專利名稱：與法尼基一定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶有關(guān)的新核酸和多肽的制作方法
背景技術(shù)：
法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶與各種蛋白質(zhì)，例如與信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)、真菌交配因子和Ras多肽的加工有關(guān)。這些甲基轉(zhuǎn)移酶的活性是完成對異戊二烯化蛋白的甲酯化作用。參見例如Ashby等，酵母(Yeast)9:907-913,1993；Khosravi-Far等，細胞生長和分化(Cell Growth and Differentiation)3:461-469,1992。
本發(fā)明的一個方面是涉及編碼羧甲基轉(zhuǎn)移酶，特別是哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶，例如人STE14和鼠MTase的核酸、多肽及其片段。本發(fā)明還涉及將所述核酸和多肽用于治療、診斷和研究的方法。例如，可將所述核酸和多肽用于鑒定MTase活性調(diào)節(jié)劑并得到與MTase結(jié)合的配體的方法。
圖2是不同種間甲基轉(zhuǎn)移酶序列的比較。
圖3是小鼠的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸和氨基酸編碼序列。
發(fā)明詳述已鑒定了編碼哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的新的核酸和多肽序列。這些酶涉及許多生物學(xué)過程，包括與下列信號傳導(dǎo)分子成熟有關(guān)的途徑，例如ras,rho,rab,rac,GTP-結(jié)合蛋白的γ亞單位、有關(guān)的G蛋白、核層粘連蛋白和真菌交配信息素。法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶至少有下列一種活性與甲基供體底物例如S-腺苷-L-甲硫氨酸(“AdoMet”)結(jié)合或粘附的能力；催化甲基向甲基受體轉(zhuǎn)移的能力(“甲基轉(zhuǎn)移酶活性”)，其中甲基受體優(yōu)選是異戊二烯化的半胱氨酸，例如S-法尼基-半胱氨酸；新暴露的α羧基的甲酯化，其中所述α羧基異戊二烯化的半胱氨酸，例如S-法尼基-半胱氨酸；與異戊二烯化半胱氨酸結(jié)合或粘附的能力；促進蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用；轉(zhuǎn)化-調(diào)節(jié)活性；或者免疫原活性，例如所述多肽或多核苷酸能夠引發(fā)本發(fā)明MTase特異性的免疫反應(yīng)。
按照下文實施例中描述的現(xiàn)有的檢測可以測量上述MTase活性。參見例如Imai等，分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997；Hrycyna等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)250:251-266,1995。
由于底物作為配體必須首先粘附于酶表面以便使酶能夠完成其催化作用，因此，通常認為在酶催化中，底物結(jié)合是第一步?？蓪⑺雒副砻娣Q為酶活性位點。底物與酶表面的結(jié)合可涉及與酶的多種相互作用，例如與一個或多個氨基酸和/或含酶的功能基的化學(xué)結(jié)合。本文所述的甲基供體底物結(jié)合活性指甲基供體底物與本發(fā)明的MTase相結(jié)合。與酶的粘附可通過一種或多種保持其天然底物的相互作用來完成；但是，當(dāng)多肽以低于相互作用天然的數(shù)量和質(zhì)量帶有底物時，所述多肽可具有甲基供體底物結(jié)合活性。
甲基供體結(jié)合和催化活性可以彼此分開。因此，根據(jù)本發(fā)明MTase多肽可具有底物結(jié)合活性，而不具有催化活性。甲基供體底物結(jié)合活性可以是任選有效的，以便完成底物的催化，競爭性或非競爭性地與活性位點結(jié)合，與酶不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致催化活性丟失(例如在是自殺底物的情況下)等。
可用常規(guī)方法測量甲基供體底物結(jié)合活性(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸的結(jié)合)。例如，通過在有效的條件下混合含可檢測標記的底物、STE14多肽或其片段以及待檢測底物結(jié)合活性的化合物，可以用競爭性結(jié)合試驗鑒定與多肽或其衍生物。所述試驗可以在液相中完成，其中通過膜分離結(jié)合的和游離的底物，或者按照需要在固相中完成?？捎酶咝?high-throughput)方法例如在芯片、圓片等完成固相檢測。
本發(fā)明多肽還能具有催化活性，例如將甲基轉(zhuǎn)移給甲基受體底物。一般來說，所述催化作用會使氨基酸，特別是異戊二烯化的半胱氨酸的新暴露的α羧基甲酯化。因此，本發(fā)明的催化活性是羧甲基化活性，特別是異戊二烯化多肽的羧甲基化活性。該活性描述于例如Hrycyna等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)250:251-266,1995；Imai等，分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997?？稍隗w外或體內(nèi)測量該活性。
多肽或其核苷酸編碼序列還具有“轉(zhuǎn)化-調(diào)節(jié)活性”。這可以是調(diào)節(jié)細胞的轉(zhuǎn)化表型的活性，例如誘導(dǎo)細胞分裂，誘導(dǎo)無貼壁依賴性生長，提高ras活性等。該作用可以是部分的或不完全的。例如STE14編碼序列在細胞內(nèi)的表達可以引起轉(zhuǎn)化的表型，或者可提高已轉(zhuǎn)化細胞的表型。通過在有助于轉(zhuǎn)化的其他基因，例如ras,p53,Rb，細胞循環(huán)調(diào)節(jié)基因等中存在缺陷可以提高轉(zhuǎn)化-促進活性。
哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶(例如人STE14)是哺乳動物多肽或其片段，含有可從天然來源得到的氨基酸序列。因此，它包括天然的、正常的、突變的、多態(tài)的等氨基酸序列。天然來源包括例如肝細胞，例如從組織或完整生物體、培養(yǎng)的細胞系，包括初級和無限增殖的細胞系、活檢組織等得到的。本發(fā)明還涉及全長哺乳動物MTase，例如STE14或者鼠MTase的片段。所述片段優(yōu)選是生物活性的。生物活性指多肽片段在活系統(tǒng)或者含活系統(tǒng)的組分中有活性。生物活性包括提及的那些，例如甲基轉(zhuǎn)移酶活性，甲基供體底物結(jié)合活性，轉(zhuǎn)化-調(diào)節(jié)活性，和/或免疫原活性?？梢杂萌魏嗡璧姆椒òɑ瘜W(xué)合成、遺傳工程、裂解產(chǎn)物等制備片段。參見下文。
本發(fā)明還涉及含有氨基酸1-284之氨基酸序列的人法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶。參見

圖1。所述284氨基酸多肽有預(yù)期的分子量31.9 kDa。
除人STE14序列外，已克隆和鑒定了來自另一哺乳動物小鼠的MTase。該序列是圖2和3中鑒定的。含例如小鼠MTase全長編碼序列的全長核酸、其啟動子和/或增強子區(qū)等可例如利用上述片段作為cDNA和基因組文庫的探針，通過PCR等常規(guī)方法鑒定并得到。
用各種方法可得到來自哺乳動物和非哺乳動物的其他同系物。例如，按照Sambrook等分子克隆(Molecular Cloning)1989，第Ⅱ章所述，可利用與對哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶有選擇性的寡核苷酸(見下文)進行雜交來篩選所述同系物。所述同系物與法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶可以有不同的核苷酸和氨基酸序列同一性和相似性。非哺乳動物生物包括例如脊椎動物、無脊椎動物、斑馬、魚、雞、果蠅、C.elegans、線蟲、原生動物、植物、擬南芥屬、病毒等。
本發(fā)明還涉及法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶特異的氨基酸序列，例如在圖1和3的特定人或小鼠序列中發(fā)現(xiàn)的定義的氨基酸序列而不是在另一氨基酸序列，優(yōu)選不是在非洲爪蟾屬Xmam4，S.pombemam4、釀酒酵母STE14或小鼠MTase中的氨基酸序列。參見Imai等分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997；Sapperstein等分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)14:1438-1449,1994。
