專利名稱：：一種雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：釀酒酵母(6^ccA3/YM^cescerew'w'seHansen)是傳統(tǒng)的酒精生產(chǎn)菌株，具備良好的工業(yè)生產(chǎn)性狀，耗糖快、乙醇耐受力高、對水解糖液中有毒物質(zhì)抗性強(qiáng)；其全序列已測定，遺傳操作技術(shù)也已經(jīng)成熟。營養(yǎng)缺陷型酵母菌株在基因工程和遺傳改造領(lǐng)域扮演著重要的角色，其中組氨酸營養(yǎng)缺陷是最為常用的營養(yǎng)缺陷型之一；此外，遺傳霉素(g418)抗性基因也是酵母常用的篩選標(biāo)記。一種用于甜高粱秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的雙倍體釀酒酵母TSH-Sc--001(保藏編號為CGMCCNO.1949)，具有非常好的發(fā)酵能力(見專利《一種基于甜高粱莖桿固體發(fā)酵制備乙醇的方法及系統(tǒng)》(申請?zhí)枮?00710080388.0)。為了對其保護(hù)和進(jìn)行進(jìn)一歩基因工程改造，需要為其添加遺傳和篩選標(biāo)記?，F(xiàn)有的對釀酒酵母進(jìn)行基因工程或遺傳改造的方法，都是以單倍體菌株作為初始菌株，但工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的酵母菌株絕大多數(shù)都是雙倍體或多倍體，如果將其單倍體化后再進(jìn)行改造會導(dǎo)致某些特性的改變。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母。該釀酒酵母保持原有釀酒酵母菌株的特性，易于識別。本發(fā)明的另一目的是提供上述雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法；該方法為雙倍體或多倍體酵母的基因工程改造提供了一種新途徑。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母，是指該釀酒酵母為雙倍體的含有組氨酸營養(yǎng)缺陷標(biāo)記和g418抗性標(biāo)記的釀酒酵母菌株。所述的雙倍體的組氨酸營養(yǎng)缺陷是指該雙倍體釀酒酵母菌株的兩條染色體的His3基因均發(fā)生了突變，喪失了合成組氨酸的能力，不能在基本培養(yǎng)基(MD)上生長；所述的含有雙倍體的g418抗性標(biāo)記是指該釀酒酵母的兩條染色體均含有g(shù)418抗性基因，能在含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固體培養(yǎng)基加20g/L的瓊脂)上生長。上述雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母是指雙倍體的含有組氨酸營養(yǎng)缺陷和g418抗性標(biāo)記的釀酒酵母菌株(Sacc力ar輝ces;'ae)TSH-Sc-001(His3-/。，該菌株于2008年11月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.273S。該菌株保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所。上述雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法，包括以雙倍體釀酒酵母菌株為出發(fā)菌株，用帶有目的基因的片段進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)化，通過發(fā)生兩次同源重組，得到2條染色體都發(fā)生了同源重組的雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株。上述方法中所述的目的基因片段是指目的基因兩端分別與His3左臂或His3右臂的DNA序列同源，目的基因片段的中間含有g(shù)418抗性基因和/或其他基因。上述雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法，包括下述步驟(1)根據(jù)5".ce2w/siaeHis3基因的序歹lj(Genebank,AccessionNo.NC001147)和pPIC9K質(zhì)粒(Invitrogen,Cat.No.V175-20)的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增含同源重組左臂和g418抗性基因(His3L-Kan)的引物，在5，端和3'端分別引入fcoRI(GMTTC)和5"a〗I(GTCGAC)識別序列，以pPIC9K質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得含同源重組左臂和g418抗性的片段His3L-Kan，純化；(2)用fcoRI和5^7I分別雙酶切His3L-Kan片段和pUC19載體，純化酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含His3同源重組左臂和g418抗性基因片段的重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan;(3)根據(jù)51.ce/wj'sj'aeHis3基因的序列資料(Genebank,AccessionNo.NC001147)設(shè)計(jì)擴(kuò)增含同源重組右臂(His3R)的引物，在5'端和3'端分別引入SaJI(GTCGAC)和尸WI(CTGCAG)識別位點(diǎn)，以5".cerew'sj'ae基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得His3同源重組右臂片段His3R，純化；(4)用I和尸WI分別雙酶切His3R和質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan，純化酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R;(5)用fcoRI和尸WI雙酶切重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R，回收純化1135bp的含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的片段His3L-Kan-His3R;(6)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化雙倍體釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定在含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的陽性單克隆菌株，得一條染色體發(fā)生了同源重組，一條染色體未發(fā)生同源重組，簡寫為(His3();(7)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化(His3v—)感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR鑒定，即得本發(fā)明在含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的兩條染色體都發(fā)生了同源重組的釀酒酵母菌株(His3+)。下面以雙倍體釀酒酵母(Scerew'sise)TSH-Sc-001為例，具體說明雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法。