑制MuRF 1的表達(dá)對(duì)Myod和GDF_8基因表 汰的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在c2cl2細(xì)胞系中，siRNA重組腺病毒在有效降低MuRF 1的表達(dá) 的同時(shí)，使細(xì)胞的生肌負(fù)調(diào)控因子GDF-8表達(dá)量下降了 15X，生肌正調(diào)控因子Myod的表達(dá) 量提高了 20%。在小鼠饑餓肌萎縮模型中，注射siRNA重組腺病毒的實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組相比 myod的表達(dá)量提高10X以上，肌肉分化的負(fù)調(diào)控因子GDF-8表達(dá)量下降了 15%。
實(shí)施例三靶向Atrogin-1和MuRF 1聯(lián)合載體的構(gòu)建，細(xì)胞水平及動(dòng)物水平藥效
14
1、雙價(jià)干擾RNA載體的構(gòu)律將上述已經(jīng)證明有效的靶向Atrogin-l基因和MuRF 1基因3'端、5'端和中間
區(qū)域的干擾片段表達(dá)盒(Hl+siRNA+U6)分別從重組載體PDC312+Hl+siRNA+U6上切下(以
A-3，-l(SEQ ID N0:1)和M-3'-l (SEQID N0 :4)為例)，將表達(dá)盒分別用Klenow片段將末端
補(bǔ)齊后，分別與合成的酶切接頭Xbal、 Sall， EcoRI、 BamHI相連接，并連接到腺病毒PDC312
載體的相應(yīng)位點(diǎn)。送測(cè)序，腺病毒載體A-3' -1+M-3' -1構(gòu)建成功。 2、干擾RNA的藥效學(xué)檢測(cè)I (1)、科允RNA麵餅白術(shù)效，翻 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在c2cl2細(xì)胞系中，A-3' -1+M-3' _1重組腺病毒對(duì)Atrogin-l的 表達(dá)抑制效率達(dá)到60 % ，對(duì)MuRF 1的表達(dá)抑制效率達(dá)到50 % 。分化標(biāo)志物myosin表達(dá)量 提高13倍。分析了轉(zhuǎn)錄因子NFk B-P65, C-F0S的表達(dá)量變化，證明無(wú)脫靶現(xiàn)象。
(2)、科允RNA云M駄，,，翻 動(dòng)物水平的western blotting分析，方法同上，動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肌 萎縮小鼠模型中，A-3' -1+M-3' -1重組腺病毒對(duì)MuRF 1的抑制效率達(dá)到了 50%左右，對(duì) Atrogin-l的抑制效率達(dá)到了 60%以上。與對(duì)照組相比，注射A_3' -1+M-3' -1重組腺病 毒的小鼠大腿腿部肌肉重量增加25%。組織病理分析結(jié)果顯示，注射A-3' -1+M-3' -1重 組腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纖維橫截面積比注射生理鹽水和Pdc312的對(duì)照組增加約 35%，二型肌纖維的橫截面積與對(duì)照組相比明顯增大。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明含有A-3' -1+M-3' -1雙價(jià)干擾序列的重組腺病毒能夠精確的 耙向Atrogin-l基因和MuRF 1基因，在降低Atrogin-l和MuRFl基因的表達(dá)的同時(shí)，能顯 著提高分化因子的表達(dá)，并降低分化抑制因子的表達(dá)，迅速而且高效的誘導(dǎo)細(xì)胞分化，抑制 I型肌纖維向II型肌纖維的轉(zhuǎn)化，顯著提高肌肉質(zhì)量，與單獨(dú)抑制Atrogin-l基因或MuRF 1基因相比，能夠起到更好的治療肌肉萎縮的效果。
0168]IB089096序列表.ST25
0169]序列表
0170]〈110〉中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
0171]〈120〉干擾肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因的干擾RNA，包含其的載體及其應(yīng)用
0172]〈130>IB089096
0173]〈160>9
0174]〈170>PatentIn version 3.1
0175]〈210>1
0176]〈211>61
0177]〈212>DNA
0178]〈213〉人工序列
0179]〈400>1
0180]gatc朋3朋c g朋ggagcgc catggatett c朋gagatet ccatggcgct ccttcgtttt 60
0181]t 61
0182]〈210>2[0183cccc皿cgcctgcgcccctgtgagtg咖ggatccccgcgcccacccaggatccgcagcc120ctccacactegttgacccactcttgtcccggtcgccgcctgcgtcgttccccagcatctt180cccaacgcgccgcateccctgggc皿gccaggccggttcctggctgtcaatccgtcccgt240ccgtcggtcgcgtccgcgctctgteccatgccgttccttgggc郷actggcggtccccg300ggccagagctgggtga卿cggcggacggctgg皿gcgcttcttggatgag皿皿gcggc360agcttcgtgagcgacctcagcagttectgc皿C皿gg3ggtetecagteagg卿atctg420ttcagcagcctg皿ctecgacgtcgcagcctC3g皿C3gC■ctcagtecttccatc皿g皿皿gtggatctatgttcacaaagg皿gtecg540皿ggagcgccatggatectgtectttgggggaagctttcacttctcgact600gccatcctggattccag^gattcaactecgtegte郷ctgttggagctgategc皿3g660tcacagctcacatccctgagtggcatcgcc