專利名稱：：轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法轉(zhuǎn)基因小鼠本發(fā)明一般性涉及轉(zhuǎn)基因小鼠以及篩選和治療疾病、特別是Αβ肽相關(guān)疾病的方法和組合物。本發(fā)明特別涉及Aβ肽和QPCT(即谷氨酰胺酰肽環(huán)化轉(zhuǎn)移酶(glutaminylpeptidecyclotransferase))以及QPCT-樣酶(QPCTL)，也稱作谷氨酰胺酰環(huán)化酶(glutaminylcyclase)(QC,EC2.3.2.5)，其催化N-末端谷氨酰胺殘基的分子內(nèi)環(huán)化為焦谷氨酸(5-氧-脯氨酸，pGlu*)并釋放氨，以及催化N-末端谷氨酸殘基分子內(nèi)環(huán)化為焦谷氨酸并釋放水。在阿爾茨海默病(AD)中發(fā)現(xiàn)的斑塊中，僅少部分Αβ肽以N-末端天冬氨酸起始(Ai3mD)。大多數(shù)肽起始于位置3焦谷氨酸(Ai3N3(pGlu))(Kuo，Y.Μ.，Emmerling,Μ.R.,Woods,Α.S.,Cotter,R.J.&Roher,Α.Ε.Isolation,chemicalcharacterization,andquantitationofAbeta3-pyroglutamylpeptidefromneuriticplaquesandvascularamyloiddeposits.BiochemBiophysResCommun237,188-191.(1997)；Saido,Τ.C.,etal.Dominantanddifferentialdepositionofdistinctbeta-amyloidpeptidespecies,AbetaN3(pE),insenileplaques.Neuron14,457-466(1995)),以及在位置42結(jié)束。與以N-末端谷氨酸起始的Αβ(ΑβΝ3Ε)相比，以N-末端谷氨酰胺起始的Αβ(ΑβΝ39)是谷氨酰胺酰環(huán)化酶(QC)更好的底物(Schilling，S.，Hoffmann,Τ.，Manhart,S.，Hoffmann，Μ.&Demuth,H.U.Glutaminylcyclasesunfoldglutamylcyclaseactivityundermildacidconditions.FEBSLett563，191-196(2004)；Cynis，H.，etal.Inhibitionofglutaminylcyclasealterspyroglutamateformationinmammaliancells.BiochimBiophysActa1764，1618-1625(2006))。與全長(zhǎng)Αβ相比，Αβ(N3pGlu)具有更高的聚集傾向(He，W.&Barrow,C.J.TheAbeta3-pyroglutamyland11-pyroglutamylpeptidesfoundinsenileplaquehavegreaterbeta-sheetformingandaggregationpropensitiesinvitrothanfull-lengthAbetaBiochemistry,38,10871-10877(1999)；Schilling,S.，etal.,OntheseedingandoligomerizationofpGlu-amyloidpeptides(invitro),Biochemistry，45，12393-12399(2006))和穩(wěn)定性(Kuo，Y.Μ.，Webster,S.，Emmerling,Μ.R.，DeLima，N.&Roher,Α.Ε.Irreversibledimerization/tetramerizationandpost—translationalmodificationsinhibitproteolyticdegradationofAbetapeptidesofAlzheimer'sdisease.BiochimBiophysActa1406，291-298(1998))，且不出增力口的毒性(Russo，C.，etal.Pyroglutamate-modifiedamyloid-peptides-AN3(pE)-stronglyaffectculturedneuronandastrocytesurvival,JournalofNeurochemistry82，1480-1489(2002))。然而，其它研究報(bào)道Αβ(N3pGlu_40)和Αβ(N3pGlu-42)的毒性與Aβ(N1D-40)禾口ΑβΝ1_42)的毒性相似(Tekirian，Τ·L，Yang，Α.Y.，Glabe，C.&Geddes，J.W.Toxicityofpyroglutaminatedamyloidbeta-peptides3(pE)-40and_42issimilartothatofAbetal-40and-42，JNeurochem73，1584-1589(1999))，以及Aβ(N3pGlu)不是AD腦中的主要變體(Lemere，C.Α.，etal.Sequenceofdepositionofheterogeneousamyloidbeta—peptidesandAPOEinDownsyndrome-implicationsforinitialeventsinamyloidplaqueformation，NeurobiolDis3，16-32(1996))。Schilling等已經(jīng)表明焦谷氨酸修飾的肽在最初Αβ聚集體形成中展示直至250倍的加速(Schilling，S.，etal.，OntheseedingandoligomerizationofpGlu-amyloidpeptides(invitro),Biochemistry，45，12393-12399(2006))，并且提供體外證據(jù)表明在Αβ位置3的谷氨酸的環(huán)化由谷氨酰胺Iitif^BI(QC)馬區(qū)云力(Schilling,S.，Hoffmann,Τ.，Manhart,S.，Hoffmann,Μ.&Demuth，H.U.glutaminylcyclasesunfoldglutamylcyclasesactivityundermildacidconditions,FEBSLett563,191-196(2004)；Cynis,H.,etal.Inhibitionofglutaminylcyclasealterspyroglutamateformationinmammaliancells,BiochimBiophysActa,1764,1618-1625(2006))οQC抑制導(dǎo)致Αβ(N3pGlu)形成顯著降低，示出QC-活性在含有焦谷氨酸的肽的細(xì)胞成熟期間的重要性(Cynis，H.，etal.Inhibitionofglutaminylcyclasesalterspyroglutamateformationinmammaliancells,BiochimBiophysActa1764,1618-1625(2006))ο已經(jīng)報(bào)道APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型示出無Aβ(N3pGlu)水平(Kuo，Y.Μ.,etal.Comparativeanalysisofamyloid-betachemicalstructureandamyloidplaquemorphologyoftransgenicmouseandAlzheimer'sdiseasebrains.JBiolChem276，12991-12998(2001))或低Αβ(N3pGlu)水平(Guntert,Α.，Dobeli,H.&Bohrmann,B.Highsensitivityanalysisofamyloid-betapeptidecompositioninamyloiddepositsfromhumanandPS2APPmousebrain.Neuroscience.143,461-475(2006))，這與APP/PS1KI小鼠相反，該小鼠具有相當(dāng)大量的Aβ(N3pGlu)，這由對(duì)全腦裂解物的2D-凝膠電泳檢測(cè)到(Casas，C.，etal.MassiveCA1/2NeuronalLosswithIntraneuronalandN-TerminalTruncatedA{beta}42AccumulationinaNovelAlzheimerTransgenicModel.AmJPathol165，1289—1300(2004))以及通過在神經(jīng)元和斑內(nèi)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)到(Wirths,0.，ffeis,J.，Kayed,R.，Saido,T.C.&Bayer,Τ.A.Age-dependentaxonaldegenerationinanAlzheimermousemodel,NeurobiolAging8，onlineversion(2006))。APP/PS1KI小鼠發(fā)生腦和脊髓中年齡依賴個(gè)生車由，$個(gè)生(Wirths,0.，ffeis,J.，Kayed,R.，Saido,T.C.&Bayer，Τ.A.Age-dependentaxonaldegenerationinanAlzheimermousemodel,NeurobiolAging8,onlineversion(2006))，在10月齡在CAl中50%神經(jīng)元喪失(Casas,C.，etal.MassiveCA1/2NeuronalLosswithIntraneuronalandN-TerminalTruncatedA{beta}42AccumulationinaNovelAlzheimerTransgenicModel.AmJPathol165，1289—1300(2004))，在6月齡工作記憶和運(yùn)動(dòng)性能不足(Wirths,0.，Breyhan,H.，Schafer,S.，Roth,C.&Bayer,Τ.A.DeficitsinworkingmemoryandmotorperformanceintheAPP/PSlkimousemodelforAlzheimer'sdisease,NeurobiolAging8,8(2007))。在2—6個(gè)月之間的年齡，Αβ(N3pGlu)聚集速度高于未修飾的Αβ(NlD)的聚集速度。盡管有提示，但是由于N-截短的Αβ肽的較高異質(zhì)性而難以使Αβ(N3pGlu)沉積與在這個(gè)模型中觀測(cè)到的CAl神經(jīng)兀喪失相關(guān)聯(lián)(Casas,C.,etal.MassiveCAl/2NeuronalLosswithIntraneuronalandN-TerminalTruncatedA{beta}42AccumulationinaNovelAlzheimerTransgenicModel.AmJPathol165，1289-1300.(2004))。谷氨酰胺酰環(huán)化酶(QC，EC2.3.2.5)在伴隨氨釋放下催化N-末端谷氨酰胺殘基分子內(nèi)環(huán)化為焦谷氨酸(pGlu*)。QC首先由Messer在1963年從熱帶植物Caricapapaya的乳膠中分離(Messer,M.1963Nature4874,1299)。24年后，在動(dòng)物垂體中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的酶活性(Busby,W.H.J.etal.1987JBiolChem262，8532-8536；Fischer,W.H.andSpiess,J.1987ProcNatlAcadSciUSA84,3628-3632)。對(duì)于哺乳動(dòng)物QC，針對(duì)TRH和GnRH前體已經(jīng)示出N末端Gln由QC轉(zhuǎn)化為pGlu(Busby,W.H.J.etal.1987JBiolChem262,8532-8536；Fischer,W.H.andSpiess,J.1987ProcNatlAcadSciUSA84，3628-3632)。另外，QC的最初定位實(shí)驗(yàn)表明與其推定的催化產(chǎn)物在牛垂體中的共同定位，進(jìn)一步改善在肽激素合成中的推測(cè)的功能(Bockers，Τ.Μ.etal.1995JNeuroendocrinol7，445-453)。相反，植物QC的生理學(xué)功能還不太清楚。在得自C.papaya的酶的情況中，推測(cè)其在植物的病原性微生物防御中的作用(ElMoussaoui，A.etal.2001CellMolLifeSci58,556-570)。最近通過序列對(duì)比鑒別了得自其它植物的推定的QC(Dahl，S.W.etal.2000ProteinExprPurif20,27-36)然而，這些酶的生理學(xué)功能還不明確。從植物和動(dòng)物獲知的QC示出對(duì)于底物N末端位置中的L-谷氨酰胺的嚴(yán)格特異性，且發(fā)現(xiàn)它們的動(dòng)力學(xué)行為服從Michaelis-Menten等式(Pohl,T.etal.1991ProcNatlAcadSciUSA88,10059-10063；Consalvo,A.P.etal.1988AnalBiochem175，131-138；Gololobov,M.Y.etal.1996BiolChemHoppeSeyler377,395-398)。然而來自C.papaya的QC與來自哺乳動(dòng)物的高保守的QC的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比未表明任何序列同源(Dahl，S.W.etal.2000ProteinExprPurif20,27-36)盡管植物QC看起來屬于新的酶家族(Dahl，S.W.etal.2000ProteinExprPurif20，27-36)，但是發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物QC具有與細(xì)菌氨基肽酶顯著同源的序列(Bateman，R.C.etal.2001Biochemistry40，11246-11250)，由此推斷植物和動(dòng)物的QC具有不同的進(jìn)化源。EP02011349.4揭示了編碼昆蟲谷氨酰胺酰環(huán)化酶的多核苷酸，以及由其編碼的多肽。這個(gè)申請(qǐng)進(jìn)一步提供了包含具有該發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。分離的多肽和包含昆蟲QC的宿主細(xì)胞用于篩選降低谷氨酰胺酰環(huán)化酶活性的制劑的方法中。這種制劑被描述為可用作殺蟲劑。本發(fā)明的主題特別用于Αβ_相關(guān)疾病的領(lǐng)域，這種疾病的一個(gè)實(shí)例是阿爾茨海默病。阿爾茨海默病(AD)特征在于與營(yíng)養(yǎng)不良的神經(jīng)元、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)的胞外淀粉樣斑塊的異常聚集(Terry，R.D.andKatzman,R.1983AnnNeurol14,497-506；Glenner,G.G.andWong,C.W.1984BiochemBiophysResComm120,885-890；Intagaki,S.etal.1989JNeuroimmunol24,173-182；Funato,H.etal.1998AmJPathol152,983-992；Selkoe,D.J.2001PhysiolRev81，741_766)。淀粉樣-β(簡(jiǎn)寫為Αβ)肽是老年斑的主要成分，且認(rèn)為其直接參與AD的發(fā)病和進(jìn)展，這個(gè)假說由遺傳學(xué)研究支持(Glenner,G.G.andWong,C.W.1984BioehemBiophysResComml20,885-890；Borchelt,D.R.etal.1996Neuron17,1005-1013；Lemere,C.A.etal.1996NatMed2，1146-1150;Mann,D.Μ.andIwatsubo,Τ.1996Neurodegeneration5,115—120；Citron,Μ.etal.1997NatMed3,67-72；Selkoe,D.J.2001PhysiolRev81,741-766)。Αβ是由β-淀粉樣前體蛋白(APP)的蛋白酶解產(chǎn)生的(Kang,J.etal.1987Nature325,733-736；Selkoe,D.J.1998TrendsCellBiol8，447-453)，其相繼在Aβ的N末端被β-分泌酶裂解以及在C末端被γ-分泌酶裂解(Haass,C.andSelkoe,D.J.1993Cell75,1039-1042；Simons,Μ.etal.1996JNeurosci16899-908)。除了在N末端以L-Asp起始的主要Αβ肽之外(Αβ1-42/40)，在老年斑中出現(xiàn)大量異質(zhì)性N-末端截短形式。據(jù)報(bào)道這些縮短的肽與全長(zhǎng)同種型相比在體外更具神經(jīng)毒性且更迅速聚集(Pike,C.J.etal.1995JBiolChem270，23895-23898)。已知N-截短的肽在早期發(fā)作的家族AD(FAD)對(duì)象中過量產(chǎn)生(Saido，Τ.C.etal.1995Neuronl4,457-466；Russo,C,etal.2000Nature405，531—532)，以及在Down's綜合征(DS)腦中早期出現(xiàn)并隨著年齡增加(Russo，C.etal.1997FEBSLett409，411-416，Russo，C.etal.2001NeurobiolDis8,173-180；Tekirian,T.L.etal.1998JNeuropatholExpNeurol57，76-94)。最后，它們的量反映了疾病的進(jìn)展嚴(yán)重程度(Russo,C.etal.1997FEBSLett409,411-416；Guntert,A.etal.2006Neuroscience143,461-475)。其它的翻譯后過程可通過位置1和7的天冬氨酸的異構(gòu)化或外消旋轉(zhuǎn)化以及通過殘基3和11的谷氨酸的環(huán)化進(jìn)一步修飾N-末端。在位置3含有焦谷氨酸的同種型[Ai3N3(pGlu)-40/42]代表老年斑中主要形式的N-截短種類-占Aβ總量的大約50%(Mori,H.etal.1992JBiolChem267,17082-17086,Saido,Τ.C.etal.1995Neuron14,457-466；Russo,C.etal.1997FEBSLett409,411-416；Tekirian,Τ.L.etal.1998JNeuropatholExpNeurol57,76-94；Geddes,J.W.etal.1999NeurobiolAging20,75-79；Harigaya,Y.etal.2000BiochemBiophysResCommun276，422-427)，其也存在于前淀粉樣損害中(Lalowski,M.etal.1996JBiolChem271，33623-33631)。AβN3(pE)肽的積累可能是由于增強(qiáng)聚集及賦予對(duì)大多數(shù)氨基肽酶抗性的結(jié)構(gòu)修飾所致(Saido，T.C.etal.1995Neuron14,457-466；Tekirian,Τ.L.etal.1999JNeurochem73,1584—1589)。這種證據(jù)提供了ΑβΝ3(ρΕ)肽在AD發(fā)病中起關(guān)鍵作用的線索。然而，對(duì)于其神經(jīng)毒性和聚集性質(zhì)所知甚少(He，W.andBarrow,C.J.1999Biochemistry38，10871-10877；Tekirian,Τ.L.etal.1999JNeurochem73，1584-1589)。此外，這些同種型對(duì)于膠質(zhì)細(xì)胞的作用以及膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于這些肽的應(yīng)答完全未知，盡管激活的膠質(zhì)細(xì)胞與老年斑嚴(yán)格相關(guān)且可能積極促進(jìn)了淀粉樣沉積物的積累。在近年來的研究中，在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中研究7Αβ1-42、Aβ1-40、[pGlu3]A33-42、[pGlu3]Aβ3—40、[pGlull]A^11-42禾口[^Glull]Aβ11-40肽的毒性、聚集性質(zhì)以及分解代謝，示出焦谷氨酸修飾加劇Aβ-肽的毒性性質(zhì)，且還抑制其由培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的降解。Shirotani等研究了在體外感染Sindbis病毒的原代皮質(zhì)神經(jīng)元中[PGlu3]Ai3肽的產(chǎn)生。他們構(gòu)建了淀粉樣前體蛋白互補(bǔ)DNA，其通過氨基酸取代和缺失編碼[PGlu3]Ai3的潛在前體。對(duì)于一個(gè)起始是N-末端谷氨酰胺殘基而不是天然前體中的谷氨酸的人工前體而言，推測(cè)是自發(fā)轉(zhuǎn)化或者通過谷氨酰胺酰環(huán)化酶轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸。在[PGlu3]Ai3的天然前體中位置3的N-末端谷氨酸的環(huán)化機(jī)制在體外、原位或體內(nèi)均未被確定(Shirotani，K.etal.2002NeuroSciLett327,25-28)發(fā)明概述本發(fā)明包含用于Αβ肽相關(guān)疾病的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物模型的方法和組合物。特別地，本發(fā)明包含過表達(dá)Αβ-肽的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。本發(fā)明人產(chǎn)生了表達(dá)SEQIDNo1所示Αβ3Ε-42的轉(zhuǎn)基因小鼠品系(tgN3E_42)或者表達(dá)SEQIDNo2所示ΑβN3Q-42的轉(zhuǎn)基因小鼠品系(tgN3Q_42)。在tgN3Q_42小鼠腦中觀測(cè)到最高水平AβN3(pGlu)。在許多腦部區(qū)域中觀測(cè)到強(qiáng)表達(dá)，包括海馬CAl神經(jīng)元以及對(duì)于tgN3Q-42在小腦Purkinje細(xì)胞。TgN3Q_42小鼠產(chǎn)生大量Purkinje細(xì)胞變性，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及嚴(yán)重神經(jīng)學(xué)表型，導(dǎo)致過早死亡。年輕的(直至4周齡)tgN3E-42純合小鼠示出無明顯神經(jīng)病變，然而在tgN3E-42純合小鼠(3月齡)中，使用兩種不同抗體通過免疫組織化學(xué)方法在許多腦部區(qū)域中觀測(cè)到Αβ強(qiáng)表達(dá)。這些區(qū)域包括海馬CAl區(qū)，以及各個(gè)腦干區(qū)域。使用針對(duì)Aβ的抗體4G8在純合和野生型動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)Purkinje細(xì)胞染色，而用針對(duì)Aβ的抗體6Ε10標(biāo)記的切片未示出任何免疫反應(yīng)性。對(duì)Aβ(N3pGlu-42)的免疫組織化學(xué)分析在CAl和腦干中示出相似染色模式，但是在CA3中額外示出標(biāo)記。這些數(shù)據(jù)確證CAl形態(tài)學(xué)中的明顯改變。對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)和Αβ(N3pGlu-42)進(jìn)行雙免疫熒光染色表明在tgN3E_42小鼠的CAl區(qū)域中顯著增高的神經(jīng)膠質(zhì)數(shù)目(圖3)。純合的tgN3E-42小鼠示出神經(jīng)變性組合情緒改變(圖8)、認(rèn)知障礙(圖9A、圖9B和圖9C)及由于運(yùn)動(dòng)障礙導(dǎo)致的體重減輕(圖10)的進(jìn)展性表型。這些發(fā)現(xiàn)顯然表明Αβ(N3pGlu-42)形成與組織病理學(xué)的關(guān)系。最重要的是，本文描述的模型首次在幾周的年齡顯著積累Αβ(N3pGlu-42)，伴隨神經(jīng)元喪失。這些獨(dú)特的結(jié)果使在轉(zhuǎn)基因小鼠中應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因策略成為研究不同的淀粉樣肽的神經(jīng)毒性性質(zhì)的優(yōu)異方法。本文描述的前原-策略(pr印ro-strategy)因此可用于其它肽如ADaruAbri或者Αβ-相關(guān)肽。在與小鼠谷氨酰胺酰環(huán)化酶(QC)轉(zhuǎn)基因小鼠雜交繁育后，雜合tgN3E_42小鼠中Αβ(N3pGlu-42)水平顯著升高，示出原則上QC可催化谷氨酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸。這些數(shù)據(jù)表明Αβ(N3pGlu-42)在神經(jīng)元內(nèi)的增加的積累足以產(chǎn)生變性和共濟(jì)失調(diào)，且表明可建立由于焦谷氨酸形成導(dǎo)致的神經(jīng)變性的小鼠模型。本發(fā)明進(jìn)一步包含篩選調(diào)節(jié)Αβ_肽相關(guān)疾病的生物活性劑的組合物和方法，所述疾病包括但不限于輕度認(rèn)知障礙(MCI)、阿爾茨海默病(AD)、腦淀粉樣血管病、Lewy體癡呆、唐氏綜合征中的神經(jīng)變性、遺傳性腦出血伴淀粉樣變(hereditarycerebralhemorrhagewithamyloidosis,荷蘭型)、家族性丹麥型癡呆(FamilialDanishDementia)、家族性英國(guó)型癡呆(FamilialBritishDementia)、伴有或不伴有幽門螺桿菌感染的潰瘍性疾病和胃癌、病原性精神病癥(pathogenicpsychoticconditions)、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎癥性宿主應(yīng)答、癌癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、獲得性免疫缺陷綜合征、移植排斥、亨廷頓舞蹈癥(HD)、受損的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、內(nèi)皮中白細(xì)胞粘附和遷移過程、攝食減少、睡眠-覺醒(sleep-wakefulness)、能量代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)受損、自主功能受損、激素平衡受損和體液調(diào)節(jié)受損以及關(guān)島帕金森-癡呆復(fù)合征(GuamParkinson-Dementiacomplex)。本發(fā)明另一方面包含用于篩選QC和/或QPCTL抑制劑的方法和組合物。此外，本發(fā)明包含治療和/或預(yù)防Αβ_肽相關(guān)疾病的方法和組合物，特別是抑制Αβ-肽相關(guān)毒性和/或聚集傾向的方法和組合物。