專利名稱：：O139群霍亂弧菌檢測(cè)用組合物、試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及霍亂弧菌的特異性檢測(cè)用組合物、試劑盒和檢測(cè)方法，特別涉及0139群霍亂弧菌的特異性檢測(cè)用組合物、試劑盒和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：霍亂是由霍亂弧菌(Vibriochlorae)引起的烈性腸道傳染疾病，患者的臨床癥狀常表現(xiàn)為大量米湯狀排泄，造成迅速脫水。如不及時(shí)治療，可導(dǎo)致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡?；魜y弧菌按照血清型可分為多個(gè)群，但是并不是所有的群都能引起疾病的流行。其中，能夠引起霍亂流行的主要有兩種血清型01群和0139群(K即erJB，MorrisJG，LevineMM.Cholera.Clin.Microbiol.Rev,1995,8:48-86)。因此在霍亂弧菌的檢測(cè)中，其血清型分型是有效檢測(cè)的重要組成部分。就其致病性檢測(cè)指標(biāo)來(lái)說(shuō)，早期研究發(fā)現(xiàn)，霍亂的強(qiáng)致病作用主要是因?yàn)榛魜y弧菌分泌的霍亂毒素導(dǎo)致的腹瀉所致。因此在0139群霍亂弧菌引發(fā)的霍亂出現(xiàn)之前，一直使用霍亂毒素(choleratoxin，CT)作為檢測(cè)其病原性的標(biāo)準(zhǔn)。歷史上的前7次霍亂流行都由01群霍亂弧菌引發(fā)。在1992年末，在印度出現(xiàn)了由0139群引發(fā)的霍亂，并迅速傳至周圍國(guó)家。自從0139群霍亂弧菌引發(fā)霍亂爆發(fā)以后，并且隨著對(duì)0139群和01群霍亂弧菌研究的深入，發(fā)現(xiàn)有一些非0139群也非01群的霍亂弧菌也表達(dá)霍亂毒素CT，但是并不會(huì)引發(fā)霍亂的爆發(fā)。同時(shí)，在偶然情況下01和0139群霍亂弧菌由于缺失ctx基因而不表達(dá)霍亂毒素，同時(shí)也不會(huì)引發(fā)霍亂的爆發(fā)。所以，要準(zhǔn)確檢測(cè)致病性霍亂弧菌的存在需要同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)指標(biāo)霍亂毒素CT和血清型指標(biāo)(ChakrabortyS，MukhopadhyayAK，BhadraRK，etal.VirulencegenesinenvironmentalstrainsofVibriocholerae.Appl.Environ.Microbiol,2000，66:4022-4028)。鑒于霍亂流行的危害性較大，使霍亂弧菌的檢測(cè)尤為重要。但是傳統(tǒng)的弧菌檢測(cè)法需要先用堿性蛋白胨培養(yǎng)液培養(yǎng)增菌，培養(yǎng)分離出菌株之后才能檢測(cè)，由于其對(duì)菌株培養(yǎng)的需要，使這種傳統(tǒng)檢測(cè)方法并不總是適用。因?yàn)榛魜y弧菌在嚴(yán)苛的生存條件下，例如抗生素、營(yíng)養(yǎng)素缺乏、氣候寒冷等，就會(huì)進(jìn)入一種可存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)，不適于基于菌株培養(yǎng)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法(LyonW.T.TaaManPCRfordetectionofVibriocholerae01,0139，non_01，andnon_0139inpurecultures,rawoysters,andsyntheticseawater.Appl.Environ.Microbiol，2001，67:4685-4693)。并且，傳統(tǒng)弧菌檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于對(duì)樣品的迅速檢測(cè)處理。由于傳統(tǒng)的霍亂弧菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于快速檢測(cè)，并且涉及菌的培養(yǎng)，對(duì)于操作人員來(lái)說(shuō)具備一定的危險(xiǎn)性，近年來(lái)針對(duì)霍亂及霍亂毒素的PCR反應(yīng)快速檢測(cè)技術(shù)開(kāi)始出現(xiàn)。對(duì)于PCR檢測(cè)來(lái)說(shuō)，引物的選擇至關(guān)重要，直接影響檢測(cè)的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果或者假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。另外，對(duì)于產(chǎn)毒型霍亂弧菌的檢測(cè)，單獨(dú)檢測(cè)一個(gè)基因，往往不足以判斷其致病性。2003年Fukushima等利用SYBR熒光染料建立了多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系(HiroshiF，YoshieT，RyotaroS.Duplexreal—timeSYBRGreenPCRassaysfordetectionof17speciesof3foodorwaterbornepathogensinstools.J.Clin.Microbiol,2003，41:5134-5146)，雖然縮短了檢測(cè)時(shí)間和工作量，但是由于采用非毒素基因的單一靶位點(diǎn)檢測(cè)，用于檢測(cè)致病菌時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果存在一定的假陽(yáng)性率。對(duì)于食品等樣品中霍亂弧菌的檢測(cè)是預(yù)防與監(jiān)測(cè)霍亂的重要步驟。并且霍亂弧菌的檢測(cè)對(duì)于患者疾病的確診與菌株的分型也有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容為了更加準(zhǔn)確地特異性檢測(cè)樣品0139群霍亂弧菌的存在，本發(fā)明提供一種特異性檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的組合物。