用BLAST計算機程序通過檢索基因/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫可以常規(guī)發(fā)現(xiàn)特定的氨基酸序列。從MTase的約前65個氨基酸，例如CAARAPP等可以篩選哺乳動物的特異性序列。人特異性氨基酸序列是例如ICGVSYALTV。可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶特異性氨基酸序列用于產(chǎn)生作為抗原的肽以便得到所述抗原特異性的免疫反應(yīng)。可將通過所述免疫得到的抗體用作哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的特異性探針用于診斷或研究目的。
通過現(xiàn)有方法可分析本發(fā)明多肽，例如具有圖1或圖3中所列的多肽序列以鑒定所述多肽中的結(jié)構(gòu)和/或功能結(jié)構(gòu)域。例如，當(dāng)通過親水性分析(例如Kyte和Doolittle，分子生物學(xué)雜志(J. Mol.Bio.)157:105,1982)分析圖1所列的多肽編碼序列時，鑒定出推測的跨膜區(qū)在L16-T34；L44-Y59；I68-F85；I156-L173以及V225-W241。推測的催化區(qū)域是V110-L284?？捎酶鞣N其他程序包括EMBL蛋白質(zhì)預(yù)測(Rost和Sander，蛋白質(zhì)(Proteins)19:55-72,1994)分析其結(jié)構(gòu)并常規(guī)預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域。
上述本發(fā)明多肽可包括哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的完整編碼序列或其片段。例如，哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的N-末端區(qū)例如通過提高其活性或穩(wěn)定該區(qū)域可調(diào)節(jié)其酶活性。因此，有用的片段包括圖1和圖2中鼠或人序列的約氨基酸1-65。通過與所需多肽在閱讀框架中連接，可以用這些片段調(diào)節(jié)、穩(wěn)定或者提高其他MTase或其他多肽的活性?？梢允褂靡粋€或多個片段，例如人或鼠STE14可含有兩個或多個具有調(diào)節(jié)活性的N末端區(qū)?？蓪Ψ峄ㄏ虻陌腚装彼狒燃谆D(zhuǎn)移酶多肽的片段進行篩選以具有特異性的生物活性，例如甲基供體結(jié)合活性，甲酯化活性、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)化-調(diào)節(jié)活性、免疫原性等。通過檢測所述片段的所需活性，可用常規(guī)方法鑒定有用的片段。在下文和實施例中描述了這些活性的測量方法。按EP496162中所述鑒定和制備這些肽。
本發(fā)明多肽還可與圖1或圖3所列氨基酸序列有100％或者較低的氨基酸序列同一性。為了進行下文的討論序列同一性指在比較序列如圖2的對應(yīng)位置上，發(fā)現(xiàn)了與圖1或圖3所列序列中相同的核苷酸或氨基酸。與圖1或圖3所列氨基酸序列有低于100％的序列同一性的多肽可在天然序列上含有各種取代，包括同源氨基酸取代。參見下文同源氨基酸取代的實例。被比較的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽中，相同和同源殘基的總數(shù)除以序列中的殘基總數(shù)就等于序列相似性百分比。為了計算序列同一性和相似性，可按照任何所需的方法、算法、計算機程序等，包括例如FASTA、BLASTA排列并計算被比較的序列。與圖1的氨基酸序列有低于100％氨基酸序列同一性的多肽可含有例如約99％、95％，優(yōu)選遠大于約71％，例如75％或更大的同源性，只要所述序列不是非洲爪蟾屬Xmam4,S.pombe mam4、釀酒酵母(S.cerevisiae)STE14或小鼠MTase。參見，見Imai等分子細胞生物學(xué)(Mol. Cell. Bio.)17:1543-1551,1997；Sapperstein等分子細胞生物學(xué)(Mol. Cell. Bio.)14:1438-1449,1994。也可排除圖3的片段。
哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽、片段或取代的多肽還可含有各種修飾，所述修飾包括類脂修飾、甲基化、磷酸化、糖基化、共價修飾(例如氨基酸R基團的)、氨基酸取代、氨基酸缺失或者氨基酸增加?？捎酶鞣N方法，包括重組、合成、化學(xué)等方法完成對所述多肽的修飾。
可將本發(fā)明多肽(例如人STE14或小鼠MTase，其片段，其突變體)用于許多方面，例如用于檢測，按下文所述作為抗體的免疫原，作為生物活性劑(例如具有一種或多種與STE14有關(guān)的活性)。
可將編碼法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的多肽、其衍生物或者其片段與一個或多個結(jié)構(gòu)域、功能結(jié)構(gòu)域、可檢測結(jié)構(gòu)域、抗原結(jié)構(gòu)域和/或理想的所需多肽結(jié)合，所述結(jié)合以自然中沒有的即非天然的排列方式進行，天然排列方式指例如人或鼠STE14基因、從活生物例如動物，優(yōu)選哺乳動物例如人、小鼠或其細胞系的基因組制備的基因組片段。包括所述特征的多肽是嵌合的或融合多肽?？砂凑崭鞣N方法，包括化學(xué)的、合成的、半合成的和/或重組方法制備所述嵌合多肽。編碼所述嵌合多肽的嵌合核酸可在連續(xù)的或者含例如內(nèi)含子、剪接位點、增強子等的間斷的開放閱讀框架中含有各種結(jié)構(gòu)域或所需的多肽(例如用于穩(wěn)定或提高活性的多個N末端結(jié)構(gòu)域)。可以用各種方法生產(chǎn)嵌合核酸。參見例如美國專利5439819。結(jié)構(gòu)域或理想的多肽具有任何理想的特性，包括生物學(xué)功能例如催化、信號、生長促進、細胞靶向(例如信號序列、靶向序列，例如內(nèi)體、溶酶體、ER、核)等，結(jié)構(gòu)功能例如疏水、親水、跨膜等，受體-配體功能和/或可檢測功能，例如與酶、熒光多肽、綠熒光蛋白(Chalfie 等，1994，科學(xué)(Science)263: 802；Cheng等，1996，天然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)14:606； Levy等，1996，天然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)14:610；)等。此外，當(dāng)導(dǎo)入宿主細胞中時，可將多肽或其部分用作可檢測標記。例如可將編碼本發(fā)明氨基酸序列的核酸在框架中與理想的編碼序列融合，然后作為純化、篩選或標記的標記物。融合區(qū)可編碼可裂解位點以促進表達、分離、純化等。
按照本發(fā)明，可以用表達系統(tǒng)，例如體內(nèi)、體外、無細胞、重組、細胞融合等生產(chǎn)本發(fā)明多肽。由所述系統(tǒng)給予所述多肽的修飾包括糖基化，氨基酸取代(例如使用不同的密碼子)，多肽加工例如消化、裂解、內(nèi)肽酶或外肽酶活性、化學(xué)部分包括類脂和磷酸的連接等。按照常規(guī)方法，包括洗滌劑提取(例如CHAPS、辛基糖苷)、硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水交換色譜、羥基磷灰石色譜和植物凝血素色譜可以從天然來源、轉(zhuǎn)化的宿主細胞(培養(yǎng)基或細胞)中回收本發(fā)明多肽。按照需要，在完成天然蛋白的構(gòu)型中可適用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可將高效液相色譜(HPLC)用于最后的純化步驟。
哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶核酸或其片段是含有可從天然來源得到的核苷酸序列的核酸或者是含有編碼哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶之編碼序列的核酸。見上文。因此，它包括天然的、正常的、突變的、多態(tài)性的、簡并序列等，等位基因。天然來源包括例如從組織或整個生物體、包括初級和無限增殖細胞系的培養(yǎng)的細胞系得到的活細胞。人STE14的表達是相對普遍存在的，例如在心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、接觸和外周血白細胞中均可表達人STE14。還在各種癌細胞包括HL-60、Hela細胞S3、慢性骨髓性白血病K-562、成淋巴細胞白血病MOLT-4、伯基特淋巴瘤Raji、結(jié)腸直腸腺癌SW480、肺癌和黑素瘤G361中表達。轉(zhuǎn)錄體的近似大小為約2 kb、3.5 kb和5 kb。
在圖1中列出了哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶STE14之人等位基因的核酸序列。它含有在核苷酸位置90-994的284個氨基酸的開放閱讀框架。它在1-89含有5’非翻譯序列，在945-2556含有3’非翻譯序列。本發(fā)明的核酸序列可含有從氨基酸1至氨基酸284的完整編碼序列(即全長，有起始密碼子和終止密碼子)，其簡并序列，及其片段。本發(fā)明的核酸還含有與上述和下述任何核苷酸序列100％互補的核苷酸序列，例如反義序列。
本發(fā)明還涉及編碼全部或部分MTase的小鼠核苷酸序列，例如圖3所示的序列。就人等位基因而言，本發(fā)明涉及其簡并序列和其反義片段。