上述雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法，包括下述步驟(l)以pPIC9K質(zhì)粒DNA為模板，以His3L-lF-Kan和Kan-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得SEQIDNo.9所示的具有Kan抗性基因和His3基因編碼區(qū)5，端40bp的DNA序列，并在3，端加上5^I識別位點(diǎn)的DNA序列His3L，-Kan;所述的引物His3L-1F-Kan為SEQIDNo.1所示的DNA序列，所述的引物Kan-R為SEQIDNo.3所示的DNA序列；(2)以純化后的PCR產(chǎn)物His3L，-Kan為模板，以His3L-2F和Kan-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得如SEQIDNo.10所示的DNA序列His3L-Kan;純化；所述的引物His3L-2F為SEQIDNo.2所示的DNA序列;(3)用AcoRI和I分別雙酶切His3L-Kan片段和pUC19載體，純化酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含同源重組左臂和g418抗性基因的重組質(zhì)粒pUCl9-His3L-Kan;(4)以6;cerew'w'ae基因組DNA為模板，以His3R-F和His3R-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得如SEQIDNo.11所示的His3同源重組右臂DNA片段His3R，純化；所述的引物His3R-F為SEQIDNo.4所示的DNA序列，所述的引物His3R-R為SEQIDNo.5所示的DNA序列；(5)用I和尸WI分別雙酶切His3R片段和質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan，純化，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R;(6)用fcoRI和尸WI雙酶切重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R，回收純化，得如SEQIDNo.12所示的含His3同源重組左臂、g418抗性基因和His3同源重組右臂的片段His3L-Kan-His3R—;(7)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化雙倍體釀酒酵母(51cerew'w'ae)TSH-Sc-001(保藏編號為CGMCCNO.1949)感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR鑒定，得到在含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的陽性單克隆菌株，一條染色體發(fā)生了同源重組，一條染色體未發(fā)生同源重組的釀酒酵母菌株，簡寫為TSH-Sc-001(His3+/—);所述的鑒定引物His3L為SEQIDNo.6所示的DNA序列，所述的鑒定引物Kan-ID為SEQIDNo.7所示的DNA序列，所述的鑒定引物His--ID為SEQIDNo.8所示的DNA序列；(8)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化TSH-Sc-001(His3+/—)感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，得到在含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的陽性單克隆菌株兩條染色體都發(fā)生了同源重組釀酒酵母菌株(5.cerew'w'ae)TSH--Sc-001(His3-/-)(保藏編號為:CGMCCNO.2738);所述的鑒定引物His3L為SEQIDNo.6所示的DNA序列，所述的鑒定引物Kan-ID為SEQIDNo.7所示的DNA序列，所述的鑒定引物His-ID為SEQIDNo.8所示的DNA序列。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明所得釀酒酵母具有組氨酸營養(yǎng)缺陷和g418抗性標(biāo)記，易于識別和保護(hù)；(2)本發(fā)明構(gòu)建方法為雙倍體或多倍體酵母的基因工程改造提供了一種新的途徑和方法；(3)本發(fā)明構(gòu)建方法簡單、高效，而且保持酵母的原有特性不變。圖1為His3L-Kan-His3R片段構(gòu)建過程的流程圖。圖2為pUC19-His3L-Kan質(zhì)粒I和I雙酶切鑒定電泳圖譜，其中M1:DL15000;M2:DL2000;1:pUC19-His3L-Kan。圖3為pUC19--His3L-Kan-His3R質(zhì)粒5boRI和尸WI雙酶切鑒定電泳圖譜，其中1:pUC19-His3L-Kan-His3R;Ml:DL2000;M2:DL15000。圖4為His3L-Kan-His3R片段電泳圖譜，其中1:His3L-Kan-His3R;Ml:DL15000;M2:DL2000。圖5為重組菌株用引物His3-F、His-ID、Kan-ID進(jìn)行鑒定的PCR示意圖。圖6為TSH-Sc-001、TSH-Sc-001(His3+/—)和TSH-Sc-OOl(His3-/-)PCR鑒定電泳圖譜，其中1:His3-F+His-ID空白對照；2:His3-F+Kan-ID空白對照；3:TSH-Sc-001的DNA為模板，His3-F和His-ID為引物；4:TSH-Sc-001的DNA為模板，His3-F和Kan-ID為引物；5:TSH-Sc-001(His3+"的DNA為模板，His3-F和His-ID為引物；6:TSH-Sc-001(His3+/—)的DNA為模板，His3_F和Kan-ID為引物;7:TSH-Sc-001(His3—7—)的DNA為模板，His3-F和His-ID為引物；8:TSH-Sc-001(His3—7—)的DNA為模板，His3-F和Kan-ID為引物；M:DL2000。圖7為質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實(shí)施例l同源重組片段His3L-Kan-His3R的構(gòu)建1.1構(gòu)建含同源重組左臂和g418抗性基因的pUC19-His3L-Kan質(zhì)粒1.1.1擴(kuò)增含同源重組左臂和g418抗性的His3L-Kan片段(926bp)根據(jù)Genebank中己報(bào)道的51cerew'w'aeHis3基因的序列資料(AccessionNo.NC001147)和pPIC9K質(zhì)粒(Invitrogen，Cat.No.V175-20)的序列資料，利用PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)PCR引物。上游引物His3L-IF-Kan5，-(3，(SEQIDNo.1)上游引物His3L-2F5，GATTGCGATCTCTTTAAAG-3，(SEQIDNo.2)下游引物Kan-R5'-ACGCGTCGACTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3，(SEQIDNo.3)1)以pPIC9K質(zhì)粒為模板，以His3L-IF-Kan和Kan-R為引物擴(kuò)增Kan抗性基因，同時(shí)引入His3基因編碼區(qū)5，端40bp的序列，并在3，端加上&JI識另'J位點(diǎn)。