該組合物包括下列引物上游引物5'-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3'(序列號(hào)l);下游引物5'-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3'(序列號(hào)2)。該引物為針對(duì)0139群霍亂弧菌基因組0抗原編碼基因rfb-0139設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性引物，利用該組合物，可以使用PCR方法特異性檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的存在。其中，可進(jìn)一步包括探針5'-熒光基團(tuán)-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA(序列號(hào)3)-熒光淬滅基團(tuán)-3'。從而使該組合物可適用于熒光實(shí)時(shí)定量PCR(realtimePCR)檢測(cè)方法，其中所述熒光基團(tuán)可以是Tet，其熒光淬滅基團(tuán)可以是ECLIPSE。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員均知，也可以使用本領(lǐng)域已知的其他熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記上述探針。更進(jìn)一步地，為了滿足既能有效地檢測(cè)0139群致病性霍亂弧菌、又能同時(shí)判斷該霍亂弧菌產(chǎn)生霍亂腸毒素的能力，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供一種特異性檢測(cè)樣品中產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌的組合物。該組合物中包括下列兩對(duì)引物第一對(duì)引物-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3';-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3';上游引物5'下游引物5'第二對(duì)引物上游引物5'下游引物5'-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3'(序列號(hào)4)，-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3'(序列號(hào)5)。其中第一對(duì)引物為針對(duì)基因組0抗原編碼基因rfb-0139的引物，第二對(duì)引物為針對(duì)霍亂毒素基因ctxA的引物。使用該組合物，既檢測(cè)了其基因組0抗原編碼基因rfb-0139，又特異性檢測(cè)了霍亂毒素基因ctxA，所以利用該組合物可以通過(guò)PCR方法檢測(cè)樣品中產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌的存在。并且，上述組合物中可進(jìn)一步包括探針5'-熒光基團(tuán)-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團(tuán)_3'和5'-熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT(序列號(hào)6)-熒光淬滅基團(tuán)-3'。從而使得該組合物和試劑盒可由于通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌的存在。其中所述熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)可為Tet和ECLIPSE,或FAM和ECLIPSE。并且，在一個(gè)反應(yīng)體系的不同探針中，使用不同的熒光基團(tuán)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)本領(lǐng)域知識(shí)自行選擇合適的熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式提供一種特異性檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的PCR檢測(cè)試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)體系和上述組合物中的任意一種。優(yōu)選所述PCR反應(yīng)體系為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。其中優(yōu)選使用TaqMan探針體系進(jìn)行標(biāo)記和檢測(cè)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的方法，使用上述組合物中的任意一種，或上述試劑盒中的任意一種，該方法包括提取樣品中的細(xì)菌基因組DNA;使用上述組合物中的任意一種作為反應(yīng)采用的引物和/或探針，或使用上述試劑盒中的任意一種，用PCR法檢測(cè)其中目的片段的存在，從而判斷樣品中0139群霍亂弧菌的存在。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員可知的PCR反應(yīng)條件，優(yōu)選為95士2t:預(yù)變性超過(guò)lmin，95士2t:變性超過(guò)5s，60士2t:延伸超過(guò)10s，共反應(yīng)超過(guò)30個(gè)循環(huán)，最后可選地在72士2t:下延伸超過(guò)2min。當(dāng)上述PCR法為普通PCR法時(shí)，其反應(yīng)條件進(jìn)一步優(yōu)選為94t:預(yù)變性2min，94t:變性30s，6(TC延伸lmin，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸7min。