可從各種不同來源可得到本發(fā)明核酸。本發(fā)明核酸可得自DNA或RNA，例如聚腺苷酸化mRNA，例如從組織、細胞或全生物體分離的。所述核酸可直接得自DNA或RNA，或cDNA文庫。所述核酸可得自在特定發(fā)育階段、有所需的基因型、表型(例如致癌轉(zhuǎn)化的細胞或癌細胞)等的細胞。
就上述多肽而言，含有編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的核酸可僅包括編碼序列；編碼序列和其他編碼序列(例如編碼前導(dǎo)序列、分泌、靶向、酶、熒光或其他診斷肽的序列)，編碼序列和非編碼序列，例如在5’或3’末端或者分散在編碼序列中的的非翻譯序列，例如內(nèi)含子。含不間斷編碼多肽之核苷酸序列的核酸指所述核苷酸序列含有法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸編碼序列，在編碼序列中沒有間隔或中斷的非編碼核苷酸，例如不含內(nèi)含子。還可將所述核苷酸序列描述為是連續(xù)的?？梢杂贸Ｒ?guī)方法得到編碼人或小鼠MTase的基因組DNA。
本發(fā)明的核酸還可含有與上述核酸有效相連的表達控制序列。術(shù)語“表達控制序列”指調(diào)節(jié)由與其有效相連之核酸編碼的多肽的表達的核酸序列。可以在mRNA或多肽水平調(diào)節(jié)表達。因此，表達控制序列包括mRNA相關(guān)的元件和蛋白質(zhì)相關(guān)的元件。所述元件包括啟動子、增強子(病毒的或細胞的)，核糖體結(jié)合序列，轉(zhuǎn)錄終止子等。當(dāng)表達控制序列處于影響或完成編碼序列之表達的位置上時，即認為所述表達控制序列與核苷酸編碼序列有效相連。例如，當(dāng)啟動子與編碼序列的5’有效相連時，所述編碼序列的表達受該啟動子的調(diào)控。表達控制序列可以是正?；虻漠愒吹膬?nèi)源序列。
可以在核酸雜交的基礎(chǔ)上篩選本發(fā)明核酸。兩個單鏈核酸質(zhì)譜雜交在一起的能力是其核苷酸序列互補性的測量標準，例如核苷酸間的堿基配對，例如A-T,G-C等。因此，本發(fā)明還涉及與含圖1或圖3，優(yōu)選圖1所列核苷酸序列之核酸雜交的核酸。與后者雜交的核苷酸序列將有一互補核酸鏈，或者在存在聚合酶(即適宜的核酸合成酶)的條件下作為一條鏈的模板。本發(fā)明包括核酸的兩條鏈，例如有義鏈和反義鏈。
可選擇雜交條件以篩選與圖1所列核苷酸序列有理想數(shù)量的核苷酸互補性的核酸。能夠與所述序列雜交的核酸優(yōu)選有約95％，更優(yōu)選97％等序列間互補性。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下，與圖1所列核苷酸序列或其互補序列雜交的DNA序列。在本文中，嚴格條件指；例如50％甲酰胺，6X SSC或6X SSPE，以及任選的，阻斷劑(例如Denhardt’s 試劑；BLOTTO，肝素、變性的、成片段的鮭精DNA)，在42℃(如果刪除甲酰胺，則用68℃)。可以按Sambrook等分子克隆(Molecular Cloning)1989，第9章中所述完成洗滌和雜交。還可按Sambrook等所述，基于探針與其靶間形成的雜交物的熔解溫度(Tm)的計算結(jié)果來完成雜交。所述嚴格條件可篩選核酸序列間有至少約95％，優(yōu)選97％核苷酸互補性的序列，前提是所述核酸不是非洲爪蟾屬Xmam4, S.pombe mam4、釀酒酵母STE14或小鼠MTase。參見Imai等分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)17: 1543-1551, 1997；Sapperstein等分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)141438-1449，1994。
根據(jù)本發(fā)明，核酸或多肽可在圖1或圖3所列的核苷酸或氨基酸序列中含有一個或多個不同。通過任何現(xiàn)有方法，包括定向或隨機誘變可完成對核苷酸和/或氨基酸序列的改變或修飾。
編碼本發(fā)明人或小鼠MTase的核酸可包括天然MTase基因中的核苷酸，例如天然多態(tài)性，正?；蛲蛔兊任换?核苷酸或氨基酸)，在哺乳動物例如人、猴子、豬、小鼠、大鼠或兔的自然種群中發(fā)現(xiàn)的突變。術(shù)語天然的指所述核酸可得自天然來源，例如動物組織和細胞、體液、組織培養(yǎng)細胞、法醫(yī)樣品。天然突變包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基-或羧基-末端)，取代或增加?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知的方法，通過核酸雜交檢測并分離這些基因。應(yīng)認識到，與其他癌基因類似，天然變體包括在宿主細胞和生物體中產(chǎn)生疾病的缺失、取代和增加。
編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可含有在天然基因、轉(zhuǎn)錄體或cDNA中發(fā)現(xiàn)的密碼子，例如圖1所列的，或者它可含有編碼相同氨基酸序列的簡并密碼子。
還可基于從基因數(shù)據(jù)庫例如Genbank、EMBL的同源性檢索制備本發(fā)明序列的修飾，例如突變?？捎酶鞣N方法包括計算機程序BLAST中所述的算法、smith-Waterman算法完成序列同源性檢測。例如，可以鑒定序列間的保守序列。參見例如圖2。通過鑒定并排列多肽間的保守氨基酸，然后修飾保守或非保守位置的氨基酸，可將突變導(dǎo)入序列。
本發(fā)明核酸和相應(yīng)的多肽包括與圖1的核苷酸序列不同(或者其次優(yōu)選圖3)但表型上沉默的序列。這些序列修飾包括例如不影響氨基酸序列的核苷酸取代(用于相同氨基酸或簡并序列的不同密碼子)，用同源氨基酸代替天然氨基酸，例如(以側(cè)鏈大小和極性化程度為基礎(chǔ)的)小非極性的半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸；小極性的絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺；大極性的谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸；中間極性的酪氨酸、組氨酸、色氨酸；大非極性的苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。
還可將同源氨基酸按如下分類不帶電荷的極性R基團，谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；酸性氨基酸(帶負電荷的)，天冬氨酸和谷氨酸；堿性氨基酸(帶正電荷的)賴氨酸、精氨酸、組氨酸。同源取代還包括Dayhoff在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜5(Atlas of Protein Sequence ans Structure)(1978)中以及Argos在EMBO J.,8, 779-785(1989)中描述的那些。
本發(fā)明的突變蛋白包括其中人序列中的氨基酸殘基由非洲爪蟾屬Xmam4，S.pombe mam4、釀酒酵母STE14或小鼠MTase中相應(yīng)位置相應(yīng)結(jié)構(gòu)域中的殘基取代的氨基酸序列。
核酸可包括編碼具有圖1或圖3所列之氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，不同的是，其中一個或多個位置由同源氨基酸取代；或者編碼編碼具有圖1(較不優(yōu)選的圖3)所列之氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，不同的是含有1、5、10、15或20取代，例如其中取代是保守氨基酸。本發(fā)明還涉及由所述核酸編碼的多肽。另外，還需要改變序列中的密碼子以優(yōu)化在所需宿主中的表達。
本發(fā)明核酸可包括例如DNA、RNA、合成的核酸、肽核酸、修飾的核苷酸或混合物。DNA可以雙鏈或單鏈的。根據(jù)所需的目的，例如核酸酶例如RNase抗性、改進體內(nèi)穩(wěn)定性等，含核酸的核苷酸可經(jīng)各種已知的鍵例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等相連。參見例如美國專利5378825。
對核酸可進行各種修飾，例如連接可檢測標記(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、改善雜交檢測或穩(wěn)定性的部分。按照所需的方法還可將核酸與固體支持物例如硝基纖維素、磁或順磁微球(例如美國專利5411863；美國專利5543289中所述的；例如含鐵磁體、超磁、順磁、超順磁、氧化鐵和多糖)、尼龍、瓊脂糖、重氮化的纖維素、膠乳固體微球、聚丙烯酰胺等相連。參見例如美國專利5470967、5476925、5478893。
