專利名稱：：一種篩選解除葡萄糖代謝阻遏的丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種篩選解除葡萄糖代謝阻遏的丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法。
背景技術(shù)：
：世界范圍內(nèi)石油等化石燃料供應(yīng)的短缺，天然氣和其他原料價(jià)格的上揚(yáng)，以及對溫室氣體減排的要求，迫使人們轉(zhuǎn)向制備可再生能源，關(guān)注生物燃料的發(fā)展前景。丁醇就是備受關(guān)注的生物燃料之一。丁醇是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，全球年需求量超過140萬噸。丁醇又是一種極具潛力的新型生物燃料，其熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)；含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會腐蝕管道，便于管道輸送；蒸汽壓低、安全性高，且能與汽油以任意比混合。丁醇可由化學(xué)合成法和發(fā)酵法生產(chǎn)。化學(xué)合成法的主要路線包括兩條，一是以丙烯為原料，經(jīng)羰基合成法生成正、異丁醛，加氫后分餾得到正丁醇；二是以乙醛為原料，經(jīng)醇醛縮合成丁醇醛，脫水生成丁烯醛，再經(jīng)加氫后得到正丁醇。發(fā)酵法則是以糧食為原料，經(jīng)發(fā)酵獲得丙酮、丁醇和乙醇(三者質(zhì)量比3:6:1)，再經(jīng)精餾后分別制得丙酮、丁醇和乙醇。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇是僅次于乙醇發(fā)酵的全球第二大發(fā)酵工業(yè)。隨著石油價(jià)格的不斷上漲，丙酮丁醇發(fā)酵重新獲得人們的重視。發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇過程中所使用的菌種是成功生產(chǎn)丁醇的關(guān)鍵因素。研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)，丙酮丁醇梭菌將首先利用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖利用完畢后，再開始利用其他糖類如淀粉、乳糖和蔗糖等。正是這種"葡萄糖抑制效應(yīng)"的存在，使丙酮丁醇梭菌中的淀粉酶受到抑制，當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完以后，菌株才能利用淀粉酶來分解淀粉。目前，主要是以丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)為出發(fā)菌株，以淀粉為原料，利用發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇?，F(xiàn)已有多篇針對發(fā)酵工藝進(jìn)行改進(jìn)的專利，如果能對丁醇產(chǎn)生菌自身進(jìn)行改造，解除葡萄糖抑制效應(yīng)，使丁醇產(chǎn)生菌能更加有效地利用葡萄糖使之轉(zhuǎn)化為丁醇，則能夠進(jìn)一步提高丁醇的產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種篩選丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法。本發(fā)明所提供的篩選丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法，包括以下步驟1)將丁醇產(chǎn)生菌進(jìn)行化學(xué)誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株培養(yǎng)于含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基中，挑取降解淀粉的單菌落轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。上述方法還包括將所述丁醇產(chǎn)生菌突變株進(jìn)行淀粉降解能力的篩選得到突變株，將突變株轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟?？蓪⑸鲜龊Y選得到的丁醇產(chǎn)生菌突變株再進(jìn)行化學(xué)誘變，將經(jīng)過誘變的丁醇產(chǎn)生菌突變株培養(yǎng)于含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基中，挑取降解淀粉3的單菌落轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株的步驟。上述過程至少重復(fù)一次。當(dāng)然，上述丁醇產(chǎn)生菌突變株的篩選方法也可以只包括步驟1)和2)的過程。上述方法中，所述葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物具體可為2-脫氧葡萄糖。上述方法中，所述含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基的組成為2-脫氧葡萄糖2g/L、可溶性淀粉5g/L、硫酸鎂0.02g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.Olg/L、氯化鈉0.01g/L、乙酸銨2.2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、生物素2yg/L、維生素B工lmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L、瓊脂2g/L，其余為水；所述葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基的組成葡萄糖20-70g/L、硫酸鎂0.02g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、氯化鈉0.01g/L、乙酸銨2.2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、生物素2iig/L、維生素Bllmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L，其余為水。所述化學(xué)誘變所使用的誘變劑為硫酸二乙酯，所述硫酸二乙酯的終濃度為0.2-1%，具體可為1%，所述誘變時(shí)間為10-40min，具體可為15min。