專利名稱：：一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及纖維素酶活力測(cè)定方法，具體說(shuō)是一種羧甲基纖維素酶活力(CMCNa-DNS)的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：纖維素酶(Cellulase)是一種多組分的復(fù)合酶，不同來(lái)源的纖維素酶其組成及各組分比例有較大差異。一般來(lái)講，纖維素酶包括外切e-1,4-葡聚糖酶(￡乂(^-1，4-glucanase,EC3.2.1.91)、內(nèi)切3-1，4國(guó)葡聚糖酶(￡11(1(^-1,4-glucanase,EC3.2丄4)和纖維二糖酶(Cellobiase,EC3.2丄21)。不同來(lái)源的纖維素酶制劑產(chǎn)品中三種酶組分含量的比例不同，因此其最終的表觀酶活力會(huì)有差異。同時(shí)纖維素酶作用的底物也比較復(fù)雜，致使纖維素酶活力的測(cè)定方法很多，且方法復(fù)雜而不統(tǒng)一。常用的方法有羧甲基纖維素糖化力法、羧甲基纖維素液化力法、濾紙?zhí)腔Ψ?、濾紙崩潰法和棉花糖化力法等。上述測(cè)定方法中，羧甲基纖維素糖化力主要代表外切P-1,4葡聚糖苷酶和內(nèi)切酶的活力總和，在研究和實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用比較普遍.。國(guó)內(nèi)外采用羧甲基纖維素糖化法測(cè)定纖維素酶活力的方法很多。目前，國(guó)際上有較公認(rèn)的IPUAC推薦的纖維素酶測(cè)定方法(T.K.GHOSE，1987)，由表1看出，該方法分別對(duì)來(lái)自三個(gè)廠家(PrimfastCL購(gòu)自杰能科公司，CellusoftL購(gòu)自諾維信公司，A5為本公司自主研發(fā)產(chǎn)品)纖維素酶進(jìn)行多次檢測(cè)，其變異系數(shù)達(dá)2%以上。造成較大誤差的原因可能是加入的羧甲基纖維素鈉濃度高和粘度大，容易在操作過(guò)程中帶來(lái)較大誤差，且該方法反應(yīng)時(shí)間為30分鐘，利用比色管顯色后需稀釋用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度值，整個(gè)操作繁瑣且耗時(shí)；另外，該方法DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑配制不經(jīng)定容，從而造成批次間較大差異。表lIPUAC推薦方法對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約90分鐘；②以還原糖物質(zhì)的量接近0.5mg確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。國(guó)內(nèi)有纖維素酶的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2583-2003，由表2看出，該方法分別對(duì)來(lái)自三個(gè)廠家纖維素酶進(jìn)行多次檢測(cè)，其變異系數(shù)達(dá)2%，甚至于4%以上。國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法建立在IPUAC方法基礎(chǔ)之上，主要在底物、酶液稀釋倍數(shù)的確立及葡萄糖標(biāo)線制作方面做了較大改動(dòng)，該方法檢測(cè)樣品所需時(shí)間與IPUAC推薦方法相似，且由于國(guó)產(chǎn)底物差異性，帶來(lái)更大的誤差。表2國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2583-2003對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗ff約90分鐘；②還原糖吸光度值須在0.30至0.35之間確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，以提高測(cè)定的精確性、重現(xiàn)性，且使測(cè)試方法簡(jiǎn)便、快速且能同時(shí)對(duì)更多樣品檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)上述之目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，由如下步驟組成-(1)待測(cè)纖維素酶液制備①待測(cè)酸性纖維素酶液制備將液體酶(或固體酶)用0.05mol/LpH4.8的醋酸鈉緩沖液稀釋；②待測(cè)中性纖維素酶液制備將液體酶(或固體酶)用0.05mol/LpH6.0的磷酸鈉緩沖液稀釋；(2)往反應(yīng)管中加入稀釋的待測(cè)酶液100300uL，再加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于5(TC反應(yīng)1030min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋的待測(cè)酶液100300uL，再加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于50。C反應(yīng)1030min;(3)將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；(4)所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；(5)取反應(yīng)后溶液200uL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。上述反應(yīng)容器為2mL—次性塑料離心管。上述待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù)是指使每毫升酶液反應(yīng)后生成的還原糖的物質(zhì)的量為2.5umo1。上述1%羧甲基纖維素鈉溶液的粘度為4%。上述DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑的配制方法是將盛有約500mL蒸餾水的1L燒杯置于5(TC水浴中預(yù)熱，加入10.0g3，5-二硝基水楊酸，攪拌使其全部溶解，再緩慢加入150mL0.67M(質(zhì)量百分濃度w/v)氫氧化鈉(NaOH)溶液，攪拌直到溶液澄清透明為止，最后加入300.0g四水合酒石酸鉀鈉，待全部溶解并冷卻后定容至1000mL，過(guò)濾，于棕色試劑瓶中保存，暗處放置7天后使用。酶活定義lmL液體或lg固體酶制劑在5(TC，pH4.8(或pH6.0)條件下，每分鐘催化生成lPmol葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位，以U/mL或U/g。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確，誤差小，重現(xiàn)性好，測(cè)試速度快，適于同時(shí)測(cè)定大量樣品。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例(分別對(duì)來(lái)自不同廠家纖維素酶進(jìn)行活力測(cè)定，其中PrimfastCL購(gòu)自杰能科公司，CellusoftL購(gòu)自諾維信公司，A5為本公司自主研發(fā)產(chǎn)品)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。首先制備待測(cè)纖維素酶液①制備待測(cè)酸性纖維素酶液將液體酶(或固體酶)用0.05mol/LpH4.8的醋酸鈉緩沖液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使每毫升酶液反應(yīng)后生成的還原糖的物質(zhì)的量為2.5umol;②制備待測(cè)中性纖維素酶液將液體酶(或固體酶)用0.05mol/LpH6.0的磷酸鈉緩沖液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使每毫升酶液反應(yīng)后生成的還原糖的物質(zhì)的量為2.5umol。并配制DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑:將盛有500mL左右蒸餾水的1L燒杯置于50。C水浴中預(yù)熱，加入10.0g3，5-二硝基水楊酸，攪拌使其全部溶解，再緩慢加入150mL0.67W氫氧化鈉溶液，攪拌直到溶液澄清透明為止，最后加入300.0g四水合酒石酸鉀鈉，待全部溶解并冷卻后定容至1000mL，過(guò)濾，于棕色試劑瓶中保存，暗處放置7天后使用。實(shí)例l:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液200uL，再加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于5(TC反應(yīng)10min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液200tiL，再加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于5(TC反應(yīng)10min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘4%)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200liL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表3。