本發(fā)明的另一方面涉及寡核苷酸和核酸探針。可將所述寡核苷酸或核酸探針用于例如檢測、定量分析或分離檢測樣品中的人或小鼠MTase、例如STE14核酸。所述檢測可滿足各種不同的目的，包括研究、診斷和法庭。對于診斷目的，可以鑒定樣品中核酸序列的存在或含量，其中所述樣品得自組織、細胞、體液等。在優(yōu)選的方法中，本發(fā)明涉及檢測核酸的方法，包括將檢測樣品中的靶核酸與寡核苷酸在可使所述靶與寡核苷酸有效雜交的條件下接觸；然后檢測雜交情況。還可將本發(fā)明的寡核苷酸用于合成性的核酸擴增例如PCR(例如Saiki等，1988，科學(xué)(Science)241:53；美國專利4683202；PCR工具方法及應(yīng)用指南，Innis等編，Academic Press,New York,1990)或示差顯示(參見例如Liang等，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)21:3269-3275,1993；美國專利5599672；WO97/18454)。有用的寡核苷酸包括例如5’-CAGATAGCCATCCGAGCTTGT-3’(282-302位核苷酸)；5’-CTCCTGAATCACAGCCTGGAGTA-3’(462-484位核苷酸)；5’-CCTGGAGTATACAGTAGCTGCT-3’(476-497位核苷酸)。還可與其他基因例如ras、p53、Rb、細胞周期調(diào)節(jié)基因等的寡核苷酸共同完成所述檢測。有關(guān)方法和探針參見例如美國專利5591582。
本發(fā)明的另一方面是人STE14或小鼠MTase特有的核苷酸序列。法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的特有序列是指在人或小鼠STE14例如在圖1核苷酸序列中的特定核苷酸順序，該特定核苷酸順序在其他核酸中罕見或者不常見，特別是不出現(xiàn)在動物的核酸中，優(yōu)選哺乳動物，例如人、大鼠、小鼠等。包括有義和反義核苷酸序列?？梢杂贸Ｒ?guī)方法本發(fā)明的特有核酸?？捎煤鎏赜行蛄械暮怂嶙鳛殡s交探針以便在Northern印跡上鑒定含核酸混合物的樣品是否存在人或小鼠STE14?？稍趪栏駰l件下完成雜交以篩選與探針有至少95％同一性(即互補性)的核酸，但也可以使用較低的嚴格條件。特有的法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列可以在其5’或3’端與本專利中提及的各種核苷酸序列，包括編碼STE14、酶、GFP等其他部分的序列、表達控制序列等在框架中融合。參見例如Hrycyna等酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)250:251-266,1995。
根據(jù)所需的選擇性，例如按Sambrook等分子克隆(MolecularCloning)1989所述，可以在不同的條件下完成雜交。例如，為了特異性地檢測人或小鼠MTase，將寡核苷酸與靶核酸在所述寡核苷酸進與所述靶雜交的條件下進行雜交，例如其中所述寡核苷酸與所述靶100％互補。如果需要篩選核苷酸互補性低于100％，至少例如99％、97％、95％、90％、70％、67％的靶核酸，也可以使用不同的條件，前提是所述序列不是非洲爪蟾屬Xmam4,S.pombe mam4、釀酒酵母STE14。參見Imai等分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997;Sapperstein等分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)14:1438-1449,1994。由于本發(fā)明人或小鼠MTase中的突變可引起或增強疾病，例如癌癥、良性腫瘤，因此，本發(fā)明的寡核苷酸可用于診斷。例如在聚合酶鏈反應(yīng)接著DNA測序以鑒定所述序列是否是正常序列的過程中，可利用本發(fā)明的寡核苷酸以及其他癌基因或ras信號傳導(dǎo)途徑中的基因例如GRB2、H-、K-和N-ras、cRaf、MAP激酶、p42、p44、Ser/Thr激酶、Elk-1、c-myc、c-Jun、G-蛋白、Ftase、PPSEP、PPSMT等的寡核苷酸來診斷有癌癥癥狀或其他與Ras信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)的疾病(見下文)的患者是否患有所述疾病。在優(yōu)選的方法中，本發(fā)明涉及診斷癌癥的方法，該方法包括將含靶核酸的樣品與寡核苷酸在可以使所述靶與寡核苷酸雜交的有效條件下雜交；鑒定雜交情況，其中所述寡核苷酸含有人或小鼠MTase的序列，優(yōu)選含有其特有序列；然后確定所述寡核苷酸所雜交的靶核酸的核苷酸序列?？梢杂酶鞣N方法確定所述序列，包括分離靶核酸，或者其cDNA，然后用所需的方法確定其序列。
本發(fā)明的寡核苷酸可含有圖1的任何連續(xù)的核苷酸序列。本發(fā)明的這些寡核苷酸(核酸)可以是任何所需大小的，例如約10-200個核苷酸，12-100，優(yōu)選12-50、12-25、14-16，至少約15，至少約20個核苷酸等。所述寡核苷酸可含有非天然核苷酸，例如次黃嘌呤核苷。所述寡核苷酸與圖1或圖3的序列有100％同一性或互補性，或者它可含有錯配的或核苷酸取代，例如1、2、3、4、或5個取代。根據(jù)本發(fā)明，所述寡核苷酸可含有一試劑盒，其中所述試劑盒含有所需的緩沖液(例如磷酸鹽、tris等)、檢測組合物等。所述寡核苷酸可以是用本領(lǐng)域已知的放射性或非放射性標記物標記過的或未標記過的。
還可以從本發(fā)明核酸，優(yōu)選圖1編碼序列的反義，次優(yōu)選圖3編碼序列的反義來制備反義核酸。反義核酸可用于各個方面，例如調(diào)節(jié)法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的表達，例如抑制該酶、檢測其表達或者進行原位雜交。可以按照類似美國專利5576208描述的ras抑制作用的方式使用這些寡核苷酸。對于調(diào)節(jié)法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的表達來說，可將反義寡核苷酸與表達控制序列有效相連。
可用任何所需的方法標記本發(fā)明的核酸。可用放射性示蹤劑例如32P、35S、125I、3H或14C(僅提及最常用的)標記所述核酸?？砂凑杖魏畏椒ɡ缬梅派湫詷擞浀暮塑账嵩?'或5'端進行末端標記、多核苷酸激酶(用或不用磷酸酶去磷酸化)或者連接酶(根據(jù)待標記的末端)完成放射性標記。也可以使用非放射性標記，將本發(fā)明核酸與具有免疫學(xué)特性的殘基(抗原、半抗原)結(jié)合，所述特性是與特定試劑(配體)的特異性親和性、能夠使可檢測酶反應(yīng)完成(酶或輔酶、酶底物或者與酶反應(yīng)有關(guān)的其他底物)的特性，或者物理特性，例如熒光或在所需波長的發(fā)射或吸收等。
通過各種技術(shù)，包括Northern印跡、PCR、原位雜交等，可將本發(fā)明核酸，包括寡核苷酸、反義核酸等用于檢測完整器官、組織、細胞等中法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的表達。所述核酸可特別地用于檢測紊亂的表達，例如法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的細胞特異性和/或亞細胞改變?？蓡为毣蛘吲c其他基因產(chǎn)物(例如ras-H、-N、-K4A、-K4B、p53、Rb、RCEl等)一起確定法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的水平。
根據(jù)所需的目的，可以在不同的體外和體內(nèi)系統(tǒng)中表達本發(fā)明核酸。例如，可將核酸插入一表達載體，導(dǎo)入所需宿主，然后在可以有效表達所述核酸所編碼之多肽的條件下進行培養(yǎng)。有效條件包括適于所述宿主細胞生產(chǎn)所述多肽的任何培養(yǎng)條件，包括有效溫度、pH培養(yǎng)基、培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基的添加劑(例如擴增或誘導(dǎo)表達的添加劑例如丁酸鹽，或者如果所述核酸與dhfr基因相連，則用氨甲喋呤)、環(huán)己酰胺、細胞密度、培養(yǎng)皿等?？赏ㄟ^任何有效的方法，例如裸DNA、磷酸鈣沉淀、電穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、與脂質(zhì)體融合，與可提高其攝入到細胞中的試劑結(jié)合、病毒轉(zhuǎn)染而將核酸導(dǎo)入細胞。已導(dǎo)入本發(fā)明核酸的細胞即是轉(zhuǎn)染的宿主細胞。所述核酸可以是染色體外物質(zhì)或者整合到宿主細胞的染色體中。可以是穩(wěn)定的或瞬時的。可根據(jù)與宿主細胞的相容性來選擇表達載體。宿主細胞包括哺乳動物細胞，例如COS-7、CHO、HeLa/LTK、NIH3T3、HEK 293、酵母、昆蟲細胞，例如Sf9(S.Frugipeda)和果蠅、細菌例如大腸桿菌，鏈球菌、芽孢桿菌、酵母、真菌細胞、植物、胚胎干細胞(例如哺乳動物，例如小鼠或人)癌癥或腫瘤細胞?？砂凑疹愃艷raziani等癌基因(Oncogene)7:229-235的方法完成Sf9表達。當(dāng)在Sf9細胞中表達人基因時，其活性以膜餾份中的最高。同樣根據(jù)與宿主的相容性和所需的目的，例如高拷貝數(shù)、大量、誘導(dǎo)、擴增、控制表達來選擇表達控制序列?？墒褂玫钠渌蛄邪ɡ鐏碜許V40、CMV的增強子、可誘導(dǎo)啟動子、細胞型特異性的元件，或者可進行選擇性或特異性細胞表達的序列?？捎糜隍?qū)動表達的啟動子包括例如內(nèi)源啟動子，SV40等。
