專利名稱：：基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽制備方法及用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物工程領域，具體涉及保健食品生產(chǎn)和生物制藥技術，特指高效酶解制備油菜籽蛋白水解肽的方法。
背景技術：
：來源于食品蛋白的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽由于可以平穩(wěn)降低高血壓患者血壓，且安全性高、毒副作用小，已成為近年來的研究熱點之一。已報道有以牛奶、乳酪、大豆、魚肉、蔬菜、小麥及大米蛋白等為原料，經(jīng)蛋白酶酶解產(chǎn)生了具有較好血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽。菜籽餅粕含有30~40%的優(yōu)質(zhì)蛋白，幾乎不存在限制性氨基酸，營養(yǎng)價值優(yōu)于任何其他植物蛋白，是一種理想的、潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，但原來一般僅作為生產(chǎn)飼料的原料，未作深加工開發(fā)利用，如果以其作為制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的原料，不僅可以開發(fā)一種天然降血壓產(chǎn)品，還可以延伸菜籽加工產(chǎn)業(yè)鏈，大幅提高經(jīng)濟效益。目前血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的生產(chǎn)主要是采用蛋白酶水解的方法。但是，常規(guī)酶解存在水解效率低、水解速度慢、水解度低、酶利用率低、生產(chǎn)成本較高等缺點。超聲波是一種縱波，在介質(zhì)中傳播時，會產(chǎn)生熱效應、機械效應和空化效應，引起介質(zhì)的一些特性變化。因為上述特性，超聲波技術對有效成分的提取、高分子的降解、酶解反應等都有較好的促進作用。其中超聲波酶促反應具有高效、廉價、無污染、操作簡單、技術易推廣應用等特點，可提高酶促反應速度和有效成分的產(chǎn)率。Atequad等研究發(fā)現(xiàn)，超聲空化對木瓜蛋白酶構(gòu)象、紫外光譜以及催化活性都有不同程度的影響。Sakaklbara等等觀察到，在3種不同的超聲強度下蔗糖酶水解蔗糖水解速度均高于對照；宿哲然等研究發(fā)現(xiàn)，40kHz、125W的超聲波能有效地促進蛋清蛋白的酶解，使其水解度提高13%~35.48%;郭詩靜等用超聲處理豬胰脂肪酶，表明酶分子能更好地結(jié)合底物，加快酶促反應；于淑娟等的研究結(jié)果表明，超聲波輔助酶解的靈芝多糖得率明顯多于常規(guī)方法；MasanaoImai等將超聲波預處理纖維素然后再酶解，酶解速度顯著提高。然而，利用超聲與酶解過程相結(jié)合的技術制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究僅有本研究課題組的報道。利用脈沖超聲輔助酶解法制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，可以提高蛋白水解效率、提高酶的利用率、降低生產(chǎn)成本。脈沖超聲輔助酶解法制備油菜籽蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究，國內(nèi)外未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是將脈沖超聲波技術應用于油菜籽蛋白酶解反應，制備具有抑制體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的油菜籽餅粕水解肽的方法及用途。本發(fā)明上述目的是通過以下技術手段實現(xiàn)的先對油菜籽餅粕進行粉碎、用脈沖超聲波進行處理溶解，其次用蛋白酶水解進行血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備，在水解過程前期施加脈沖超聲波，最后通過過濾、濃縮并再經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥得到粉狀的產(chǎn)品。對粉碎后的油菜籽餅粕以與水1:41:20的比例加入水中形成混懸液，采用功率為10mW/mL~100mW/mL、工作/間歇比0.5:1~5:1的脈沖超聲處理30~120min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽餅粕重量1%~15%的蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液進行酶解，酶解的溫度為40-55"C,pH5.0-9.5，在酶解開始后對酶解體系采用頻率為20kHz40kHz、功率為lmW/mL20mW/mL、工作/間歇比0.5:1~5:1的脈沖超聲處理2060min，停止超聲處理，繼續(xù)酶解，總共酶解時間2~5小時。酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到9(TC保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度為30%(w/w)，再噴霧干燥或冷凍干燥得到油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品。以產(chǎn)品的質(zhì)量占原料菜籽餅粕質(zhì)量的百分比來表示油菜籽蛋白水解肽的得率。同時測定油菜籽蛋白水解肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)生抑制作用的IC5()值(就是對ACE抑制率達到50%時的多肽水溶液的濃度，產(chǎn)物的ICso值越小表示其對ACE的抑制活性越高)來反映油菜籽蛋白水解肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的抑制活性。本發(fā)明所具有的優(yōu)點是本發(fā)明采用脈沖超聲波進行處理油菜籽餅粕后加酶水解，與經(jīng)過同樣酶解過程但不施加超聲的對照試驗相比，可以使酶解產(chǎn)物的肽得率提高30%到54%，1<:5()值降低34%~46%，大大提高了酶解效率和產(chǎn)物的活性。圖1是本發(fā)明制備油菜籽多肽方法的工藝流程圖。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。