表3本發(fā)明方法(實(shí)例l)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約55分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.4500.550umol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例2:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液100UL，再加入與酶液等量體積的P/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于50。C反應(yīng)10min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液100"L，再加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試齊lj，混勻，置于50。C反應(yīng)10min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的"/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200UL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表4。表4本發(fā)明方法(實(shí)例2)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約55分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.2250.275ymol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例3:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液300UL，再加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于5(TC反應(yīng)10min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液300uL，再加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于50。C反應(yīng)10min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的in/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200uL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表5。表5本發(fā)明方法(實(shí)例3)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約55分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.6750.825umol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例4:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液200UL，再加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma,低粘)溶液底物，混勻，置于5(TC反應(yīng)30min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液200uL，再加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于5(TC反應(yīng)30min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的lQ/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200ixL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表6。表6本發(fā)明方法(實(shí)例4)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約75分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.4500.550iimol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例5:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液100UL，再加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于50'C反應(yīng)30min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液IOOuL，再加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于5(TC反應(yīng)30min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200UL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表7。表7本發(fā)明方法(實(shí)例5)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3407241244175備注①檢測(cè)總耗時(shí)約75分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.2250.275umol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例6:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液300UL，再加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于50'C反應(yīng)30min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液300uL，再加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于5(TC反應(yīng)30min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的lo/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200uL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表8。表8本發(fā)明方法(實(shí)例6)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約75分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.6750.825umol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例7:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液200PL，再加入與酶液等量體積的l。/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于5(TC反應(yīng)20min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液200uL，再加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于50"C反應(yīng)20min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出,迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200uL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表9。