用PyrobestDNAPolymerase(Takara，Cat.No.D訓(xùn)5A)，反應(yīng)體系為10XPyrobestBufferII5.00—1dNTP混合物(每種dNTP2.5mM)4.OOWHis3L-IF-KanorHis3L-2F(20幽)1.0014Kan-R(20剛)1.0014PyrobestDNA聚合酶(5U/pl)0.pPIC9K質(zhì)粒DNA0.ddH2038.總體積50.PCR反應(yīng)條件94。C5min;94。C30s，60。C30s，72。Clmin，循環(huán)30次；72。C10min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將所得片段大小為S66bp的PCR產(chǎn)物His3L，-Kan(SEQIDNo.9)用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，Cat.No.DP209-02)進(jìn)行純化，操作步驟和方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。2)以His3L，-Kan為模板，以His3L-2F和Kan-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)引入His3基因編碼區(qū)5'端93bp的序列，并在5'端加上AcoRI識別位點(diǎn)，3，端加上6^I識別位點(diǎn)。用PyrobestDNAPolymerase(Takara，Cat.No.DR005A)，PCR反應(yīng)體系、條件和PCR產(chǎn)物純化方法與l)所述的PCR相同。回收、純化片段大小為926bp的PCR產(chǎn)物，得含同源重組左臂和g418抗性的His3L-Kan片段(SEQIDNo.10)。1.1.2構(gòu)建含同源重組左臂和g418抗性基因的pUC19-His3L-Kan質(zhì)粒(3568bp)pUC19(Takara，Cat.No.D3219)質(zhì)粒經(jīng)KcoBDH5a(TIANGEN，Cat.No.CB101-02)擴(kuò)增后，用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN，Cat.No.DP103-02)進(jìn)行提取，操作歩驟和方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。將PUC19質(zhì)粒和上述所得PCR產(chǎn)物His3L-Kan分別用fc。RI(Takara，Cat.No.D1040A)和WI(Takara，Cat.No.D1080A)進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下AB10XHbuffer5.On110XHbuffer5.Ou15boRI2.On1Ac。RI2.On1&7I2.On1WI2.Oix1pUC1920.0"1EcoRI-His3L-Kan-SalI20.Oti1d孤O21.Oti1ddKO21.0ti1總體積50.Op1總體積50.On1將上述體系混勻，瞬時(shí)離心，37X:酶切過夜。酶切產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，Cat.No.DP209-02)進(jìn)行純化，操作歩驟和方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。將純化的酶切片段(Ec0RI-PUC19-Sail和EcoK丄-His3L-Kan-Sail)用T4DNA連接酶(Takara，Cat.No.D2011A)進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系如下10XT4DNAligasebuffer2.0u1EcoRI-pUC19-Sail2.0u1EcoRI-His3L-Kan-Sail10.On1T4DNAligase1.Oii1ddH205.On1總體積20.On1將上述體系混勻，瞬時(shí)離心，16r連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化^coh'DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN,Cat.No.CB101-02)，方法步驟如下取出于-7CTC凍存的fco7iDH5a感受態(tài)細(xì)胞，放于手心使之速融，然后再置于冰上；分別取50wl至滅菌后的印pendorf管中，再加入5ul連接產(chǎn)物，輕輕混勻，置冰浴30min;42。C熱休克90s，不要搖動試管，迅速放入冰浴2min;每管加入950u137t:預(yù)熱的LB培養(yǎng)液，于37°C200rpm培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素標(biāo)記基因。3500rpm離心5min，倒掉900ul上清，將剩余的100u1液體和細(xì)胞沉淀混勻，均勻地涂布于含有氨芐青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB平板培養(yǎng)基上，37。C倒置培養(yǎng)過夜。:挑取抗性平板上的單克隆菌落，接種于5ml含有氨芐青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200卬m培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN,Cat.No.DP103-02)提取質(zhì)粒，用I(Takara，Cat.No.Dl(MOA)和WI(Takara，Cat.No.D1080A)雙酶切進(jìn)行鑒定(圖2)，酶切體系如下10XHbuffer2.Op1fc。RI1.On1WI1.0u丄pUQ9-His3L-Kan10.OnlddH206.0ii1總體積20.On1pUC19-His3L-Kan質(zhì)粒用&'oRI和I雙酶切得到兩個(gè)大小分別為915bp和2653bp的片段，將鑒定正確的克隆轉(zhuǎn)接于含有氨芐青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。1.2含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的pUC19-His3L-Kan-His3R質(zhì)粒的構(gòu)建1.2.1擴(kuò)增同源重組右臂His3R片段(228bp)根據(jù)Genebank中已報(bào)道的Scere7iw'seHis3基因的序列資料(AccessionNo.NC001147),利用PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)PCR引物。上游引物His3R-F5'-ACGCGTCGACGTAGGAGATCTCTCTTGCGAGATG-3，(SEQIDNo.4)下游引物His3R-R5，-AACTGCAGCTACATAAGAACACCTTTGGTGGAG--3'(SEQIDN。.5)擴(kuò)增的目的片段為His3R(228bp)(SEQIDNo.11)，用酵母基因組DNA提取試劑盒(TI認(rèn)GEN，Cat.No.DP307-02)提取5:ceiwisise(CGMCCNO.1949)基因組DNA，作為擴(kuò)增His3R片段的模板，以His3R-F和His3R-R為引物擴(kuò)增His3編碼區(qū)3'端210bp的序列，并在5'端加上&7I識別位點(diǎn)，3，端加上ft^I識別位點(diǎn)。