當(dāng)上述PCR法為實(shí)時(shí)定量PCR法時(shí)，其反應(yīng)條件進(jìn)一步優(yōu)選為94t:預(yù)變性2min，94t:變性10s，6(TC延伸30s，共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。上述PCR法中優(yōu)選使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)。在上述熒光實(shí)時(shí)定量PCR中，優(yōu)選使用T叫Man探針?lè)?。本檢測(cè)體系所檢測(cè)標(biāo)本無(wú)需活菌，在樣品處理的第一步DNA提取的裂解過(guò)程中就可使霍亂弧菌迅速死亡，減少了對(duì)操作人員的生物危害。本方法無(wú)需增菌，整個(gè)反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成，大大節(jié)省了人力與時(shí)間，可用于快速檢測(cè)。并且，利用本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方式，例如，如上所述同時(shí)使用第一對(duì)和第二對(duì)引物進(jìn)行PCR時(shí)，可以特異性檢測(cè)樣品中的產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌的存在，S卩，不僅僅能夠?qū)悠分械幕魜y弧菌分型，而且能夠判斷其產(chǎn)生霍亂毒素的能力，特異性區(qū)分致病性霍亂弧菌和非致病性霍亂弧菌。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用本發(fā)明所述的特異性探針，利用T叫Man實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，該方法由于自動(dòng)化程度高，無(wú)需開(kāi)蓋檢測(cè)產(chǎn)物，還減少了產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。利用本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或方法對(duì)0139群霍亂弧菌檢測(cè)時(shí)，同時(shí)使用針對(duì)兩個(gè)基因(rfb-0139和ctxA)的上述兩對(duì)引物的普通雙重PCR體系的實(shí)施方式的檢測(cè)敏感性達(dá)到102拷貝每反應(yīng)體系；除了使用上述兩對(duì)引物，還使用了T叫Man技術(shù)，加入上述兩個(gè)特異性探針的實(shí)時(shí)熒光雙重PCR檢測(cè)體系的實(shí)施方式的檢測(cè)范圍為1X102至1X109拷貝；采用上述兩對(duì)引物的普通雙重PCR實(shí)施方式對(duì)0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感性達(dá)1X1(^pg每反應(yīng)體系，而實(shí)時(shí)熒光雙重PCR實(shí)施方式對(duì)0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感性可達(dá)1Xl(^pg每反應(yīng)體系，并且該檢測(cè)快速簡(jiǎn)便，整個(gè)反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成。圖1為普通雙重PCR檢測(cè)敏感度的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，"-"為陰性對(duì)照，泳道10°10"為每個(gè)PCR反應(yīng)所加質(zhì)粒DNA模板拷貝數(shù)分別為10°10"拷貝每反應(yīng)體系。圖2為雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)敏感度的擴(kuò)增曲線圖，標(biāo)識(shí)"壙，曲線為ctxA熒光檢測(cè)信號(hào)，平滑線為rfb-0139熒光檢測(cè)信號(hào)，由左到右每PCR反應(yīng)的模板量分別為109101拷貝質(zhì)粒DNA;水平信號(hào)線為陰性對(duì)照。圖3為普通雙重PCR及實(shí)時(shí)熒光雙重PCR檢測(cè)體系對(duì)0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)圖，其中(A)M為分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道N為陰性對(duì)照，泳道1-8為每個(gè)PCR反應(yīng)所加基因組DNA模板數(shù)分別為1X10—2pg至1X105pg每反應(yīng)體系。(B)標(biāo)識(shí)"*"曲線為ctxA熒光檢測(cè)信號(hào)，平滑線為rfb-0139熒光檢測(cè)信號(hào)；由左到右每PCR反應(yīng)的模板量分別為109拷貝質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照和1X105pg至1X10—2pg基因組DNA;水平信號(hào)線為陰性對(duì)照。圖4為說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光雙重PCR檢測(cè)體系對(duì)檢測(cè)0139群霍亂弧菌基因組DNA的特異性的圖，其中標(biāo)識(shí)"f曲線為ctxA熒光檢測(cè)信號(hào)，平滑線為rfb-0139熒光檢測(cè)信號(hào)，"+"為IX109拷貝質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照每反應(yīng)體系；"0139"為0139群霍亂弧菌基因組DNAIX103pg每反應(yīng)體系；水平信號(hào)線為陰性對(duì)照和19種陰性對(duì)照菌基因組DNA。具體實(shí)施例方式為了特異性檢測(cè)0139群霍亂弧菌，發(fā)明人選擇了0139群霍亂弧菌的基因組0抗原編碼基因rfb-0139作為靶標(biāo)序列，針對(duì)該基因設(shè)計(jì)了特異性引物，并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇了最具有特異性的一對(duì)引物(rfb0139-F和rfb0139-R，見(jiàn)下表1)用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，選擇rfb0139-F和rfb0139-R作為特異性引物，用PCR方法檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的存在。