上述方f去中，所述丁醇產(chǎn)生菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)或糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)等，具體可為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287。采用上述篩選方法獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。丁醇產(chǎn)生菌突變株DG123,已于2008年12月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN22825。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備丁醇的方法。本發(fā)明所提供的制備丁醇的方法，是培養(yǎng)按照上述任一所述的方法得到的丁醇產(chǎn)生菌突變株，得到丁醇。上述方法中，所述培養(yǎng)丁醇產(chǎn)生菌突變株的培養(yǎng)基的組成為KH2P040.75g/L、K2HP043H200.75g/L、MgS047H200.4g/L、MnS04*H200.01g/L、FeS047H200.01g/L、NaCl1.Og/L、酵母粉5.Og/L、(NH4)2S042.Og/L、葡萄糖70g/L，其余為水；所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為36-38。C，靜置發(fā)酵72-96小時(shí)。本發(fā)明以丁醇產(chǎn)生菌-丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287為出發(fā)菌株，采用上述方法篩選得到解除葡萄糖代謝阻遏的丁醇產(chǎn)生菌突變株DG123CGMCCN22825，該突變株可以利用培養(yǎng)基中的淀粉，解除了葡萄糖代謝阻遏，培養(yǎng)該丙酮丁醇梭菌突變株DG123CGMCCN22825，發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量可達(dá)13.5g/L。本發(fā)明方法將現(xiàn)代常用于PCR技術(shù)的96孔板、酶標(biāo)儀及96孔深孔板應(yīng)用于菌種篩選中，使篩選過程簡化，有效的提高了篩選效率、縮短了篩選周期，使傳統(tǒng)的誘變選育工作中耗時(shí)費(fèi)力的篩選方法得到了明顯的改善。圖1為丙酮丁醇梭菌突變株的篩選流程圖4圖2為丙酮丁醇梭菌突變株的ELISA檢測結(jié)果具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1、丙酮丁醇梭菌突變株的獲得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2287。(中國專利，申請?zhí)?00810102673.2)。下述實(shí)施例中所涉及的培養(yǎng)基和試劑的組成如下RCM培養(yǎng)基的組成葡萄糖5.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、淀粉10.0g/L、氯化鈉5.Og/L、醋酸鈉3.Og/L，其余為水。pH6.8。115。C條件下滅菌20分鐘。含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基(P2-l培養(yǎng)基)的組成2_脫氧葡萄糖2g/L、可溶性淀粉5g/L、硫酸鎂0.02g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、氯化鈉0.01g/L、乙酸銨2.2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、生物素2yg/L、維生素B1lmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L、瓊脂2g/L，其余為水。p朋.9。115。C條件下滅菌20分鐘。葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基(P2-2培養(yǎng)基)的組成葡萄糖20_70g/L、硫酸鎂0.02g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、氯化鈉0.01g/L、乙酸銨2.2g/L、磷酸二氫鉀O.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、生物素2iig/L、維生素Bilmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L，其余為水。P朋.9。115。C條件下滅菌20分鐘。淀粉溶液的組成將10g可溶性淀粉溶于1L水中得到。碘液先將2.6g碘化鉀溶于水中，再加入1.3g碘，定容至lOOmL，得到碘液。pH7.0的磷酸鹽緩沖液將5.29gKH2P04和13.94gK2HP04溶于1L水中，pH7.0。生理鹽水0.75%質(zhì)量百分含量的氯化鈉溶液。丙酮丁醇梭菌突變株的篩選流程圖如圖1所示，具體的篩選方法如下1、誘變處理將丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287接種于RCM培養(yǎng)基中，37t:厭氧培養(yǎng)36h，此時(shí)菌體生長至對數(shù)生長中后期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液，再加入硫酸二乙酯(購于Sigma公司)，使硫酸二乙酯在混合液中的終濃度為lX，37tH秀變15min;加入質(zhì)量百分含量為25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液離心，菌體沉淀用RCM培養(yǎng)基洗滌兩次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養(yǎng)基中37t:厭氧培養(yǎng)2436h。2、挑選單菌落初篩取上述步驟1中經(jīng)誘變處理并用RCM培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)后的菌體涂布于P2-l培養(yǎng)基平板上，37t:厭氧培養(yǎng)，48h后可見單菌落。用已滅菌的牙簽將隨機(jī)挑取的有明顯淀粉降解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入裝有l(wèi)mLRCM培養(yǎng)基的96孔深孔板中，37t:厭氧培養(yǎng)。36h后，用排槍吸取0.lmL菌液轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為30g/L的lmLP2-2培養(yǎng)基中，96孔深孔板37"C厭氧培養(yǎng)72h;剩余的菌液于4t:保存用于復(fù)篩。3、丙酮丁醇梭菌突變株解除葡萄糖代謝阻遏情況的檢測將上述步驟2的96孔深孔板5000rpm/min離心10min，用排槍取上清液100yL至96孔板中，加入100iiL淀粉溶液，37t:反應(yīng)2h，再加入10yL碘液。