實施例l對粉碎后的油菜籽餅粕以與水1:20的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用頻率為20kHz功率為100mW/mL工作/間歇比1:1的脈沖超聲處理90min,使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽餅粕重量1%(w/w)的堿性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液進行酶解，酶解的溫度為40'C，pH為9.5，在酶解開始后對酶解體系采用頻率為20kHz、功率為10mW/mL、工作/間歇比0.5:1的脈沖超聲處理30min,停止超聲處理，繼續(xù)酶解，總共酶解時間3h;酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到卯'C保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度為30%(w/w)，再經(jīng)噴霧干燥得到油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品。測定多肽產(chǎn)品的得率(多肽產(chǎn)品與原料的重量比率)和對ACE抑制率與ICM)值，具體測定方法如下先將5^L的ACE加入lOpL多肽樣品在37"下恒溫5min，然后加入50pL的6.5mmol/LHip-His-Leu(用100mmol/L的硼酸鹽緩沖液配制，含300mmol/L的NaCl，pH為8.3)，在37。C下恒溫反應30min后加入85pL的lmol/LHC1溶液終止反應。用HPLC進行分析，記錄對應組分峰面積，同時用10pL100mmol/L、pH為8.3的硼酸鹽緩沖液作空白試驗。水解肽對ACE的抑制率可用下式計算i=^^xl00%式中i——多肽對ACE的抑制率；」——空白對照組Hip的峰面積；萬——多肽組Hip的峰面積。IC50測定方法是將要測定的水解肽分別稀釋成幾個梯度濃度的溶液，按照上述方法反應后分別測定溶液對ACE的抑制率，得出水解肽濃度與抑制率關系圖，根據(jù)圖確定50%抑制率所對應的這一水解肽樣品的濃度即為lC50。對照試驗以粉碎的相同的菜籽餅粕以與水1:20的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下不施加超聲提取5h，再按照上述相同酶解過程處理，但不施加超聲，酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到9(TC保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度為30%(w/w)，再經(jīng)噴霧干燥得到油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品，測定多肽產(chǎn)品的得率和對ACE抑制率與ICso值。經(jīng)過測定，無超聲處理過程的酶解產(chǎn)物多肽得率和IC5{)值分別為3.47%(w/w)和4.16mg/mL，有超聲處理過程的酶解產(chǎn)物多肽得率和IC5o值分別為5.34%(w/w)和2.75mg/mL，可見，在同等過程條件下采用超聲波的酶解產(chǎn)物肽得率提高54%，IC5Q降低34%。實施例2對粉碎后的油菜籽餅粕以與水1:6.67的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用頻率為22kHz功率為80mW/mL工作/間歇比5:1的脈沖超聲處理20min,使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽餅粕重量2%(w/w)的中性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液進行酶解，酶解的溫度為55'C，pH為5.5，在酶解開始后對酶解體系采用頻率為30kHz、20mW/mL、工作/間歇比1:1的脈沖超聲處理60min，停止超聲處理，繼續(xù)酶解，總共酶解時間5h;酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到9(TC保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度為30%(w/w)，再經(jīng)噴霧干燥得到油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品。對照試驗參見實施例1。經(jīng)過測定，酶解產(chǎn)物多肽得率和IC5o值分別為4.82%(w/w)和2.41mg/mL，與對照試驗相比，酶解產(chǎn)物肽得率提高39%，1<:5{)降低42%。實施例3對粉碎后的油菜籽餅粕以與水1:4的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用頻率為40kHz功率為10mW/mL工作/間歇比0.5:1的脈沖超聲處理120min,使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽餅粕重量5%(w/w)的木瓜蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液進行酶解，酶解的溫度為5(TC,pH為6.5，在酶解開始后對酶解體系采用頻率為28kHz、功率為5mW/mL、工作/間歇比2:1的脈沖超聲處理45min，停止超聲處理，繼續(xù)酶解，總共酶解時間4h;酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到9(TC保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度為30%(w/w)，再經(jīng)噴霧干燥得到油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品。對照試驗參見實施例l。經(jīng)過測定，酶解產(chǎn)物多肽得率和ICso值分別為4.51%(w/w)和2.62mg/mL，與對照試驗相比，酶解產(chǎn)物肽得率提高30%，ICso降低370/0。