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供過表達(dá)特定Αβ_肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的另一目的是提供編碼特定Aβ-肽的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的再一目的是提供與啟動(dòng)子連接的編碼Aβ-肽的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的另一目的是提供非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型系統(tǒng)。本發(fā)明的再一目的是提供非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型系統(tǒng)，用以在特定組織類型中研究Aβ-肽的體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)和作用。本發(fā)明的另一目的是提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過表達(dá)淀粉樣肽ADan禾ΠABri。另外，先前的抑制研究示出人和小鼠QC是金屬依賴性轉(zhuǎn)移酶。QC脫輔基酶可以由鋅離子最有效地再活化，且鋅依賴性氨基肽酶的金屬結(jié)合基序也存在于人QC中。與活性位點(diǎn)結(jié)合的金屬相互作用的化合物是強(qiáng)力抑制劑。先前示出重組人QC以及得自腦提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺酰以及谷氨酰環(huán)化。最驚人的是發(fā)現(xiàn)QC-催化的Glu1-轉(zhuǎn)化在大約ρΗ6.0最有利，而Gln1-轉(zhuǎn)化為PGlu-衍生物在最佳ρΗ為大約8.0時(shí)出現(xiàn)。由于pGlu-Aβ-相關(guān)肽的形成可以受重組人QC和得自豬垂體提取物的QC活性的抑制作用抑制，因此酶QC在治療例如阿爾茨海默病的藥物開發(fā)中是靶位。通過給予哺乳動(dòng)物Aβ_肽活性的效應(yīng)物，可以防止或者減輕或者治療選自如下的病癥輕度認(rèn)知障礙(MCI)、阿爾茨海默病(AD)、腦淀粉樣血管病、Lewy體癡呆、唐氏綜合征中的神經(jīng)變性、遺傳性腦出血伴淀粉樣變(荷蘭型)、家族性丹麥型癡呆、家族性英國(guó)型癡呆、伴有或不伴有幽門螺桿菌感染的潰瘍性疾病和胃癌、病原性精神病癥、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎癥性宿主應(yīng)答、癌癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、獲得性免疫缺陷綜合征、移植排斥、亨廷頓舞蹈癥(HD)、受損的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、內(nèi)皮中白細(xì)胞粘附和遷移過程、攝食減少、睡眠-覺醒、能量代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)受損、自主功能受損、激素平衡受損和體液調(diào)節(jié)受損。進(jìn)一步地，通過給予哺乳動(dòng)物Αβ_肽活性的效應(yīng)物，可以刺激胃腸道細(xì)胞增殖，優(yōu)選胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖，產(chǎn)酸壁細(xì)胞以及分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的急性酸分泌和分化。此外，通過給予哺乳動(dòng)物Aβ_肽活性的效應(yīng)物，可以抑制骨髓祖細(xì)胞的增殖。另外，給予Aβ_肽抑制劑可導(dǎo)致雄性生育能力抑制。本發(fā)明提供了用于腸道外給予、腸道內(nèi)給予或者口服給予的藥物組合物，所述藥物組合物包含Aβ-肽的至少一種效應(yīng)物組合常用載體和/或賦形劑。附圖簡(jiǎn)述通過附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的這些及其它方面。圖1產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建體及在2月齡小鼠腦中的表達(dá)譜。(a)，Ai3Nl_42在位置1具有天冬氨酸(D)而起始，ΑβΝ3Ε-42在位置3具有谷氨酸(E)而起始以及AβN3Q-42在位置3具有谷氨酰胺(Q)而起始。N-截短的ΑβΝ3Ε-42和Ai3N3Q-42肽可以通過QC活性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生ΑβΝ3(ρΕ)-42。(b)，轉(zhuǎn)基因載體的示意圖。tgN3E-42和tgN3Q-42轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)在Thyl啟動(dòng)子控制下的Αβ(Ν3Ε-42)或者Αβ(N3Q-42)，且與小鼠TRH的前原肽(pr印ro-p印tide)(氨基酸甲硫氨酸1_精氨酸76)融合。QC轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)在CAG啟動(dòng)子控制下的小鼠QC小基因(mQPCT)。對(duì)野生型(N=6)、QC(N=6)、tgN3E_42(N=9)、tgN3E-42/QC(N=9)和tgN3Q_42(N=4)小鼠腦半球裂解物中的Αβ(χ-42)和Aβ(N3pGlu-42)進(jìn)行ELISA分析(c_e)。(c)，與野生型對(duì)照組相比，在tgN3E_42小鼠中發(fā)現(xiàn)Αβ(χ-42)水平顯著增加(P<0.0001)。與tgN3E-42(P<0.0001，未配對(duì)t-檢驗(yàn))和tgN3E-42-QC雙轉(zhuǎn)基因小鼠(P<0.0001，未配對(duì)t-檢驗(yàn))相比，tgN3Q_42示出最高水平的Αβ(x-42)。(d)與單獨(dú)tgN3E-42表達(dá)相比，tgN3E_42_QC雙轉(zhuǎn)基因小鼠水平增加。與tgN3E-42(P<0.0001，未配對(duì)t-檢驗(yàn))和tgN3E_42_QC雙轉(zhuǎn)基因(P<0.0001，未配對(duì)t_檢驗(yàn))小鼠相比38吧0-42小鼠示出最高水平八3(N3pGlu-42)。(e)對(duì)于Αβ(N3pGlu_42)與總Αβ(x-42)的比率也是如此。所有小鼠均是2月齡。數(shù)值是平均值士s.e.m.，乍<0.05。***P<0.001。圖2:tgN3Q-42轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定。(a)，(b)野生型(WT)和tgN3Q_42小鼠的圖片，示出tgN3Q-42小鼠一般較小且表現(xiàn)出彎曲姿勢(shì)(b)。(c)tgN3Q-42腦的目測(cè)檢驗(yàn)表明與年齡匹配的野生型同窩出生的小鼠(2月齡)相比萎縮的小腦。(d)與年齡匹配的野生型同窩出生的小鼠(2月齡小鼠)相比，雌性和雄性tgN3Q-42小鼠均示出體重減輕(未配對(duì)t-檢驗(yàn))。(e)與野生型同窩出生小鼠相比，tgN3Q-42小鼠顯示顯著降低的存活率(P=0.0002；LogrankTest)。數(shù)值是平均值士s.e.m.，***P<0.001。圖3A:tgN3Q-42小鼠的免疫組織化學(xué)染色。(a)使用抗體4G8進(jìn)行免疫染色表明在海馬的CAl錐體層中的強(qiáng)Αβ積累(插圖示出在低倍顯微鏡下海馬概觀)，而使用抗Αβ(N3pGlu)的抗體僅檢測(cè)到有限的免疫反應(yīng)性(b)。(c)通過4G8染色示出的丘腦中細(xì)胞外彌漫性Αβ沉積。(d-e)小腦中Αβ染色(4G8)限于Purkinje細(xì)胞。(f-g)通過抗Aβ(N3pGlu)的抗體示出大多數(shù)Purkinje細(xì)胞積累以焦谷氨酸起始N-截短的Αβ。(h)GFAP染色表明tgN3Q-42小鼠中Bergmarm神經(jīng)膠質(zhì)的顯著染色，而野生型動(dòng)物(i)持續(xù)陰性。小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Ibal表明在tgN3Q-42小鼠中圍繞Purkinje細(xì)胞及在白質(zhì)束中的小膠質(zhì)細(xì)胞群(j)，而在野生型同窩出生的小鼠中則沒有(k)。(1)用4G8和抗遍在蛋白對(duì)Purkinje細(xì)胞進(jìn)行雙重染色。注意在4G8陽性Purkinje細(xì)胞中的豐富的遍在蛋白免疫反應(yīng)性，這是變性的標(biāo)志物。圖3B純合的tgN3E_42表達(dá)小鼠的免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色。(a)-(d)海馬CAl區(qū)域的4G8染色示出僅在轉(zhuǎn)基因小鼠(a)和(c)的CAl層中的Αβ積累，野生型小鼠，(b)，(d)tgN3E-42純合小鼠)。(e),(f)抗Αβ(N3pGlu)的抗體表明僅在轉(zhuǎn)基因小鼠(e),tgN3E-42純合小鼠的海馬的CAl錐體層中的強(qiáng)Aβ積累；(f)，野生型小鼠)。tgN3E_42純合小鼠與野生型小鼠的CAl形態(tài)學(xué)對(duì)比表明在轉(zhuǎn)基因小鼠的這個(gè)區(qū)域(g)，(h)中神經(jīng)元喪失，(g)，野生型小鼠；(h)，tgN3E-42純合轉(zhuǎn)基因小鼠)。雙重免疫熒光染色示出tgN3E-42純合小鼠與野生型小鼠相比CAl中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著增加(i)，(j)。圖4:在位置3具有焦谷氨酸而起始的Αβ(ΑβΝ3(ρΕ))的形成由谷氨酰胺酰環(huán)化酶(QC)催化。N-末端以在位置3具有谷氨酸(ΑβΝ3Ε)或谷氨酰胺(Ai3N3Q)而起始的Αβ可作為QC底物以產(chǎn)生ΑβΝ3(ρΕ)。在體外已經(jīng)示出焦谷氨酸從N-末端谷氨酸的轉(zhuǎn)化較慢，而相反的是從谷氨酰胺形成焦谷氨酸是快速酶促過程(Schilling，S.，Hoffmann,Τ.,Manhart,S.,Hoffmann,Μ·&Demuth,H.U.Glutaminylcyclasesunfoldglutamylcyclasesactivityundermildacidconditions.FEBSLett563,191-196(2004))。這個(gè)觀測(cè)結(jié)果在細(xì)胞培養(yǎng)中證實(shí)(Cynis,H.，etal.InhibitionofGlutaminylcyclasesalterspyroglutamateformationinmammaliancells.BiochimBiophysActa1764,1618-1625(2006))，且根據(jù)本發(fā)明在體內(nèi)腦中出現(xiàn)。此外，細(xì)胞培養(yǎng)物中QC的藥物學(xué)抑制導(dǎo)致ΑβΝ3(ρΕ)水平降低(Cynis,H.,etal.Inhibitionofglutamylcyclasesalterspyroglutamateformationinmammaliancells.BiochimBiophysActa1764,1618-1625(2006))。圖5在2月齡tgN3Q_42小鼠腦切片中使用Aβ抗體4G8的免疫組織化學(xué)染色的概觀。在海馬CAl神經(jīng)元、小腦Purkinje細(xì)胞、皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域中觀測(cè)到豐富染色。圖6示出用于制備進(jìn)行原核注射的片段的限制策略。示出了用于產(chǎn)生含有轉(zhuǎn)基因(TRH-Ai3N3Q(3-42)或者TRH-AβN3E(3_42)轉(zhuǎn)基因+Thyl啟動(dòng)子)的7170-bp片段的具有EcoRI限制位點(diǎn)位置的tgN3Q-42質(zhì)粒的示意圖。該圖不是按比例描繪的。圖7示出PCR基因分型方法學(xué)。示出用于檢測(cè)隨機(jī)整合和轉(zhuǎn)基因完整性的引物的定位。圖中示出相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小。粗線表示質(zhì)粒主鏈序列。半箭頭(Halfarrows)表示引物位置。該圖不是按比例描繪的。TRH-AβN3E(3-42)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體具有相同結(jié)構(gòu)。圖8例證了7周齡小鼠在暗光箱中的行為。與野生型同窩出生的小鼠相比，tgN3E-42小鼠示出進(jìn)入明亮區(qū)域的次數(shù)顯著減少(雜合小鼠ρ<0.01，純合小鼠ρ<0.05)，表明tgN3E-42小鼠情緒改變。圖9A示出3月齡tgN3E_42小鼠在恐懼條件裝置中的行為與雜合小鼠和野生型同窩出生小鼠相比，純合小鼠在情境恐懼下反應(yīng)為活動(dòng)增加及僵直(freezing)行為降低。圖9B示出在恐懼條件裝置中3月齡tgN3E_42小鼠的行為與同窩出生小鼠相比純合tgN3E-42小鼠在線索恐懼條件下反應(yīng)為活動(dòng)增加。圖9C示出在恐懼條件裝置中3月齡tgN3E_42小鼠的行為純合tgN3E_42小鼠示出明顯縮短的僵直(freezing)持續(xù)時(shí)間。圖9A、圖9B和圖9C的結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)基因tgN3E_42小鼠的認(rèn)知下降。圖10示出3月齡的tgN3E_42小鼠的體重。在雜合和純合小鼠中觀測(cè)到體重降低，純合小鼠達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。體重降低是由于同種tgN3E-42小鼠的運(yùn)動(dòng)缺陷所致，這由于pGlu-Αβ3-42積累和神經(jīng)元喪失而在年幼發(fā)生。圖11示出在雜合和純合tgN3E_42小鼠腦中荷載的Αβ(χ_42)(上圖)和pGlu-Αβ(3-42)(下圖)。在從腦中提取之后，通過ELISA在SDS-和甲酸級(jí)分中確定Aβ濃度。計(jì)算Aβ的總量，且針對(duì)腦濕重標(biāo)準(zhǔn)化。僅分析雄性動(dòng)物(N=2-6)。純合的動(dòng)物積累顯著更高濃度的pGlu-Αβ，伴隨神經(jīng)元喪失、記憶力和行為受損。圖12示出在雜合和純合的tgN3E_42小鼠、tgN3Q_42和APPsw小鼠腦中荷載的pGlu-Αβ(3-42)(上圖)和Αβχ-42(下圖)。在從腦中提取之后，通過ELISA在SDS-和甲酸級(jí)分中確定Aβ濃度。計(jì)算Aβ的總量，且針對(duì)腦濕重標(biāo)準(zhǔn)化。純合的tgN3E-42和雜合的tgN3Q-42動(dòng)物積累顯著更高濃度的pGlu-Αβ，伴隨神經(jīng)元喪失、記憶力和行為受損。圖13示出在應(yīng)用強(qiáng)的強(qiáng)直收縮(tetanus)(時(shí)間點(diǎn)0)之后EPSP的長(zhǎng)期增強(qiáng)作用。tgN3E-42純合小鼠的LTP與野生型小鼠相比顯著減少(野生型小鼠vstg小鼠p=0.007；tg小鼠n=18；野生型小鼠n=12；重復(fù)測(cè)量AN0VA)。類似跟蹤代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)在致強(qiáng)直作用之前10分鐘(1)和致強(qiáng)直作用之后240分鐘(2)的典型記錄。通過下文詳細(xì)描述將更加理解本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢(shì)和特征。發(fā)明詳述本發(fā)明包含產(chǎn)生用以研究Αβ_肽相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法和組合物，以及轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。本發(fā)明特別包含產(chǎn)生過表達(dá)Αβ-肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法和組合物，以及轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。本發(fā)明進(jìn)一步包含檢測(cè)Αβ-肽抑制劑的方法和組合物以及具有Aβ-肽抑制劑的預(yù)防/治療和藥物組合物。本發(fā)明還提供了治療如下病癥的新方法輕度認(rèn)知障礙(MCI)、阿爾茨海默病、家族性丹麥型癡呆(FDD)、家族性英國(guó)型癡呆(FBD)以及唐氏綜合征中的神經(jīng)變性。沉積在阿爾茨海默病和唐氏綜合征患者腦中的淀粉樣β_肽的N-末端以及沉積在家族性丹麥型癡呆和家族性英國(guó)型癡呆中的淀粉樣肽Adan和Abri的N-末端具有焦谷氨酸。在FDD中的Adan和FBD中的Abri以及阿爾茨海默病和唐氏綜合征中的Aβ的N-末端的pGlu形成已經(jīng)示出是相關(guān)疾病的發(fā)生和進(jìn)展的重要事件，因?yàn)樾揎椀牡矸蹣应?肽、ADan和Abri示出增強(qiáng)的淀粉樣蛋白聚集和毒性的傾向，很可能使疾病的發(fā)作和進(jìn)展惡化(Russo，C.etal.2002JNeurochem82,1480-1489；Ghiso，J.etal.2001Amyloid8，277—284)。定義術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指已經(jīng)摻入宿主基因組中或者能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制以及能導(dǎo)致一或多個(gè)細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)的DNA節(jié)段。舉例的轉(zhuǎn)基因能使宿主細(xì)胞或者從中產(chǎn)生的動(dòng)物與相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或動(dòng)物相比具有新的表型。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指非人動(dòng)物、通常是哺乳動(dòng)物，該動(dòng)物具有在其細(xì)胞一部分中作為染色體外元件存在的非內(nèi)源核酸序列或者穩(wěn)定整合進(jìn)其種系DNA中的非內(nèi)源核酸序列。術(shù)語“構(gòu)建體”是指重組核酸、通常為重組DNA，其為了特異性核苷酸序列的表達(dá)而產(chǎn)生，或者用于構(gòu)建其它重組核苷酸序列。所述重組核酸可編碼例如嵌合或人源化多肽。多肽在本文是指包含10個(gè)以上氨基酸的所有可能的氨基酸序列。術(shù)語“可操縱地連接“是指DNA序列與調(diào)節(jié)序列以這樣的方式連接，由此當(dāng)合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)使得基因表達(dá)。術(shù)語“可操縱地插入”是指感興趣的核苷酸序列位于指導(dǎo)導(dǎo)入的感興趣的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的核苷酸序列的鄰近。轉(zhuǎn)基因包含本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的Aβ-肽多核苷酸包括Aβ-肽cDNA，且應(yīng)也包括修飾的Αβ-肽cDNA。如本文所用，核酸的“修飾”可包括與參考序列相比一或幾個(gè)核苷酸的添加、缺失或者取代。核酸的修飾可包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不改變編碼的氨基酸序列的取代，或者導(dǎo)致保守取代。這種修飾可相應(yīng)于有意產(chǎn)生的變化，如加入PolyA尾部，或者相應(yīng)于在核酸復(fù)制期間作為突變產(chǎn)生的變化。如本文所用，術(shù)語“基本相同的核苷酸序列”是指與參考多核苷酸具有足夠相同性的DNA，由此其在中等嚴(yán)格或者更高嚴(yán)格雜交條件下與參考核苷酸雜交。與參考核苷酸序列具有“基本相同的核苷酸序列”的DNA與參考核苷酸序列的序列相同性范圍可以為至少60%至至少95%。短語“中等嚴(yán)格雜交條件”是指使得靶核酸與互補(bǔ)核酸結(jié)合的條件。雜交的核酸通常具有至少大約60%至至少大約95%的相同性。中等嚴(yán)格條件與如下條件等同在50%甲酰胺、5XDenhart's溶液、5X磷酸鈉EDTA緩沖液(SSPE)、0.2%SDS(Aldrich)中在大約42°C雜交，隨后在大約42°C在0.2XSSPE、0.2%SDS(Aldrich)中洗滌。高嚴(yán)格雜交條件是指這樣的條件，即允許僅那些在大約在65°C在0.018MNaCl中形成穩(wěn)定雜交體的核酸序列雜交的條件，例如如果雜交體在大約65°C在0.018MNaCl中不穩(wěn)定，其在高嚴(yán)格條件下也不穩(wěn)定。高嚴(yán)格條件可例如是在50%甲酰胺、5xDenhart's溶液、5xSSPE、0.2%SDS中在大約42°C雜交，隨后在大約65°C在0.IXSSPE和0.SDS中洗滌。其它合適的中等嚴(yán)格和高嚴(yán)格雜交緩沖液和條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，且例如在如下文獻(xiàn)中描述Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，2nded.，ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.(1989)；Ausubeletal.(CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999))。由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因編碼的氨基酸序列可以是得自人的Αβ_肽序列，或者得自任何物種、優(yōu)選鼠物種的Αβ-肽同源物。由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因編碼的氨基酸序列也可以是Αβ-肽氨基酸序列的片段，只要該片段保留全長(zhǎng)Αβ-肽序列的一些或者全部功能即可。所述序列也可以是修飾的Αβ-肽序列。各種取代、缺失或者添加是改變、加入或者缺失一個(gè)氨基酸或者少量氨基酸(典型低于10%，更典型低于5%，更典型低于1%)。氨基酸序列的“修飾”包含氨基酸序列的保守取代。本領(lǐng)域熟知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。如下六組均包含彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴；2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。只要所述多肽保留Aβ_肽的一些或全部結(jié)構(gòu)和/或功能特性，其序列中可包含其它小修飾。舉例的結(jié)構(gòu)或功能特性包括序列相同性或?qū)嵸|(zhì)相似性、抗體反應(yīng)性、保守結(jié)構(gòu)域如RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或酸性結(jié)構(gòu)域的存在。DNA構(gòu)建體和載體本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含上述Αβ-肽轉(zhuǎn)基因的DNA構(gòu)建體。如本文所用，術(shù)語“DNA”構(gòu)建體是指DNA分子中遺傳元件的特異性排列。除了人Αβ-肽或者其突變形式之夕卜，本發(fā)明還提供了使用來自其它物種的多肽以及來自非人哺乳動(dòng)物的突變的Αβ-肽的DNA構(gòu)建體。如果需要，所述DNA構(gòu)建體可以被工程化為與合適的表達(dá)元件如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操縱地連接，以使得所述DNA構(gòu)建體中遺傳元件在合適細(xì)胞或組織中表達(dá)。表達(dá)控制機(jī)制的使用使得可以定向輸送和表達(dá)感興趣的基因。例如，本發(fā)明的構(gòu)建體可以使用表達(dá)盒構(gòu)建，所述表達(dá)盒包含在5'-3'轉(zhuǎn)錄方向的與在腦組織中基因表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)、編碼突變體或野生型Αβ-肽的DNA，以及在宿主動(dòng)物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。也可以存在一或多個(gè)內(nèi)含子。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以對(duì)于宿主動(dòng)物是內(nèi)源的或者對(duì)于宿主動(dòng)物是外來或外源的。本文描述的DNA構(gòu)建體可以摻入載體中以增殖或者轉(zhuǎn)染進(jìn)合適細(xì)胞中，產(chǎn)生過表達(dá)Aβ-肽的突變體非人動(dòng)物，這些也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于希望的性質(zhì)選擇載體，例如用于在特定細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生載體。載體可以含有使可操縱地連接的核酸組織特異性或者可誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于確定使Αβ_肽在希望的組織中表達(dá)的合適的組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。應(yīng)注意如本文所述的組織特異性表達(dá)不需要在除了優(yōu)選的組織之外的組織中完全無表達(dá)。相反，“細(xì)胞特異性”或者“組織特異性”表達(dá)是指感興趣的基因的大部分表達(dá)是在優(yōu)選的細(xì)胞類型或者組織中。所述載體中也可以包含各種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，以表達(dá)Αβ_肽或者可以被調(diào)節(jié)的核酸。這種誘導(dǎo)型系統(tǒng)包括例如四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Gossen&Bizard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,895547-5551(1992)；Gossenetal.,Science,26817664769(1995)；Clontech,PaloAlto,Calif.)