專利名稱：：食源性致病菌核酸高效提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種食源性致病菌核酸高效提取方法。
背景技術(shù)：
：PCR技術(shù)目前已被廣泛用于病原微生物的檢測(cè)。PCR檢測(cè)技術(shù)的第一步就是模板核酸的制備，即樣本中核酸的提取，這直接影響著PCR反應(yīng)的結(jié)果。長(zhǎng)期以來(lái)，樣本中核酸的提取和純化一直是耗時(shí)、繁瑣的過(guò)程，嚴(yán)重減慢了檢測(cè)速度。因此，許多學(xué)者一直在探索各種核酸的提取方法。樣品中核酸的提取分為兩個(gè)步驟裂解細(xì)胞和提取核酸。從樣品中提取核酸首先要通過(guò)物理、化學(xué)或酶解作用裂解細(xì)胞，使核酸釋放出來(lái)。常用方法包括物理法(煮沸、凍融、微波、超聲、研磨等)、化學(xué)方法(高鹽、表面活性劑SDS、熱酚等)和酶解法(裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等)。常用幾種核酸提取方法有酚-氯仿抽提法、螯合樹(shù)脂/純化柱法、玻璃粉吸附法、磁珠吸附法、免疫親和法、各種試劑盒法。幾種核酸提取方法進(jìn)行比較，見(jiàn)表1:表1幾種核酸提取方法比較<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高質(zhì)量、高產(chǎn)量、高通量的細(xì)菌核酸高效提取方法。上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)食源性致病菌核酸高效提取方法，其組成包括將細(xì)菌培養(yǎng)液離心，向離心沉淀中加入緩沖液A，震蕩并加入溶菌酶，溫育后加入蛋白酶K，加入緩沖液B，劇烈振蕩后，在溫度65t:溫育10分鐘，制成裂解溶液，通過(guò)硅基質(zhì)Si02材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液。所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的細(xì)菌培養(yǎng)液離心為將l-5mL細(xì)菌培養(yǎng)液以8，000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，吸凈上清。所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的向離心沉淀中加入緩沖液A，震蕩并加入溶菌酶，溫育后加入蛋白酶K，加入緩沖液B，劇烈振蕩后，在溫度65t:溫育IO分鐘，制成裂解溶液的過(guò)程為向細(xì)菌沉淀中加入250iiL緩沖液A:20mol/L三羥甲基氨基甲烷TrisHCI、2mol/L乙二胺四乙酸EDTA、1.2%聚乙二醇辛基苯基醚Triton，振蕩至菌體徹底懸浮，加入終濃度為20mg/mL的溶菌酶，在溫度為37。C溫育30分鐘，向管中加入20yL濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200yL緩沖液B:0.05moL/L三羥甲基氨基甲烷TrisHCI、pH為7.6的0.lmol/L氯化鈉NaCI、0.05mol/L乙二胺四乙酸EDTA、2X十二烷基硫酸鈉SDS，劇烈振蕩后，在溫度65t:溫育10分鐘。所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的通過(guò)硅基質(zhì)Si(^材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液過(guò)程包括在裂解液中加入220iiL無(wú)水乙醇，充分振蕩后，轉(zhuǎn)入一個(gè)具有吸附膜的吸附管內(nèi)(吸附管放入收集管中)，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500iiL緩沖液C:0.3M醋酸鈉NaAc、300yL無(wú)水乙醇，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500yL漂洗液D:70%的乙醇溶液，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，如此重復(fù)1次，最后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，棄濾液；將吸附管轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200iiL的TE緩沖液10mM三羥甲基氨基甲烷Tris、lmM乙二胺四乙酸EDTA室溫放置2分鐘，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，濾液即為核酸溶液，再溫度-2(rC時(shí)保存?zhèn)溆?。所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述?5t:溫育10min后，溶液將由乳濁液變成液，如果未變成透明，說(shuō)明細(xì)菌沒(méi)有徹底裂解。所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50iiL，用水做洗脫液時(shí)pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，核酸產(chǎn)物應(yīng)保存在溫度_20°C。這個(gè)技術(shù)方案有以下有益效果1.本發(fā)明不但能消除食品和培養(yǎng)基成分的干擾，得到高純度、高濃度的核酸，而且能同時(shí)提取8種菌，包括G+菌和G-菌，并滿足PCR-DHPLC檢測(cè)條件的要求。2.