可將另一所需基因?qū)胂嗤乃拗饕赃_到例如調(diào)節(jié)法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的表達、闡明法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶的功能或者所需基因的功能的目的。所需基因包括其他癌基因，與細胞周期有關(guān)的基因，例如p53、Rb等。所述基因可以是正?；?，或者變異的，例如突變、嵌合體、多態(tài)性等。
可將本發(fā)明核酸或多肽用作核酸或蛋白質(zhì)電泳、色譜等的大小標記物。通過掃描限制位點的序列、計算大小、然后完成相應(yīng)的限制消化，可確定一定的限制片段。還可將人法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶cDNA用作凝膠上的2.5 kb分子量標記物。
本發(fā)明的另一方面涉及調(diào)節(jié)與MTase基因有關(guān)的生物學(xué)途徑，特別是疾病。例如細胞增殖(例如癌)、生長控制、細胞程序死亡、分化、形態(tài)發(fā)生、交配型、G蛋白質(zhì)信號、細胞粘附等。例如，本發(fā)明的哺乳動物MTase與各種蛋白質(zhì)的加工有關(guān)，所述蛋白質(zhì)例如指是類脂-修飾的(如含有類固醇中間體如faransyl或香葉基香葉基，或其它異戊二烯化物種)和/或含N-末端C、CC、CCXX、CXC的多肽。參見例如Cox和Der，生物化學(xué)生物物理通訊(Biochim.Biophys.Acta)1333，F(xiàn)51-F71,1997。特別令人感興趣的是哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶在ras多肽加工中所起的作用，因為后者與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)化有關(guān)。Ras和含上述基元的其他多肽通過一個或多個涉及法尼基化、內(nèi)切蛋白酶解和甲基化的步驟得到加工。參見例如Gelb，科學(xué)(Science)275,1751-1751,1997。ras(野生型、突變的、構(gòu)成型等，ras)的過表達，任選地加上其他基因的異常表達產(chǎn)生致癌活性。治療ras過表達的一種方法是抑制ras成熟途徑以便產(chǎn)生不完全加工的/或失活的ras積累物，從而消除或降低其致癌作用。根據(jù)本發(fā)明，通過阻斷哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶例如STE14可抑制ras成熟?？梢杂酶鞣N方法完成阻斷，包括施用STE14抗體或者其他STE14配體、STE14肽(特別是與甲基供體結(jié)合，但沒有甲基轉(zhuǎn)移酶或甲基轉(zhuǎn)酯化活性的那些)、STE14催化活性抑制劑(例如甲基供體模擬物或者競爭劑或者拮抗劑)、STE14基因標記抑制劑(例如反義或雙鏈RNA，例如Fire等自然(Nature)391:806-811,1998)。可按照本發(fā)明所述的方法或者按照本領(lǐng)域現(xiàn)有的方法鑒定阻斷劑。
本發(fā)明的一個方面涉及鑒定調(diào)節(jié)法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶活性的化合物。通過提高、降低、拮抗、促進、穩(wěn)定等其活性可調(diào)節(jié)所述活性。因此，本發(fā)明的一個方面是有利于篩選調(diào)節(jié)甲基摻入甲基轉(zhuǎn)移酶之甲基受體底物的化合物。
因此，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶，特別是圖1或圖3的人或小鼠MTase之化合物，包括，在存在待測化合物的條件下，將甲基供體底物、甲基受體底物以及哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶或者具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的其片段在所述哺乳動物羧甲基轉(zhuǎn)移酶或所述片段可使所述甲基受體甲基化的有效條件下反應(yīng)；檢測所述甲基受體底物的甲基化作用；然后通過比較存在和不存在所述試驗化合物的條件下甲基化作用的數(shù)量來鑒定所述試驗化合物是否可調(diào)節(jié)甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
任何功能性甲基供體底物均是可接受的，包括可檢測標記的S-腺苷-甲硫氨酸，特別是S-腺苷-L-[甲基-14C]甲硫氨酸或S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸。同樣，任何功能性甲基受體也均是令人滿意的，包括含末端法尼基化(farnsylated)半胱氨酸的多肽，末端為CC、CCXX或CXC的和/或是用例如法尼基(farnsyl)或香葉草基香葉草基將半胱氨酸異戊二烯化的多肽。功能性甲基受體底物包括例如Ras-H、-N、-K4A、-K4B、Lamins A和B、RhoB、RhoE、其他的、Rap2、Rheb、磷酸酶激酶和視紫紅質(zhì)激酶、轉(zhuǎn)導(dǎo)素、cGMP磷酸二酯酶、IFN-誘導(dǎo)的鳥苷酸-結(jié)合蛋白1、IP35-磷酸酶、PxF、PRL-1/PTPCAAX1和2、生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys等。其他底物包括肝素6病毒(Otto等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271:4569-72,1996)。總之，如果在甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中是可被作用的，則任何底物均是適宜的。因此，底物可含有其他原子，例如通過肽或其他鍵連接的其他氨基酸殘基并可以任何需要的方式進行修飾。例如，可將底物固定于例如含膠、sepharose、硅膠、瓊脂糖、sephadex、纖維素、多糖、玻璃、聚合物等的固體支持物。還可用例如抗體、抗生物素蛋白、放射性標記、aptamer、熒光標記、核酸等對底物進行可檢測標記。所述底物還可含有磷酸、甲基、糖或類脂。
優(yōu)選在其中完成受體-底物甲基化的環(huán)境中將待測化合物與底物反應(yīng)。所述環(huán)境可以指有效條件。在不存在待測化合物以確立基本活性作為對照的條件下，確定這些條件。可用常規(guī)方法選擇有效條件，例如使用鹽、緩沖液、還原和/或氧化劑、pH’s等。例如，當(dāng)使用含法尼基化C末端半胱氨酸的甲基受體底物時，有效的甲基化作用導(dǎo)致其甲基化。
底物、待測化合物與MTase在可完成甲基化的條件下反應(yīng)完成后，下一步是確定所述試驗化合物對甲基化作用的影響。在不存在試驗化合物的條件下優(yōu)化甲基化作用以確立MTase的基本活性。一般地，檢測甲基化作用包括測量被標記的甲基(例如3H或14C)插入到MTase的受體底物中的情況。在優(yōu)選的實施方案中，甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，甲基供體底物是可檢測標記的S-腺苷甲硫氨酸(例如S-腺苷-L-[甲基-14C]甲硫氨酸或者S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸)，然后用鏈霉抗生物素蛋白-包被的珠捕獲甲基受體底物來檢測甲基化作用；測量摻入到所述甲基受體底物中的標記的甲基的量。但是，根據(jù)摻入到甲基受體底物中的錨定物(例如實施例中的生物素)，可使用任何現(xiàn)有的方法完成捕獲，例如用蛋白質(zhì)A包被的SPA珠可與可用于捕獲全長細胞蛋白的抗Ras抗體結(jié)合。如果所述細胞RAS是未甲基化的，可以用重組MTase摻入來自3H-S-腺苷甲硫氨酸的標記。
總的來說，本發(fā)明的檢測方法涉及捕獲甲基底物受體并辨別所述底物是否已得到修飾，即是否加入了甲基。這一目的可通過任何有效的方法完成，所述方法包括抗體(例如識別甲基化底物但不識別未甲基化底物或者反過來的抗體)；質(zhì)譜；電泳遷移率變動；色譜；電泳等。
可將MTase組分以各種形式例如基本上純化的、作為細胞膜組分(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))或者作為可溶提取物加到反應(yīng)混合物中。在不同的情況下，MTase多肽可得自天然來源、重組來源(例如在昆蟲細胞系或細菌中作為融合或非融合蛋白表達的人STE14，如Hrycyna等酶學(xué)方法(Methods Enzymol)250:251-266,1995中所述的)，或者通過合成方法(化學(xué)或酶促產(chǎn)生的，例如裂解全長MTase)生產(chǎn)。優(yōu)選，在用MTase編碼序列(例如cDNA、基因、基因組片段等)轉(zhuǎn)化的細胞系中表達MTase。在后一種情況下，MTase是作為細胞的異源組分而存在；所謂異源，指MTase不僅在不同種的細胞系中表達，而且由例如通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等已導(dǎo)入所述細胞的編碼序列編碼。優(yōu)選在所述細胞(細菌、酵母哺乳動物等)中高水平表達MTase。人法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶或其片段使優(yōu)選的編碼序列。參見圖1。有用的人序列片段具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性和甲基供體底物結(jié)合活性。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面，以細胞裂解產(chǎn)物提供MTase，例如將用人STE14轉(zhuǎn)化的細胞裂解，然后將所得的裂解產(chǎn)物直接用于檢測，即粗裂解產(chǎn)物。含重組人STE14的粗裂解產(chǎn)物可任選地再精煉或者富集人STE14。例如，按Hrycyna等酶學(xué)方法(Methods Enzymol)250:251-266,1995中所述，分離膜級份等。