；由重金屬誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子；應(yīng)答蛻皮激素或相關(guān)類固醇如muristerone的昆蟲類固醇激素(Noetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,933346-3351(1996)；Yaoetal.，Nature,366:476_479(1993)；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)；由類固醇如糖皮質(zhì)激素和雌激素誘導(dǎo)的小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)(Leeetal.,Nature,294=228-232(1981)；以及可由溫度改變誘導(dǎo)的熱激蛋白啟動(dòng)子；大鼠神經(jīng)元特異性烯醇酶基因啟動(dòng)子(Forss-Petter，etal.,Neuron5；197-197(1990))；人β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子(Ray,etal.,GenesandDevelopment(1991)5:2265_2273)；人血小板衍生生長(zhǎng)因子B(PDGF-B)鏈基因啟動(dòng)子(Sasahara,etal.，Cell(1991)64-.2X1-221)；大鼠鈉離子通道基因啟動(dòng)子(Maue，etal.，Neuron(1990)4:223_231)；人銅-鋅過氧化物岐化酶基因啟動(dòng)子(Ceballos-Picot,etal.,BrainRes.(1991)552:198-214)；以及哺乳動(dòng)物POU結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)基因家族成員的啟動(dòng)子(Xietal.，(1989)Nature340:35-42)。調(diào)節(jié)元件，包括啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，根據(jù)調(diào)節(jié)性質(zhì)可以是組成型或被調(diào)節(jié)的，且可以在各種組織或者在一種或一些特殊組織中被調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)序列或者調(diào)節(jié)元件與本發(fā)明的多核苷酸序列之一可操縱地連接，由此所述多核苷酸序列與所述調(diào)節(jié)序列之間的物理和功能關(guān)系使得所述多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄?？捎糜谠谡婧思?xì)胞中表達(dá)的載體可包括例如調(diào)節(jié)元件，包括CAG啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)類固醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、Pgtf、Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)啟動(dòng)子、thy-Ι啟動(dòng)子等等。如果需要，所述載體可含有選擇標(biāo)記。如本文所用，“選擇標(biāo)記”是指為已經(jīng)導(dǎo)入選擇標(biāo)記的細(xì)胞提供可選擇表型的遺傳元件。選擇標(biāo)記通常是基因，其基因產(chǎn)物提供對(duì)于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或者殺死細(xì)胞的物質(zhì)的抗性。許多選擇標(biāo)記可用于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中，包括例如Neo、Hyg、hisD、Gpt和Ble基因，如在如下文獻(xiàn)中描述Ausubeletal.(CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999))和美國(guó)專利No.5，981，830?？捎糜谶x擇選擇標(biāo)記存在的藥物包括例如對(duì)于Neo的G418，對(duì)于Hyg的潮霉素，對(duì)于hisD的組氨醇，對(duì)于Gpt的黃嘌呤以及對(duì)于Ble的博來霉素(見Ausubeletal,supra,(1999)；美國(guó)專利No.5，981，830)。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可摻入陽性選擇標(biāo)記、陰性選擇標(biāo)記或者這兩種標(biāo)記(見例如美國(guó)專利No.5，981，830)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是如下DNA構(gòu)建體和融合蛋白mTRH-Aβ(Ν3Ε-42)，mTRH-Aβ(N3Q-42)。優(yōu)選的克隆載體是含有Thy-I序列的pUC18。非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明主要提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其基因組包含編碼Αβ_肽的轉(zhuǎn)基因。所述DNA片段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組中。含有希望的基因序列的DNA分子可以通過任何方法導(dǎo)入多能細(xì)胞如ES細(xì)胞中，由此使得導(dǎo)入的分子在其同源區(qū)經(jīng)歷重組。可以使用的技術(shù)包括但不限于磷酸鈣/DNA共沉淀法、DNA顯微注射進(jìn)細(xì)胞核中、電穿孔、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染和聚陽離子方法(例如e.g.，polybrene、polyornithine等)。所述DNA可以是單鏈或雙鏈DNA，線性或環(huán)狀(見例如Hoganetal.,ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory(1986)；Hoganetal.,ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual,seconded.,ColdSpringHarborLaboratory(1994),美國(guó)專禾IjNo.5，602，299,5,175，384,6,066，778,4,873，191和6，037，521；retrovirusmediatedgenetransferintogermlines(VanderPuttenetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6148-6152(1985))；genetargetinginembryonicstemcells(Thompsonetal.,Cell56:313-321(1989))；electroporationofembryos(Lo,MolCell.Biol.31803-1814(1983))；以及sperm-mediatedgenetransfer(Lavitranoetal.,Cell57:717-723(1989))。例如，合子是顯微注射的良好靶，顯微注射合子的方法為本領(lǐng)域熟知(見US4，873，191)。在不同發(fā)育階段的胚胎細(xì)胞也可以用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。根據(jù)胚胎細(xì)胞的發(fā)育階段使用不同方法。這種轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞(ES)可以因此在其導(dǎo)入胚泡階段胚胎的囊胚腔中之后使胚胎定居且促成所得嵌合動(dòng)物的種系(見Jaenisch，Science2401468-1474(1988)綜述)。在將轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞導(dǎo)入囊胚腔中之前，如果轉(zhuǎn)基因提供這種選擇方式，可以對(duì)轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞進(jìn)行各種選擇以富集具有整合的轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞比例?；蛘?，可以使用PCR篩選具有整合的轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染也可以用于在非人動(dòng)物中導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。發(fā)育中的非人胚胎可以在體外培養(yǎng)成胚泡階段。在此期間，分裂球可以是進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶(Jaenisch,Proc.Nati.Acad.Sci.USA73:1260-1264(1976))。通過酶處理除去透明帶獲得分裂球的有效感染(Hoganetal.,supra,1986)0用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)典型是攜帶轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahneretal.,Proc.Natl.AcadSci.USA82:6927-6931(1985)；VanderPuttenetal.,Proc.Natl.AcadSci.USA82:6148-6152(1985))。通過在單層產(chǎn)生病毒的細(xì)胞上培養(yǎng)所述分裂球可易于且有效地獲得轉(zhuǎn)染(VanderPutten,supra,1985；Stewartetal.，EMBOJ.6:383_388(1987))?；蛘?，可以在晚期階段進(jìn)行感染?？梢詫⒉《净蛘弋a(chǎn)生病毒的細(xì)胞注射進(jìn)所述分裂球中(JahnerD.etal.,Nature298:623-628(1982))。大多數(shù)建立者(founder)是嵌合轉(zhuǎn)基因的，因?yàn)閾饺雰H在細(xì)胞亞類中發(fā)生，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。再者，所述建立者在基因組的不同位置可含有轉(zhuǎn)基因的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒插入，其在后代中通常是分離的。另外，轉(zhuǎn)基因可以通過妊娠中期胚胎的子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染導(dǎo)入種系中(Jahneretal.,supra，1982)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其它方式包括將逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蛘弋a(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的絲裂霉素C處理的細(xì)胞顯微注射進(jìn)受精卵或者早期胚胎的卵周隙中(WO90/08832(1990)；HaskellandBowen,Mai.Reprod.Dev.40386(1995))也可以使用任何其它技術(shù)將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物中，例如敲入(knock-in)或者拯救(rescue)技術(shù)，以解決本發(fā)明的問題。所述敲入技術(shù)為本領(lǐng)域熟知，例如Casasetal.(2004)AmJPathol165，1289-1300所述。一旦產(chǎn)生建立者動(dòng)物，可以使其繁殖、近交、遠(yuǎn)交或者雜交以產(chǎn)生特定動(dòng)物群體。舉例的這種繁殖策略包括但不限于具有一個(gè)以上整合位點(diǎn)的建立者動(dòng)物的遠(yuǎn)交，以建立獨(dú)立品系；獨(dú)立品系的近交以產(chǎn)生由于每個(gè)轉(zhuǎn)基因的加合表達(dá)作用而以更高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的復(fù)合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(compoundtransgenics)；雜合轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交產(chǎn)生對(duì)于指定整合位點(diǎn)是純合的小鼠，以擴(kuò)大表達(dá)且消除需要通過DNA分子篩選動(dòng)物；獨(dú)立純合品系的雜交產(chǎn)生復(fù)合的雜合或純合品系；在不同的近交背景繁殖動(dòng)物，以檢驗(yàn)修飾等位基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因表達(dá)的作用以及表達(dá)的作用。篩選并評(píng)估所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以選擇具有感興趣表型的那些動(dòng)物。最初的篩選可以使用例如Southern印跡分析或者PCR進(jìn)行，分析動(dòng)物組織以核實(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)基因整合。也可以使用一些技術(shù)評(píng)定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的組織中轉(zhuǎn)基因的mRNA表達(dá)水平，所述技術(shù)包括但不限于對(duì)得自動(dòng)物的組織樣品進(jìn)行Northern印跡分析、原位雜交分析和逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(rt-PCR)。合適組織的樣品可以通過使用特異于所述轉(zhuǎn)基因的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)估?？蛇M(jìn)一步鑒定所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物以鑒別具有可用于本發(fā)明方法中的表型的那些動(dòng)物。特別地，可以使用本文揭示的方法篩選過表達(dá)轉(zhuǎn)基因(如QPCT或QPCTL)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。例如，可以在熒光顯微鏡下觀測(cè)組織切片的熒光存在，表示存在報(bào)道基因。影響Αβ_肽的組織特異性表達(dá)的另一種方法是使用組織特異性啟動(dòng)子。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝特異性；Pinkertetal.,(1987)GenesDev.1:268_277)；淋巴細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(CalameandEaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275)，特別是T細(xì)胞受體啟動(dòng)子(ffinotoandBaltimore(1989)EMBOJ.8:729-733)以及免疫球蛋白啟動(dòng)子(Banerjietal.，(1983)Cell33729-740；QueenandBaltimore(1983)Cell33:741_748)，神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如神經(jīng)絲蛋白啟動(dòng)子、Thy-I啟動(dòng)子或者Bri-蛋白啟動(dòng)子；Sturchler-Pierratetal.，(1997)Proc.Natl.AcadSci.USA9413287-13292，ByrneandRuddle(1989)PNAS86:5473_5477)，胰腺特異性啟動(dòng)子(Edlundetal.，(1985)Science230:912_916)，心臟特異性表達(dá)啟動(dòng)子(α肌漿球蛋白重鏈啟動(dòng)子，Subramaniam,A,JonesWK,GulickJ,WertS,NeumannJ,andRobbinsJ.Tissue-specificregulationofthealpha-myosinheavychaingenepromoterintransgenicmice.JBiolChem266:24613_24620，1991.)，以及乳腺特異性啟動(dòng)子(例如乳清蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專利No.4，873，316和歐洲專利申請(qǐng)公開No.264，166)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的分離的細(xì)胞。所述DNA構(gòu)建體可以通過任何熟知的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入細(xì)胞中(Sambrooketal.，MolecularCloningALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.(1989)；Ausubeletal.,supra,(1999))。或者，所述細(xì)胞可以通過從如本文所述產(chǎn)生的突變的非人哺乳動(dòng)物中分離細(xì)胞而獲得。因此，本發(fā)明提供了分離自本發(fā)明Αβ-肽突變體非人哺乳動(dòng)物、特別是Αβ-肽突變小鼠的細(xì)胞。所述細(xì)胞可得自純合的Αβ-肽突變體非人哺乳動(dòng)物如小鼠，或者雜合的Aβ-肽突變體非人哺乳動(dòng)物如小鼠。效應(yīng)物(Effectors)如本文所用，效應(yīng)物被定義為結(jié)合酶并增加(促進(jìn))或降低(抑制)其體外和/或體內(nèi)活性的分子。一些酶具有影響其催化活性的分子的結(jié)合位點(diǎn)；刺激分子稱作激活物。酶甚至可具有多個(gè)位點(diǎn)以識(shí)別一個(gè)以上的激活物或者抑制劑。酶可以檢測(cè)多種分子的濃度，且使用該信息改變其自身活性。效應(yīng)物可以調(diào)節(jié)酶活性，因?yàn)槊缚梢猿尸F(xiàn)出活性和無活性構(gòu)象激活物是陽性效應(yīng)物，抑制劑是陰性效應(yīng)物。效應(yīng)物不僅在酶的活性位點(diǎn)起作用，而且也在調(diào)節(jié)位點(diǎn)或者變構(gòu)位點(diǎn)起作用，該術(shù)語用于強(qiáng)調(diào)指出調(diào)節(jié)位點(diǎn)是與催化位點(diǎn)不同的酶元件，且用于區(qū)分這種調(diào)節(jié)形式與在催化位點(diǎn)底物與抑制劑之間的競(jìng)爭(zhēng)(Darnell，J.，Lodish,H.andBaltimore,D.1990,MolecularCellBiology2"dEdition,ScientificAmericanBooks,NewYork,page63)。酶抑制劑可逆的酶抑制劑包含競(jìng)爭(zhēng)件抑制劑、非競(jìng)爭(zhēng)件可逆的抑制劑、慢結(jié)合或緊密結(jié)合的抑制劑、過渡態(tài)類似物以及多底物類似物。競(jìng)爭(zhēng)件抑制劑示出:與酶的非共價(jià)相互作用，與底物競(jìng)爭(zhēng)酶活性位點(diǎn)?？赡娴拿敢种苿┑闹饕饔脵C(jī)制以及解離常數(shù)的定義可以如下文所示KonE+I、‘*·E-Ikoff+SE-S,E-P，E+PKd=K.=^-Kn酶-抑制劑[E-I]復(fù)合物的形成阻止底物的結(jié)合，因此反應(yīng)不能進(jìn)行產(chǎn)生正常生理學(xué)產(chǎn)物P。較大的抑制劑濃度[I]導(dǎo)致較大的[E-I]，剩下的底物可以結(jié)合的游離酶較少。非競(jìng)爭(zhēng)件可逆的抑制劑在除了活性位點(diǎn)之外的位點(diǎn)(變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn))結(jié)合導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化，降低或終止其催化活性。慢結(jié)合或者緊密結(jié)合抑制劑是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其中抑制劑與酶之間的平衡緩慢達(dá)到，&較低)，可能是由于必須在所述酶或抑制劑中發(fā)生的構(gòu)象變化所致，通常是過渡態(tài)類似物，在與酶濃度相似的濃度是有效的(亞納摩爾Kd值)由于k。ff值如此低，因此這些類型的抑制劑“幾乎”是不可逆的。過渡杰類似物是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其模擬催化反應(yīng)的酶的過渡態(tài)。由于降低過渡態(tài)的能量而發(fā)生酶催化作用，因此過渡態(tài)結(jié)合有利于底物結(jié)合。多底物類似物對(duì)于包含兩或多個(gè)底物的反應(yīng)，可以設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或者過渡態(tài)類似物使其含有與所述兩或多個(gè)底物類似的結(jié)構(gòu)特征。不可逆的酶抑制劑驅(qū)動(dòng)未結(jié)合的酶和抑制劑與酶抑制劑復(fù)合物之間的平衡(E+I—E-I)一路向右到共價(jià)鍵(lOOkcal/mole)，使得抑制作用不可逆。親和件標(biāo)記試劑活件位點(diǎn)定向的不可逆抑制劑(競(jìng)爭(zhēng)性不可逆抑制劑)由酶識(shí)別(可逆的，特異性結(jié)合)，隨后共價(jià)鍵形成，與底物、過渡態(tài)或者產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，使得藥物與靶酶之間可以特異性相互作用，含有反應(yīng)性官能團(tuán)(例如親核物質(zhì)，-COCH2Br)，使得共價(jià)鍵形成。如下反應(yīng)方案描述了具有其靶酶的活性位點(diǎn)定向試劑，其中Kd是解離常數(shù)，kina。tivati。n是共價(jià)鍵形成速率。E十/<Κο>Ε·~?！薄?gt;￡-f基于機(jī)制的酶失活物(也稱作自殺抑制劑)是活件位點(diǎn)定向試劑(惰性)，其結(jié)合酶活性位點(diǎn)，在此其通過酶催化能力被轉(zhuǎn)化為活性形式(激活)。一旦激活，抑制劑與酶之間形成共價(jià)鍵。如下反應(yīng)方案示出基于機(jī)制的酶失活物的作用機(jī)制，其中Kd是解離常數(shù)，k2是一旦與酶結(jié)合所述抑制劑的激活速率，k3是激活的抑制劑、P與所述酶的解離速率(產(chǎn)物可以仍是活性的)，k4是激活的抑制劑與酶之間共價(jià)鍵形成的速率。<image>imageseeoriginaldocumentpage18</image>失活(共價(jià)鍵形成，k4)必須在解離(k3)之前發(fā)生，否則現(xiàn)在為反應(yīng)性的抑制劑釋放進(jìn)環(huán)境中。分配比率k3/k4釋放的產(chǎn)物與失活的比率應(yīng)最小化，以有效地失活該系統(tǒng)及使不希望的副反應(yīng)最小化。較大的分配比率(有利解離)導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。非競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制劑從非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(僅結(jié)合ES復(fù)合物的抑制劑)的定義中，可以寫出如下等式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>ES復(fù)合物解離底物，解離常數(shù)等于Ks，而ESI復(fù)合物不解離底物(即具有等于0的Ks值)。預(yù)期Michaelis-Menten類型酶的&降低。增加底物濃度導(dǎo)致ESI濃度增加(不能進(jìn)展為反應(yīng)產(chǎn)物的復(fù)合物)，因此抑制作用不能被除去。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制劑。最優(yōu)選的是競(jìng)爭(zhēng)性可逆的酶抑制劑。術(shù)語“k/’或者“K/’和“KD”是結(jié)合常數(shù)，其描述了抑制劑與酶的結(jié)合以及隨后從酶中釋放。另一測(cè)量是"IC5tl”值，其反映抑制劑濃度，在給定底物濃度產(chǎn)生50%酶活性。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是呈現(xiàn)谷氨酰胺酰環(huán)化酶活性的酶的抑制劑。更優(yōu)選地，所述呈現(xiàn)谷氨酰胺酰環(huán)化酶活性的酶的抑制劑是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的是呈現(xiàn)谷氨酰胺酰環(huán)化酶活性的酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其是小分子。尤其優(yōu)選的是呈現(xiàn)谷氨酰胺酰環(huán)化酶活性的酶的小分子抑制劑，其結(jié)合谷氨酰胺酰環(huán)化酶的活性位點(diǎn)金屬離子。如本文所用，術(shù)語“QC”包含谷氨酰胺酰環(huán)化酶(QC，QPCT)和QC-樣(QPCTL)酶。QC與QC-樣酶具有相同或相似的酶活性，進(jìn)一步定義為QC活性。在這方面，QC-樣酶可以在其分子結(jié)構(gòu)方面與QC截然不同。如本文所用，術(shù)語“QC活性”定義為在氨釋放下N-末端谷氨酰胺殘基分子內(nèi)環(huán)化為焦谷氨酸(pGliO或者N-末端L-高谷氨酰胺(homoglutamine)或者L-β-高谷氨酰胺分子內(nèi)環(huán)化為環(huán)狀焦-高谷氨酰胺衍生物。見方案1和2。方案1:QC對(duì)谷氨酰胺的環(huán)化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>方案2=QC對(duì)L-高谷氨酰胺的環(huán)化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>如本文所用，術(shù)語“EC”包含QC和QC樣酶作為谷氨酸環(huán)化酶(EC)的副活性(sideactivity)，進(jìn)一步定義為EC活性。