用Pyrobest腿Polymerase(Takara，Cat.No.DR005A)，反應(yīng)體系為10XPyr。bestBufferII5.00pldNTPmix(2.5mMeach)4.00HlHis3R-F(20141)1.His3R-R(20幽)1.PyrobestDNAPolymerase(5U/V1)0.25m!Xcerew^iae(CGMCCNO.1949)基因組DNA0.dd貼38.25^1總體積50.OOWPCR反應(yīng)條件94。C5min;94。C30s，60。C30s，72。C30s，循環(huán)30次；72。C10min。PCR結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將檢測結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒(TIANGEN，Cat.No.DP209-02)進(jìn)行純化，操作步驟和方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。1.2.2含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的pUC19-His3L-Kan-ms3R質(zhì)粒(3778bp)的構(gòu)建1.1構(gòu)建得到的pUC19-His3L-Kan質(zhì)粒和1.2.1得到的PCR產(chǎn)物His3R用5"s/I(Takara，Cat.No.D1080A)禾tl尸stI(Takara，Cat.No.D1073A)雙酶切，酶切體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>連接反應(yīng)條件、轉(zhuǎn)化fc^iDH5a感受態(tài)細(xì)胞的方法同1.1.2。挑取抗性平板上的單克隆菌落，接種于5ml含有氨節(jié)青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN，Cat.No.DP103-02)提取質(zhì)粒，得pUC19-His3L-Kan-His3R質(zhì)粒(見圖7)，用fc。RI(Takara，CatalogNo.D104。A)和MI(Takara，CatalogNo.D1073A)雙酶切進(jìn)行鑒定(見圖3)，酶切體系如下10XHbuffer2.0y1bRI1.0ti1尸WI1,0ti1pUC19-His3L-Kan-His3R10.0u1ddHz0__________6.0y1總體積20.0y]pUC19-His3L-Kan-His3R質(zhì)粒用fcoRI和AtI雙酶切得到兩個(gè)大小分別為1135bp和2643bp的片段。將鑒定正確的克隆轉(zhuǎn)接于含有氨芐青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。1.3含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的His3L-Kan-His3R打靶片段的獲得pUC19-His3L-Kan-His3R質(zhì)粒用A，coRI(Takara，Cat.No.D1040A)和尸MI(Takara，Cat.No.D1073A)雙酶切，酶切體系如下10XHbuffer5.0u1fc。RI2.0u1尸s力12.0u1pUC19-His3L-Kan-His3R20.0卩1ddH2021.0nl總體積50.Op1酶切反應(yīng)條件和酶切產(chǎn)物純化方法同1.1.2，回收U35bp的含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的His3L-Kan-His3R片段(SEQIDNo.12)(見圖4)。實(shí)施例2單染色體交換釀酒酵母菌株的獲得用實(shí)施例1中1.3得到的U35bp的His3卜Kan--His3R片段，通過電穿孔方法轉(zhuǎn)化5".cerew'siseTSH-Sc-001(CGMCCN0.1949)感受態(tài)細(xì)胞。所用的電穿孔儀是GenePulserXcellElectroporationSystem(Bio-Rad公司)，5".carew'w'se感受態(tài)細(xì)胞的制備方法參照該儀器說明書。對于每個(gè)電轉(zhuǎn)的樣品，準(zhǔn)備一支含lml1M山梨醇的YPD液體培養(yǎng)基的小試管并置于冰上冷卻，同時(shí)準(zhǔn)備2mm的電轉(zhuǎn)杯并置于冰上冷卻。將待轉(zhuǎn)化的His3L-Kan-His3R片段(100ng/5iil)于冰上冷卻，加入40iil的感受態(tài)細(xì)胞到DNA樣品中，輕輕地混勻，丁冰上冰浴約5min。準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)儀，按預(yù)設(shè)的程序進(jìn)行釀酒酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化的參數(shù)為C二25uF;PC=200ohm;V-1.5kV;2咖cuvettes。將DNA-感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入到冰冷的2mm電轉(zhuǎn)杯底部，蓋上蓋子，按鍵進(jìn)行電擊；取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入lml冰冷的含lM山梨醇的YPD液體培養(yǎng)基到電轉(zhuǎn)杯中，然后倒回小試管中。檢查電轉(zhuǎn)記錄，電擊的時(shí)間應(yīng)該為5ms左右，將電轉(zhuǎn)化后的Scerew、ise預(yù)培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)候涂布于含1M山梨醇及0.25g/Lg418的YPD平板培養(yǎng)基上，30。C倒置培養(yǎng)3d。挑取g418抗性平板上的單克隆菌落，接種于5ml含g418(0.25g/L)的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C200rpm培養(yǎng)過夜；用酵母基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,Cat.No.DP307-02)進(jìn)行5".ce化ws/se基因組DNA的提取，操作步驟和方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。以初始或重組的51cere7iw'se基因組DNA為模板，通過下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，判定是否發(fā)生了同源重組。上游引物His3-F來源于His3基因上游啟動子區(qū)的-段序列；下游引物His-ID來源于His3基因區(qū)(為一段反向互補(bǔ)序列)；下游引物Karr-ID來源于Kan基因區(qū)(為一段反向互補(bǔ)序列)。因此，引物His3-F和His-ID的擴(kuò)增產(chǎn)物代表未發(fā)生同源重組(SEQIDNo.13);引物His3-F和Kan-ID的擴(kuò)增產(chǎn)物則代表已發(fā)生同源重組(SEQIDNo.14)。引物以基因組DNA為模板的PCR示意圖(見圖5)。