使用該方法，可特異性檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的基因組0抗原編碼基因rfb-0139，進(jìn)而特異性檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的存在，并且在檢測(cè)初期就通過(guò)裂解使霍亂弧菌死亡，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員造成威脅。優(yōu)選使用熒光實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)，省去了普通PCR的凝膠電泳等時(shí)間，使其檢測(cè)和分析更加簡(jiǎn)便，縮短了檢測(cè)的時(shí)間。更優(yōu)選使用T叫Man技術(shù)標(biāo)記的熒光實(shí)時(shí)PCR法，使用TaqMan技術(shù)時(shí)，其探針優(yōu)選為rfb0139-探針5'-熒光基團(tuán)-08(1^0八八1八08八8(:(:(1^八881-熒光淬滅基團(tuán)-3'，該探針為針對(duì)該靶標(biāo)序列特異性探針，增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性。其熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)可以分別是Tet和ECLIPSE。同時(shí)，為了特異性檢測(cè)產(chǎn)毒型的O139群霍亂弧菌，發(fā)明人又將主要導(dǎo)致霍亂的嚴(yán)重癥狀一一腹瀉的霍亂毒素的基因ctxA作為PCR檢測(cè)的靶標(biāo)序列，針對(duì)該基因設(shè)計(jì)了特異性引物。同樣，經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，選擇出最具有特異性的一對(duì)引物(ctxA-F和ctxA-R，見(jiàn)下表1)用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，同時(shí)采用引物rfb0139-F和rfb0139-R，以及引物ctxA-F和ctxA-R，用雙重PCR的方法檢測(cè)樣品中產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌的存在。使用該方法，在一次檢測(cè)中既可以檢測(cè)0139群霍亂弧菌，又能夠判斷該菌產(chǎn)生霍亂毒素的能力，可以更準(zhǔn)確地特異性檢測(cè)致病的產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌。優(yōu)選采用熒光雙重實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)，更優(yōu)選采用TaqMan技術(shù)標(biāo)記，所使用的探針為rfb0139_探針5'-熒光基團(tuán)-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT-熒光淬滅基團(tuán)-3'，和ctxA-探針5'-熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團(tuán)_3'，其中兩個(gè)探針中使用不同的熒光基團(tuán)。使用該方法，不僅可以準(zhǔn)確地檢測(cè)致病的產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌，而且其操作更加簡(jiǎn)便，在加入所需試劑開(kāi)始反應(yīng)后，不需再次開(kāi)蓋加樣和取樣，避免了污染的發(fā)生。并且其結(jié)果可以直接讀出，而不需要后續(xù)的諸如凝膠電泳之類的操作，大大節(jié)省了檢測(cè)的時(shí)間。而且，這兩個(gè)探針均為針對(duì)相應(yīng)基因設(shè)計(jì)的特異性探針，更加增強(qiáng)了其檢測(cè)的特異性。其中所述熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)對(duì)可以是Tet和ECLIPSE，以及FAM和ECLIPSE。但是6并不限于這兩對(duì)熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇合適的熒光基團(tuán)及其對(duì)應(yīng)的熒光淬滅基團(tuán)。下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，這里列出的實(shí)施例僅僅為示例性說(shuō)明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。引物和T叫Man探針的設(shè)計(jì)與合成利用Genbank的Blast工具對(duì)0139群霍亂弧菌的ctxA基因與rfb-0139基因序列進(jìn)行分析，選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測(cè)靶標(biāo)序列，并針對(duì)這兩個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物和探針(見(jiàn)表l)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中ctxA基因的檢測(cè)探針5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記ELIPSE熒光淬滅基團(tuán)，rfb-0139基因的檢測(cè)探針5'端標(biāo)記Tet熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記ECLIPSE熒光淬滅基團(tuán)。