如本文所用，術(shù)語“EC活性”定義為N-末端谷氨酸殘基通過QC分子內(nèi)環(huán)化為焦谷氨酸(pGlu*)。見方案3。方案3=QC(EC)對(duì)不帶電谷氨酰肽的N-末端環(huán)化作用<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>術(shù)語“QC-抑制劑”、“谷氨酰胺酰環(huán)化酶抑制劑”為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，是指抑制谷氨酰胺酰環(huán)化酶(QC)的催化活性或者其谷氨酰環(huán)化酶(EC)活性的酶抑制劑。谷氨酰胺酰環(huán)化酶抑制劑的效價(jià)鑒于與QC抑制相關(guān)，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法和醫(yī)學(xué)應(yīng)用使用這樣的物質(zhì)，其對(duì)于QC抑制的Ki為10μM或更低，更優(yōu)選1μM或更低，甚至更優(yōu)選0.1μM或更低，或者0.01μM或更低，或者最優(yōu)選0.001μM或更低。事實(shí)上，本發(fā)明包含Ki值為較低微摩爾、優(yōu)選納摩爾及甚至更優(yōu)選皮摩爾范圍的抑制劑。因此，雖然所述活性物質(zhì)在本文為方便起見描述作“QC抑制劑”，但是應(yīng)理解這種命名法不限制本發(fā)明主題為特定的作用機(jī)制。QC抑制劑的分子量通常地，本發(fā)明方法和醫(yī)學(xué)應(yīng)用的QC抑制劑是小分子，例如分子量為lOOOg/mole或更低，500g/mole或更低，優(yōu)選400g/mole或更低，及甚至更優(yōu)選350g/mole或更低，以及300g/mole或更低。月太如果本發(fā)明中提及肽或氨基酸，根據(jù)如下常規(guī)列表，每個(gè)氨基酸殘基以單字母或者三字母名稱表示，相應(yīng)于氨基酸的通用名氨基酸單字母符號(hào)三字母符號(hào)丙氨酸AAla精氨酸RArg天冬酰胺NAsn天冬氨酸DAsp半胱氨酸CCys谷氨酰胺QGln谷氨酸EGlu甘氨酸GGly組氨酸HHis異亮氨酸IIle亮氨酸LLeu賴氨酸KLys甲硫氨酸MMet苯丙氨酸FPhe脯氨酸PPro絲氨酸SSer蘇氨酸TThr色氨酸WTrp酪氨酸YTyr纈氨酸VVal如本文所用，術(shù)語“Αβ-肽”是指選自如下的Αβ-肽SEQIDΝο:1所示Αβ3Ε-42,SEQIDNo2所示ΑβN3Q-42，Aβ(N3pGlu_42)，SEQIDNo3所示Αβ3E-40，SEQIDNo4所示AβN3Q-40及Aβ(N3pGlu_42)。如本文所用，“Αβ-肽相關(guān)疾病，，是指特征在于Aβ-肽或者由其介導(dǎo)的所有那些疾病、失調(diào)或病癥。治療劑的測(cè)定和鑒別本發(fā)明的方法和組合物特別用于評(píng)估Αβ_肽的效應(yīng)物，以及用于開發(fā)治療和預(yù)防淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的藥物和治療劑，所述疾病如輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病、唐氏綜合征中的神經(jīng)變性、家族性丹麥型癡呆和家族性英國(guó)型癡呆。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞可用于各種篩選測(cè)定中。例如，任何各種懷疑影響Αβ-肽積累的潛在物質(zhì)以及適當(dāng)?shù)霓卓箘┖头忾]治療劑均可以被篩選，通過給予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物并評(píng)定這些物質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的功能和表型以及對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的(神經(jīng)學(xué))表型的作用進(jìn)行篩選。行為研究也可用于測(cè)試潛在的治療劑，如設(shè)計(jì)為評(píng)定動(dòng)作技能、學(xué)習(xí)和記憶缺陷的那些研究。這種測(cè)試的一個(gè)例子是Morris水迷宮(Morris(1981)LearnMotivat12:239-260)。此外，行為研究可包括位置移動(dòng)活動(dòng)(locomotoractivity)的評(píng)估，如用轉(zhuǎn)棒和曠場(chǎng)進(jìn)行的評(píng)估。本發(fā)明的方法可有利地使用分離自純合或雜合Αβ_肽突變的非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，用以研究淀粉樣積累以及檢測(cè)潛在的治療化合物。本發(fā)明的方法也可使用表達(dá)Aβ-肽的細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。過表達(dá)Αβ_肽的細(xì)胞可用于體外方法中，以篩選作為治療Αβ相關(guān)疾病的潛在治療劑的化合物。在這種方法中，將化合物與過表達(dá)Αβ-肽的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或者衍生自Αβ-肽突變的非人動(dòng)物的細(xì)胞接觸，并篩選與Αβ-肽的表達(dá)相關(guān)的表型變化。細(xì)胞測(cè)定以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中Αβ產(chǎn)生的改變可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法評(píng)定。Αβ-融合多肽如Αβ-肽可特別用于這種篩選方法，因?yàn)棣ˇ?肽的表達(dá)可以通過熒光強(qiáng)度監(jiān)測(cè)。其它舉例的融合多肽包括其它熒光蛋白，或者其修飾物，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白，聚組氨酸，F(xiàn)LAG等，以及任何類型的附加表位。這種融合多肽可以例如使用特異于該融合多肽的抗體檢測(cè)。所述融合蛋白可以是完整多肽或者其功能部分，只要該功能部分保留希望的性質(zhì)如抗體結(jié)合活性或者熒光活性即可。本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒別用于治療上述疾病的潛在治療劑的方法。所述方法包括將含有包含編碼Aβ-肽的多核苷酸的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞與化合物接觸，篩選Aβ-肽生成降低的細(xì)胞，從而鑒別用于治療Αβ-肽相關(guān)疾病的潛在治療劑。所述細(xì)胞可以分離自具有含有Aβ-肽DNA構(gòu)建體的有核細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物?；蛘?，所述細(xì)胞可含有包含編碼具有Aβ-肽的綠色熒光蛋白融合多肽或者其它融合多肽的核酸的DNA構(gòu)建體。此外，表達(dá)Αβ_肽的細(xì)胞可用于初步篩選中，以鑒別作為潛在治療劑的化合物，所述化合物具有改變Aβ-肽表達(dá)相關(guān)表型的活性。在使用Aβ-肽突變的非人哺乳動(dòng)物的體內(nèi)篩選中，合適的對(duì)照細(xì)胞可用于對(duì)比篩選結(jié)果。如果需要，可以使用本發(fā)明的Αβ-肽突變的非人哺乳動(dòng)物在體內(nèi)進(jìn)一步檢測(cè)通過使用表達(dá)Αβ-肽的細(xì)胞進(jìn)行的初始體外篩選鑒別的化合物的效力。因此，本發(fā)明提供了使用基于細(xì)胞的測(cè)定篩選大量化合物的方法，例如使用高通量篩選，以及提供了在Αβ-相關(guān)疾病的動(dòng)物模型中進(jìn)一步檢測(cè)作為治療劑的化合物的方法。QC參與焦谷氨酸的形成，焦谷氨酸有利于淀粉樣β-肽的聚集。因此，抑制QC可以不依賴于發(fā)生環(huán)化的機(jī)制而阻止導(dǎo)致阿爾茨海默病和唐氏綜合征發(fā)生和進(jìn)展的形成斑的[pGlu3]Aβ3-40/42/43或者[pGlu"]A311-40/42/43的沉淀(precipitation)。在淀粉樣肽的位置3、11和22發(fā)現(xiàn)谷氨酸。其中位置22(相應(yīng)于淀粉樣前體蛋白ΑΡΡ770的第693位氨基酸，Swissprotentry:P05067)從谷氨酸(E)至谷氨酰胺(Q)的突變已經(jīng)被描述為所謂的荷蘭型腦動(dòng)脈淀粉樣變的突變。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了在位置3和11具有焦谷氨酸殘基的淀粉樣肽比Αβ1-40/4243更具細(xì)胞毒性和疏水性(SaidoΤ.C.2000MedicalHypotheses54(3)427-429)。通過β-分泌酶β-位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE)在不同位點(diǎn)(HuseJ.T.etal.2002Biol.Chem.277(18)16278-16284)和/或通過氨基肽酶處理可以產(chǎn)生多個(gè)N-末端變化。目前沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持Glu1-肽通過未知的谷氨酰環(huán)化酶(EC)經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為pGlu-妝(Garden,R.W.,Moroz,Τ.P.,Gleeson,J.Μ.,Floyd,P.D.,Li,L.J.,Rubakhin,S.S.，andSweedler,J.V.(1999)JNeurochem72，676-681；HosodaR.etal.(1998)JNeuropatholExpNeurol.57，1089-1095)。沒有鑒別能環(huán)化Glu1-肽的這種酶活性，其在弱堿性或者中性PH條件下在N-末端質(zhì)子化且具有負(fù)電荷的Glu1γ-羧酸部分。QC對(duì)Gln1-底物的活性在低于pH7.O條件下顯著降低。相反，看起來Glu1-轉(zhuǎn)化可以在酸性反應(yīng)條件下發(fā)生(例如Iwatsubo,T.，Saido,T.C.，Mann,D.Μ.，Lee,V.Μ.，andTrojanowski,J.Q.(1996)AmJPathol149，1823-1830所述)。先前研究了QC在弱酸性條件下是否能識(shí)別并轉(zhuǎn)換淀粉樣-β肽衍生的肽(WO2004/098625)。因此，合成并研究了作為酶的潛在底物的肽[Gln3]Aβl_lla、Aβ3_lla、[Gln3]A33-lla、A33-21a、[Gln3]Aβ3_21a和[Gln3]Aβ3_40。選擇這些序列用以模擬天然N-末端和C-末端截短的[Glu3]Ai3肽以及[Gln3]Ai3肽，它們由于翻譯后Glu-酰胺化而可能出現(xiàn)。研究表明木瓜和人QC催化谷氨酰胺酰和谷氨酰環(huán)化。顯然，QC的主要生理學(xué)功能是在激素分泌之前或期間在內(nèi)分泌細(xì)胞中通過谷氨酰胺環(huán)化完成激素成熟。已知這種分泌囊泡是酸性PH。因此，這種酶在pH5.0-7.O范圍的副活性可以是其新發(fā)現(xiàn)的也環(huán)化Glu-Aβ肽的谷氨酰環(huán)化酶活性。然而，由于與Gln-轉(zhuǎn)化相比更緩慢地發(fā)生Glu-環(huán)化，質(zhì)疑的是谷氨酰環(huán)化是否起明顯的生理學(xué)作用。然而，在神經(jīng)變性疾病的病理學(xué)中，谷氨酰環(huán)化是相關(guān)的。對(duì)這種酶反應(yīng)的pH依賴性的研究已經(jīng)示出未質(zhì)子化的N-末端是Gln1-肽環(huán)化所必需的，因此底物的PKa-值等于QC催化作用的pKa-值。因此，QC穩(wěn)定未質(zhì)子化的α-氨基部分對(duì)Y-羰基碳的分子內(nèi)親核攻擊。與含有N-末端谷氨酰胺的肽存在的一價(jià)電荷相反，含有Glu的肽的N-末端Glu殘基在中性PH主要是二價(jià)電荷。谷氨酸呈現(xiàn)出對(duì)于Y-羧基和α-氨基部分分別為大約4.2和7.5的pKa值，即在中性pH及之上，盡管α-氨基氮是部分或全部未質(zhì)子化及親核的，Y-羧基基團(tuán)是未質(zhì)子化的，因此不產(chǎn)生親電子羰基活性。因此，分子內(nèi)環(huán)化是不可能的。然而，在大約5.2-6.5的pH范圍內(nèi)，在其各自pKa值之間，這兩個(gè)官能團(tuán)均以非離子化形式存在，濃度為總含有N末端Glu的肽的1-10%(-NH2)或者10-1%(-C00H)。結(jié)果，在弱酸性PH范圍存在N-末端Glu肽的種類，其攜帶無電荷的這兩個(gè)基團(tuán)，且因此QC可以穩(wěn)定分子內(nèi)環(huán)化為PGlu-肽的中間體，即如果Y-羧基基團(tuán)質(zhì)子化，則羰基碳是足夠親電子的以允許未質(zhì)子化α-氨基基團(tuán)的親核攻擊。在這個(gè)pH下，羥基離子發(fā)揮離去基團(tuán)的功能。這些假說通過QC催化的Glu-βNA轉(zhuǎn)化獲得的pH依賴性數(shù)據(jù)確證。與QC催化的Gln-βNA的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化相反，催化的最佳PH移動(dòng)到大約pH6.0的酸性范圍，即其中底物分子同時(shí)大量攜帶質(zhì)子化的Y-羧基和未質(zhì)子化的α-氨基基團(tuán)的pH范圍。此外，動(dòng)力學(xué)確定的7.55士0.02的pKa值與通過滴定確定的Glu-β3ΝΑ的α-氨基基團(tuán)的值(7.57士0.05)非常一致。在生理學(xué)上，在pH6.0條件下，QC催化的谷氨酸環(huán)化的二級(jí)速率常數(shù)(或者特異性常數(shù)，kcat/KM)與谷氨酰胺環(huán)化相比慢IXIO5-IXIO6倍。然而，這兩個(gè)模型底物Glu-βNA和Gln-βNA的非酶轉(zhuǎn)換是可以忽略的，與觀測(cè)的可以忽略的pGlu-肽形成一致。因此，對(duì)于通過QC催化的pGlu-形成，從酶與非酶速率常數(shù)比率中可以估計(jì)至少IO8的加速(對(duì)比酶催化的二級(jí)速率常數(shù)與相應(yīng)的非酶環(huán)化作用一級(jí)速率常數(shù)，對(duì)于Gln-和Glu-轉(zhuǎn)化的催化proficiency因子分別為109-101(I/M)。從這些數(shù)據(jù)中推斷在體內(nèi)僅通過酶途徑使PGlu-形成似乎是可能的。由于QC在腦中高度富集，且考慮到最近發(fā)現(xiàn)的30μM的(Gin-)TRH-樣肽成熟的0.9.分鐘的高周轉(zhuǎn)率(Prokal,L.，Prokai-Tatrai,K.，Ouyang,X.，Kim,H.S.，ffu,W.Μ.，Zharikova,Α.，andBodor,N.(1999)JMedChem42，4563-4571)，如果提供相似的反應(yīng)條件，則可以推測(cè)合適的谷氨酸底物的大約100小時(shí)的環(huán)化半衰期。此外，鑒于QC/EC腦在分泌途徑中的區(qū)室化和定位，實(shí)際的體內(nèi)酶和底物濃度和反應(yīng)條件可以更有利于在完整細(xì)胞中酶環(huán)化。且如果N-末端Glu被轉(zhuǎn)化為Gln，可以預(yù)期由QC介導(dǎo)的更快速的pGlu形成。在體外，這兩個(gè)反應(yīng)均通過應(yīng)用QC/EC-活性抑制劑而被抑制?？傊?，本領(lǐng)域揭示了在腦中高度富集的人QC很可能是從Glu-Aβ和Gln-Aβ前體中形成淀粉樣pGlu-Αβ肽的催化劑，其構(gòu)成在阿爾茨海默病中發(fā)現(xiàn)的50%以上的斑沉積。這些發(fā)現(xiàn)鑒別了QC/EC在老年斑形成中起作用，并因此是治療阿爾茨海默病、唐氏綜合征中神經(jīng)變性、家族性丹麥型癡呆和家族性英國(guó)型癡呆的新的藥物靶位。除了在位置1具有天冬氨酸而起始的Αβ(ΑβNlD)之外，AD腦中大多數(shù)淀粉樣-β肽在其N-末端引出大的異質(zhì)性。如上所述，優(yōu)勢(shì)種類在位置3具有焦谷氨酸而起始(Ai3N3(pGlu))。pGlu殘基源自谷氨酰胺酰環(huán)化酶(QC)對(duì)N-末端谷氨酸的環(huán)化。然而，N-谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為pGlu較慢，因?yàn)镼C天然轉(zhuǎn)化N-谷氨酰胺底物(圖1和圖4)。tgN3E-42小鼠中的Aβ(Ν3Ε-42)和tgN3Q_42小鼠中的Aβ(N3Q-42)作為與小鼠促甲狀腺激素釋放激素(mTRH)的前原序列(pre-pro-sequence)的融合蛋白表達(dá)(圖lb),通過分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)(Cynis,H.,etal.Inhibitionofglutaminylcyclasealterspyroglutamateformationinmammaliancells,BiochimBiophysActa1764,1618-1625(2006))。對(duì)野生型(WT)、QC、tgN3E_42、tgN3E_42_QC雙轉(zhuǎn)基因和tgN3Q_42小鼠腦裂解物的Aβ(χ-42)和Αβ(N3pGlu-42)進(jìn)行ELISA量化表明顯著差異(圖lc_e)。雖然野生型和QC轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生少量?jī)?nèi)源Αβ(x-42)(WT，1.29士0.91；QC，1·36士0.61pg/mgii)，但是tgN3E-42小鼠產(chǎn)生32.57士2.27Aβχ-42(pg/mgw.w.)，這個(gè)結(jié)果顯著高于野生型小鼠(P<0.0001)。在tgN3E-42-QC雙轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測(cè)到Αβ(χ-42)增加傾向，為53.29士10.13(pg/mgw.w.)。TgN3Q_42小鼠與tgN3E_42小鼠(P<0·0001)和tgN3E_42_QC雙轉(zhuǎn)基因小鼠(ρ<0·0001)小鼠相比示出Aβ(Χ-42)增高12倍(410.2士21.52pg/mgw.w)(圖lc)。在野生型和QC小鼠中，通過ELISA檢測(cè)不到AβN3(pGlu)(圖Id)。令人感興趣地，tgN3E-42(l.89士0.16pg/mgw.w.)與tgN3E_42_QC雙轉(zhuǎn)基因小鼠(2.34士0.14pg/mgw.w.)之間存在顯著差異。tgN3E-42-QC雙轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生增加1.2倍量的Αβ(N3pGlu_42)(P<0.05)0這個(gè)結(jié)果證實(shí)了近來關(guān)于QC-催化N-谷氨酸形成的發(fā)現(xiàn)(Cynis，H.，etal.InhibitionofglutaminyleyeIasealterspyroglutamateformationinmammaliancells,BiochimBiophysActa1764，1618-1625(2006))。tgN3Q_42小鼠示出與tgN3E_42小鼠相比顯著較高的Aβ(N3pGlu-42)水平(53.23士4.59pg/mgw.w)(增加28倍以上；P<0.0001)。Aβ(N3pGlu-42)與總Aβ(χ-42)的比率表明相似結(jié)果。TgN3E_42小鼠的該比率為0.06士0.005，相比之下tgN3E-42-QC雙轉(zhuǎn)基因小鼠的該比率為0.05士0.005(P=0.25)。TgN3Q-42小鼠示出明顯增加的比率，為0.11士0.015(P<0.0001)(圖Ie)。令人感興趣地，tgN3Q-42轉(zhuǎn)基因小鼠顯現(xiàn)顯而易見的肉眼可見異常性，包括生長(zhǎng)延遲，小腦萎縮、過早死亡表型(圖2)以及明顯的神經(jīng)學(xué)缺陷，特征在于喪失運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和共濟(jì)失調(diào)。與對(duì)照組(雌性，19.90士0.40g；雄性，24.43士1.23g)相比，tgN3Q_42小鼠在2月齡的體重顯著下降(雌性，12.20士0.95g；雄性17.60士0.51g；均是顯著的=P<0.001)。神經(jīng)學(xué)表型類似Purkinje細(xì)胞變性小鼠模型的表型。使用Αβ的抗體4G8(表位氨基酸17-24)，tgN3Q-42小鼠腦切片示出主要在CAl錐體神經(jīng)元和Purkinje細(xì)胞中的強(qiáng)免疫反應(yīng)性(圖3和5)。其它腦部區(qū)域中的神經(jīng)元也是陽性的，但是不太豐富。胞外Αβ沉積不是最主要的染色模式，但是在皮質(zhì)、海馬、小腦、丘腦及其它皮質(zhì)下區(qū)域中也作為彌漫性斑塊出現(xiàn)。在小腦分子層、梨狀神經(jīng)元層(piriform)和顆粒(granular)層未檢測(cè)到斑塊，而僅在Purkinje細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)Aβ免疫反應(yīng)性(圖3e，f)。大多數(shù)(如果不是全部)Purkinje細(xì)胞也是Αβ(N3pGlu)陽性的(圖3f，g)。對(duì)tgN3Q-42小鼠進(jìn)行神經(jīng)病理學(xué)分析證實(shí)Purkinje細(xì)胞的神經(jīng)變性，其是遍在蛋白(蛋白質(zhì)降解標(biāo)記)陽性的(圖31)，且伴隨小腦分子層和白質(zhì)束中富集小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖3h-k)。這個(gè)結(jié)果與年齡依賴性運(yùn)動(dòng)受損和小腦萎縮相關(guān)(圖2c)。從雜合tgN3E-42(tgN3E_42het)中產(chǎn)生純合的tgN3E_42動(dòng)物(tgN3E_42hom)，以增加轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。事實(shí)上，tgN3E-42hom小鼠與tgN3E-42het小鼠相比積累顯著更高量的pGlu-Αβ(3-42)。Aβ的積累和沉積主要在海馬CAl層(圖3Β)。在4周齡階段，根據(jù)ELISA量化pGlu-Αβ形成達(dá)到最大，隨后降低至較低濃度(圖11)。相反，總Αβ濃度增加直至3月齡。Αβ(N3pGlu)的形成因此加速其它Αβ種類的沉積。因此，使用嚙齒動(dòng)物Αβ的抗體觀測(cè)CAl層染色。pGlu-Αβ產(chǎn)生增加導(dǎo)致認(rèn)知下降，如在實(shí)施例2所述及圖8、9Α、圖9Β和圖9C例證的行為測(cè)定中觀測(cè)。因此，tgN3E-42hom代表優(yōu)異的小鼠模型，用以研究通過QC形成的pGlu-修飾的淀粉樣肽的作用，及用以評(píng)估目的在于如通過QC抑制而降低Aβ(N3pGlu)的治療策略。tgN3E-42het、tgN3E_42hom和tgN3Q_42het小鼠腦中pGlu-Αβ含量對(duì)比示出顯著差異。在純合tgN3E-42和雜合tgN3Q-42小鼠中，在其生命的前幾周觀測(cè)到Aβ3(pE)_42的快速形成，tgN3E-42het小鼠和過表達(dá)攜帶Swedish突變的淀粉樣前體蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠(APPsw小鼠)則相反(圖12)。對(duì)比示出tgN3E-42和tgN3Q-42品系的另一重要且獨(dú)特的特征腦中pGlu-Αβ含量在幾周內(nèi)達(dá)到在現(xiàn)有技術(shù)其它小鼠模型例如APPsw小鼠中從未達(dá)到的量。例如，在16個(gè)月齡的APPsw小鼠中，腦中Αβ(N3pGlu)比1_2月齡的tgN3Q_42或者tgN3E-42hom小鼠低大約4_5倍。然而，這些APPsw小鼠中荷載的總Aβ超過tgN3E_42hom和tgN3Q-42小鼠的100倍以上(圖12)。這個(gè)實(shí)施例證實(shí)轉(zhuǎn)基因策略提供上好的機(jī)會(huì)以研究不同Aβ肽如Aβ(N3pGlu)在AD病理學(xué)中的作用。因此，通過調(diào)整轉(zhuǎn)基因，也可以神經(jīng)元特異性表達(dá)其它N-和C-末端Aβ以及研究其神經(jīng)毒性潛力。tgN3E_42和tgN3Q_42小鼠最終證實(shí)了pGlu-修飾的Aβ肽的神經(jīng)毒性，因?yàn)閜Glu-Αβ(3-42)的積累伴隨神經(jīng)元喪失、長(zhǎng)期增強(qiáng)(long-termpotentiation)和認(rèn)知障礙。這些組合的特征對(duì)于這些動(dòng)物模型是獨(dú)特的，因此代表在阿爾茨海默病樣病理學(xué)嚙齒動(dòng)物模型中的主要進(jìn)展。在純合tgN3E_42小鼠和野生型同窩出生的小鼠中評(píng)價(jià)海馬長(zhǎng)期增強(qiáng)(LTP)，以研究行為障礙的生理學(xué)基礎(chǔ)。在5個(gè)月齡，處死tgN3E-42純合和野生型同窩出生小鼠，制備海馬切片用以離體測(cè)量LTP。在tgN3E-42純合小鼠的切片中，LTP顯著降低(圖13)。在應(yīng)用首次強(qiáng)直收縮訓(xùn)練(tetanustrain)后不久，與野生型小鼠的fEPSP-slope(在時(shí)間點(diǎn)1為251.4士18.8%)相比，其fEPSP-slope顯著減小(在時(shí)間點(diǎn)1為205.3士13.2%)tg小鼠fEPSP增強(qiáng)的受損隨著時(shí)間保持，在LTP測(cè)量4小時(shí)后仍顯著降低(tgN3E-42小鼠114.O士6.8%；野生型小鼠157.1士14.0%，在時(shí)間點(diǎn)240)。分析刺激強(qiáng)度與所得信號(hào)大小之間的相關(guān)性(fEPSP-slope)，示出tgN3E_42小鼠與野生型小鼠相比其EPSPslope顯著降低(tgN3E-42hom小鼠最大EPSPslope3.7士0.4mV/ms；野生型小鼠最大EPSPslope5.6士0.5mV/ms，均為3mV刺激強(qiáng)度)。輸入-輸出-曲線數(shù)值是平均值士S.Ε.M。數(shù)據(jù)表明tgN3E_42小鼠的遺傳修飾削弱了基線突觸傳遞及因此的正常神經(jīng)元功能以及突觸可塑性(LTP)。LTP破壞導(dǎo)致海馬依賴性記憶功能受損，因?yàn)樵谛∈竽X中該區(qū)域的學(xué)習(xí)和記憶的細(xì)胞相關(guān)性被破壞。降低的EPSP振幅(amplitude)反映突觸喪失，這與在tgN3E-42純合小鼠中觀測(cè)到的神經(jīng)元變性顯然一致。