本發(fā)明按照核酸提取的2個(gè)步驟裂解和提取，本著簡(jiǎn)便、有效、適合、環(huán)保和經(jīng)濟(jì)原則，進(jìn)行菌體細(xì)胞的裂解方法的選擇，菌體核酸提取方法的選擇，最后組合與篩選了4種提取方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，分析了4種提取方法所得核酸的質(zhì)量，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增效果驗(yàn)證和DHPLC檢測(cè)效果驗(yàn)證，優(yōu)選出高效、適合、環(huán)保和經(jīng)濟(jì)的提取方法酶解吸附膜法。3.本發(fā)明方法提取核酸的純度高、產(chǎn)量大，可同時(shí)提取8種致病菌，不僅包括6+菌，還包括G-菌，能滿足PCR-DHPLC檢測(cè)的色譜級(jí)要求。其它的提取方法不能同時(shí)具備本方法的特點(diǎn)，尤其不能同時(shí)提取G+菌和G-菌，或提取后質(zhì)量也不高，影響核酸的使用。本發(fā)明的具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:食源性致病菌核酸高效提取方法，其組成包括將細(xì)菌培養(yǎng)液離心，向離心沉淀中加入緩沖液A，震蕩并加入溶菌酶，溫育后加入蛋白酶K，加入緩沖液B，劇烈振蕩后，在溫度65t:溫育10分鐘，制成裂解溶液，通過(guò)硅基質(zhì)Si02材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液。實(shí)施例2:所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的細(xì)菌培養(yǎng)液離心為將l-5mL細(xì)菌培養(yǎng)液以8，OOOrpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，吸凈上清。實(shí)施例3:所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的向離心沉淀中加入緩沖液A，震蕩并加入溶菌酶，溫育后加入蛋白酶K，加入緩沖液B，劇烈振蕩后，在溫度65t:溫育10分鐘，制成裂解溶液的過(guò)程為向細(xì)菌沉淀中加入250L緩沖液A:20mol/L三羥甲基氨基甲烷TrisHCI、2mol/L乙二胺四乙酸EDTA、1.2%聚乙二醇辛基苯基醚Triton,振蕩至菌體徹底懸浮，加入終濃度為20mg/mL的溶菌酶，在溫度為37。C溫育30分鐘，向管中加入20yL濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200yL緩沖液B:0.05moL/L三羥甲基氨基甲烷TrisHCI、pH為7.6的0.lmol/L氯化鈉NaCI、0.05mol/L乙二胺四乙酸EDTA、2X十二烷基硫酸鈉SDS，劇烈振蕩后，在溫度65t:溫育10分鐘。實(shí)施例4:所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的通過(guò)硅基質(zhì)Si02材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液過(guò)程包括在裂解液中加入220iiL無(wú)水乙醇，充分振蕩后，轉(zhuǎn)入一個(gè)具有吸附膜的吸附管內(nèi)(吸附管放入收集管中)，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500iiL緩沖液C:0.3M醋酸鈉NaAc、300yL無(wú)水乙醇，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500yL漂洗液D:70%的乙醇溶液，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，如此重復(fù)1次，最后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，棄濾液；將吸附管轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200iiL的TE緩沖液10mM三羥甲基氨基甲烷Tris、lmM乙二胺四乙酸EDTA室溫放置2分鐘，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，濾液即為核酸溶液，再溫度-2(rC時(shí)保存?zhèn)溆?。?shí)施例5:所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，所述的65t:溫育10min后，溶液將由乳濁液變成液，如果未變成透明，說(shuō)明細(xì)菌沒(méi)有徹底裂解。實(shí)施例6:所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50iiL，用水做洗脫液時(shí)pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，核酸產(chǎn)物應(yīng)保存在溫度-20°C。權(quán)利要求一種食源性致病菌核酸高效提取方法，其組成包括將細(xì)菌培養(yǎng)液離心，其特征是向離心沉淀中加入緩沖液A，震蕩并加入溶菌酶，溫育后加入蛋白酶K，加入緩沖液B，劇烈振蕩后，在溫度65℃溫育10分鐘，制成裂解溶液，通過(guò)硅基質(zhì)SiO2材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是所述的細(xì)菌培養(yǎng)液離心為將l-5mL細(xì)菌培養(yǎng)液以8，000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，吸凈上清。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是所述的向離心沉淀中加入緩沖液A，震蕩并加入溶菌酶，溫育后加入蛋白酶K，加入緩沖液B，劇烈振蕩后，在溫度65t:溫育10分鐘，制成裂解溶液的過(guò)程為向細(xì)菌沉淀中加入250iiL緩沖液A:20mol/L三羥甲基氨基甲烷TrisHCI、2mol/L乙二胺四乙酸EDTA、1.2%聚乙二醇辛基苯基醚Triton，振蕩至菌體徹底懸浮，加入終濃度為20mg/mL的溶菌酶，在溫度為37。