上游引物His3-F:5，-TGCACGGTCCTGTTCCCTAGCATG-3，(SEQIDNo.6)下游引物Kan-ID:5'-AGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTC-3，(SEQIDNo,7)下游引物His-ID:5，-GGAATGCTTGGCCAGAGCATGTATC-3，(SEQIDNo.8)初始菌株TSH-Sc-001分別用這兩對引物擴(kuò)增，僅引物His3-F和His-ID能得到681bp的PCR產(chǎn)物。'條染色體發(fā)生了重組、另一條染色體未發(fā)生重組的菌株分別用這兩對引物擴(kuò)增，能得到582bp和681bp的PCR產(chǎn)物。兩條染色體均發(fā)生了重組的菌株分別用這兩對引物擴(kuò)增，僅引物His3-F和Kan-ID能得到582bp的PCR產(chǎn)物。用rTaqDNAPolymerase(Takara，Cat.No.DR100AM)，反應(yīng)體系為:10XPCRBuffer5.dNTPmix(2.5mMeach)4.0)^1MgCl2(25mM)3.(MHis3-F(20141)1.0)^1Kan-IDorHis-ID(20MM)1.0^1TaqDNAPolymerase(5U/V1)0.5Pl■5.ceiwisisegenomeDNA0.5Mld弧O35.(M總體積50.PCR反應(yīng)條件94。C5min;94。C30s，60。C30s，72。Clmin，循環(huán)30次；72。C10min。PCR結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物片段大小，結(jié)果(見圖6)顯示經(jīng)過7欠電轉(zhuǎn)化得到的能在含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的單克隆菌落，用引物His3-F和Kan-ID擴(kuò)增能得到582bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.14)，用引物His3-F和His-ID擴(kuò)增能得到681bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.13)，證明只有一條染色體發(fā)生了同源重組，另一條染色休未發(fā)生同源重組，重組菌株簡寫為TSH—Sc—001(His3+/，。實(shí)施例3雙染色體交換釀酒酵母菌株的獲得用實(shí)施例2得到的TSH-Sc-001(His3+/—)菌株制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例2。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含1M山梨醇及0.5g/Lg418的YPD平板培養(yǎng)基上，30。C倒置培養(yǎng)3d。單克隆菌落的培養(yǎng)方法、基因組DNA提取方法和PCR鑒定方法同實(shí)施例2。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(見圖6)，經(jīng)過兩次電轉(zhuǎn)化得到的能在含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的單克隆菌落，僅引物His3-F和Kan-ID能擴(kuò)增得到582bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.14)，引物His3-F和His-ID未能擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，證明兩條染色體都發(fā)生了同源重組，獲得了本發(fā)明的釀酒酵母(XcereWs畫/se)TSH-Sc—001(His3-/-)(CGMCCNO.2738)。實(shí)施例4重組釀酒酵母菌株表型及活性鑒定將TSH-Sc-001、實(shí)施例2所得TSH-Sc-001(His3v—)和實(shí)施例3所得TSH-Sc—001(His3-7-)分別接種到Y(jié)PD、YPD-0.25g418(含0.25g/L的g418)、YPD-0.5g418(含0.5g/L的g418)和MD(培養(yǎng)基組成為無氨基酸酵母氮源YNB13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4mg/L，瓊脂20g/L)平板培養(yǎng)基上，30。C倒置培養(yǎng)48h。結(jié)果在YPD平板培養(yǎng)基上3個(gè)菌株均能生長；在YPD-0.25g418平板培養(yǎng)基上TSH-Sc-001不能生長，TSH-Sc-001(His3+/—)和TSH-Sc-001(His3—A)能生長。在YPD-0.5g418甲板培養(yǎng)基上TSH-Sc-001和TSH-Sc-001(His3+/—)不能生長，TSH-Sc-001(His3—/_)能生長。在MD平板培養(yǎng)基上TSH-Sc-OOl和TSH-Sc-001(His3+/—)能生長，TSH-Sc-001(His3-/-)不能生長。上述結(jié)果說明TSH-Sc-001(His3+/—)只有一條染色體發(fā)生了重組，因此只能耐受低濃度(0.25g/L)的g418，同時(shí)由于未發(fā)生重組的一條染色體有完整的His3基因，故能在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基上生長；SH-Sc-001(His3-/-)兩條染色體均發(fā)生了重組，因此能耐受高濃度(0.5g/L)的g418，同時(shí)由于兩條染色體的His3基因均被破壞，不能合成組氨酸，故不能在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基上生長。同時(shí)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明，TSH-Sc-OOl、TSH-Sc-OOl(His3+0和TSH-Sc-001(His3-/-)在發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力方面沒有差別。本發(fā)明在不改變初始菌株其它特征的前提下，為其添加了組氨酸營養(yǎng)缺陷標(biāo)記和g418抗性標(biāo)記，得到目的菌株Xcerew'w'aeScOOlTSH-Sc-001(His3-/-)(CGMCCNO.2738)。該菌株含有的這些標(biāo)記既可以作為菌株本身的一個(gè)特征，同時(shí)為對該菌株進(jìn)行深入的遺傳和基因工程改造提供了基礎(chǔ)和可用的篩選標(biāo)記。