檢測的目的是篩選并鑒定調(diào)節(jié)MTase活性的化合物。因此，通常在存在和不存在試驗化合物的情況下完成甲基化作用?？捎贸Ｒ?guī)方法例如通過確定在存在所述試驗化合物的情況下甲基化作用更多或更少，可確定化合物是否調(diào)節(jié)RCE。
還可用全細胞完成檢測。例如，可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶活性的調(diào)節(jié)劑加到所需的宿主細胞中，然后觀察其對細胞系的影響。如所述，MTase可使細胞中的不同蛋白質(zhì)甲基化。參見上文。因此，通過鑒定底物是否已被甲基化，可測量抑制劑對全細胞(或提取物等)的影響。例如，在表達ras的細胞系中，全細胞檢測可包括給細胞施用試驗化合物；例如用抗體或電泳遷移率變動檢測ras中間產(chǎn)物是否已在細胞中積累來確定或檢測所述試驗化合物是否可調(diào)節(jié)ras的加工。可將細胞系進行加工以表達甲基轉(zhuǎn)移酶底物，過表達底物等。有關(guān)法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的體內(nèi)檢測方法還包括修飾試驗化合物以使其進入細胞，例如衍生化合物、將化合物包在脂質(zhì)體中以及提高傳遞到細胞例如以刺激吞噬作用的其他方法。還可將試劑加入所述細胞并例如通過檢測細胞形態(tài)等檢測其抑制轉(zhuǎn)化的能力。參見例如美國專利5688655。還可按美國專利5710171、5703241、5585359、5557729、5532359、5470832、5420245、5185248所述完成檢測。
用于體外(例如作為膜的來源)和體內(nèi)檢測的細胞系可表達一種或多種異源基因，包括FTase、RCE1、Rb、rac、p53、Ras-H、-N、-K4A、-K4B、LaminsA和B、RhoB、RhoE、Rap2、Rheb、磷酸酶激酶和視紫紅質(zhì)激酶、轉(zhuǎn)導(dǎo)素、cGMP磷酸二酯酶、IFN-誘導(dǎo)的鳥苷酸-結(jié)合蛋白1、IP35-磷酸酶、PxF、PRL-1/PTPCAAX1和2。
用該方法或其他方法鑒定的化合物可用于在原位、體外(試管、固體支持物等)、體內(nèi)或任何所需的環(huán)境中調(diào)節(jié)細胞、組織、全生物體內(nèi)法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶活性。總之，具有所述體外活性的化合物將用于體內(nèi)調(diào)節(jié)與法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶有關(guān)的生物途徑，例如以治療與上述生物和細胞活性有關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明還涉及治療和預(yù)防與ras、G-蛋白質(zhì)等-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的疾病，例如癌癥、與異常細胞增殖有關(guān)的疾病。例如，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，該方法包括給需要治療的個體施用治療疾病有效量的化合物，其中所述化合物是法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因或多肽表達的調(diào)節(jié)劑。治療所述疾病指延緩其發(fā)作、延緩所述疾病的進展，改善或延緩疾病的臨床和病理學(xué)跡象。調(diào)節(jié)劑化合物或化合物的混合物可以是合成的、天然的或重組的。調(diào)節(jié)劑化合物可包括氨基酸、核苷酸、碳氫化合物、類脂、多糖等。調(diào)節(jié)劑化合物優(yōu)選是法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)劑，例如抑制或提高其mRNA、蛋白質(zhì)表達或加工?？捎貌煌脑噭├绶戳x核酸、核酶、aptamer、合成的化合物或者天然化合物調(diào)節(jié)表達。為了治療疾病，可將所述化合物或混合物配制成含可藥用載體或本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他賦形劑的藥物組合物。參見例如Remington’s PharmaceuticalSciences，第8版，Mack Publishing Company,1990。所述組合物還可含有有效量的其他化合物，特別是為了治療癌癥。
本發(fā)明還涉及特異性識別法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的抗體?？砂凑杖魏嗡璧姆椒ㄖ苽淇贵w，例如多克隆、單克隆、重組、嵌合抗體。例如為了生產(chǎn)單克隆抗體，將圖1(其特異性片段)的多肽經(jīng)皮下和/或腹膜內(nèi)以可有效引發(fā)免疫反應(yīng)的量施用給小鼠、山羊或兔，加或不加佐劑。所述抗體還可是單鏈FAb。所述抗體可以是IgG、亞型、IgG2a、IgGl等。還可通過施用裸DNA產(chǎn)生抗體。參見例如美國專利5703055、5589466、5580859。
法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶特異性抗體指所述抗體識別法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶中的或包括該酶，例如圖1和圖3的人和鼠序列的氨基酸的特定序列。因此，特異性抗體將以高于不同表位的親和性(例如用免疫印跡法檢測和/或測量的)結(jié)合圖1中的氨基酸序列，即表位。因此，人STE14表位特異性的抗體可用于檢測在樣品(例如含人STE14基因產(chǎn)物的組織樣品)中是否存在所述表位，將其與不含所述表位的樣品加以區(qū)別。按Santa Cruz BiotechnologyInc.,Research Product Catalog所述使用所述抗體，因此，可將其加以配制，例如100μg/ml。
另外，還可例如用合成肽文庫或aptamer(例如Pitrung等美國專利5142854；Geysen等1987，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)102:259-274；Scott等，1990科學(xué)(Sciences),249:386;Blackwell等，1990，科學(xué)(Sciences)250:1104；Tuerk等，1990，科學(xué)(Sciences)249:505)制備與本發(fā)明法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽或其衍生物結(jié)合的配體。
可將結(jié)合法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的抗體和其他配體用于各種用途包括治療、診斷、商業(yè)研究工具，例如以定量分析動物、組織、細胞等中的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽的水平以鑒定其細胞定位和/或分布，純化該酶或者含其一部分的多肽，調(diào)節(jié)其功能等?？蓪⑵淇贵w或其衍生物用于Western印跡、ELIZA、免疫沉淀、RIA等。本發(fā)明涉及完成所述方法的檢測、組合物和試劑盒等。
可將本發(fā)明抗體用于檢測各種樣品，包括組織、細胞、體液、血液、尿、腦脊髓液中的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽或其片段。本發(fā)明方法包括例如(a)在本領(lǐng)域已知的可進行結(jié)合的有效條件下，接觸與圖1的肽結(jié)合的配體，(b)檢測配體與肽之間的特異性結(jié)合。所謂特異性結(jié)合指所述配體與特定的氨基酸序列相連，所述氨基酸序列例如在圖1或其衍生物的氨基酸序列內(nèi)或包括圖1或其衍生物的氨基酸序列。還可將抗體或其衍生物用于已知法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶或其片段的表達?？蓡为毣蚺c其他基因產(chǎn)物一起確定法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽的水平。具體地講，可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的量(例如表達水平)與相同或不同樣品中的其他多肽例如ras、FTase、內(nèi)蛋白酶等的量進行比較(例如比例)?？蓪⒎峄ㄏ虻陌腚装彼狒燃谆D(zhuǎn)移酶的配體與其他抗體，例如識別癌癥的癌癥學(xué)標記包括ras等的抗體一起使用?？傊?，可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶特異性的試劑按照任何所需的方法，例如按美國專利5397712、5434050、5429947所述用于診斷和/或法醫(yī)研究。