C溫育30分鐘，向管中加入20iiL濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200yL緩沖液B:0.05moL/L三羥甲基氨基甲烷TrisHCI、pH為7.6的0.lmol/L氯化鈉NaCI、0.05mol/L乙二胺四乙酸EDTA、2X十二烷基硫酸鈉SDS，劇烈振蕩后，在溫度65。C溫育10分鐘。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是所述的通過(guò)硅基質(zhì)Si02材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液過(guò)程包括在裂解液中加入220i！L無(wú)水乙醇，充分振蕩后，轉(zhuǎn)入一個(gè)具有吸附膜的吸附管內(nèi)(吸附管放入收集管中)，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500yL緩沖液C:0.3M醋酸鈉NaAc、300yL無(wú)水乙醇，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500yL漂洗液D:70%的乙醇溶液，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，如此重復(fù)1次，最后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，棄濾液；將吸附管轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200iiL的TE緩沖液10mM三羥甲基氨基甲烷Tris、lmM乙二胺四乙酸EDTA室溫放置2分鐘，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，濾液即為核酸溶液，再溫度-2(TC時(shí)保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是所述的通過(guò)硅基質(zhì)Si(^材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液過(guò)程包括在裂解液中加入220iiL無(wú)水乙醇，充分振蕩后，轉(zhuǎn)入一個(gè)具有吸附膜的吸附管內(nèi)(吸附管放入收集管中)，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500yL緩沖液C:0.3M醋酸鈉NaAc、300iiL無(wú)水乙醇，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，再向吸附管中加入500yL漂洗液D:70%的乙醇溶液，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄濾液，如此重復(fù)1次，最后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，棄濾液；將吸附管轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200iiL的TE緩沖液10mM三羥甲基氨基甲烷Tris、lmM乙二胺四乙酸EDTA室溫放置2分鐘，以12000rpm轉(zhuǎn)速離心2分鐘，濾液即為核酸溶液，再溫度-2(TC時(shí)保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是所述的65t:溫育10min后，溶液將由乳濁液變成液，如果未變成透明，說(shuō)明細(xì)菌沒(méi)有徹底裂解。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50iiL，用水做洗脫液時(shí)pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，核酸產(chǎn)物應(yīng)保存在溫度-20。C。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50iiL，用水做洗脫液時(shí)pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，核酸產(chǎn)物應(yīng)保存在溫度-20。C。全文摘要食源性致病菌核酸高效提取方法，PCR技術(shù)目前已被廣泛用于病原微生物的檢測(cè)。PCR檢測(cè)技術(shù)的第一步就是模板核酸的制備，即樣本中核酸的提取，這直接影響著PCR反應(yīng)的結(jié)果。長(zhǎng)期以來(lái)，樣本中核酸的提取和純化一直是耗時(shí)、繁瑣的過(guò)程，嚴(yán)重減慢了檢測(cè)速度。因此，許多學(xué)者一直在探索各種核酸的提取方法。本發(fā)明其組成包括將細(xì)菌培養(yǎng)液離心，向離心沉淀中加入緩沖液A，震蕩并加入溶菌酶，溫育后加入蛋白酶K，加入緩沖液B，劇烈振蕩后，在溫度65℃溫育10分鐘，制成裂解溶液，通過(guò)硅基質(zhì)SiO2材料的吸附膜收集高質(zhì)量的核酸提取核酸溶液。本發(fā)明應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)。文檔編號(hào)C12P19/34GK101748176SQ200810209630公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月8日優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日發(fā)明者李蘇龍申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心