實施例4對粉碎后的油菜籽餅粕與水1:10的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用頻率為24kHz功率為60mW/mL工作/間歇比3:1的脈沖超聲處理40min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽餅粕重量1%(w/w)的堿性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液進行酶解，酶解的溫度為40'C，pH為9.0，在酶解開始后對酶解體系采用頻率為40kHz、lmW/mL、工作/間歇比3:1的脈沖超聲處理20min，停止超聲處理，再繼續(xù)酶解100min，調(diào)節(jié)pH值到6.0，同時調(diào)節(jié)酶解體系溫度到50°C，加入占原料油菜籽餅粕重量1%(w/w)的中性蛋白酶繼續(xù)酶解，總共酶解時間4h;酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到9(TC保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度為30%(w/w)，再經(jīng)噴霧干燥得到油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品。對照試驗參見實施例1。經(jīng)過測定，酶解產(chǎn)物多肽得率和ICso值分別為5.17%(w/w)和2.58mg/mL，與對照試驗相比，酶解產(chǎn)物肽得率提高49%，1(:5()降低38%。實施例5對粉碎后的油菜籽餅粕與水1:12.5的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用頻率為33kHz功率為90mW/mL工作/間歇比2:1的脈沖超聲處理80min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽餅粕重量2.5%(w/w)的中性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液進行酶解，酶解的溫度為5CTC,pH為6.5,在酶解開始后對酶解體系采用頻率為22kHz、功率為5mW/mL、工作/間歇比2:1的脈沖超聲處理50min，停止超聲處理，繼續(xù)酶解，總共酶解時間2.5h;酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到9(TC保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度為30%(Ww),再經(jīng)冷凍干燥得到油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品。對照試驗參見實施例l。經(jīng)過測定，酶解產(chǎn)物多肽得率和ICso值分別為4.89%(w/w)和2.70mg/mL，與對照試驗相比，酶解產(chǎn)物肽得率提高41%,ICso降低35。/()。實施例與對照試驗的效果對比見表1。表1實施例與對照試驗的產(chǎn)物多肽得率和對ACE抑制的ICso值比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1.基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的酶解制備方法，其特征在于按照下述步驟進行先將油菜籽餅粕粉碎加水溶解，然后脈沖超聲處理，再將所得油菜籽蛋白溶液加入蛋白酶酶解，對酶解體系施加脈沖超聲處理，酶解結(jié)束后，對酶解液加熱滅酶后經(jīng)過過濾、真空濃縮，最后再經(jīng)過干燥得到粉狀的油菜籽蛋白水解肽產(chǎn)品。2.根據(jù)權利要求1所述的基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的酶解制備方法,其特征在于將粉碎后的油菜籽餅粕與水以重量計1:41:20的比例加入水中形成混懸液，采用功率為10mW/mL100mW/mL、工作/間歇比0.5:1~5:1的脈沖超聲處理30~120min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液。3.根據(jù)權利要求1所述的基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的酶解制備方法，其特征在于將占油菜籽餅粕以重量計1°/。~5%的蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液進行酶解，在酶解開始后對酶解體系采用頻率為20kHz^40kHz、功率為lmW/mL~20mW/mL、工作/間歇比0.5:1~5:1的脈沖超聲處理2060min，停止超聲處理，繼續(xù)酶解，酶解時間共計2~5小時。4.根據(jù)權利要求1所述的基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的酶解制備方法，其特征在于所使用的蛋白酶為中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或數(shù)種相結(jié)合使用，酶解的溫度40-55°C，pH5.5-9.5。5.根據(jù)權利要求1所述的基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的酶解制備方法，其特征在于酶解結(jié)束后，將酶解液加熱到9(TC保持15秒鐘滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液并把濾液真空濃縮到干物質(zhì)濃度以重量計為30%。6.根據(jù)權利要求1所述的基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的酶解制備方法，其特征在于所述干燥為噴霧干燥或冷凍干燥。7.基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的用途，其特征在于用于制備抑制體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性的藥物。8.基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的用途，其特征在于用于制備抑制體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性的保健食品。全文摘要基于脈沖超聲波技術的油菜籽蛋白水解肽的酶解制備方法，其特征在于按照下述步驟進行先將油菜籽餅粕粉碎加水溶解，然后脈沖超聲處理，再將所得油菜籽蛋白溶液加入蛋白酶，對酶解體系施加脈沖超聲處理，最后經(jīng)過過濾、真空濃縮，再經(jīng)過冷凍干燥或者噴霧干燥得到粉狀的產(chǎn)品。該方法可以提高蛋白水解效率、提高酶的利用率、降低生產(chǎn)成本。利用該方法制得的油菜籽蛋白水解肽可以用于制備抑制體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的藥物或者保健食品。文檔編號A23L1/29GK101418329SQ200810235780公開日2009年4月29日申請日期2008年12月2日優(yōu)先權日2008年12月2日發(fā)明者何榮海,毛麗琴,王振斌,馬海樂,琳駱申請人:江蘇大學