當(dāng)溶液內(nèi)有淀粉沒有被淀粉酶分解時(shí)，加入碘液就會顯藍(lán)色；當(dāng)加入碘液后溶液為無色時(shí)，說明該株菌是已解除葡萄糖代謝阻遏的突變株。在檢測時(shí)也可借助酶標(biāo)儀來輔助讀值，將96孔板于550nm處檢測吸光度，吸光度值越小說明剩余的淀粉越少、淀粉酶活性越高，即是目的突變株。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。其中，96株突變株的篩選效果如圖2和表1所示。表l96株突變株的吸光度值測定結(jié)果12467891011123bcdfgh0.2800.2150.6352.9890.2083.3151.0830.2260.1361.7353.3062.9973.0581.6180.9510.3610.4573.1141.7510.2611.5090.9133.3062.1562.7992,6281.1762.8460.1872.7801.3190.3492,8650.1802.1212.5120.4960,6440.2022.9820,2410.3081.1402.0570.9091.1372,1421.9831.0421.8073.0980.3240.5470.4800.1770.7071.0432.9333.3462.3460.2670.7073.1460.7112.2450.2792.1280.9290.6951.8783.0960.3070.3170.7880.4432.3760.2720.2262,4080.8842.5231.1570.4700.3930.9710.8070.7490.1850.4350.3932,3250.3153.2282.4752.8263.1204、復(fù)篩從上述步驟2中4t:保存的菌液中吸取0.lmL經(jīng)步驟3檢測顏色較淺的孔中的突變株，接入裝有l(wèi)mLRCM培養(yǎng)基的96孔深孔板中，37。C厭氧培養(yǎng)36h，用排槍吸取0.lmL發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為40g/L的lmLP2-2培養(yǎng)基中，96孔深孔板37。C厭氧培養(yǎng)48h;按上述步驟3的檢測方法進(jìn)行檢測，挑選檢測結(jié)果顏色較淺的突變株接入葡萄糖終濃度為40g/L的5mLP2-2培養(yǎng)基中，接種量為0.5mL，37。C厭氧培養(yǎng)48h，結(jié)束發(fā)酵。采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量，具體的測定條件如下樣品前處理方法將發(fā)酵液12000rpm/min離心lmin，取上清液，用濾徑為0.22ym的濾膜過濾。色譜條件為Agilent1200液相色譜儀，示差檢測器；BioRadAminexHPX-87H有機(jī)酸柱(300*7.8mm)，柱溫15°C;上樣量10y1;流動相為0.05慮112504，流速0.5ml/min;丁醇標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司(目錄號4C006217);在如上色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為40.9分鐘。采用上述篩選方法，使用一塊96孔深孔板可同時(shí)檢測96株突變株的去葡萄糖分解代謝物阻遏情況。對500株菌采用上述方法進(jìn)行篩選，共獲得三株解除葡萄糖分解代謝物阻遏的突變株，分別命名為DGD4、DGH3和DGG3，將DGD4、DGH3和DGG3分別接入葡萄糖終濃度為20g/L、40g/L和50g/L的P2-2培養(yǎng)基中，37t:厭氧培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如表2所示。表2去葡萄糖代謝阻遏的丙酮丁醇突變株的丁醇產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2中，當(dāng)P2-2培養(yǎng)基中葡萄糖的終濃度為50g/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量基本沒有變化，說明這三株菌可利用的初始葡萄糖濃度為40g/L。實(shí)施例2、丙酮丁醇梭菌突變株的獲得選擇由實(shí)施例1誘變丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2287，(中國專利，申請?zhí)?00810102673.2))得到的突變株丙酮丁醇梭菌DGG3為出發(fā)菌株繼續(xù)進(jìn)行誘變篩選。實(shí)驗(yàn)中所涉及的培養(yǎng)基和試劑的組成同實(shí)施例1。1、誘變處理與實(shí)施例1步驟1不同的是，使用的硫酸二乙酯在混合液中的終濃度為1%，誘變時(shí)間為30min。2、挑選單菌落初篩與實(shí)施例1步驟2不同的是，轉(zhuǎn)接入P2-2培養(yǎng)基中，葡萄糖的終濃度為70g/L。3、丙酮丁醇梭菌突變株解除葡萄糖抑制的檢測同實(shí)施例1步驟3。4、復(fù)篩與實(shí)施例1步驟4不同的是，P2-2培養(yǎng)基中，葡萄糖的終濃度為70g/L。采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量，具體的測定條件同實(shí)施例1步驟4。對300株菌采用上述方法進(jìn)行篩選，結(jié)果共獲得2株解除葡萄糖代謝阻遏的突變株，分別命名為DG61和DG123，將DG61和DG123分別接入葡萄糖終濃度為70g/L的P2-2培養(yǎng)基中，37t:厭氧培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，突變株DG61丁醇的平均產(chǎn)量為9.5g/L，突變株DG123丁醇的平均產(chǎn)量為10.8g/L。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)DG123已于2008年12月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN22825。實(shí)施例3、利用丙酮丁醇梭菌DG123CGMCC漁2825發(fā)酵生產(chǎn)丁醇將上述實(shí)施例2獲得的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DG123CGMCC漁2825接種于RCM培養(yǎng)基中，37。C溫箱中靜置培養(yǎng)至對數(shù)期，作為發(fā)酵種子液。將上述獲得的發(fā)酵種子液按照5%的體積百分含量接種到裝有3LCGM培養(yǎng)基(CGM培養(yǎng)基的組成KH2P040.75g/L、K2HP043H200.75g/L、MgS047H200.4g/L、MnS04H200.01g/L、FeS047H200.01g/L、NaCl1.0g/L、酵母提取物5.Og/L、(NH4)2S042.Og/L、葡萄糖70g/L，其余為水。