長(zhǎng)期證據(jù)表明Αβ的進(jìn)展性大腦沉積在AD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。因此特別感興趣的是了解APP的蛋白酶解加工及其負(fù)責(zé)在Αβ區(qū)域的N-末端和C-末端裂解的蛋白酶。具有起自Αβ位置4的苯丙氨酸的主要種類的多個(gè)(Ragged)肽已經(jīng)由Masters等在1985年艮道(Masters,C.L.,etal.AmyloidplaquecoreproteininAlzheimerdiseaseandDownsyndrome,ProcNatlAcadSciUSA82,4245—4249(1985))。gf發(fā)現(xiàn)存在爭(zhēng)議，因?yàn)闆]有N-末端序列可得自在含有十二烷基硫酸鈉的緩沖液中純化的核(cores)，提示N-末端被封閉(Selkoe，D.J.，Abraham,C.R.，Podlisny,Μ.B.&Duffy,L.K.IsolationofLow-Mo1ecular-ffeightProteinsfromAmyloidPlaqueFibersinAlzheimer'sDisease,JournalofNeurochemistry46,1820-1834(1986)；Gorevic,P.D.,etal.IsolationandpartialcharacterizationofneurofibrillarytanglesandamyloidplaquecoreinAlzheimer'sDisease:immunohistologicalstudies,JNeuropatholExpNeurol45，647-664(1986))。在1992年，Mori等對(duì)得自AD腦的純化的Αβ蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，首次描述了Αβ(N3pGlu)的存在，其解釋了測(cè)序氨基末端的難度(Mori，H.，Takio，K.，0gawara，M·&Selkoe,D.J.MassspectrometryofpurifiedamyloidbetaproteininAlzheimer'sDisease.JBiolChem.267，17082-17086(1992))。他們報(bào)道了通過這種方法分離的總Αβ僅10-15%起自在位置3具有Αβ(N3pGlu)。后來逐漸清楚Αβ(N3pGlu)代表了AD和唐氏綜合征患者腦中Αβ肽的主要部分(Kuo，Y.Μ.，Emmerling，Μ.R.，Woods,Α.S.，Cotter，R.J.&Roher,Α.Ε.Isolation，chemicalcharacterization,andquantitationofAbeta3-pyroglutamylpeptidefromneuriticplaquesandvascularamyloiddeposits，BiochemBiophysResCommun237,188-191.(1997)；Saido，T.C.，etal.Dominantanddifferentialdepositionofdistinctbeta-amyloidpeptidespecies，AbetaN3(pE)，insenileplaques，Neuronl4，457-466(1995)；Piccini，A.，etal.{beta}-AmyloidIsDifferentinNormalAgingandinAlzheimerDisease，J.Biol.Chem.280,34186-34192(2005)；Saido,Τ.C.，Yamao-Harigaya,W.，Iwatsubo,Τ.&Kawashima，S.Amino-andcarboxyl-terminalheterogeneityofbeta-amyloidpeptidesdepositedinhumanbrain，NeurosciLett215，173-176(1996)；Kuo，Y.M.，etal.Comparativeanalysisofamyloid-betachemicalstructureandamyloidplaquemorphologyoftransgenicmouseandAlzheimer'sDiseasebrains，JBiolChem276,12991-12998(2001)；Hosoda,R.,etal.QuantificationofmodifiedamyloidbetapeptidesinAlzheimerdiseaseandDownsyndromebrains，JNeuropatholExpNeuro157，1089-1095(1998)；Harigaya，Y.，etal.Amyloidbetaproteinstartingpyroglutamateatposition3isamajorcomponentoftheamyloiddepositsintheAlzheimer'sDiseasebrain,BiochemBiophysResCommun276,422-427(2000)；Iwatsubo,Τ.，Saido,Τ.C.，Mann,D.Μ.，Lee,V.Μ.&Trojanowski，J.Q.，F(xiàn)ull-lengthamyloid-beta(1-42(43))andamino-terminalIymodifiedandtruncatedamyloid-beta42(43)depositindiffuseplaques,AmJPathol149,1823-1830(1996)；Miravalle,L.,etal.Amino-TerminallyTruncatedAbetaPeptideSpeciesAretheMainComponentofCottonWoolPlaques,Biochemistry44,10810-10821(2005)；Piccini,A.,etal.AssociationofaPresenilin1S170FMutationWithaNovelAlzheimerDiseaseMolecularPhenotype,ArchNeurol.64,738-745.(2007)；Russo,C.,etal.Heterogeneityofwater-solubleamyloidbeta-peptideinAlzheimer'sDiseaseandDown'ssyndromebrains,FEBSLett409,411-416.(1997)；Guntert,Α.，Dobeli,H.&Bohrmann,B.Highsensitivityanalysisofamyloid-betapeptidecompositioninamyloiddepositsfromhumanandPS2APPmousebrain,Neuroscience,143,461-475(2006)；Tekirian,Τ.L.,etal.N-terminalheterogeneityofparenchymalandcerebrovascularAbetadeposits,JNeuropatholExpNeurol57,76-94(1998))。N-末端缺失通常增強(qiáng)β-淀粉樣肽在體外聚集(Pike,C.J.，Overman,Μ.J.&Cotman,C.W.Amino-terminalDeletionsEnhanceAggregationofbeta-AmyloidPeptidesinVitro,J.Biol.Chem.270，23895-23898(1995))。因此，本發(fā)明人產(chǎn)生了Aβ3-42轉(zhuǎn)基因小鼠(tgN3E_42)，其表達(dá)在N末端具有天然谷氨酸的SEQIDNo1所示Aβ(Ν3Ε-42)，以及表達(dá)起自谷氨酰胺的SEQIDNo2所示Αβ(N3Q-42)的小鼠(tgN3Q-42)。由于N-末端谷氨酸由谷氨酰胺置換，因此所述Aβ肽通過QC活性被轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼岬乃俣燃涌熘辽?個(gè)數(shù)量級(jí)(Schilling，S.，Hoffmann,Τ.，Manhart,S.,Hoffmann,Μ.&Demuth,H.U.Glutaminylcyclasesunfoldglutamylcyclasesactivityundermildacidconditions.FEBSLett563,191-196(2004)；Cynis,H.,etal.Inhibitionofglutaminylcyclasealterspyroglutamateformationinmammaliancells,BiochimBiophysActa1764，1618-1625(2006))。此外，谷氨酸環(huán)化為焦谷氨酸是pH依賴性過程。酶促谷氨酰胺轉(zhuǎn)化有利地在PH7.5進(jìn)行，而谷氨酸轉(zhuǎn)化在最佳pH6.5發(fā)生。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于解釋導(dǎo)致高毒性焦谷氨酸肽沉積在AD中非常重要。顯然，隨著Αβ肽的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，QC及其底物共同定位于酸性區(qū)室內(nèi)，有利于N-谷氨酸底物環(huán)化。此外，軸突轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)示出在AD腦中受損，幫助神經(jīng)毒性Αβ(N3pGlu)的產(chǎn)生。另外，通過QC特異性抑制劑對(duì)QC活性的藥物學(xué)抑制顯著降低了體外Αβ(N3pGlu)水平(Cynis,H.，etal.InhibitionofGlutaminylcyclasesalterspyroglutamateformationinmammaliancells,BiochimBiophysActa1764，1618-1625(2006))。總之，本發(fā)明人首先揭示了Aβ(N3pGlu)在誘導(dǎo)嚴(yán)重神經(jīng)變性的神經(jīng)毒性淀粉樣肽級(jí)聯(lián)中是優(yōu)勢(shì)肽，其次這種毒性很可能是由于神經(jīng)元內(nèi)Aβ(N3pGlu)聚集所致，最后QC活性調(diào)節(jié)腦中Aβ(N3pGlu)形成，這使QC成為良好的治療靶用以防止AD中有害的Aβ(N3pGlu)肽形成。在這方面，使用如圖1和圖6所示前原肽表達(dá)策略在這個(gè)領(lǐng)域是全新的。使用小鼠促甲狀腺激素釋放激素前原序列，可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生不同Αβ種類，如本發(fā)明實(shí)施例和附圖中針對(duì)Aβ3Ε-42和Aβ3Q-42及所得pGlu-形成所示。Aβ序列可以由淀粉樣肽的其它序列置換，以鑒定這些肽的病理生理功能。在正常的APP代謝期間，由于β_或Y-分泌酶裂解導(dǎo)致各種Αβ肽形成。根據(jù)本發(fā)明的策略，可以基于本文所述的前原蛋白加工策略進(jìn)一步開發(fā)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是阿爾茨海默病、家族性英國(guó)型癡呆和家族性丹麥型癡呆的模型，通過用相應(yīng)的淀粉樣肽序列置換TRH而產(chǎn)生，如圖1、6和7所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含表達(dá)SEQIDNo:3所示Aβ3Ε-40的轉(zhuǎn)基因小鼠(tgN3E-40)或者表達(dá)SEQIDNo:4所示AβN3Q-40的轉(zhuǎn)基因小鼠(tg-N3Q_40)，導(dǎo)致Aβ(N3pGlu-40)形成。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是這樣的動(dòng)物模型，其在表達(dá)構(gòu)建體中包含選自Αβ3E-42(SEQIDNo:9)、Aβ3Q-42(SEQIDNo10),Aβ3Ε-40(SEQIDNo11)和Aβ3Q-40(SEQIDNo12)的至少一個(gè)核苷酸序列，更優(yōu)選選自Ai33E-42(SEQIDNo9)^PAβ3Q-42(SEQIDNo10)的至少一個(gè)核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物模型包含選自mTRH-Αβ3E-42(SEQIDNo6)和mTRH-Aβ3Q-42(SEQIDNo8)的至少一個(gè)核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物模型包含選自Thy-1-mTRH-Aβ3Ε-42(SEQIDNo5)和Thy-l-mTRH-Aβ3Q-42(SEQIDNo7)的至少一個(gè)核苷酸序列。優(yōu)選的動(dòng)物模型對(duì)于選自如下的至少一個(gè)核苷酸序列是雜合的Thy-1-mTRH-Aβ3E-42(SEQIDNo5)、Thy+mTRH-Aβ3Q-42(SEQIDNo:7)、mTRH-Aβ3E-42(SEQIDNo6)、mTRH-Aβ3Q-42(SEQIDNo:8)、Aβ3E-42(SEQIDNo9)、Aβ3Q-42(SEQIDNo:10)、Aβ3E-40(SEQIDNo11)^PAβ3Q-40(SEQIDNo:12)。特別優(yōu)選的是對(duì)于選自如下的至少一個(gè)核苷酸序列是純合的動(dòng)物模型Thy-l-mTRH-Αβ3E-42(SEQIDNo:5)、Thy-1-mTRH-Aβ3Q-42(SEQIDNo:7)、mTRH-Aβ3Ε-42(SEQIDNo:6)、mTRH-Aβ3Q-42(SEQIDNo:8)、Aβ3E-42(SEQIDNo:9)、Aβ3Q-42(SEQIDNo:10)、Aβ3E-40(SEQIDNo11)^PAβ3Q-40(SEQIDNo:12)。此外，本發(fā)明包含表達(dá)重組谷氨酰胺酰環(huán)化酶和至少一個(gè)Aβ肽的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，所述Aβ肽選自SEQIDNo:1所示Αβ3Ε-42、SEQIDNo:2所示AβN3Q-42、SEQIDNo4所示Aβ3Ε-40或者SEQIDNo4所示AβN3Q-40。這種動(dòng)物可以通過使表達(dá)重組谷氨酰胺酰環(huán)化酶的轉(zhuǎn)基因小鼠品系與表達(dá)選自SEQIDNo1所示Αβ3Ε-42、SEQIDNo2所示AβN3Q-42、SEQIDNo3所示Aβ3Ε-40或者SEQIDNo4所示AβN3Q-40的至少一個(gè)Αβ肽的小鼠品系雜交育種而獲得。優(yōu)選的雜交育種的小鼠品系表達(dá)哺乳動(dòng)物QC，特別是人或小鼠QC或者木瓜QC。特別優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物QC，因?yàn)橥ㄟ^這些篩選方法鑒別的效應(yīng)物應(yīng)用于治療哺乳動(dòng)物、特別是人的疾病。進(jìn)一步優(yōu)選的雜交育種小鼠表達(dá)QC的同工酶。呈現(xiàn)出與谷氨酰胺酰環(huán)化酶顯著的序列同源性的這些同工酶是來自如下動(dòng)物的谷氨酰胺酰肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶樣蛋白質(zhì)(QPCTL)人(進(jìn)一步命名為人isoQC)(GenBankaccessionno.ΝΜ_017659)，小鼠(GenBankaccessionno.NM_027455),食蟹猴(Macacafascicularis)(GenBankaccessionno.AB168255),恒河猴(Macacamulatta)(GenBankaccessionno.XM_001110995)，貓(GenBankaccessionno.XM_541552)，大鼠(GenBankaccessionno.XM_001066591)，牛(GenBankaccessionno.BT026254)，或其具有至少50%/75%序列相同性/相似性、優(yōu)選70%/85%序列相同性/相似性、最優(yōu)選90%/95%序列相同性/相似性的類似物。所述序列在SEQ.IDNo:13_23中示出。進(jìn)一步揭示的是編碼這些QPCTL的核酸序列(SEQ.IDNo24-34)。本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)QPCTL的雜交育種的小鼠品系，所述QPCTL選自SEQ.IDNo13-15,22和23所示人QPCTL，包括其同種型和剪接型；大鼠QPCTL(SEQ.IDNo19)以及小鼠QPCTL(SEQ.IDNo20)。本發(fā)明更優(yōu)選的是表達(dá)QPCTL的雜交育種的小鼠品系，所述QPCTL選自SEQ.IDNo13-15所示人QPCTL，包括其同種型；以及小鼠QPCTL(SEQ.IDNo20)。本發(fā)明最優(yōu)選的是表達(dá)QPCTL的雜交育種的小鼠品系，所述QPCTL選自所示人QPCTL(SEQ.IDNo13)和小鼠QPCTL(SEQ.IDNo20)。在這方面，特別參考US60/846，244，其特別進(jìn)一步揭示了QPCTL-同工酶。這個(gè)申請(qǐng)?jiān)诖嗽尤氡疚?。表達(dá)重組谷氨酰胺酰環(huán)化酶的轉(zhuǎn)基因小鼠品系可以根據(jù)US60/885，649所述程序產(chǎn)生。這個(gè)申請(qǐng)的關(guān)于表達(dá)重組谷氨酰胺酰環(huán)化酶的轉(zhuǎn)基因小鼠品系的產(chǎn)生和檢測(cè)的全部?jī)?nèi)容援引加入本文。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ_肽作用的抑制劑在輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病、唐氏綜合征、家族性丹麥型癡呆和家族性英國(guó)型癡呆中的應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ_肽作用的促進(jìn)劑(promoter)在刺激胃腸道細(xì)胞增殖、特別是胃粘膜細(xì)胞增殖、上皮細(xì)胞增殖、產(chǎn)酸壁細(xì)胞和分泌組胺的腸嗜鉻樣(ECL)細(xì)胞的分化及與ECL細(xì)胞中組胺合成和貯存相關(guān)的基因表達(dá)以及通過維持或增加活性[pGlu1]-胃泌素的濃度刺激哺乳動(dòng)物中的急性酸分泌中的應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ_肽作用的抑制劑在通過降低無活性[Gln1]胃泌素轉(zhuǎn)化為活性[pGlu1]胃泌素而治療哺乳動(dòng)物的伴有或不伴有幽門螺桿菌的十二指腸潰瘍疾病和胃癌中的應(yīng)用。神經(jīng)降壓素(Neurotensin，NT)是一種參與精神分裂癥病理生理學(xué)的神經(jīng)肽，其特異性調(diào)節(jié)先前證實(shí)在這種疾病中被錯(cuò)誤調(diào)節(jié)(misregulated)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。其中測(cè)量腦脊液(CSF)NT濃度的臨床研究表明一組精神分裂癥患者具有降低的CSFNT濃度，該濃度通過有效的抗精神病藥物治療而恢復(fù)。存在大量證據(jù)吻合NT系統(tǒng)參與抗精神病藥物的作用機(jī)制。中樞給予NT的行為和生物化學(xué)作用明顯類似于系統(tǒng)給予抗精神病藥物的那些作用，抗精神病藥物增加NT神經(jīng)傳遞。這些發(fā)現(xiàn)引出這樣的假說，即NT具有內(nèi)源抗精神病藥物功能。此外，典型和非典型的抗精神病藥物不同地改變黑質(zhì)紋狀體和中腦邊緣多巴胺末端區(qū)內(nèi)NT神經(jīng)傳遞，這些作用分別預(yù)示副作用易發(fā)生性和效力(BindenE.B.etal.2001BiolPsychiatry50856-872)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ_肽作用的效應(yīng)物的促進(jìn)劑在制備抗精神病藥物和/或治療哺乳動(dòng)物精神分裂癥中的應(yīng)用。所述Αβ-肽作用的效應(yīng)物保持或者增加活性[pGlu1]神經(jīng)降壓素的濃度。在精漿中發(fā)現(xiàn)受精促進(jìn)肽(FPP)，這是與促甲狀腺激素釋放激素(TRH)相關(guān)的三肽。近來在體外和體內(nèi)獲得的證據(jù)表明FPP在調(diào)節(jié)精子生育力中起重要作用。特別地，F(xiàn)PP最初刺激不受精的(無能力的)精子“開啟”，且變得更迅速可育，但是隨后阻止精子獲能，由此精子不經(jīng)歷自發(fā)性頂體喪失，且因此不失去受精潛力。模擬這些應(yīng)答，并通過已知調(diào)節(jié)腺嘌呤環(huán)化酶(AC)/cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的腺苷而確實(shí)增強(qiáng)。FPP和腺苷均已經(jīng)示出在無能力的細(xì)胞中刺激cAMP產(chǎn)生，但是在有能力的細(xì)胞中抑制cAMP產(chǎn)生，F(xiàn)PP受體與腺苷受體和G蛋白相互作用，以實(shí)現(xiàn)AC的調(diào)節(jié)。這些事件影響各種蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化狀態(tài)，一些在起始“開啟”中起重要，另一些可能參與其自身頂體反應(yīng)。也在精漿中發(fā)現(xiàn)的降鈣素和血管緊張素II在體外對(duì)于無能力的精子具有相似作用，且可以增強(qiáng)對(duì)FPP的應(yīng)答。這些分子在體內(nèi)具有相似作用，通過刺激影響生育力及隨后維持受精潛力。FPP、腺苷、降鈣素和血管緊張素Π的可用性降低或者其受體缺陷導(dǎo)致雄性不育(Fraser，L.R.andAdeoya-Osiguwa,S.A.2001VitamHorm63，1-28)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ肽作用的抑制劑在制備受精抑制藥物和/或降低哺乳動(dòng)物生育力中的應(yīng)用。Αβ肽作用的抑制劑降低活性[PGIU1=FPP的濃度，導(dǎo)致阻止精子獲能及精細(xì)胞失活。相反，可以示出Αβ肽作用的促進(jìn)劑能刺激雄性生育力以及治療不育癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ肽作用的抑制劑/促進(jìn)劑在制備治療病理生理學(xué)狀況的藥物中的應(yīng)用，如抑制骨髓祖細(xì)胞增殖、瘤形成、宿主炎癥反應(yīng)、癌癥、惡性轉(zhuǎn)移、黑素瘤、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈硬化、再狹窄、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、移植排斥反應(yīng)、獲得性免疫缺陷綜合征、受損的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、內(nèi)皮白細(xì)胞粘附和遷移。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ肽作用的抑制劑/促進(jìn)劑在制備治療如下病癥的藥物中的應(yīng)用，所述病癥為攝食減少和睡眠_(dá)覺醒、能量代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)受損、自主功能受損、激素平衡受損以及體液調(diào)節(jié)受損。在一些蛋白質(zhì)中聚谷氨酰胺擴(kuò)充導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病，如亨廷頓舞蹈癥、帕金森氏癥以及Kennedy's病。其機(jī)制仍未知。聚谷氨酰胺重復(fù)的生物化學(xué)性質(zhì)提示一種可能的解釋在谷氨酰胺酰_谷氨酰胺酰鍵的內(nèi)分解裂解及隨后焦谷氨酸形成可導(dǎo)致通過增加聚谷氨酰胺酰蛋白質(zhì)的分解代謝穩(wěn)定性、疏水性、致淀粉樣變性和神經(jīng)毒性而發(fā)病(Saido，Τ.C.；MedHypotheses(2000)Mar；54(3):427_9)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ肽作用的抑制劑/促進(jìn)劑在制備治療帕金森氏癥和亨廷頓舞蹈癥的藥物中的應(yīng)用。與AβΝ3ρΕ(3-42)pGlu-致淀粉樣變性肽一樣，Adan和ABri沉積在患有家族性丹麥型癡呆(FDD)或者家族性英國(guó)型癡呆(FBD)的患者腦中。這些癡呆是遺傳性疾病，基于在染色體13上編碼的Bri蛋白終止密碼子中的突變(Vidal，R.，F(xiàn)rangione，B.,Rostagno,Α.，Mead,S.，Revesz,Τ.，Plant,G.&Ghiso，J.(1999)Nature399,776-781.Ghiso,J.，Revesz,Τ.,Holton,J.,Rostagno,A.,Lashley,Τ.,Houlden,H.,Gibb,G.,Anderton,B.,Bek,T.，Bojsen-MolIer,Μ.etal.(2001)Amyloid.8，277-284.)。這個(gè)疾病的病理學(xué)特征與阿爾茨海默病非常相似，包括腦淀粉樣血管病以及神經(jīng)炎癥(Rostagno，Α.，Revesz,Τ.，Lashley,Τ.,Tomidokoro,Y.,Magnotti,L.,Braendgaard,H.,Plant,G.,Bojsen-Moller,Μ.，Holton,J.，F(xiàn)rangione,B.etal.(2002)JBiolChem277，49782-49790.)。重要的是，沉積的淀粉樣肽是N-末端pGlu-修飾的，且FDD中的斑塊由pGlu-修飾的Adan和Aβ組成(Tomidokoro,Y.,Lashley,Τ.,Rostagno,Α.,Neubert,Τ.Α.,Bojsen-Moller,Μ.,Braendgaard,H.,Plant,G.,Holton,J.,Frangione,B.,Revesz,Τ.etal.(2005)J.Biol.Chem.280,36883-36894.)。所述pGlu-修飾顯然加速聚集形成，因?yàn)橐呀?jīng)描述了可溶的Adan不含有N-末端pGlu(Tomidokoro,Y.,Lashley,Τ.,Rostagno,Α.,Neubert,Τ.Α.,Bojsen-Moller,Μ.,Braendgaard,H.,Plant,G.,Holton,J.,Frangione,B.,Revesz,Τ.etal.(2005)J.Biol.Chem.280，36883-36894.)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ肽作用的抑制劑/促進(jìn)劑在制備治療家族性英國(guó)型癡呆和/或家族性丹麥型癡呆的藥物中的應(yīng)用。趨化細(xì)胞因子(趨化因子)是吸引并激活白細(xì)胞的蛋白質(zhì)，且認(rèn)為其在炎癥中起重要作用。