本發(fā)明還涉及按照所需方法例如按美國專利5434050所述制備的標記的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽?？蓪擞浀亩嚯挠糜诶缃Y(jié)合檢測，例如以鑒定與法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合或相連的物質(zhì)，揭示法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶在細胞、體外、體內(nèi)或原位系統(tǒng)內(nèi)的運動等。
可分離本發(fā)明的核酸、多肽、抗體、法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶配體等。術(shù)語“分離”指物質(zhì)不以其起源環(huán)境中的形式存在，例如更濃，更純，與組分分開等。分離的核酸包括例如具有從活動物中的染色體DNA分離的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶序列的核酸。該核酸可以是載體的一部分或者插入到染色體(通過特異性的基因靶向或者隨機整合在一個位置而不是其正常位置)中，并仍是分離的，即不是其天然環(huán)境中的形式。本發(fā)明核酸或多肽還可以是基本上純的。所謂基本上純的，是指核酸或多肽與其他核酸或多肽是分開的并基本上不含其他核酸或多肽，即所述核酸或多肽是主要的和活性組分。
本發(fā)明還涉及含法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶核酸的轉(zhuǎn)基因動物，例如非人哺乳動物，例如小鼠。可按照本領(lǐng)域已知的方法，包括例如將重組基因經(jīng)前核注射到1細胞胚胎的前核中，將人工酵母染色體摻入到胚胎干細胞中，基因靶向方法，胚胎干細胞方法來制備轉(zhuǎn)基因動物。參見例如美國專利4736866、4873191、4873316、5082779、5304489、5174986、5175384、5175385、5221778；Gordon等美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)77:7380-7384(1980)；Palmiter等細胞(Cell)41:343-345(1985)；Palmiter等遺傳工程年鑒(Ann.Rev.Genet.)20:465-499(1986)；Askew等分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)13:4115-4124(1993)；Games等自然(Nature)373: 523-527,1995;Valancius和smithies，分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)ll:1402-1408,1991；Stacey等、分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)14:1009-1016,1994；Hasty等自然(Nature)350: 243-246,1995；Rubinstein等核酸研究(Nucl.AcidRes.)21:2613-2617,1993?？蓪⒈景l(fā)明核酸導(dǎo)入任何非人哺乳動物包括小鼠(Hogan等，1986，小鼠胚胎操作實驗室手冊(Manipulatingthe Mouse Embryo: A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)、豬(Hammer等，自然，315: 343-346, 1985)、綿羊(Hammer等，自然，315: 343-346,1985)、牛、大鼠或靈長類。參見例如Church,1987，生物技術(shù)趨勢(Trends in Biotech.)5: 13-19; Clark等，1987，生物技術(shù)趨勢(Trends in Biotech.)5: 20-24； 以及DePamphilis等，1988，生物技術(shù)(BioTechniques)6: 662-680。另外，定制的轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠可購買到。這些轉(zhuǎn)基因動物作為癌癥模型，例如以實驗藥物，作為蛇的食物，作為遺傳標記以檢測菌株源等。所述轉(zhuǎn)基因動物還可含有其他轉(zhuǎn)基因，例如Rb、p53、RCE1、FTase、rho、rab、rac、GTP結(jié)合蛋白的γ亞單位以及本說明書中上文提到的任何基因。
總之，可按照美國專利5501969、5506133、5441870、WO 90/00607、WO 91/15582所述制備并使用本發(fā)明核酸、多肽、抗體等。
有關(guān)核酸、多肽、抗體等的其他方面，可參考標準分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)科學(xué)和免疫學(xué)教科書。參見例如Davis等(1986)，分子生物學(xué)基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)Elsevir SciencesPublishing,Inc.,紐約；Hames等(1985)核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)，IL Press，分子克隆(Molecular Cloning)Sambrook等；分子生物學(xué)的現(xiàn)有工具(Current Protocols in MolecularBiology),F.M.Ausubel等編，John wiley & Sons,Inc；人類遺傳學(xué)的現(xiàn)有工具(Current Protocols in Human Genetics)Nicholas C.Dracopoli等編John wiley & Sons,Inc；蛋白質(zhì)科學(xué)的現(xiàn)有工具(Current Protocols in Protein Science),John E.Coligan等編John wiley & Sons,Inc；免疫學(xué)的現(xiàn)有工具(Current Protocols inImmunology)John E.Coligan等編John wiley & Sons,Inc。
實施例我們已設(shè)計了我們自己的該檢測方式，其中利用生物素化的異戊二烯化的肽底物(生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys；以K-Ras-4B的C末端序列為基礎(chǔ)，缺少最后3個殘基)。簡而言之，表達人STE14的細菌或昆蟲細胞膜利用共底物3H-S-腺苷甲硫氨酸使(法尼基)Cys-羧基甲基化。用鏈霉抗生物素-包被的SPA珠定量分析摻入到底物肽中的所得標記。將甲基化酶分別克隆到pRSET(Invitrogen)和pFastBac(Gibco BRL)細菌和昆蟲表達載體中。
用96孔平板(Wallac Part NO.1450-410)完成標準檢測，總檢測體積為100 l，通常含有以下列順序加入的50 l化合物，25 l膜和25 l3H-SAM/底物。HEPES pH7.4的終濃度為100 mM。將在100 mM HEPES pH7.4中的25 l膜加到各孔中，然后加入25l稀釋的底物(將甲基化酶底物貯存于-20℃的100％DMSO中，但在使用前用10％DMSO稀釋到所需的工作濃度)。向其中加入標記，即3H-SAM(～85 Ci mmol； 1 mCi/ml； 12M)；用100 mM HEPES H7.4將每孔加到0.125 l。
然后將平板密封，在室溫保溫60分鐘。
通過加入150 l含在PBS pH7.1+5 mM EDTA+0.1％Tween-20中的SPA珠混合物來終止反應(yīng)。再將平板密封，在用閃爍計數(shù)器閱讀前將珠放置過夜。
無需進一步說明，應(yīng)理解根據(jù)前文的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以完全實現(xiàn)本發(fā)明。因此，前文的優(yōu)選的具體實施方案僅僅是說明性的，不對本說明書的其他部分構(gòu)成限制。
上文引用的所有申請、專利和文獻和圖中的整個公開內(nèi)容均引入本文作為參考。
從前文描述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地確定本發(fā)明的基本特征，而且在不會偏離其精神和范圍情況下，可對本發(fā)明進行各種改變和修飾以適用于不同的用途和條件。
權(quán)利要求
1.分離的哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽或其生物活性片段。
2.權(quán)利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶，或其生物活性片段，其中所述多肽具有甲基供體底物結(jié)合活性或者甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