pH6.8)的7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為37t:，靜置發(fā)酵72小時(shí)。采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量，具體的測定條件同實(shí)施例l，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，發(fā)酵液中丁醇的平均產(chǎn)量達(dá)到13.5g/L。權(quán)利要求一種篩選丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法，包括以下步驟1)將丁醇產(chǎn)生菌進(jìn)行化學(xué)誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株培養(yǎng)于含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基中，挑取降解淀粉的單菌落轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述丁醇產(chǎn)生菌突變株進(jìn)行淀粉降解能力的篩選得到突變株，將突變株轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述丁醇產(chǎn)生菌突變株進(jìn)行化學(xué)誘變，將經(jīng)過誘變的丁醇產(chǎn)生菌突變株培養(yǎng)于含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基中，挑取降解淀粉的單菌落轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株的步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求3的過程至少重復(fù)一次。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基的組成為2-脫氧葡萄糖2g/L、可溶性淀粉5g/L、硫酸鎂0.02g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、氯化鈉0.01g/L、乙酸銨2.2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、生物素2iig/L、維生素Bllmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L、瓊脂2g/L，其余為水；所述葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基的組成葡萄糖20-70g/L、硫酸鎂0.02g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、氯化鈉0.01g/L、乙酸銨2.2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、生物素2iig/L、維生素Bllmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L，其余為水。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述化學(xué)誘變所使用的誘變劑為硫酸二乙酯，所述硫酸二乙酯的終濃度為0.2-1%，優(yōu)選為1%，所述誘變時(shí)間為10-40min，優(yōu)選為15min。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述丁醇產(chǎn)生菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)或糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)，優(yōu)選為丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287。8.—種制備丁醇的方法，是培養(yǎng)按照權(quán)利要求1-7中任一所述的方法得到的丁醇產(chǎn)生菌突變株，得到丁醇。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)丁醇產(chǎn)生菌突變株的培養(yǎng)基的組成為KH2P040.75g/L、K2HP043H200.75g/L、MgS047H200.4g/L、MnS04H200.01g/L、FeS047H200.01g/L、NaCl1.Og/L、酵母提取物5.Og/L、(NH4)2S042.Og/L、葡萄糖70g/L，其余為水；所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為36-3『C，靜置發(fā)酵72-96小時(shí)。10.丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DG123,其保藏號為CGMCCN22825。全文摘要本發(fā)明公開了一種篩選丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法。該方法包括以下步驟1)將丁醇產(chǎn)生菌進(jìn)行化學(xué)誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株培養(yǎng)于含有葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物和可溶性淀粉的固體梭菌培養(yǎng)基中，挑取降解淀粉的單菌落轉(zhuǎn)接入葡萄糖終濃度為20-70g/L的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。本發(fā)明以丁醇產(chǎn)生菌-丙酮丁醇梭菌SMB1CGMCCNo.2287為出發(fā)菌株，采用上述方法篩選得到解除葡萄糖代謝阻遏的丁醇產(chǎn)生菌突變株DG123CGMCCNo2825，該突變株可以利用培養(yǎng)基中的淀粉，解除了葡萄糖代謝阻遏，培養(yǎng)該丙酮丁醇梭菌突變株DG123CGMCCNo2825，發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量可達(dá)13.5g/L。文檔編號C12N15/01GK101768587SQ200810240858公開日2010年7月7日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者張?zhí)烊?張延平,李寅申請人:中國科學(xué)院微生物研究所