趨化因子通過N-末端半胱氨酸殘基的出現(xiàn)而被分為四類(C-、CC-、CXC-和CX3C-趨化因子)。CXC-趨化因子優(yōu)先作用于中性粒細(xì)胞。相反，CC-趨化因子優(yōu)先吸引單核細(xì)胞至炎癥部位。單核細(xì)胞侵潤(rùn)被認(rèn)為是許多疾病的關(guān)鍵因素(Gerard，C.andRollins,B.J.(2001)Nat.Immunol2,108-115；Bhatia,Μ.,etal.,(2005)Pancreatology.5,132-144；Kitamoto,S.,Egashira,K.,andTakeshita,Α.(2003)JPharmacolSci.91,192-196)。作為一個(gè)趨化因子家族，MCP家族由四個(gè)成員組成(MCP-1-4)，表現(xiàn)出優(yōu)先吸引單核細(xì)胞，但是其潛力不同(Luini,ff.，etal.，(1994)Cytokine6，28-31；Uguccioni,Μ.，etal.，(1995)EurJImmunol25，64_68)。下文示出MCP-1-4的cDNA以及氨基酸序列。人和嚙齒動(dòng)物MCP-1-4的成熟形式通過谷氨酰胺酰環(huán)化酶在翻譯后修飾，以具有N-末端焦谷氨酸(pGlu)殘基。所述N-末端pGlu修飾使得該蛋白質(zhì)對(duì)氨基肽酶的N-末端降解具有抗性，這是重要的，因?yàn)镸CP-1-4的趨化能力由其N-末端介導(dǎo)(VanDamme,J.，etal.，(1999)ChemImmunol72,42—56)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的動(dòng)物模型選擇的Αβ肽作用的抑制劑/促進(jìn)劑在制備治療由MCP-1-4、優(yōu)選MCP-I介導(dǎo)的疾病藥物中的應(yīng)用，所述疾病例如是慢性和急性炎癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈硬化，再狹窄或者胰腺炎。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過使用上述選擇的測(cè)試物質(zhì)降低或抑制Aβ肽作用的一般方式。本發(fā)明也提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼選自Ai3N3E_42(SEQIDNo:1)、A3N3Q-42(SEQIDNo:2)、AβN3E-40(SEQIDNo3)和AβN3Q-40(SEQIDNo4)的至少一個(gè)Aβ肽。本發(fā)明也提供了篩選受Αβ_肽生成影響的靶化合物的方法，其中所述方法包括使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或者本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)估Αβ-肽在體內(nèi)對(duì)可能的靶化合物的作用。更優(yōu)選地，篩選抑制或促進(jìn)Aβ肽作用的治療劑的方法包括(a)將測(cè)試物質(zhì)給予本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠，(b)評(píng)估所述測(cè)試物質(zhì)對(duì)于小鼠的神經(jīng)學(xué)表型的作用，以及(c)選擇抑制或促進(jìn)Aβ肽作用的測(cè)試物質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療或預(yù)防Αβ肽相關(guān)疾病的方法，所述方法包括(a)給予在前述篩選方法中選擇的測(cè)試物質(zhì)，(b)監(jiān)測(cè)患者Aβ肽相關(guān)疾病的臨床指征的降低情況。本發(fā)明優(yōu)選這樣的測(cè)試物質(zhì)，其在前述篩選和/或治療方法中經(jīng)鑒別是Αβ肽作用的抑制劑。所述Αβ肽相關(guān)疾病優(yōu)選是阿爾茨海默病或者唐氏綜合征中神經(jīng)變性。本文中“Αβ肽作用”是指由Αβ肽直接或間接介導(dǎo)的或者由于Αβ肽的存在而引起的所有改變。這例如但不限于包括神經(jīng)元和神經(jīng)學(xué)作用、毒性或者免疫接種作用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物、特別是小鼠在特定優(yōu)選的實(shí)施方案中也可用于確定起自N-末端Q的Aβ肽與起自N-末端E的Aβ肽之間的差異。鑒于AβN3Q是比AβΝ3Ε更好的QC的底物，這樣可以有利地推斷QC在Αβ肽相關(guān)疾病中的作用。通過上述篩選方法選擇的物質(zhì)可以通過降低Αβ肽作用(陰性效應(yīng)物，抑制劑)或者通過增加Aβ肽作用(陽性效應(yīng)物，激活劑)發(fā)揮功能。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是Αβ肽作用的抑制劑。本發(fā)明的化合物可以被轉(zhuǎn)變?yōu)樗峒映甥}，特別是藥物可接受的酸加成鹽。本發(fā)明的化合物的鹽可以是無機(jī)鹽或有機(jī)鹽形式。本發(fā)明的化合物可以被轉(zhuǎn)變?yōu)椴⒂米魉峒映甥}，特別是藥物可接受的酸加成鹽。所述藥物可接受的鹽通常采取其中堿性側(cè)鏈用無機(jī)酸或有機(jī)酸質(zhì)子化的形式。代表性的有機(jī)酸或無機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、安息香酸、扁桃酸、mandelic,甲基磺酸、羥乙基磺酸，苯磺酸、草酸、雙羥萘酸、2-萘磺酸、ρ-甲苯磺酸、環(huán)己氨磺酸、水楊酸、糖精酸或者三氟乙酸。本發(fā)明化合物的所有藥物可接受的酸加成鹽形式均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。鑒于游離化合物與其鹽形式化合物之間的密切關(guān)系，當(dāng)在本文中提及化合物時(shí)，也包含其相應(yīng)的鹽，只要在這種情況中是可能或適當(dāng)?shù)募纯?。在本發(fā)明的化合物具有至少一個(gè)手性中心時(shí)，其因此可作為對(duì)映異構(gòu)體存在。在所述化合物具有兩或多個(gè)手性中心時(shí)，其可另外作為非對(duì)映異構(gòu)體存在。應(yīng)理解所有這種異構(gòu)體及其混合物均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，一些晶體形式的化合物可以作為多晶形存在，這些也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。另外，一些化合物可以與水(即水合物)或者常用有機(jī)溶劑形成溶劑化物，這種溶劑化物也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述化合物、包括其鹽也可以其水合物形式獲得，或者包括用于其結(jié)晶化的其它溶劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療特征在于Αβ肽或者由Αβ肽介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括以有效治療該病癥的數(shù)量和給藥方案給予本發(fā)明的任何化合物或者其藥物組合物。此外，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物及其相應(yīng)的藥物可接受的酸加成鹽形式在制備用于預(yù)防或治療特征在于Αβ肽或者由Αβ肽介導(dǎo)的病癥的藥物中的應(yīng)用。所述化合物可以通過任何常規(guī)方式給予患者，包括但不限于靜脈內(nèi)、口服、皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腸道外給予或者組合這些方式給予。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及藥物組合物即藥物，其含有至少一種本發(fā)明的化合物或其鹽，任選組合一或多種藥物可接受的載體和/或溶劑。所述藥物組合物可例如是腸道外或者腸道內(nèi)給予配制物形式及含有合適的載體，或者其可以是口服配制物形式，可含有適于口服的合適載體。優(yōu)選其是口服配制物形式。根據(jù)本發(fā)明給予的效應(yīng)物可以用于可給予的藥物配制物或者配制復(fù)合物中，作為抑制劑或者組合抑制劑、底物、假底物、QC表達(dá)的抑制劑、降低哺乳動(dòng)物中QC蛋白濃度的這些酶蛋白的結(jié)合蛋白或抗體。本發(fā)明的化合物使得可以單獨(dú)對(duì)患者和疾病調(diào)整治療，特別可以避免個(gè)體不耐性、變態(tài)反應(yīng)和副作用。所述化合物隨著時(shí)間也呈現(xiàn)出不同程度的活性。從而為醫(yī)生的治療提供機(jī)會(huì)以不同地響應(yīng)患者個(gè)體情況一方面他能精確調(diào)整治療作用開始的速度，另一方面可以調(diào)整作用的持續(xù)時(shí)間特別是作用強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的治療方法代表一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中特征在于Αβ肽或者由Αβ肽介導(dǎo)的病癥的新方法。其有利地簡(jiǎn)化了易受影響的商業(yè)應(yīng)用，且適用于特別是治療基于哺乳動(dòng)物中生理學(xué)活性Aβ肽的不平衡濃度的疾病，特別適用于人用藥物。所述化合物可有利地以例如藥物制備物形式給予，所述藥物制備物含有活性成分組合本領(lǐng)域已知的常用添加劑如稀釋劑、賦形劑和/或載體。例如，所述藥物可以腸道外給予(例如在生理鹽水溶液中靜脈內(nèi)注射)，或者腸道內(nèi)給予(例如用常用載體配制的口服形式)O根據(jù)其內(nèi)源性穩(wěn)定性及其生物可利用度，可以每天給予一或多劑化合物，以達(dá)到希望的標(biāo)準(zhǔn)化血糖水平。例如，在人體內(nèi)這個(gè)劑量范圍可以是大約0.01mg-250.Omg/天，優(yōu)選大約0.Ol-IOOmg化合物/kg體重。通過給予哺乳動(dòng)物所述效應(yīng)物，可以預(yù)防或者減輕或者治療選自如下的病癥輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病(AD)、唐氏綜合征、家族性丹麥型癡呆、家族性英國(guó)型癡呆、亨廷頓舞蹈癥、伴有或不伴有幽門螺桿菌感染的潰瘍性疾病和胃癌、病原性精神病癥、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎癥性宿主應(yīng)答、癌癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、移植排斥、獲得性免疫缺陷綜合征、受損的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、內(nèi)皮中白細(xì)胞粘附和遷移、攝食減少、睡眠_(dá)覺醒、能量代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)受損、自主功能受損、激素平衡受損和體液調(diào)節(jié)受損。再者，通過給予哺乳動(dòng)物所述效應(yīng)物，可以刺激胃腸道細(xì)胞增殖，優(yōu)選胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖，產(chǎn)酸壁細(xì)胞以及分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的急性胃酸分泌和分化。另外，給予哺乳動(dòng)物所述抑制劑可以導(dǎo)致精子細(xì)胞功能喪失，因此抑制雄性生育力。因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)和控制雄性生育力的方法，以及活性降低效應(yīng)物在制備雄性避孕藥物中的應(yīng)用。此外，通過給予哺乳動(dòng)物所述效應(yīng)物，可以抑制骨髓祖細(xì)胞增殖。本發(fā)明使用的化合物因此可以通過已知方式使用惰性、無毒性藥物合適的載體和添加劑或者溶劑轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｒ?guī)配制物，如片劑、膠囊、dragSes、藥丸、栓劑、顆粒劑、氣霧劑、糖漿、液體、固體和乳狀乳液以及懸浮液和溶液。在每種這些配制物中，治療有效的化合物優(yōu)選以大約0.1-80%(重量)、更優(yōu)選1-50%(重量)總混合物的濃度存在，即以足以獲得所述劑量范圍的量存在。所述物質(zhì)可以以drag6es、膠囊、bitablecapsules、片劑、滴劑、糖漿或者栓劑或者鼻腔噴霧劑形式用作藥物。所述配制物可有利地例如通過提供活性成分與溶劑和/或載體及任選使用乳化劑和/或分散劑制備，在水用作稀釋劑的情況中，可以將有機(jī)溶劑任選用作輔助溶劑。舉例的可用于本發(fā)明中的賦形劑包括水，無毒有機(jī)溶劑如石蠟(例如天然油餾分)，植物油(例如菜籽油、落花生油、芝麻油)，醇(例如乙醇、甘油)，二醇(例如丙二醇、聚乙二醇)；固體載體如天然粉末狀礦物質(zhì)(例如高分散二氧化硅、硅酸鹽)，糖(例如粗糖、乳糖和葡聚糖)；乳化劑如非離子和陰離子乳化劑(例如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯油醚脂肪醇醚、烷基磺酸鹽和芳基磺酸鹽)，分散劑(例如木質(zhì)素、亞硫酸鹽溶液、甲基纖維素、淀粉和聚乙烯比咯烷酮)和潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、硬脂酸和十二烷基硫酸鈉)以及任選調(diào)味劑。可以通過常用的方式給予藥物，優(yōu)選通過腸道內(nèi)或者腸道外給藥方式、特別是口月艮。在腸道內(nèi)給藥的情況中，口服片劑除了上述載體之外還可進(jìn)一步含有添加劑如檸檬酸鈉、碳酸鈣和磷酸鈣，以及各種添加劑如淀粉，優(yōu)選馬鈴薯淀粉，明膠等。此外，潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石可伴隨用于壓成片劑。在用于口服的水性懸浮液和/或酏劑情況中，除上述賦形劑之外還可以在活性成分中加入各種調(diào)味劑或者色素。在腸道外給予的情況中，可以使用在合適的液體載體中的活性成分的溶液。一般而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在靜脈內(nèi)給予的情況中，給予大約0.01-2.Omg/kg、優(yōu)選大約0.01-1.Omg/kg體重/天的量有利地獲得有效的結(jié)果，在腸道內(nèi)給予的情況中，給予劑量為大約0.01-2mg/kg,優(yōu)選大約0.01-lmg/kg體重/天。然而在一些情況中根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或者患者的體重或者基于給予途徑的類型需要偏離指定劑量，但是也基于動(dòng)物種類及其對(duì)于藥物的個(gè)體應(yīng)答或者給予的間隔時(shí)間確定劑量。因此，在一些情況中可以使用低于上述最小量的劑量，而在其它情況中，可以超出所述上限。在相對(duì)大量給予的情況中，推薦將這些量在一天內(nèi)分成幾次給予。對(duì)于人用藥物給予，提供相同劑量范圍。在這種情況中相似地使用上述評(píng)注。關(guān)于舉例的藥物配制物可特別參考WO2004/098625第50_52頁的實(shí)施例，所述文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。上文一般性描述了本發(fā)明。通過參考如下實(shí)施例可以獲得對(duì)本發(fā)明更全面的理解。這些實(shí)施例只是例證本發(fā)明，無限制本發(fā)明范圍之意。盡管本文應(yīng)用一些特定術(shù)語，但是這些術(shù)語只是描述本發(fā)明而無限制之意。參考實(shí)施例1人和木瓜QC的制備宿主菌株和培養(yǎng)基根據(jù)廠商(Invitrogen)指導(dǎo)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和分析用于表達(dá)人QC的巴斯德畢赤酵母株X33(A0X1，A0X2)。根據(jù)廠商建議制備巴斯德畢赤酵母需要的培養(yǎng)基，即緩沖的甘油(BMGY)復(fù)合培養(yǎng)基或者甲醇(BMMY)復(fù)合培養(yǎng)基，以及發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。編碼人QC的質(zhì)粒載體的分子克隆應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行所有克隆程序。對(duì)于在酵母中表達(dá)，使用載體pPICZαB(Invitrogen)。pQE-31載體(Qiagen)用于在大腸桿菌中表達(dá)人QC。將起自密碼子38的成熟QC的cDNA與質(zhì)粒編碼的6X組氨酸標(biāo)記符合讀框地融合。在使用引物pQCyc-1和pQCyc-2(W02004/098625)擴(kuò)增及亞克隆之后，使用SphI和HindIII限制位點(diǎn)將片段插入表達(dá)載體中。巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及小規(guī)樽表汰根據(jù)廠商(Qiagen)指導(dǎo)，將質(zhì)粒DNA在大腸桿菌JM109中擴(kuò)增及純化。在使用的表達(dá)質(zhì)粒pPICZaB中，提供三個(gè)限制位點(diǎn)以進(jìn)行線性化。由于SacI和BstXI在QCcDNA內(nèi)切割，因此選擇PmeI進(jìn)行線性化。將20-30μg質(zhì)粒DNA用PmeI線性化，通過乙醇沉淀，并溶解于無菌去離子水中。然后根據(jù)廠商(BioRad)指導(dǎo)，使用IOyg所述DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。在含有150yg/mlZeocin的平板中進(jìn)行選擇。使用線性化質(zhì)粒的一次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生幾百個(gè)轉(zhuǎn)化體。為了檢測(cè)進(jìn)行QC表達(dá)的重組酵母克隆，將重組體在含有2mlBMGY的IOml錐形瓶中生長(zhǎng)24小時(shí)。之后，對(duì)酵母進(jìn)行離心，并重懸于2ml含有0.5%甲醇的BMMY中。通過每24小時(shí)加入一次甲醇使這個(gè)濃度保持72小時(shí)。隨后，確定上清中QC活性。融合蛋白的存在通過使用6X組氨酸標(biāo)記的抗體(Qiagen)通過Western印跡分析證實(shí)。選擇展示最高QC活性的克隆以進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵。&舗纏表汰在5L反應(yīng)器(BiostatB,B.Braunbiotech)中進(jìn)行QC表達(dá)，基本如"Pichiafermentationprocessguidelines"(Invitrogen)所述進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，使細(xì)胞在補(bǔ)力口微量鹽以及甘油作為唯一碳源的發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(PH5.5)中生長(zhǎng)。在大約24小時(shí)的最初分批培養(yǎng)階段(batchphase)及隨后大約5小時(shí)的補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段(fed-batchphase)期間，積聚細(xì)胞團(tuán)。一旦達(dá)到細(xì)胞濕重為200g/l，則使用甲醇誘導(dǎo)QC表達(dá)，應(yīng)用三步補(bǔ)料方式，全部發(fā)酵時(shí)間為大約60小時(shí)。隨后，通過在4°C以6000Xg離心15分鐘，從含有QC的上清中除去細(xì)胞。加入NaOH將pH調(diào)節(jié)為6.8，所得混濁溶液再次在4°C以37000Xg離心40分鐘。在持續(xù)混濁的情況中，使用纖維素膜(孔徑0.45μπι)進(jìn)行額外的過濾步驟。在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的6X組氨酸標(biāo)記的QC的純化組氨酸標(biāo)記的QC首先通過固定化金屬親和性層析(IMAC)純化。在典型的純化中，將IOOOml培養(yǎng)上清施加于荷載Ni2+的螯合S印haroseFF柱(1.6X20cm,Pharmacia)，該柱用含有750mMNaCl的50mM磷酸鹽緩沖液pH6.8平衡，流速5ml/min。在用10個(gè)柱體積的平衡緩沖液及5個(gè)柱體積的含有5mM組氨酸的平衡緩沖液洗滌后，通過轉(zhuǎn)變?yōu)楹?50mMNaCl和IOOmM組氨酸的50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。所得洗脫液對(duì)20mMBis-Tris/HCl(pH6.8)在4°C透析過夜。隨后，在用透析緩沖液平衡的MonoQ6柱(BioRad)上進(jìn)行陰離子交換層析進(jìn)一步純化QC。將含有QC的級(jí)分加樣于所述柱，流速4ml/min0然后用含有IOOmMNaCl的平衡緩沖液洗滌該柱。通過兩個(gè)梯度進(jìn)行洗脫，分別為30或5個(gè)柱體積的分別含有240mM和360mMNaCl的平衡緩沖液。收集6ml級(jí)分，通過SDS-PAGE分析純度。集合含有同源QC的級(jí)分，通過超濾濃縮。對(duì)于長(zhǎng)期貯存(_20°C)，加入甘油至終濃度為50%。根據(jù)Bradford或者GillandvonHippel方法(Bradford,Μ.Μ.1976AnalBiochem72,248-254；Gill,S.C.andvonHippel,P.H.1989AnalBiochem182，319-326.)量化蛋白質(zhì)。QC在大腸桿菌中的表達(dá)和純化將編碼QC的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)M15細(xì)胞(Qiagen)中，并且在選擇性LB瓊脂平板中在37°C生長(zhǎng)。在含有葡萄糖和乙醇的LB培養(yǎng)基中在室溫進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到大約0.8的OD6tltl時(shí)，使用0.ImMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)過夜。在一次冷凍和解凍循環(huán)后，在4°C通過加入在含有300mMNaCl和2mM組氨酸的50mM磷酸鹽緩沖液pH8.0中的2.5mg/ml溶菌酶使細(xì)胞裂解大約30分鐘。該溶液通過在4°C以37000Xg離心30分鐘澄清，隨后使用玻璃粉(DNA分離)過濾，以及使用纖維素濾膜的兩個(gè)額外過濾步驟以粗略過濾和精細(xì)過濾沉淀物。將上清(大約500ml)以lml/min流速應(yīng)用于Ni2+-親和柱(1.6X20cm)。使用含有150mMNaCl和IOOmM組氨酸的50mM磷酸鹽緩沖液洗脫QC。通過超濾濃縮含有QC的級(jí)分。從木瓜乳膠中純化QC根據(jù)先前報(bào)道的方法加以修改的方法(Zerhouni，S.etal.1989BiochimBiophysActa138,275-290),使用BioCAD700E(PerseptiveBiosystems,Wiesbaden,Germany)制備木瓜乳膠QC。將50g乳膠溶解于水中，如該文章所述離心。使用甲硫代磺酸S-甲酯(S-methylmethanethiosulfonate)失活蛋白酶，并對(duì)所得粗提物進(jìn)行透析。在透析之后，將全部上清加樣于用IOOmM乙酸鈉緩沖液pH5.O平衡的(21X2.5cmi.d.)SPSepharoseFastFlow柱中(流速3ml/min)。通過增加乙酸鈉緩沖液濃度以2ml/min流速在三個(gè)步驟中進(jìn)行洗脫。第一步是在0.5個(gè)柱體積中從0.IM至0.5M乙酸鹽緩沖液的線性梯度。第二步是在4個(gè)柱體積中緩沖液濃度從0.5M至0.68M的線性增加。在最后的洗脫步驟期間，使用1個(gè)柱體積的0.85M緩沖液。集合含有最高酶活性的級(jí)分(6ml)。通過超濾將濃度和緩沖液改變?yōu)?.02MTris/HCl,pH8.0(Amicon；濾膜的分子量截?cái)嘀禐镮OkDa)。加入硫酸銨以濃縮得自離子交換層析步驟的木瓜酶，至終濃度為2M。將這個(gè)溶液應(yīng)用于用2M硫酸銨、0.02MTris/HCl(pH8.0)平衡的(21X2.5cmi.d.)ButylSepharose4FastFlow柱(流速1.3ml/min)。用降低硫酸銨濃度的三個(gè)步驟進(jìn)行洗脫。在第一個(gè)步驟期間，以1.3ml/min流速應(yīng)用0.5個(gè)柱體積的從2M至0.6M硫酸銨、0.02MTris/HCl(pH8.0)的線性梯度。第二個(gè)步驟是以1.5ml/min流速應(yīng)用5個(gè)柱體積的從0.6M至OM硫酸銨、0.02MTris/HCl(pH8.0)的線性梯度。最后的洗脫步驟是以1.5ml/min流速應(yīng)用2個(gè)柱體積的0.02MTris/HCl(pH8.0)。集合含有QC活性的所有級(jí)分，通過超濾濃縮。所得同質(zhì)QC在-70°C貯存。使用Bradford方法確定最終蛋白質(zhì)濃度，與使用牛血清白蛋白獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。參考實(shí)施例2谷氨酰胺酰環(huán)化酶活性測(cè)定熒光測(cè)定使用微滴定平板的BioAssayReaderHTS_7000Plus(PerkinEimer)或者NovoStar(BMGLabtechnologies)閱讀器在30°C進(jìn)行測(cè)量。使用H-Gln-βNA通過熒光測(cè)定評(píng)估QC活性。樣品由在含有直至20mMEDTA和適當(dāng)稀釋的QC等份的0.2MTris/HCl(pH8.0)中的0.2mM熒光底物、0.25U焦谷氨酰氨基肽酶(Unizyme，Horsholm,Denmark)組成，終體積為250μ1。激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為320/410nm。通過加入谷氨酰胺酰環(huán)化酶開始測(cè)定反應(yīng)。從在測(cè)定條件下萘胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定QC活性。1單位定義為在所述條件下每分鐘從H-Gln-βNA中催化形成1μmolpGlu-βNA的QC量。在第二種熒光測(cè)定中，使用H-Gln-AMC作為底物確定QC活性。反應(yīng)在30°C進(jìn)行，使用微滴定平板的NOVOStar閱讀器(BMGlabtechnologies)。