表l引物及探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>檢測(cè)菌種的準(zhǔn)備本實(shí)施例中所使用的0139群霍亂弧菌滅活疫苗由國(guó)家生物制品檢定所惠贈(zèng)。19種其他腸道致病菌或醫(yī)院感染中常見(jiàn)的致病菌致病性大腸桿菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、痢疾志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、腸炎耶爾森菌、類志賀鄰單胞菌、腦膜炎黃桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍德菌、綠膿桿菌、傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心微生物實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)施例l采用普通PCR法的檢測(cè)細(xì)菌基因組DNA的抽提抽提各細(xì)菌基因組DNA(TAKARA公司的MiniBEST試劑盒)。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各細(xì)菌基因組DNA的純度和濃度，0139群霍亂弧菌基因組DNA用TE緩沖液稀釋至lX105pg/iil到1X10—3pg/iil的梯度標(biāo)準(zhǔn)品，其余19種其他腸道致病菌或醫(yī)院感染中常見(jiàn)的致病菌的基因組DNA用TE緩沖液稀釋至5X104pg/y1，各種基因組DNA均少量分裝，-2(TC保存?zhèn)溆谩Ｙ|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備采用TA克隆技術(shù)構(gòu)建目的質(zhì)粒。在經(jīng)過(guò)電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段分子量后，將rfb-0139和ctxA特異性序列的PCR產(chǎn)物連至pMD18-T載體(日本TaKaRa公司)上，重組陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒(Omega質(zhì)粒提取試劑盒)，采用pMD18_T載體的RVM引物進(jìn)行測(cè)序(美國(guó)BeckmanCoulter公司試劑盒)，利用CEQ8000軟件進(jìn)行序列分析，并與原目的序列進(jìn)行比對(duì)。序列完全正確的目的質(zhì)粒用紫外分光光度法定量(Eppendorf紫外分光光度計(jì))后，用1XTE(pH8.O)TE緩沖液稀釋到l(T拷貝/iU作為儲(chǔ)存液，-2(TC保存?zhèn)溆?，使用時(shí)連續(xù)10倍稀釋至濃度在1.0X10—4考貝/ill1.0X1(T拷貝/yl之間，取10iil標(biāo)準(zhǔn)品作為實(shí)時(shí)定量PCR的模板，使參加每個(gè)PCR反應(yīng)的質(zhì)粒數(shù)形成l個(gè)拷貝到10"拷貝的梯度分布。普通雙重PCR反應(yīng)條件普通雙重PCR反應(yīng)體系為25iU，取10X含鎂的緩沖液2.5iU，dNTPs(各2.5mmol/L)2ii1，25iimol/L引物各0.5iil(終濃度為500nM)，模板DNAlO.Oii1，BlendTaqplusDNA聚合酶1.0U，加滅菌水至終體系25。PCR循環(huán)參數(shù)94。C預(yù)變性2min，94°C變性30s，6(TC延伸lmin，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，最后72t:延伸7min。擴(kuò)增后取5ulPCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳后用溴化乙錠(EB)染色，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖3A。實(shí)施例2采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)法檢測(cè)采用與實(shí)施例相同的細(xì)菌基因組DNA和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其區(qū)別在于所采用的PCR方法為熒光實(shí)時(shí)定量PCR，并且使用了上述設(shè)計(jì)并合成的探針。實(shí)時(shí)熒光雙重PCR反應(yīng)條件反應(yīng)體系為25ii1，取10XPCR緩沖液2.5ii1、2.5mmol/L各dNTP2.0iU、25iimol/L引物各0.5ii1、5iimol/L探針各0.5ii1、BlendTaqplusDNA聚合酶1U、模板DNA10ul，加滅菌水至終體系25iU。PCR循環(huán)參數(shù)94。C預(yù)變性2min，94。C變性10s，60。C延伸30s，共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增結(jié)束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的Ct值。實(shí)施例1和2的檢測(cè)體系的檢測(cè)敏感度的評(píng)價(jià)取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品每反應(yīng)體系10°拷貝至1(T拷貝，或以1X10—2pg/iil到lX105pg/P1梯度濃度的0139群霍亂弧菌細(xì)菌基因組DNA為模板，評(píng)價(jià)了普通雙重PCR與實(shí)時(shí)雙重?zé)晒釺aqManPCR檢測(cè)體系的檢測(cè)敏感性，結(jié)果參見(jiàn)圖14。實(shí)施例1中對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)敏感度雙質(zhì)粒梯度稀釋模板進(jìn)行普通雙重PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)顯示，當(dāng)每反應(yīng)體系中ctxA基因和rfb-0139基因的質(zhì)粒DNA模板數(shù)降低至1.0X101及以下拷貝時(shí)，普通PCR反應(yīng)后電泳圖上未出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照也未見(jiàn)擴(kuò)增條帶(圖1)。