專利名稱：一種從細菌中提取高分子量基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌基因組提取方法，通過該方法達到提取高分子、大片段基因組以滿足許多分子生物學分析的需要，屬于微生物的分子生物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于細菌生長速度快，結(jié)構(gòu)簡單，易于培養(yǎng)，種類繁多，分布廣等優(yōu)點，因此，許多重要生命活動的闡明，都是以細菌為研究對象而開展的，許多生產(chǎn)實踐都是以細菌作為載體而實現(xiàn)的，細菌作為一類極為重要而廣泛的微生物資源，在醫(yī)藥，化工，冶金，環(huán)保，資源等方面顯示了無可替代的功能和價值。目前，對細菌的研究越來越深入到了分子水平。如分子克隆，RFLP分析，文庫構(gòu)建，這些方法和技術(shù)的發(fā)展，都對DNA片段大小提出了更高的要求。一般來說，構(gòu)建基因組文庫，初始DNA長度必須在40kb以上，否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進行RFLP和PCR分析，DNA長度可短至25kb，在該長度以上，可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下)，并可保證包含PCR所擴增的片段(一般2kb以下)。
目前，實驗室提取細菌基因組DNA的方法主要有CTAB法、堿提取法。但這些方法往往只能適應(yīng)革蘭氏陽性或者革蘭氏陰性細菌，缺乏通用性，而且要使提取的基因組DNA片段達到40kb以上比較困難。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有細菌提取方法中存在的不足，本發(fā)明提供一種從細菌中提取高分子量基因組的方法。
一種從細菌中提取高分子量基因組的方法，包括破壁、抽提(去蛋白，多糖等)、沉淀、洗滌干燥、溶解，具體工藝過程如下破壁破解細胞壁與細胞膜是獲得基因組DNA的前提，由于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的細菌壁的差異性，因而采用了針對兩類細菌的不同破壁方法革蘭氏陽性菌采用溶菌酶+蛋白酶+SDS，革蘭氏陰性細菌采用蛋白酶+SDS。
革蘭氏陽性菌用400-500ul的TE緩沖液懸浮細菌，加入45-50ul、20mg/ml的溶菌酶和40-60ul、20％的SDS，37℃溫浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃溫浴1h。
革蘭氏陰性細菌用400-500ul的TE緩沖液懸浮細菌，加入40-60ul、20％的SDS，37℃溫浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃溫浴1h。
抽提對破壁后的細菌加入170-220ul的CTAB/NaCl溶液去多糖，采用等體積的氯仿/異戊醇，離心去除蛋白和多糖及其它復合物。
沉淀吸取上清至離心管中，向其中加入0.8-1.2倍體積的異丙醇，沉淀DNA。
洗滌干燥加入0.8-1.2倍體積的無水乙醇，混勻，充分涼干，以去除乙醇避免對后續(xù)操作的影響。
溶解加入30-50ul的無菌去離子水或TE溶解DNA。
所述TE緩沖液為1mol/L Tris·Cl，pH8.0，0.5mol/L EDTA，0.5mol/L檸檬酸，加水至1000ml；所述CTAB/NaCl溶液為4.1g NaCl溶解于80ml水，緩慢加入10g CTAB，加水至100ml；所述氯仿為異戊醇(24∶1)，異丙醇，70％乙醇，20％SDS，蛋白酶K(20mg/ml)，溶菌酶(20mg/ml)。
本發(fā)明從影響提取DNA片段大小的因素入手，分別為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，提取了較常規(guī)所提片段大的高分子DNA片段，提取的基因組DNA達到40kb以上，經(jīng)吸光度檢測，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，方法重復性好，操作簡單，完全能滿足上述分子操作。
本發(fā)明在Tris-HCl的緩沖系統(tǒng)中加入EDTA和檸檬酸雙重螯合二價金屬離子進而最大可能地抑制依賴于二價金屬離子的DNA酶的活性，對DNA起到保護，防止和抑制DNase對DNA的降解；本發(fā)明將槍頭剪成大口并避免用槍頭來回的吹打，在DNA處于溶解狀態(tài)時，盡量減弱溶液的渦旋，盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。