樣品由在含有5mMEDTA和適當(dāng)稀釋的QC等份的0.05MTris/HCl(pH8.0)中的不同濃度的熒光底物、0.IU焦谷氨酰氨基肽酶(Qiagen)組成，終體積為250yl。激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為380/460nm。通過加入谷氨酰胺酰環(huán)化酶起始測(cè)定反應(yīng)。從在測(cè)定條件下7-氨基-4-甲基香豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定QC活性。使用GraFit軟件評(píng)估動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。QC的分光光度測(cè)定這個(gè)新測(cè)定用于確定大多數(shù)QC底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。使用連續(xù)方法通過分光光度測(cè)定法分析QC活性，所述方法是對(duì)先前的不連續(xù)測(cè)定(Bateman，R.C.J.1989JNeurosciMethods30，23-28)加以調(diào)整而得，使用谷氨酸脫氫酶作為輔助酶。樣品由相應(yīng)QC底物、0.3mMNADH、14mMa-酮戊二酸和30U/ml谷氨酸脫氫酶組成，終體積為250iU。通過加入QC開始反應(yīng)，并通過監(jiān)測(cè)8-15分鐘在340nm吸光度的降低進(jìn)行追蹤。評(píng)估最初的速率，以及從在測(cè)定條件下氨的標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定酶活性。所有樣品均在30°C測(cè)量，使用微滴定平板的SPECTRAFIuorPlus或者Sunrise(均來自TECAN)閱讀器。使用GraFit軟件評(píng)估動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。抑制劑測(cè)丨定對(duì)于抑制劑測(cè)試，樣品組成與上述相同，不同之處是加入推定的抑制化合物。對(duì)于QC抑制的快速檢測(cè)，樣品含有4mM相應(yīng)抑制劑，底物濃度為1Km。對(duì)于詳細(xì)研究抑制作用和確定Ki值，首先研究所述抑制劑對(duì)于輔助酶的影響。在每種情況中，對(duì)于任一檢測(cè)的酶均無影響，因此可以可靠地確定QC抑制作用。抑制常數(shù)通過用GraFit軟件將進(jìn)展曲線集擬合進(jìn)用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制的一般方程而評(píng)估。參考實(shí)施例3:MALDI-T0F質(zhì)譜分析進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行質(zhì)譜分析，使用具有線性飛行時(shí)間分析儀的Hewlett-PackardG2025LD-T0F系統(tǒng)。該儀器裝備337nm氮激光器，潛在加速源(5kV)和1.0m飛行管。以陽離子模式運(yùn)轉(zhuǎn)檢測(cè)儀，記錄信號(hào)，使用與個(gè)人計(jì)算機(jī)連接的LeCroy9350M數(shù)字存儲(chǔ)示波器濾波。將樣品(5iU)與等體積的基質(zhì)溶液混合?；|(zhì)溶液使用DHAP/DAHC，通過將30mg2',6'-二羥基苯乙酮(Aldrich)和44mg檸檬酸氫二銨(Fluka)溶解于lml在水中的乙腈/0.l%TFA(l/l,v/v)而制備。將小體積(1yl)的基質(zhì)_待分析物-混合物移至探頭尖端，并立即在真空室(Hewlett-PackardG2024Asamplepr印accessory)內(nèi)蒸發(fā)，以保證快速及均質(zhì)的樣品結(jié)晶。對(duì)于長(zhǎng)期檢測(cè)Glul-環(huán)化，將A0-衍生的肽在100ill0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.2)或者0.1MBis-Tris緩沖液(pH6.5)中在30°C保溫。肽以0.5mM[A^3-lla]或者0.15mM[A03-21a]濃度應(yīng)用，在整個(gè)24小時(shí)加入0.2UQC。在A33_21a情況中，該測(cè)定含有DMS0。在不同時(shí)間，從測(cè)定試管中取樣品，使用ZipTipS(Millip0re)根據(jù)廠商指導(dǎo)提取肽，與基質(zhì)溶液混合(1lv/v)，隨后記錄質(zhì)譜。陰性對(duì)照物不含有QC或者含有熱失活的酶。對(duì)于抑制劑研究，樣品組成與上述相同，不同之處是加入抑制化合物(5mM苯并咪唑或者2mM1，10_鄰二氮雜菲)。參考實(shí)施例4:鼠QPCT鼠QC的克隆使用編碼推定的mQC的PubMed核苷酸登記號(hào)AK017598設(shè)計(jì)用于分離mQCd開放讀框的引物。所述引物序列如下有義5‘ATATGCATGCATGGCAGGCAGCGAAGACAAGC(SEQIDNo35)；反義5‘ATATAAGCTTTTACAAGTGAAGATATTCCAACACAAAGAC(SEQIDNo36)。使用RNeasyMini試劑盒(Qiagen)從鼠胰島腺瘤細(xì)胞系0_TC3細(xì)胞中分離RNA,ililSuperScriptll(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄。隨后，在具有HerculaseEnhancedDNA-Polymerase(Stratagene)的50yl反應(yīng)中在生成產(chǎn)物的112.5稀釋液上擴(kuò)增mQCcDNA，插入PCRScriptCAM克隆載體(Stratagene)中，及通過測(cè)序核實(shí)。使用如下引物擴(kuò)增編碼成熟mQC的cDNA片段5‘ATACTCGAGAAAAGAGCCTGGACGCAGGAGAAG(SEQIDNo37)(Xhol，有義)禾P5‘ATATCTAGATTACAAGTGAAGATATTCCAAC(SEQIDNo38)(Xbal，反義)。將消化的片段連接進(jìn)載體pPICZaB中，在大腸桿菌中增殖，通過測(cè)序有義和反義鏈核實(shí)。最后，使用Pmel將表達(dá)質(zhì)粒線性化，沉淀及在-20°C貯存。巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及鼠QC的小規(guī)模表達(dá)根據(jù)廠商(BioRad)指導(dǎo)，通過電穿孔使用1_2yg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。在含有100iig/mlZeocin的平板上進(jìn)行選擇。為了檢測(cè)重組酵母克隆mQC表達(dá)，將重組體在含有2mlBMGY的10ml錐形瓶中生長(zhǎng)24小時(shí)。之后，對(duì)酵母進(jìn)行離心，并重懸于含有0.5%甲醇的2mlBMMY中。通過每24小時(shí)加入一次甲醇使這個(gè)濃度保持72小時(shí)。隨后，確定上清中QC活性。選擇展示最高活性的克隆以進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵。鼠QC的大規(guī)模表達(dá)和純化^5L(BiostadB,B.Braunbiotech,Melsungen,Germany)中iitfmQC^達(dá)。在補(bǔ)加微量鹽的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基pH5.5中進(jìn)行發(fā)酵。最初，以分批和補(bǔ)料分批階段用甘油作為唯一碳源積聚生物量大約28小時(shí)。根據(jù)Invitrogen推薦的三步方式通過補(bǔ)給甲醇起始mQC表達(dá)，完整發(fā)酵時(shí)間為大約65小時(shí)。隨后，通過分別以6000Xg和38000Xg離心15分鐘和4小時(shí)的兩次相繼的離心步驟從含有mQC的上清中除去細(xì)胞和混濁度。為了進(jìn)行純化，將發(fā)酵肉湯用水稀釋至電導(dǎo)率為大約5mS/cm，以逆流方向(15mL/min)施加于用0.05M磷酸鹽緩沖液pH6.4平衡的StreamlineSPXL柱(2.5X100cm)中。在以逆流方向用2個(gè)柱體積的平衡緩沖液洗滌后，使用含有1.5MNaCl的0.15MTris緩沖液(pH7.6)以SmL/min流速正向洗脫蛋白質(zhì)。集合含有QC的級(jí)分，加入硫酸銨至終濃度為1M。所得溶液以4mL/min流速施加于ButylSepharoseFF柱(1.6x13cm)。結(jié)合的mQC用5個(gè)柱體積的含有0.75M硫酸銨的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)洗滌，及用0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)以逆流方向洗脫。集合含有mQC的級(jí)分，通過用0.025MTris(pH7.5)透析過夜以脫鹽。之后，加入NaOH將pH調(diào)節(jié)為8.0，施加于(4.OmL/min)用0.02MTris(pH8.1)平衡的UnoQ柱(BioRad)。在用平衡緩沖液洗滌后，用含有0.18MNaCl的相同緩沖液洗脫mQC。集合呈現(xiàn)QC活性的級(jí)分，加入1MBis-Tris緩沖液pH6.0將pH調(diào)節(jié)為7.4。mQC在4°C穩(wěn)定直至1個(gè)月。為了在長(zhǎng)期貯存，加入50%甘油。實(shí)施發(fā)明的最好實(shí)施方案實(shí)施例1產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠鼠促甲狀腺素釋放激素-A0融合蛋白mTRH-A^(N3E-42)和mTRH(N3Q-42)的生成基本上如另1J處所述進(jìn)行(Cynis,H.,etal.Inhibitionofglutaminylcyclasealterspyroglutamateformationinmammaliancells,BiochimBiophysActa1764,1618-1625(2006))。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將各自cDNA插入含有鼠Thy_l序列的載體PUC18中。鼠QC從胰島瘤細(xì)胞系0-TC3中分離。mQCcDNA克隆進(jìn)載體pTG_CAG。所有構(gòu)38建體均用測(cè)序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)基因小鼠通過雄性原核注射受精的C57B16卵母細(xì)胞而產(chǎn)生(PNI，由genOway，Lyon，F(xiàn)rance產(chǎn)生)。注射的卵母細(xì)胞然后植入代孕母體以足月發(fā)育。所得后代(每個(gè)品系3個(gè)建立者)經(jīng)PCR分析進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因整合并且在與C57B16野生型小鼠雜交后經(jīng)RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因表達(dá)(每個(gè)品系n=3-5)。具有最高轉(zhuǎn)基因mRNA表達(dá)的品系被選擇用于進(jìn)一步育種和雜交育種實(shí)驗(yàn)(命名為tgN3E-42XQC小鼠)。tgN3E_42XQC轉(zhuǎn)基因小鼠表觀健康并且不顯示神經(jīng)學(xué)異常跡象。tgN3Q-42PNI的3個(gè)建立者中僅一個(gè)生出后代(tgN3Q-42小鼠模型)。但是，不育建立者中的一個(gè)在7個(gè)月年齡時(shí)在海馬CA1層顯示神經(jīng)元喪失及對(duì)A3(N3pGlu)的神經(jīng)元免疫反應(yīng)性，這在其它建立者的后代中也觀測(cè)到。在這個(gè)建立者和其它建立者的后代中觀測(cè)到相同表型清楚提示觀測(cè)到的表型不是由于整合作用所致。所有動(dòng)物均根據(jù)德國(guó)動(dòng)物照顧指南進(jìn)行處理。DNA構(gòu)建體的制備cDNA構(gòu)建體的質(zhì)量經(jīng)在瓊脂糖凝膠上電泳一個(gè)等份而驗(yàn)證和證實(shí)，未觀測(cè)到降解痕跡。最后，使用消化性BglI，EC0RI，andHindHI限制酶的限制分析產(chǎn)生預(yù)期限制圖譜。TBA-Tg質(zhì)粒用EcoRI消化，含有轉(zhuǎn)基因的7170_bp片段從載體骨架中分離。所述7.lkb轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體片段在注射進(jìn)受精卵母細(xì)胞中之前被進(jìn)一步純化及稀釋。分離的轉(zhuǎn)基因的純度和濃度經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。PCR基因分型策略篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合通過PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)。設(shè)計(jì)了兩個(gè)PCR(見圖7)-PCR1設(shè)計(jì)用于有效檢測(cè)轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合事件。選擇的引物對(duì)允許擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因序列內(nèi)的短DNA序列，產(chǎn)生特異的505bpPCR產(chǎn)物。-PCR2設(shè)計(jì)用于評(píng)估轉(zhuǎn)基因整合事件的完整性。選擇的引物對(duì)允許擴(kuò)增從啟動(dòng)子的5，區(qū)和Thyl基因的3，區(qū)延伸的DNA序列，產(chǎn)生特異的6279bpPCR產(chǎn)物。由于Thy1啟動(dòng)子盒衍生自小鼠基因組序列，因此用于研究轉(zhuǎn)基因整合完整性的PCR篩選也導(dǎo)致從內(nèi)源Thyl基因擴(kuò)增7413bp的產(chǎn)物。表1:PCR基因分型tgN3E_42和tgN3Q_42轉(zhuǎn)基因小鼠<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>進(jìn)行這些測(cè)試以監(jiān)測(cè)引物的特異性及PCR反應(yīng)的靈敏性。一旦建立，則這些PCR條件用于篩選F0代(建立者動(dòng)物)。表2經(jīng)PCR基因分型tgN3E_42和tgN3Q_42轉(zhuǎn)基因小鼠的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>確定相對(duì)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的方案表3確定tgN3E-42和tgN3Q_42轉(zhuǎn)基因小鼠中相對(duì)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>等摩爾量的來自分析的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的染色體DNA用作模板，使用熒光染料SYBR-GreenI根據(jù)下述方案進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR表4在tgN3E_42和tgN3Q_42轉(zhuǎn)基因小鼠中的實(shí)時(shí)PCR的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表5用于基因分型表達(dá)mQC的轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>進(jìn)行這些測(cè)試以監(jiān)測(cè)引物的特異性及PCR反應(yīng)的靈敏性。一旦建立，則這些PCR條件用于篩選FO代(建立者動(dòng)物)。表6用于經(jīng)PCR基因分型表達(dá)mQC的轉(zhuǎn)基因小鼠的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>經(jīng)RT-PCR量化mRNA的方案表7用于量化tgN3E-42和tgN3Q_42轉(zhuǎn)基因小鼠中的mRNA的實(shí)時(shí)PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>將1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄并用熒光染料SYBR-GreenI根據(jù)下述方案進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR表8用于在tgN3E_42和tgN3Q_42轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>免疫組織化學(xué)和組織學(xué)麻醉小鼠并用冰冷的磷酸緩沖鹽水(PBS)隨后4%低聚甲醛經(jīng)心臟灌注。小心切下腦樣品并在4°C在4%磷酸緩沖的福爾馬林中后固定。在4μπι石蠟切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)。使用下述抗體468(Αβ17-24，Signet),GFAP(Chemicon)，Ibal(Waco)，ubiquitin(DAKO)及在第3位具有焦谷氨酸的抗Aβ(Saido,Τ.C.，etal.Dominantanddifferentialdepositionofdistinctbeta-amyloidpeptidespecies,AbetaN3(pE),insenileplaques,Neuron14,457-466(1995))。生物素化抗兔及抗小鼠第二抗體(1200)購(gòu)自DAK0。用ABC方法使用Vectastain試劑盒(VectorLaboratories)以二氨基聯(lián)苯胺作為色原顯示染色。用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。對(duì)于熒光染色，使用AleXaFlUOr488禾口AlexaFluor594綴合的抗體(MolecularProbes)。對(duì)于tgN3E_42小鼠的分析，額外使用了下述抗體用于免疫組織化學(xué)鑒定Aβ/4G8(Acris)，Aβ/6Ε10(Calbiochem)，Aβ-N3pGlu-42(clone6)，GFAP(DAKO)，NeuN(Chemicon)。生物素化抗兔及抗小鼠第二抗體(1250)購(gòu)自VectorLaboratories。用ABC方法使用Vectastain試劑盒(VectorLaboratories)以二氨基聯(lián)苯胺作為色原顯示染色。對(duì)于熒光染色，使用Cy2和Cy3綴合的第二抗體(Dianova)。在熒光免疫染色上進(jìn)行DAPI核酸染色(MolecularProbes)。經(jīng)ELISA量化Aβ(χ-42)和Aβ(N3pGlu_42)腦在冷凍狀態(tài)下稱重并直接在Doimce勻漿機(jī)中在2.5ml含有完全蛋白酶抑制劑(Roche)的2%SDS中勻漿。勻漿液超聲處理30秒，隨后在4°C80000g離心1分鐘。取上清并直接在-80°C冷凍。所得沉淀重懸于0.5ml70%甲酸(FA)中并超聲處理30秒。甲酸用9.5mlIM中和，等份直接在_80°C冷凍。對(duì)于Aβ(χ-42)和Αβ(N3pGlu)ELISA測(cè)量以IOx稀釋度使用甲酸裂解物。對(duì)于Aβ(χ-42)測(cè)量使用IOx稀釋度甲酸裂解無。對(duì)于Aβ(N3pGlu-42)測(cè)量使用未稀釋FA裂解物。ELISA測(cè)量根據(jù)廠商方案進(jìn)行(IBLCo.，Ltd.Japan)。對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，累積來自SDS及FA提取的Aβ(χ-42)和Αβ(N3pGlu)濃度。Western印跡分析Aβ(χ-42)和Aβ(N3pGlu_42)用15%脲-PAGE凝膠如別處所述進(jìn)行N-末端修飾的Aβ肽的電泳分離(Klafki，H.W.,ffiltfang,J.&Staufenbiel，Μ.(1996)Anal.Biochem.237,24—29)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至半干燥條件下的硝基纖維素膜(Roth)。隨后，膜用在TBS-T(20mMTris/HCl；pH7.5；500mMNaCl,0.05%(v/v)Tween20)中的3%(w/v)奶粉封閉。Αβ肽用單克隆抗Αβ(1-16)抗體6E10(ChemiCOn)檢測(cè)。為顯色，印跡膜與辣根過氧化物酶綴合的抗小鼠第二抗體(CellSignaling)在含有5%(w/v)奶粉的TBS-T中保溫，隨后用SuperSignalWestPicoSystem(Pierce)根據(jù)廠商方案顯色。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組之間的差異用單向方差分析(ANOVA)隨后不成對(duì)t檢驗(yàn)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±s.e.m給出。不成對(duì)t檢驗(yàn)的顯著性水平如下給出:***P<0.001廣P<0.01；*P<0.05。存活率經(jīng)LogrankTest計(jì)算。所用計(jì)算均用GraphPadPrismversion4.03forWindows(GraphPadSoftware,SanDiego,CA,USA)進(jìn)行。實(shí)施例2行為試驗(yàn)初始篩選初始篩選采用標(biāo)準(zhǔn)方法以通過觀測(cè)評(píng)估提供行為及功能模式(RogersD.C.etal.，1997.BehavioralandfunctionalanalysisofmousephenotypeSHIRPA,aproposedprotocolforcomprehensivephenotypeassessment.MammGenome，8711-713)。使用修改的SHIRPA方案在高通量篩選中檢查一般健康及可干擾進(jìn)一步行為測(cè)試的特異功能(肌肉及下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能，脊髓小腦、感覺、神經(jīng)精神及自主功能)。評(píng)估從在室籠(homecage)中觀察社會(huì)行為(“室籠觀察”)而開始，然后是單個(gè)動(dòng)物在透明Plexiglas平臺(tái)中不干擾行為90秒(“個(gè)體觀察”)。小鼠行為的這個(gè)監(jiān)測(cè)隨后是一系列小測(cè)試以進(jìn)一步鑒定聽驚跳反射、懸吊行為(hangingbehavior)、視覺置位(visualplacing)、falling行為、翻正反射、姿勢(shì)反射、負(fù)趨地性(negativegeotaxis)、吊索(hangingwire)、耳顫搐(eartwitch)、須顫搐(whiskerstwitch)和眨眼。最后抓住動(dòng)物的頸部并檢查畸形異常(dysmorphologicalabnormalities).為了完成評(píng)估，稱重動(dòng)物，然后轉(zhuǎn)移回其室籠?？謶謼l件化為研究小鼠中的情境及線索恐懼反射(contextualandcuedfearreflexes)，使用商業(yè)化計(jì)算機(jī)控制的“恐懼條件化系統(tǒng)(FCS)”(TSESystems,BadHomburg,Germany)。根據(jù)OliverStiedl的方案(Stiedl0.etal.,2004Behavioralandautonomicdynamicsduringcontextualfearconditioninginmice.AutonNeurosci.BasicandClinical115(1-2):15_27)選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)置。連續(xù)兩天進(jìn)行在FCS中的研究并分為3個(gè)階段階段1(訓(xùn)練/條件化試驗(yàn))在恒定照明的(3001x)恐懼條件作用箱內(nèi)的透明丙烯酸室中進(jìn)行訓(xùn)練。揚(yáng)聲器提供恒定的白色背景噪音(68dbSPL)。停頓270秒后，小鼠被給予聽覺信號(hào)(cue)(10kHz，75dBSPL)30秒(條件化刺激)。在最后2秒聲音給予2秒足底電擊(0，7mA，恒定電流；非條件化刺激)。小鼠在電擊結(jié)束后返回它們的室籠30秒。階段2(情境保留)訓(xùn)練(階段1)后24小時(shí)，動(dòng)物再次暴露于原始情境并監(jiān)測(cè)行為270秒。階段3(音依賴性保留)在階段2后1小時(shí)在新的情境(類似大小的黑暗丙烯酸箱，由于黑色導(dǎo)致的降低的光強(qiáng)度，平地板代替電擊格柵)中測(cè)試對(duì)條件化刺激(聲音)的記憶。在新情境中自由探索270秒后施加與階段1相同的聲音180秒，經(jīng)FCS自動(dòng)記錄行為。暗亮箱在暗<_>亮探索模型中探索活動(dòng)的自動(dòng)評(píng)估(CrawleyJ.N.(2007)What'sffrongWithMyMouse:Anxiety_RelatedBehaviors.Wiley,SecondEdition,240-241)用PhenoMaster裝置(TSESystems,BadHomburg,Germany)的暗-亮箱插件進(jìn)行。插件包括由含有小通道的暗Plexiglas箱不等分分成兩個(gè)室(室的三分之一和三分之二)的Plexiglas室。較大的室是開放的并光照，而小的室封閉且黑暗。動(dòng)物逐個(gè)置于光照室并允許自由探索2個(gè)室10分鐘。光電池格柵自動(dòng)檢測(cè)小鼠活動(dòng)(在兩個(gè)室之間變換次數(shù)，每個(gè)室中消耗的時(shí)間，在每個(gè)室中移動(dòng)的距離)。學(xué)習(xí)和記憶分析Y-迷宮用三角Y形迷宮評(píng)估自發(fā)交替率(Spontaneousalternationrates)，所述迷宮從黑色塑料材料構(gòu)建，臂大小為30cmχ8cm。在20分鐘測(cè)試期間，每個(gè)小鼠隨機(jī)置于一個(gè)臂并允許自由移動(dòng)通過迷宮(Frenois,F.，Cador,M.，Caille,S.，Stinus,L.&LeMoine,C.(2002)Neuralcorrelatesofthemotivationalandsomaticcomponentsofnaloxone-precipitatedmorphinewithdrawal.EurJNeurosci.，16,1377-1389)。