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>〈210〉6〈211〉24〈212〉靈〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉鑒定引物〈400〉6tgcacggtcctgttccctagcatg24〈210〉7〈211〉25〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉鑒定引物<■〉7agacgtttcccgttgaatatggctc25〈210〉8〈211〉25〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉鑒定引物〈400〉8ggaatgcttggccagagcatgtatc〈210〉9〈211〉866〈212〉DNA<213>ArtificialSequence〈220〉〈223〉His3L，-KanDNA序列〈400〉9gattgcgatctctttaaagggtggtcccctagcgatagagatgagccatattcaacggga60ascgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataa120atgggctcgcgataatg'tcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcc180cgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacaga240tgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattt300tatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaa^cagcatt360ccaggtattagsiSLgaatatcctgattcaggtgaaa^tattgttgatgcgctggcagtgtt420cctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatt■tcgtctcgctcaggcgcaatcacg^tgaataacggtttggttgatgcgagtgattttga540tgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgcc600attctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttga660cgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgatacca720ggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggct780tatggtattgataatcctgatatg肪taaattgcagtttcatttgatgct840cgatgagtttttctaagtcgacgcgt866〈210〉10〈211〉926〈212〉薩〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉His3L-KanDNA序列〈400〉10ggaattcatgacagagcagaaagccctagtaaagcgtattacaaatgaaaccaagattca60gattgcgatctctttaaagggtggtcccctagcgatagagatgagccatattcaacggga120aacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataa180atgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcc240cgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacaga300tgagatggtc鄰actaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattt360tatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcatt420ccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgtt480cctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatt540tcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgaGOOtgacgagcgtaatggctggcctgttgaaca—agtctggaaagaaatgcataagcttttgcc660attctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttga"720cgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgatacca了80ggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggct84.0ttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgct900cgatgagtttttctaagtcgacgcgt926〈210〉11〈211〉228〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉His3RDNA序列〈400〉11acgcgtcgacgtaggagatctctcttgcgagatgatcccgcattttcttgaaagctttgc60agaggctagcagaattaccctccacgttgattgtctgcgaggcaagaatgatcatcaccg120tagtgagagtgcgttcaaggctcttgcggttgccataagagaagccacctcgcccaatgg180taccaacgatgttccctccaccaaaggtgttcttatgtagctgcagtt228〈210〉12〈211〉1135〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉His3L-Kan-His3RDNA序列〈400〉12aattcatgacagagcaga腺gccctagtaaagcgtattacaaatgaaaccaagattcaga60ttgcgatctctttaaagggtggtcccctagcgatagagatgagccatattcaacgggaaa120cgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaat180gggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccg240atgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatg300agatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcatttta360tccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattcc420aggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcc480tgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttc540gtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatg600acgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccat660tctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacg720aggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccagg780atcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggcttt840ttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcg900atgagtttttctaagtcgacgtaggagatctctcttgcgagatgatcccgcattttcttg960aaagctttgcagaggctagcagaattaccctccacgttgattgtctgcgaggcaagaatg1020atcatcaccgtagtgagagtgcgttcaaggctcttgcggttgccataagagaagccacct1080cgcccaatggtaccaacgatgttccctccaccaaaggtgttcttatgtagctgca1135〈210〉13〈211〉681〈212〉薩〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉引物His3--F和His-ID擴(kuò)增的目的產(chǎn)物DNA序列〈400〉13tgCSLCggtCCtgttccctagcatgtacgtggtcttcattcaacgtttcccattgttttttatcgaaagatgacgactttttcttaattctcactgccaggtatcgtttgaacacggcattcgcaattttctttttctattactcttggccctcggt肪tgattttcatttttttttttcccgattggcattgaattatacaa_a^tga_gcaggcaagataactagtaaagcgtattacaaatgeia^ccaagcccctagcgatagagcwtcgatcttcccagccacacaatcgcaagtgattaacgtccaccatgctctggccaagcattccagcgtatttccttttaaaccacgacgcttt60tctactattgctttgctgtgggaaaaactt120cgttttaagagcttggtgagcgctaggagt180agtcagggaagtcataacacagtcctttcc240tcctctagtacactctatatttttttatgc300acctagcggatgactctttttttttcttag360attatataaagtaatgtgatttcttcgaag420acgaaggcaaagatgacagagcagaaagcc480attcagattgcgatctctttaaagggtggt540gaaaaagaggcagaagcagtagcagaacag600acaggtatagggtttctggaccatatgata660681〈210〉14〈211〉582〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialSequence〈220〉〈223〉引物His3-F和Kan-ID擴(kuò)增的目的產(chǎn)物〈400〉14tgcacggtcctgttccctagcatgtacgtgagcgtatttccttttaaaccacgacgcttt60gtcttcattcaacgtttcccattgtttttttctactattgctttgctgtggg3犯a^ctt120atcgaaagatgacgactttttcttaattctcgttttaagagcttggtgagcgctaggagt180cactgccaggtatcgtttgaacacggcattagtcagggaagtcataacacagtcctttcc240cgcaattttctttttctattactcttggcctcctctagtacactctatatttttttatgc300ctcggtaatgattttcatttttttttttccacctagcggatgactctttttttttcttag360cgattggcattgaattatacgtaatgtgatttcttcgaag420aatatactaa肪aatgagcEiggcaagataaacgaaggcaaagatgacagagcaga幼gcc480ctagtaaagctgaaaccaagattcagattgcgatctctttaaagggtggt540cccctagcgatagagatgagccatattcaacgggaaacgtct58權(quán)利要求1、一種雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母，其特征在于所述的釀酒酵母為雙倍體的含有組氨酸營養(yǎng)缺陷標(biāo)記和g418抗性標(biāo)記的釀酒酵母菌株。2、按照權(quán)利要求1所述的釀酒酵母，其特征在于所述的釀酒酵母菌株是指釀酒酵母菌株(Scezwhise)TSH-Sc-001(His3-/-)，該菌株己于2008年11月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.2738。3、權(quán)利要求1所述的雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于以雙倍體釀酒酵母菌株為出發(fā)菌株，用帶有目的基因的片段進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)化，通過發(fā)生兩次同源重組，得到2條染色體都發(fā)生了同源重組的雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株。4、按照權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于其所述的目的基因片段是指目的基因的兩端分別與His3左臂或His3右臂的DNA序列同源，目的基因片段的中間含有g(shù)418抗性基因和/或其他基因。5、權(quán)利要求1或3所述的雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法，包括下述步驟(1)根據(jù)5."re^w'seHis3基因的序列和pPIC9K質(zhì)粒的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增含同源重組左臂和g418抗性基因的引物，在5'端和3'端分別引入^boRI(GAATTC)和WI(GTCGAC)識別序列，以pPIC9K質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得含同源重組左臂和g418抗性的片段His3L-Kan，純化；(2)用fcoR工和I分別雙酶切His3L-Kan片段和pUC19載體，純化酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ct感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含His3同源重組左臂和g418抗性基因片段的重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan;(3)根據(jù)61cerew'w'seHis3基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增含同源重組右臂(His3R)的引物，在5，端和3，端分別引入5k/1和尸WI識別位點(diǎn)，以5".cerew、j'se基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得His3同源重組右臂片段His3R，純化；(4)用I和尸MI分別雙酶切His3R和質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan，純化酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的重組質(zhì)粒pUC19--His3L-Kan-His3R;(5)用fcoRI和尸WI雙酶切重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R，回收純化1135bp的含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的片段His3L-Kan-His3R;(6)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化雙倍體釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定在含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的陽性單克隆菌株，得一條染色體發(fā)生了同源重組，一條染色體未發(fā)生同源重組，標(biāo)記為(His3();(7)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化雙倍體釀酒酵母(His3+/—)感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR鑒定，即得本發(fā)明在含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的兩條染色體都發(fā)生了同源重組的釀酒酵母菌株(His3—^)。