3.權(quán)利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶，或其生物活性片段，其中所述多肽能夠?qū)⒓谆D(zhuǎn)移給含末端S-法尼基-半胱氨酸的甲基受體底物。
4.權(quán)利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶或其生物活性片段，是人的。
5.權(quán)利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶，含有圖1所列的氨基酸1-氨基酸284。
6.權(quán)利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶，含有圖3所列的氨基酸1-氨基酸153。
7.權(quán)利要求6的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶，由圖3所列的氨基酸序列組成。
8.權(quán)利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶或其生物活性片段，是基本上純的。
9.含有編碼哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽或其生物活性片段之核苷酸序列的分離的核酸。
10.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述被編碼的多肽具有甲基供體底物結(jié)合活性或甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
11.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述多肽能夠?qū)⒓谆D(zhuǎn)移給含末端S-法尼基-半胱氨酸的甲基受體底物。
12.權(quán)利要求9的分離的核酸，是人的。
13.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核苷酸序列編碼圖1所列的氨基酸1-氨基酸284。
14.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核苷酸序列編碼圖3所列的氨基酸1-氨基酸153。
15.權(quán)利要求9的分離的核酸，由圖3所列的核酸組成。
16.權(quán)利要求9的分離的核酸，基本上由選自圖1所列之核苷酸序列的任何連續(xù)的12-100個堿基對的序列或其互補序列組成。17、權(quán)利要求16的分離的核酸，還含有可檢測的標記。18權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與表達控制序列有效相連。
19.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核酸含有天然核苷酸序列。
20.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核酸不間隔地編碼所述多肽。
21.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核酸是DNA或RNA。
22.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中所述核酸還含有可檢測標記。
23.權(quán)利要求9的分離的核酸，其中一個或多個氨基酸位置是被取代的或者缺失的或者兩者兼而有之，且由所述核酸編碼的多肽具有甲基供體底物結(jié)合活性或者甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
24.權(quán)利要求23的分離的核酸，其中一個或多個被取代的氨基酸位置是被同源氨基酸取代的。
25.權(quán)利要求9的分離的核酸，具有在嚴格條件下與圖1所列核苷酸序列雜交的天然可得的核苷酸序列或其互補序列，前提是所述序列不是非洲爪蟾屬Xmam4,S.pombe mam4、釀酒酵母STE14或其片段。
26.權(quán)利要求25的分離的核酸，包括與圖1所列的核苷酸序列的至少95％核苷酸序列同一性。
27.權(quán)利要求25的分離的核酸，其中所述核苷酸序列編碼具有甲基供體底物結(jié)合活性或甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
28.在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中表達由核酸編碼的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶多肽的方法，所述方法包括在有效表達所述多肽的條件下培養(yǎng)含權(quán)利要求15之核酸的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述宿主細胞是Sf9或HEK293。
30.權(quán)利要求28的方法，還包括分離含所述多肽的所述宿主細胞的膜級份。
31.權(quán)利要求28的方法，還包括調(diào)節(jié)所述多肽的表達。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述多肽含有圖1所列的氨基酸1-氨基酸284。
33.含權(quán)利要求9的核酸的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
34.含權(quán)利要求13的核酸的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
35.含權(quán)利要求9的核酸的載體。
36.含權(quán)利要求13的核酸的載體。
37.含權(quán)利要求13的核酸的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
38.鑒定調(diào)節(jié)哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶之化合物的方法，所述方法包括在存在試驗化合物的情況下，使甲基供體底物、甲基受體底物和哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶或其具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段在所述哺乳動物羧甲基轉(zhuǎn)移酶或其片段可使所述甲基受體底物甲基化的有效條件下反應(yīng)；檢測所述甲基受體底物的甲基化作用；并通過比較存在和不存在試驗化合物時的甲基化量來鑒定所述試驗化合物是否可調(diào)節(jié)甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶或其片段是人的。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述甲基受體底物含有異戊二烯化的C末端半胱氨酸。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，而甲基供體底物是可檢測標記的S-腺苷甲硫氨酸。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，而甲基供體底物是含可檢測標記的甲基的S-腺苷甲硫氨酸，所述甲基化檢測是通過捕獲甲基受體底物并測量摻入到所述甲基受體底物中的標記的甲基的量來完成。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，而甲基供體底物是含可檢測標記的甲基的S-腺苷甲硫氨酸，所述甲基化檢測是用鏈霉抗生物素蛋白包被的珠捕獲甲基受體底物并測量摻入到所述甲基受體底物中的標記的甲基的量來完成。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述羧甲基轉(zhuǎn)移酶是基本上純的。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述羧甲基轉(zhuǎn)移酶作為細胞膜異源組分存在。
46.權(quán)利要求38的方法，其中所述羧甲基轉(zhuǎn)移酶作為融合蛋白存在。
47.權(quán)利要求38的方法，其中所述羧甲基轉(zhuǎn)移酶含有圖1所列的氨基酸1-284。
48.權(quán)利要求38的方法，其中所述方法用完整的細胞完成。
49.哺乳動物哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉(zhuǎn)移酶特異性的分離的抗體。
50.權(quán)利要求48的分離的抗體，與選自圖1的氨基酸序列結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶核酸和多肽,特別是可從人得到的或衍生的。所述核酸和多肽用于診斷和鑒定調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)途徑,特別是與細胞周期、細胞增殖和癌癥有關(guān)的途徑之試劑的檢測。
文檔編號C12Q1/48GK1298449SQ99805412
公開日2001年6月6日 申請日期1999年4月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月24日
發(fā)明者崔允禎, A·K·諾斯, G·A·馬丁, G·博拉格 申請人:昂尼克斯藥物公司