圖1A.為用常規(guī)CTAB法提取的氧化亞鐵硫桿菌(革蘭氏陰性)基因組DNA；B.為本方法所提的氧化亞鐵硫桿菌基因組DNA，Marker為λDNA cuttedby HindIII；圖2A.為用本方法提取的枯草桿菌(革蘭氏陽性)基因組DNA；B.為用常規(guī)CTAB法提取的枯草桿菌基因組DNA，Marker為λDNA cutted by HindIII。
具體實施例方式
實施例1收集濕重約1g的新鮮菌體，用TE懸浮，10000rpm離心2min；去上清，并向沉淀中加入480ulTE，懸浮細菌；向懸浮液中加入0.05ml溶菌酶，顛倒混勻，37℃溫浴1h。(適合革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌直接進入步驟4)；加入40ul的20％SDS和5ul蛋白酶K，顛倒混勻，37℃溫浴1h；加入CTAB/NaCl溶液200ul，柔和顛倒混勻，65℃溫浴10min；加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)柔和顛倒混勻，12000rpm離心5min；將上清液用剪成大口的槍頭小心吸取轉(zhuǎn)移到一新離心管中；加入等體積的異丙醇柔和顛倒混勻，用消毒牙簽挑出絮狀物轉(zhuǎn)移到一新離心管；用70％乙醇洗滌兩次，涼干；將附著有DNA的牙簽轉(zhuǎn)移到一新離心管中，加入50ul無菌水過夜溶解。溶解液即為所提的DNA。
權(quán)利要求
1.一種從革蘭氏陽性菌中提取高分子量基因組的方法，其特征在于包括破壁、抽提、沉淀、洗滌干燥、溶解，具體工藝過程如下破壁用400-500ul的TE緩沖液懸浮細菌，加入45-50ul、20mg/ml的溶菌酶和40-60ul、20％的SDS，37℃溫浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃溫浴1h；抽提對破壁后的細菌加入170-220ul的CTAB/NaCl溶液去多糖，采用等體積的氯仿/異戊醇，離心去除蛋白和多糖及其它復合物；沉淀吸取上清至離心管中，向其中加入0.8-1.2倍體積的異丙醇，沉淀DNA；洗滌干燥加入0.8-1.2倍體積的無水乙醇，混勻，充分涼干，；溶解加入30-50ul的無菌去離子水或TE溶解DNA；所述TE緩沖液為1mol/L Tris·Cl，pH8.0，0.5mol/L EDTA，0.5 mol/L檸檬酸，加水至1000ml；所述CTAB/NaCl溶液為4.1g NaCl溶解于80ml水，緩慢加入10g CTAB，加水至100ml；所述氯仿為∶異戊醇(24∶1)，異丙醇，70％乙醇，20％SDS，蛋白酶K(20mg/ml)，溶菌酶(20mg/ml)。
2.一種從革蘭氏陰性菌中提取高分子量基因組的方法，其特征在于包括破壁、抽提、沉淀、洗滌干燥、溶解，具體工藝過程如下破壁用400-500ul的TE緩沖液懸浮細菌，加入40-60ul、20％的SDS，37℃溫浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃溫浴1h；抽提對破壁后的細菌加入170-220ul的CTAB/NaCl溶液去多糖，采用等體積的氯仿/異戊醇，離心去除蛋白和多糖及其它復合物；沉淀吸取上清至離心管中，向其中加入0.8-1.2倍體積的異丙醇，沉淀DNA；洗滌干燥；加入0.8-1.2倍體積的無水乙醇，混勻，充分涼干，；溶解加入30-50ul的無菌去離子水或TE溶解DNA；所述TE緩沖液為1mol/L Tris·Cl，pH8.0，0.5mol/L EDTA，0.5 mol/L檸檬酸，加水至1000ml；所述CTAB/NaCl溶液為4.1g NaCl溶解于80ml水，緩慢加入10g CTAB，加水至100ml；所述氯仿為∶異戊醇(24∶1)，異丙醇，70％乙醇，20％ SDS，蛋白酶K(20mg/ml)，溶菌酶(20mg/ml)。
全文摘要
一種從細菌中提取高分子量基因組的方法，包括采用溶菌酶+蛋白酶+SDS或采用蛋白酶+SDS破壁、TE緩沖液抽提(去蛋白，多糖等)、經(jīng)沉淀、洗滌干燥、溶解。本發(fā)明從影響提取DNA片段大小的因素入手，提取了較常規(guī)所提片段大的高分子DNA片段，提取的基因組DNA達到40kb以上，經(jīng)吸光度檢測，OD260/OD280比值在1.8－2.0之間。方法重復性好，操作簡單，完全能滿足上述分子操作。
文檔編號C12N15/31GK1952150SQ200610032560
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者柳建設(shè), 夏樂先, 邱冠周, 高健, 閆穎, 曾嘉 申請人:中南大學