6、權(quán)利要求1或2所述的雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于包括下述步驟(1)以pPIC9K質(zhì)粒DNA為模板，以His3L-1F-Kan和Kan-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得如SEQIDNo.9所示的DNA序列His3L，-Kan;所述的引物His3L-IF-Kan為SEQIDNo.1所示的DNA序列，所述的引物Kan-R為SEQIDNo,3所示的DNA序列；(2)以純化后的PCR產(chǎn)物His3L，-Kan為模板，以His3L-2F和Kan-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得SEQIDNo.10所示的DNA序列His3L-Kan;純化；所述的引物His3L-2F為SEQIDNo.2所示的DNA序列；(3)用fcoRI和I分別雙酶切His3L-Kan片段和pUC19載體，純化酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含同源重組左臂和g418抗性基因的重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan;(4)以Sce縱/"se基因組DNA為模板，以His3R-F和His3R-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得SEQIDNo.11所示的含His3同源重組右臂DNA片段His3R，純化；其中所述的引物His3R-F為SEQIDNo.4所示的DM序列，所述的引物His3R-R為SEQIDNo.5所示的DNA序列；(5)用I和尸WI分別雙酶切His3R片段和質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan，純化，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，得含同源重組左臂、g418抗性基因和同源重組右臂的重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R;(6)用fcoRI和尸WI雙酶切重組質(zhì)粒pUC19-His3L-Kan-His3R，回收純化，得如SEQIDNo.12所示的DNA片段His3L_Kan-His3R;(7)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化雙倍體釀酒酵母TSH-Sc-001感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR鑒定，得到在含0.25g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的陽性單克隆菌株，一條染色體發(fā)生了同源重組，一條染色體未發(fā)生同源重組的釀酒酵母菌株TSH-Sc-001(His3+/—);其中PCR鑒定所用的引物His3L為SEQIDNo.6所示的DNA序列，所述的引物Kan-ID為SEQIDNo.7所示的DNA序列，所述的引物His-ID為SEQIDNo.8所示的DNA序列；(8)通過電穿孔方法將His3L-Kan-His3R片段轉(zhuǎn)化TSH-Sc-001(His3+"感受態(tài)細(xì)胞，涂含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基，挑取陽性克隆，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，得到在含0.5g/Lg418的YPD培養(yǎng)基上生長的陽性單克隆菌株兩條染色體都發(fā)生了同源重組釀酒酵母菌株("w^/m)TSH-Sc-001(His3-/-)，其中PCR鑒定所用的引物同步驟(7)。7、按照權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于其歩驟(1)中所述的引物His3L-IF-Kan為SEQIDNo.1所示的DNA序列，所述的引物Kan-R為SEQIDNo.3所示的DNA序列。8、按照權(quán)利要求6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于其步驟(2)中所述的引物His3L-2F為SEQIDNo.2所示的DNA序列。9、按照權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于其步驟(4)中所述的引物His3R-F為SEQIDNo.4所示的DNA序列，所述的引物His3R-R為SEQIDNo.5所示的DNA序列。10、按照權(quán)利要求9所述的構(gòu)建方法，其特征在于其步驟(8)中PCR鑒定所用的引物His3L為如SEQIDNo.6所示的DNA序列，所述的引物Kan-ID為SEQIDNo.7所示的DNA序列，所述的引物His-ID為SEQIDNo.8所示的DNA序列。全文摘要本發(fā)明公開了一種雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母及其構(gòu)建方法，屬于微生物生物工程領(lǐng)域，本發(fā)明釀酒酵母是指該釀酒酵母為雙倍體的含有組氨酸營養(yǎng)缺陷標(biāo)記和g418抗性標(biāo)記的釀酒酵母菌株。該菌株是TSH-Sc-001(His3-/-)。本發(fā)明雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的構(gòu)建方法，是以雙倍體釀酒酵母菌株為出發(fā)菌株，用帶有目的基因的片段進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)化，通過發(fā)生兩次同源重組，得到2條染色體都發(fā)生了同源重組的雙倍體組氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株。本發(fā)明所得釀酒酵母，易于識別和保護(hù)；其次，本發(fā)明構(gòu)建方法為雙倍體或多倍體酵母的基因工程改造提供了一種新的途徑和方法；本發(fā)明構(gòu)建方法簡單、高效，保持酵母的原有特性不變。文檔編號C12R1/865GK101525580SQ20081024756公開日2009年9月9日申請日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者李十中,鄭煥娣申請人:清華大學(xué)