表9本發(fā)明方法(實(shí)例7)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約65分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.4500.550Pmol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例8:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液100uL，再加入與酶液等量體積的P/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于5(TC反應(yīng)20min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液100uL，再加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于5(TC反應(yīng)20min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的lQ/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200UL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540mn波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表IO。表IO本發(fā)明方法(實(shí)例8)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果\<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約65分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.2250.275Umol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。實(shí)例9:往2mL—次性塑料離心管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液300UL，再加入與酶液等量體積的1%羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻，置于50。C反應(yīng)20min;同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入稀釋到適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液300ixL，再加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于5(TC反應(yīng)20min;將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的P/。羧甲基纖維素鈉(Sigma，低粘)溶液底物，混勻；所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；取反應(yīng)后溶液200UL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖(以葡萄糖計(jì))含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表ll。表ll本發(fā)明方法(實(shí)例9)對(duì)不同廠家纖維素酶活力檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>備注①檢測(cè)總耗時(shí)約65分鐘；②以反應(yīng)后生成還原糖的物質(zhì)的量為0.6750.825umol確定待測(cè)酶液最適稀釋倍數(shù)。結(jié)論本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，同一樣品多次測(cè)試變異系數(shù)小，測(cè)試結(jié)果重現(xiàn)性好，測(cè)試速度快，且適于同時(shí)測(cè)定大量樣品。權(quán)利要求1、一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，其特征在于由如下步驟組成(1)待測(cè)纖維素酶液制備將液體酶或固體酶用0.05mol/L緩沖液稀釋；(2)往反應(yīng)管中加入待測(cè)酶液100～300μL，再加入與酶液等量體積的1％羧甲基纖維素鈉低粘溶液底物，混勻，置于50℃反應(yīng)10～30min；同時(shí)做酶的空白對(duì)照，往反應(yīng)管中加入待測(cè)酶液100～300μL，再加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于50℃反應(yīng)10～30min；(3)將所有反應(yīng)管取出，樣品管立即加入3倍酶液體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，對(duì)照管加入與酶液等量體積的1％羧甲基纖維素鈉低粘溶液底物，混勻；(4)所有反應(yīng)管放入沸水浴中加熱5分鐘，取出，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)；(5)取反應(yīng)后溶液200μL至96孔細(xì)胞板中于酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。2、如權(quán)利要求l所述一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，其特征在于上述反應(yīng)管為2mL—次性塑料離心管。3、如權(quán)利要求l所述一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，其特征在于上述待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù)是指使每毫升酶液反應(yīng)后生成的還原糖的物質(zhì)的量為2.5ymol。4、如權(quán)利要求l所述一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，其特征在于上述1%羧甲基纖維素鈉溶液的粘度為4%。5、如權(quán)利要求l所述一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，其特征在于上述DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑的配制方法是將盛有約500mL蒸餾水的lL燒杯置于5(TC水浴中預(yù)熱，加入10.0g3，5-二硝基水楊酸，攪拌使其全部溶解，再緩慢加入150mL0.67M氫氧化鈉溶液，攪拌直到溶液澄清透明為止，最后加入300.0g四水合酒石酸鉀鈉，待全部溶解并冷卻后定容至1000mL，過(guò)濾，于棕色試劑瓶中保存，暗處放置7天后使用。6、如權(quán)利要求1所述一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，其特征在于上述待測(cè)纖維素酶液制備是制備成待測(cè)酸性纖維素酶液，將液體酶或固體酶用0.05mol/LpH4.8的醋酸鈉緩沖液稀釋。7、如權(quán)利要求1所述一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，其特征在于上述待測(cè)纖維素酶液制備是制備成待測(cè)中性纖維素酶液，將液體酶或固體酶用0.05mol/LpH6.0的磷酸鈉緩沖液稀釋。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)一種羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定方法，先制備酸性或中性纖維素酶待測(cè)酶液將液體酶用酸性或中性的緩沖液稀釋；再往反應(yīng)管中加入待測(cè)酶液，加入與等量體積羧甲基纖維素鈉溶液底物，做酶的空白對(duì)照則加入3倍體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，混勻，置于50℃反應(yīng)；接著將所有反應(yīng)管取出，樣品管加入3倍體積DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑，對(duì)照管加入與等量體積羧甲基纖維素鈉溶液底物；然后將所有反應(yīng)管水浴加熱5分鐘，取出，冷卻至室溫終止反應(yīng)；最后取反應(yīng)后溶液于540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，同一樣品多次測(cè)試變異系數(shù)小，測(cè)試結(jié)果重現(xiàn)性好，測(cè)試速度快，且適于同時(shí)測(cè)定大量樣品。文檔編號(hào)C12Q1/34GK101358230SQ20081019833公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年9月5日優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日發(fā)明者張盛圳,朱桂芳,李芬芳,袁文杰,黃碧蓮申請(qǐng)人:東莞寶麗美化工有限公司