實(shí)施例2中對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)敏感度雙質(zhì)粒梯度稀釋模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)顯示，當(dāng)反應(yīng)體系ctxA基因和rfb-0139基因的質(zhì)粒DNA模板數(shù)為102拷貝以上時(shí)，其熒光信號(hào)強(qiáng)度ARn高于檢測(cè)域值(ARn=30)，其檢測(cè)范圍是1.0X1021.0X109拷貝每反應(yīng)體系(圖2)。兩個(gè)耙基因擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值和模板之間均存在良好的相關(guān)性，rfb-0139相關(guān)性為0.998，擴(kuò)增效率達(dá)到1.04，ctxA相關(guān)性為0.999，擴(kuò)增效率為0.97。實(shí)施例1中對(duì)細(xì)菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度將0139群霍亂弧菌基因組DNA梯度稀釋到1X105pg至1X10—2pg每反應(yīng)體系時(shí)普通雙重PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)顯示，當(dāng)基因組DNA梯度稀釋至每反應(yīng)體系1X10°pg時(shí)普通雙重PCR反應(yīng)后電泳圖上未出現(xiàn)ctxA和rfb-0139目的擴(kuò)增條帶(圖3A)。實(shí)施例2中對(duì)細(xì)菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度用與實(shí)施例1相同梯度濃度的基因組DNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)時(shí)顯示，在1.0X10°pg及以上時(shí)，其熒光信號(hào)強(qiáng)度ARn高于檢測(cè)域值(ARn=30)，該結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光雙重PCR對(duì)0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度比普通雙重PCR的檢測(cè)敏感度高10倍(圖3B)。該雙重檢測(cè)體系中，兩個(gè)靶基因擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值和模板之間有良好的相關(guān)性，ctxA相關(guān)性為0.997，擴(kuò)增效率為1.02，rfb-0139相關(guān)性為0.999，擴(kuò)增效率達(dá)到0.97。檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià)以上述19種其他腸道致病菌或醫(yī)院感染中常見(jiàn)的致病菌的基因組DNA為模板評(píng)價(jià)了雙重T叫Man實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的特異性。利用實(shí)施例2中所述的體系對(duì)0139群霍亂弧菌滅活疫苗基因組DNA的1X103pg每反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可見(jiàn)明確的擴(kuò)增曲線，對(duì)上述19種非霍亂弧菌的病原菌基因組DNA的5X105pg每反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)時(shí)均未產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，說(shuō)明我們使用的探針和引物與我們選定的19種陰性對(duì)照菌之間不存在交叉反應(yīng)。用已知濃度(1.0X107每反應(yīng)體系)陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照進(jìn)行盲檢測(cè)，未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果(圖4)。盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過(guò)具體實(shí)施例示例性說(shuō)明了本發(fā)明的某些實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明并不限于上面所公開(kāi)的實(shí)施方式，而是可以根據(jù)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的知識(shí)對(duì)其進(jìn)行修改，所作修改不會(huì)超出本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。例如，本發(fā)明所使用的熒光實(shí)時(shí)PCR也可以根據(jù)需要采用說(shuō)明書(shū)中所列出的實(shí)施例中指出的熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)以外的標(biāo)記物質(zhì)，如Cy5、HEX、TAMRA、ROX、BHQ、Cy3、TxRd、JOE等標(biāo)記物；或使用T叫man技術(shù)之外的其他標(biāo)記體系，例如MGB探針、分子信標(biāo)MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等熒光探針標(biāo)記技術(shù)；或使用染料嵌合法如SYBRGreenI等不飽和染料與LCGreen等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定量檢測(cè)目的基因的存在，進(jìn)而特異性地檢測(cè)0139群霍亂弧菌的存在。