c^^g^ct tcatg^cat tttgg^3皿720gtggtectgaaagttcttga3g3ccagc^ ■cateagac ttetecggga acttctccag780actctctecacatccttatgC3cactggtg C3gagagtcg gc33gtctgt gctggtgggc840tgtgggtgtatcggatggag 3ccattctec 3ctggcagc3 gcagctg^t■tcagcaggcctgccttcaaa ggcctcacga tcaccgacct gcctgtgtgc960ttecaactgaacatcatgcag郷ctgagtgacgggcgggacctggtcagcctgggccag1020gcagccccagacctgcatgtgctragtgaggaccggctectgtgga卿gactctgccag1080teccacttctC3g3g3ggC3gattcgc皿gcgtttgatcttgtctgacaa郷gragctg1140gattgga卿agatgtetttteagcttgtecgatgtteccgragtetggg1200gtcaccctgcagctttgcaaacactgccacattctctcctgg皿gggractgaccatccg1260tgcacggcca3C皿CCC3g3gagctgctccgtctcactttcccctcaagactttetcaat1320ttgttcaagttctgaateatCCC3gC3C3Cgacaacacttcag皿ggcttcteattggat1380ggctgggagtcgggacacttcatttgteaategtgtecatttteagcattggcttga皿c1440tgcgggggatacgtcattgagg卿cgttggcgggga卿gatgragttgCCg3tgg皿31500tttecaaatgtgaattccacatgag皿ctggtecag皿皿gc3ga皿tectgte皿tega1560ctttttettttcccteacgatttgcaagca3gactete皿ggc皿g皿ctctetgtcagc1620C3tgg皿3Cggagtcctcttgagttcccteggc皿皿3gc1680gatgg^cactctgtttecagttgtteagag皿g皿gg皿1740gatg皿cgctgtcattgagaaacccttgggctttgggtttggattcggggtttgttttca1800gcaggcc皿gaagtetetccacctgaaatctgcacgggctteagtccttetcctetgaag1860atgccacacaatggtctecctcte皿3gcategcgtgttctctggcaacatectttetct1920ggg郷咖tgtctgtgtttcatgteagttctetectctgtg皿gtgatcte卿tggga1980郷ctgttegaaaagccctctcttggttctgacttcctgtccccccagtc2040cctctcagtccctgcacctcttctcctttcatgttgtcactcctgteggg雄cggg郷2100ccagcte皿ggtcatg皿g3g卿atteggcacctgtgcatgctcagaac2160tttccattteactcttccttcttctegcctgacttcteggcttgtccgggcttccttgag2220tgtcttcatggateagtggatgtctgggaccttegg卿gcccaagaactg郷cttgag2280tctcacactegccagtte皿cattctgccagctgctgtttcccctcggca2340ggcc皿tgagctgaggcactgtctgttctgteggcccagcatccaactcaagtcaccctg2400朋ccgggactttttcacaag catgatttca aagaaagcctgategatgtg ttcgtcttea2460acttgtttcaggactgagtt 3g3gc皿3g3 te皿gagtcccgggggttct tgtg卿rag25203g3C3tg朋Cactgtgg皿g 3皿ggag皿g gagatctcagggctteagga gtteattcct2580ggggtgggggaaatgttttt atettttect ttttecagattgttgctttt ctecaatgte2640catetetttgcaattgtett tgctgttttt ttttteaatctcra皿te皿attgccacte2700tgcatgctcttggC皿3C皿gc2722〈210>8〈211>1053〈212>DNA〈213〉鼠〈400>8aatctggcctgattcctgatgga^cgctegg卿3gC3g60ctgatctgccccatctgcctgg卿tgtttaccaagcctgtggtcatcctgccctgccaa120cacaacctctgccgg皿gtgtgccaacgacatcttccaggctgcgaatccctactggacc180■ccgcggtggctcagtgtccatgtctggaggtcgtttccgttgcccctcgtgccgccat240g^gtgatcatggaccggcacggggtgtacggcctgcagaggaacctgctggtgg^^c300atcattgacatctacaagcaggagtgctccagtcggcccctgC3g^3ggcagccacccg360atgtg固ggaacatctactgtctcacgtgtgaggtgcct420acttgctccttgtg固ggtgtttggggctcaccaggcctgtgaggttgcccctttgcaa480agcatcttccgactgagctgtctccatgctggtggcgggg540■cgaccgagtgcagacgatcatctctcagctggtggactcgtgc卿gtg3CC33gg3g600aatagccacc郷tg皿ggaggagctgagtacaccctctacgccatcctg660gatgag^ga3g3gCg3gCtgctgcagcgg3tC3CgC3ggg卿ctgggc720ttcatcgaggctctgatcctccagtecagggagcagctgg^^gtccaccaagcttgtg780gagaccgccatccagtccctggatgagcccccttcctctc■gtgCC33g840cagctcatcaagaagcctcc^gggctgcc3gCtgggg^g3C3g3gC皿■ggctttg卿ctttactctggactteg^cggccttgagg960gccattgactttgggac卿tg郷郷ag g郷agttte c卿卿gga ggctgatgag1020ga卿gggcgtgacc3C3g3 gggac3cc皿tea1053 〈210>9 〈211>60 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>9 gatcaaaaag cctccaagct gtgccttgtt caagagacaa ggcacagctt ggaggttttt 60
權(quán)利要求
一種用于預(yù)防和治療肌肉萎縮的載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA。
2. 權(quán)利要求l的干擾RNA，其靶向肌特異E3泛素蛋白連接酶基因。
3. 權(quán)利要求1的干擾RNA，所述肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因?yàn)锳trogin-l基因 (SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO :8)基因。
4. 權(quán)利要求1的干擾RNA，其靶向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中間區(qū)域序列和/ 或所述MuRF 1基因的3'端、5'端或中間區(qū)域序列。
5. 權(quán)利要求l的干擾RNA，其中所述載體是病毒載體或質(zhì)粒載體。
6. —種干擾RNA，其編碼DNA序列與權(quán)利要求1_5任一項(xiàng)的干擾RNA的編碼DNA序列 相同。
7. —種載體，其包含編碼權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的干擾RNA的DNA序列。
8. 權(quán)利要求7的載體，其包含分別干擾Atrogin-l和MuRF 1基因的干擾RNA的DNA編碼序列。
9. 權(quán)利要求7或8的載體，其中所述載體是腺病毒載體或小環(huán)DNA質(zhì)粒載體。
10. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的干擾RNA和/或權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的載體在制備預(yù)防 和治療肌肉萎縮的藥物中的應(yīng)用。
11. 一種預(yù)防和治療肌肉萎縮的藥物，其包含上述權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的干擾RNA和 /或權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的載體作為活性成分。
12. —種干擾肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因的方法，所述方法包括下列步驟a) 將干擾肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因的干擾RNA編碼的DNA與載體連接；b) 用所述載體轉(zhuǎn)染包含肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了干擾肌肉特異E3泛素蛋白連接酶基因表達(dá)的方法，具體地Atrogin-1基因和MuRF1基因的干擾RNA及其DNA序列，包含其的載體和由所述載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA，以及將所述干擾RNA序列，包含其的載體和由所述載體轉(zhuǎn)錄的干擾RNA用于制備預(yù)防和治療肌肉萎縮疾病的藥物中的應(yīng)用。在細(xì)胞水平和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上，本發(fā)明的干擾RNA序列將Atrogin-1基因和MuRF1基因的表達(dá)分別比對(duì)照降低60％和30％左右，肌肉細(xì)胞分化水平分別比對(duì)照升高70％和30％左右。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上表現(xiàn)出明顯的肌肉萎縮治療效果，有效提高疾病發(fā)生時(shí)的肌肉質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101748120SQ20081018311
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者叢浩龍, 劉長(zhǎng)梅, 田波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所