所以，這些本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的改變和慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書(shū)所限定。序列表〈110〉蔡劍平〈120>0139群霍亂弧菌的特異性檢測(cè)用組合物和試劑盒〈130>DF10-081416〈160>6〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>tgatgttgtgggataagcaatctt24〈210>2〈211>20〈212>DNA<213>霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>ctcagcaatgcggtggtcta20〈210>3〈211〉26〈212〉DNA〈213>霍亂弧菌(Vibriochlorae)<400〉aacccgcccttctaatg'aacacgcca26〈210〉4〈211〉22<212〉DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400〉atgccaagaggacagagtgagt22〈210〉5〈211〉28〈212〉DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400〉tcaaactaattgaggtggaaacatatcc28〈210〉6〈211〉30〈212〉DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)<400〉tcgtgcctaacaaatcccgtctgagttcct30權(quán)利要求一種用于特異性檢測(cè)樣品中O139群霍亂弧菌的組合物，其中包括下列引物上游引物5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′，下游引物5′-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3′。2.如權(quán)利要求l所述的組合物，其中進(jìn)一步包括探針5'_熒光基團(tuán)-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團(tuán)_3'。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述熒光基團(tuán)為Tet，所述熒光淬滅基團(tuán)為ECLIPSE。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中進(jìn)一步包括另一對(duì)引物上游引物5'-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3'，下游引物5'-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3'。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中進(jìn)一步包括探針5'_熒光基團(tuán)-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團(tuán)_3'，和5'_熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團(tuán)_3'，并且在兩個(gè)探針中分別使用不同的熒光基團(tuán)。6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述的兩對(duì)熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)為Tet和ECLIPSE,以及FAM禾PECLIPSE。7.—種用于特異性檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)體系，和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的組合物。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中所述PCR反應(yīng)體系為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。9.一種特異性檢測(cè)樣品中0139群霍亂弧菌的方法，包括提取樣品中的細(xì)菌基因組DNA;使用權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的組合物，或使用權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，用PCR法擴(kuò)增所述細(xì)菌基因組DNA;對(duì)PCR反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述PCR法的反應(yīng)條件為95±2°C預(yù)變性超過(guò)lmin，95±2。C變性超過(guò)5s，60±2°C延伸超過(guò)10s，共反應(yīng)超過(guò)30個(gè)循環(huán)，最后在72士2t:下延伸超過(guò)2min;或95±2°C預(yù)變性超過(guò)lmin，95±2°C變性超過(guò)5s，60±2°C延伸超過(guò)10s，共反應(yīng)超過(guò)30個(gè)循環(huán)。全文摘要本發(fā)明涉及一種O139群霍亂弧菌檢測(cè)用組合物、試劑盒和檢測(cè)方法。該組合物中包含針對(duì)產(chǎn)毒型O139群霍亂弧菌O抗原編碼基因rfb-O139和分泌霍亂毒素的致病毒素基因ctxA的特異性引物。本發(fā)明的組合物和試劑盒能夠靈敏地檢測(cè)出樣品存在的產(chǎn)毒型O139群霍亂弧菌，其檢測(cè)下限為1.0×102拷貝每反應(yīng)體系。對(duì)其基因組DNA的檢測(cè)敏感度為1.0×100pg每反應(yīng)體系。文檔編號(hào)C12Q1/10GK101768633SQ20081024746公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者吳麗娟,楊輝,胡繼紅,蔡劍平,龔成申請(qǐng)人:蔡劍平