交替被定義為相繼進(jìn)入重疊三聯(lián)體設(shè)置(overlappingtripletsets)中的3個(gè)臂。一旦小鼠四個(gè)爪均進(jìn)入一個(gè)臂時(shí)進(jìn)入被定義為是相繼的。交替百分比被計(jì)算為實(shí)際與可能的交替的比率。為了消除氣味線索，迷宮用含有30%乙醇、60%水和10%無味香皂的溶液清洗。十字迷宮十字迷宮由黑色塑料材料構(gòu)成(臂大小長(zhǎng)30.0cm，寬8.0cm，壁高15.0cm)。相鄰臂成90°。四個(gè)臂從8.0平方厘米的中心空間伸出。因此，動(dòng)物經(jīng)中心空間進(jìn)入臂。在20.0分鐘測(cè)試期間，每個(gè)小鼠最初隨機(jī)置于一個(gè)臂中并允許自由穿過迷宮。各個(gè)臂被標(biāo)記為1-4。交替被定義為在重疊四聯(lián)體設(shè)置上的連續(xù)入口處進(jìn)入4個(gè)不同的臂(例如2，3，4，1或4，2，3，1，但非1，2，3，2)。一旦小鼠四個(gè)爪均進(jìn)入一個(gè)臂時(shí)進(jìn)入被定義為是相繼的。交替百分比被計(jì)算為在觀察期間實(shí)際與總體進(jìn)行的交替的比率。為了消除氣味線索，在每次試驗(yàn)后迷宮用含有30%乙醇、60%水和10%無味香皂的溶液清洗。測(cè)試在中等白光條件下進(jìn)行。更短的測(cè)試時(shí)間框架即10分鐘是可以的。T-迷宮連續(xù)交替任務(wù)(continuousalternationtask)(T-CAT)根據(jù)Gerlai(Gerlai,R.(1998)AnewcontinuousalternationtaskinT-mazedetectshippocampaldysfunctioninmice.Astraincomparisonandlesionstudy.BehavBrainRes.，95，91-101)提供的方法使用T迷宮。該裝置由黑色塑料材料制成，有黑色地板和閘門(guillotinedoor)0小鼠測(cè)試由一個(gè)單節(jié)測(cè)試組成，其從1個(gè)強(qiáng)迫選擇(forced-choice)試驗(yàn)開始，隨后是14個(gè)自由選擇試驗(yàn)。(i)強(qiáng)迫選擇試驗(yàn)在第一個(gè)試驗(yàn)中，兩個(gè)目的臂之一通過降下閘門而阻斷。在小鼠從起始臂釋放后，它會(huì)探索迷宮，進(jìn)入開放臂并返回起始位置。一旦小鼠返回起始臂，立即降下閘門，動(dòng)物被限制5秒。(ii)自由選擇試驗(yàn)在打開起始臂的門之后，動(dòng)物自由選擇兩個(gè)目的臂，因?yàn)樗虚l門都是開放的。一旦小鼠進(jìn)入一個(gè)目的臂，就將另一個(gè)目的臂關(guān)閉。當(dāng)小鼠返回起始臂時(shí)，在起始臂限制5秒后開始下一個(gè)自由選擇試驗(yàn)。30分鐘后或者14個(gè)自由選擇試驗(yàn)進(jìn)行后終止測(cè)試session。在認(rèn)為期間動(dòng)物從未被拿起，并且實(shí)驗(yàn)人員不知道被測(cè)試動(dòng)物的基因型。對(duì)每個(gè)動(dòng)物計(jì)算交替率，其是將交替選擇次數(shù)除以總選擇次數(shù)。在給定時(shí)間框架內(nèi)進(jìn)行少于8次選擇的動(dòng)物被排除在分析之外。Morris水迷宮在典型樣式中，小鼠被置于小水池后端首先避免應(yīng)激，并且面向水池側(cè)以避免偏倚，其含有藏在在水面下幾毫米的逃脫平臺(tái)。視覺線索如著色形狀被置于水池周圍使動(dòng)物一目了然。水池通常直徑為4-6英尺，深2英尺。水線上的側(cè)壁防止小鼠被實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)分散注意力。當(dāng)被釋放時(shí)，小鼠在水池中游泳以尋找出口，記錄各項(xiàng)參數(shù)，包括在水池每個(gè)象限耗費(fèi)的時(shí)間，到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間(潛伏期)，及總行走距離。小鼠從水中的逃脫增強(qiáng)了其迅速發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的愿望，在后續(xù)試驗(yàn)(平臺(tái)在相同位置)中小鼠能夠更快速定位平臺(tái)。發(fā)生這種行為改善是因?yàn)樾∈笠呀?jīng)學(xué)習(xí)到隱藏平臺(tái)的位置與明顯的視覺線索相關(guān)。在足夠練習(xí)后，有技能的小鼠可以從任何釋放點(diǎn)直接游泳到平臺(tái)。運(yùn)動(dòng)行為分析抱緊測(cè)試(ClaspingTest):為測(cè)試抱緊行為，小鼠吊尾30秒，記錄下肢抱緊時(shí)間。O秒抱緊被記為0分，1-10秒被記為1分，10-20秒被記為2分，抱緊20秒以上被記為3分(Nguyen,Τ.,Hamby,A.&Massa,S.Μ.(2005)Clioquinoldown-regulatesmutanthuntingtinexpressioninvitroandmitigatespathologyinaHuntington'sdiseasemousemodel.ProcNatlAcadSciUSA.，102，11840—11845)。足跡分析為獲得足跡，后爪用藍(lán)色無毒墨水標(biāo)記。將動(dòng)物置于暗通道(30cmχ7cm直徑)的一端，暗通道通向封閉箱。通道地面鋪白紙。使動(dòng)物行走到通道另一端，在這取出它們并放到它們的室籠中。最低2個(gè)不停留通過是需要的。步幅長(zhǎng)度是通過測(cè)量每步之間距離而確定，并計(jì)算平均步幅長(zhǎng)度(Barlow，C.，Hirotsune,S.，Paylor,R.，Liyanage,M.,Eckhaus,Μ.,Collins,F.,Shiloh,Y.,Crawley,J.N.,Ried,Τ.,Tagle,D.&Wynshaw-Boris,Α.(1996)Atm-deficientmice-.aparadigmofataxiatelangiectasia.Cell.，86，159-171).平衡木平衡和一般運(yùn)動(dòng)功能用平衡木任務(wù)評(píng)估。Icmdowel橫桿附著在兩個(gè)超出帶墊表面之上44cm的支持柱上。在所述50cm長(zhǎng)橫桿的每一端附著一9x15cm逃脫平臺(tái)。動(dòng)物被置于橫桿中心并釋放。每個(gè)動(dòng)物在一天測(cè)試中進(jìn)行3個(gè)試驗(yàn)。記錄動(dòng)物停留在橫桿上的時(shí)間，將所有3個(gè)試驗(yàn)所得的距跌落的潛伏時(shí)間被平均。如果動(dòng)物在整個(gè)60秒試驗(yàn)中均停留在橫桿上或者逃脫到一個(gè)平臺(tái)上，則記錄60秒最大時(shí)間(Arendash，G.W.，Gordon,Μ.N.,Diamond,D.Μ.,Austin,L.Α.,Hatcher,J.Μ.,Jantzen,P.,DiCarlo,G.,ffilcock,D.&Morgan,D.(2001)BehavioralassessmentofAlzheimer'stransgenicmicefollowinglong-termAbetavaccination:taskspecificityandcorreIationsbetweenAbetadepositionandspatialmemory.DNACellBiol·，20，737-744)。吊繩任務(wù)作為敏捷性和抓握強(qiáng)度的測(cè)試，將3mm線繩懸掛在平衡木裝置的帶墊表面上方35cm處。使動(dòng)物用它們的前爪抓緊繩子并釋放。在一個(gè)60秒試驗(yàn)期間使用0-5等級(jí)體系評(píng)估每個(gè)動(dòng)物在這個(gè)任務(wù)中的行為表現(xiàn)0=不能留在繩上；1=僅前爪或后爪懸吊；2=與1一樣，但試圖爬上繩；3=坐在繩上并且能夠保持平衡；4=四爪和尾巴繞繩并水平運(yùn)動(dòng)；5=逃脫(Moran,P.M.，Higgins,L.S.，Cordell,B.&Moser,P.C.(1995)Age-relatedlearningdeficitsintransgenicmiceexpressingthe751-aminoacidisoformofhumanbeta-amyloidprecursorprotein.ProcNatlAcadSciUSA,92,5341-5345)。垂直抓緊懸吊任務(wù)(VerticalGripHangingTask).通過將動(dòng)物懸掛在wirebar上(40x20cm面積，Imm金屬絲間隔1cm)而測(cè)試動(dòng)物的神經(jīng)肌肉異常(平衡和肌肉強(qiáng)度)。在小鼠被置于bar上并頭朝下時(shí)(高度30cm)，測(cè)量60秒內(nèi)距跌落的潛伏時(shí)間(Erbel-Sieler,C.,Dudley,C.,Zhou,Y.,Wu,Χ.,Estill,S.J.,Han,Τ.,Diaz-Arrastia,R.,Brunskill,Ε.W.,Potter,S.S.&McKnight,S.L.(2004)BehavioralandregulatoryabnormalitiesinmicedeficientintheNPASlandNPAS3transcriptionfactors.ProcNatlAcadSciUSA.，101，13648-13653)。轉(zhuǎn)棒用加速轉(zhuǎn)棒(TSE-Systems，Germany)測(cè)試運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)和協(xié)調(diào)。轉(zhuǎn)棒具有3.5cm的軸直徑和黑色橡皮表面。每個(gè)小鼠進(jìn)行每日6個(gè)試驗(yàn)，連續(xù)2天。將小鼠置于平衡木上，臉轉(zhuǎn)離實(shí)驗(yàn)者視野。它們?cè)诠?其圍繞垂直軸以增加速度旋轉(zhuǎn))上需向前運(yùn)動(dòng)，被強(qiáng)迫連續(xù)調(diào)整它們的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。在每個(gè)試驗(yàn)開始時(shí)，小鼠被置于不活動(dòng)的鼓上，鼓在360秒試驗(yàn)期間被加速到48rpm的速度。記錄動(dòng)物跌落棒的時(shí)間，360秒后截?cái)?Dere，Ε.，DeSouza-Silva,Μ.Α.,Frisch,C.,Teubner,B.,Sohl,G,Willecke,K.&Huston,J.P.(2003)Connexin30-deficientmiceshowincreasedemotionalityanddecreasedrearingactivityintheopen-fieldalongwithneurochemicalchanges.EurJNeurosci.,18,629-638)。用二因素ANOVA(基因型χ訓(xùn)練天數(shù))進(jìn)行分析，隨后Bonferroniposthoc檢驗(yàn)。強(qiáng)迫游泳測(cè)試強(qiáng)迫游泳測(cè)試與Morris水迷宮中的搜索測(cè)試(probetest)相同進(jìn)行(Spittaels,K.,VandenHaute,C.,VanDorpe,J.,Bruynseels,K.,Vandezande,K.,Laenen,I.,Geerts,H.,Mercken,Μ.,Sciot,R.,VanLomme1,Α.,Loos,R.&VanLeuven,F.(1999)Prominentaxonopathyinthebrainandspinalcordoftransgenicmiceoverexpressingfour-repeathumantauprotein.AmJPathol，155，2153—2165)。簡(jiǎn)而言之，直徑IlOcm的水池填充20cm高的不透明水并保持在22°C。在一個(gè)60秒試驗(yàn)中將小鼠放在水池中央，用計(jì)算機(jī)自動(dòng)化追蹤系統(tǒng)(VideoMot2，TSE-Systems)測(cè)量總游泳距離和游泳速度。曠場(chǎng)(OpenField)用曠場(chǎng)測(cè)試評(píng)估探索行為和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)(Iocomotoractivity)。小鼠用曠場(chǎng)箱進(jìn)行測(cè)試，曠場(chǎng)箱由灰色塑料制成，具有50x50cm表面積和38cm高的墻壁。通過自動(dòng)化追蹤系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，該系統(tǒng)配有直立(rearing)指示器，其包括32個(gè)紅外傳感器以監(jiān)測(cè)直立活動(dòng)(verticalactivity)(VideoMot2,TSE-Systems,Germany)。在5分鐘期間記錄的行為參數(shù)是(i)跑步速度及總行走距離，(ii)在中心部分(20x20cm)消耗的時(shí)間比總時(shí)間，(iii)直立事件動(dòng)物后腿站立而前腿懸空或靠墻的次數(shù)(直立活動(dòng)的測(cè)量)(Dere，Ε.，DeSouza-Silva,Μ.Α.，F(xiàn)risch，C.，Teubner,B.,Sohl,G,Willecke,K.&Huston,J.P.(2003)Connexin30-deficientmiceshowincreasedemotionalityanddecreasedrearingactivityintheopen-fieldalongwithneurochemicalchanges.EurJNeurosci.，18，629—638)。高架十字迷宮(ElevatedPlus-Maze).裝置高架十字迷宮根據(jù)Lister(1987)的描述建造。其具有黑色Plexiglas地面，具有5x5cm中心方平臺(tái)，從該平臺(tái)放射出2個(gè)具有0.25cm高邊緣的45x5cm開放臂，和2個(gè)具有由透明Plexiglas制成的40cm高的壁的45x5cm封閉臂。沿4個(gè)臂的每一個(gè)臂的一半畫白線，由此測(cè)量位置移動(dòng)(locomotion)。裝置在十字膠合板基座上升高到地面上方45cm。裝置置于用60瓦紅燈泡照明的2x5m實(shí)驗(yàn)室房間中。程序小鼠在它們的室籠中被攜帶進(jìn)測(cè)試房間。所有時(shí)間均通過其尾巴根部拿小鼠。將小鼠一次一個(gè)置于十字迷宮的中心區(qū)面向開放臂。然后使小鼠探索裝置5分鐘。靜靜坐在離裝置約Im遠(yuǎn)的觀察者記錄動(dòng)物在迷宮上的行為。位于迷宮中心上方150cm的攝像機(jī)也記錄行為。用LimeLight評(píng)分行為。5分鐘后，通過尾巴根部手拿而移走小鼠返回其室籠。迷宮然后在各測(cè)試之間用70%乙醇溶液清洗并干燥。記錄的行為包括1.開放臂進(jìn)入動(dòng)物進(jìn)入開放臂的頻率。小鼠全部4個(gè)爪都在臂中計(jì)為1次進(jìn)入。2.封閉臂進(jìn)入動(dòng)物進(jìn)入封閉臂的頻率。小鼠全部4個(gè)爪都在臂中計(jì)為1次進(jìn)入。3.開放臂停留時(shí)間動(dòng)物待在開放臂中的時(shí)間長(zhǎng)度。4.封閉臂停留時(shí)間動(dòng)物待在封閉臂中的時(shí)間長(zhǎng)度。5.中心區(qū)進(jìn)入動(dòng)物全部4個(gè)爪進(jìn)入中心區(qū)的頻率。6.中心區(qū)停留時(shí)間動(dòng)物待在中心區(qū)中的時(shí)間長(zhǎng)度。7.頭下探(Headdipping)動(dòng)物超過開放臂側(cè)面朝地面低頭的頻率。8.Stretchattend姿勢(shì)動(dòng)物向前伸頭和肩然后縮回原始位置的頻率。9.直立動(dòng)物后腿站立或用前爪靠在迷宮墻壁上的次數(shù)。10.不探索行為(Nonexploratorybehaviour)理毛(Grooming)或小鼠在任何時(shí)候均不活動(dòng)。11.撒尿尿積水或條痕數(shù)。12.大便產(chǎn)生的大便數(shù)。13.位置移動(dòng)動(dòng)物跨過開放臂和封閉臂上的劃線的次數(shù)。從這些結(jié)果計(jì)算每個(gè)動(dòng)物基于總臂進(jìn)入的開放臂和封閉臂進(jìn)入的百分比。計(jì)算在5分鐘測(cè)試中停留在開放臂和封閉臂中的時(shí)間百分比。避開開放臂的指數(shù)(Trullas，R.，&Skolnick，P.1993.Differencesinfearmotivatedbehaviorsamonginbredmousestrains.Psychopharmacology,111,323-331)計(jì)算為[100-在開放臂上的時(shí)間開放臂進(jìn)入)\2]。權(quán)利要求過表達(dá)Aβ肽的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包含含有編碼Aβ肽的DNA轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述動(dòng)物對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是雜合的。3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述動(dòng)物對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是小鼠。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因是鼠來源的。6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因是人來源的。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因是重組基因。8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述重組基因編碼嵌合或人源化多肽。9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼Ai3N3E-42(SEQIDNo:1)、A3N3Q-42(SEQIDNo:2)、AβN3E-40(SEQIDNo3)和AβN3Q-40(SEQIDNo4)中的至少一個(gè)。10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼AβΝ3Ε-42(SEQIDNo1)和AβN3Q-42(SEQIDNo2)中的至少一個(gè)。11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因與組織特異性啟動(dòng)子可操縱地連接。12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其另外包含含有編碼谷氨酰胺酰環(huán)化酶或者谷氨酰胺酰_肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶樣蛋白的DNA轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述谷氨酰胺酰環(huán)化酶或者谷氨酰胺酰-肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶樣蛋白質(zhì)選自人isoQC(SEQIDNo14或15)、小鼠(SEQIDNo20)、Macacafascicularis(SEQIDNo16)>Macacamulatta(SEQIDNo:17)、貓(SEQIDNo:18)、大鼠(SEQIDNo:19)、牛(SEQIDNo:21)，或其具有至少50%/75%序列相同性/相似性的類似物。14.權(quán)利要求12或13的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述谷氨酰胺酰環(huán)化酶或者谷氨酰胺酰-肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶樣蛋白質(zhì)是SEQ.IDNo:13-15、22或23所示人QC或isoQC、大鼠QC(SEQ.IDNo19)或者小鼠(SEQ.IDNo20)的同種型或者剪接型。15.權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述谷氨酰胺酰環(huán)化酶或者谷氨酰胺酰_肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶樣蛋白質(zhì)是SEQ.IDNo:13或SEQ.IDNo20之一。16.篩選抑制或促進(jìn)Αβ肽體內(nèi)作用的生物活性物質(zhì)的方法，包括a)將測(cè)試物質(zhì)給予權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的非人動(dòng)物，和b)確定所述物質(zhì)對(duì)于產(chǎn)生的Aβ肽作用的作用。17.<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>18.<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>19.<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>20.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是鼠來源的。21.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是人來源的。22.權(quán)利要求16-21任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是重組基因。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述重組轉(zhuǎn)基因編碼嵌合或人源化多肽。24.權(quán)利要求16-23任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼AβΝ3Ε-42(SEQIDNo1),AβN3Q-42(SEQIDNo:2)、AβN3E-40(SEQIDNo3)和/或AβN3Q-40(SEQIDNo:4)。25.權(quán)利要求16-24任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼AβN3E-42(SEQIDNo1)和/或AβN3Q-42(SEQIDNo:2)。26.衍生自權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞系。27.轉(zhuǎn)基因小鼠，其包含編碼Αβ肽的轉(zhuǎn)基因核苷酸序列，所述轉(zhuǎn)基因核苷酸序列與啟動(dòng)子可操縱地連接，整合進(jìn)小鼠基因組中，其中所述小鼠表現(xiàn)出可以用Αβ肽作用的Αβ肽抑制劑逆轉(zhuǎn)或減輕的表型。28.權(quán)利要求27的小鼠，其中所述小鼠過表達(dá)Αβ肽。29.權(quán)利要求27或28的小鼠，其中所述小鼠對(duì)于Αβ肽是雜合的。30.權(quán)利要求27或28的小鼠，其中所述小鼠對(duì)于Αβ肽是純合的。31.權(quán)利要求27或28的小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因序列編碼鼠Αβ肽。32.權(quán)利要求27或28的小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因序列編碼人Αβ肽。33.權(quán)利要求27-32任一項(xiàng)的小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼Ai3N3E-42(SEQIDNo1),AβN3Q-42(SEQIDNo:2)、AβΝ3Ε-40(SEQIDNo3)和/或AβN3Q-40(SEQIDNo:4)。34.權(quán)利要求27-33任一項(xiàng)的小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼Ai3N3E-42(SEQIDNo1)和/或AβN3Q-42(SEQIDNo:2)。35.篩選抑制或促進(jìn)Αβ肽作用的治療劑的方法，包括a)將測(cè)試物質(zhì)給予權(quán)利要求27-34任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，b)評(píng)估所述測(cè)試物質(zhì)對(duì)于小鼠神經(jīng)學(xué)表型的作用，和c)選擇抑制或促進(jìn)Aβ肽作用的測(cè)試物質(zhì)。36.治療或預(yù)防Αβ肽相關(guān)疾病的方法，包括a)給予權(quán)利要求35的選擇的測(cè)試物質(zhì)，和b)監(jiān)測(cè)患者的Αβ肽相關(guān)疾病的臨床指標(biāo)的降低。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述Aβ肽相關(guān)疾病是阿爾茨海默病。38.包含權(quán)利要求36的選擇的測(cè)試物質(zhì)的藥物組合物。39.權(quán)利要求36的選擇的測(cè)試物質(zhì)在制備治療和/或預(yù)防Aβ肽相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。40.篩選受Αβ肽產(chǎn)生影響的靶化合物的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或者權(quán)利要求27-34任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)估Αβ肽在體內(nèi)對(duì)于可能的靶化合物的作用。全文摘要本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，特別是編碼參與Aβ肽相關(guān)疾病的Aβ肽蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明另外提供了包含編碼Aβ肽的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞和細(xì)胞系。本發(fā)明進(jìn)一步提供了評(píng)估影響Aβ肽的物質(zhì)的方法和組合物，用于治療肽相關(guān)疾病的組合物中。文檔編號(hào)C12N9/10GK101802000SQ200880106765公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年9月12日優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日發(fā)明者H·欽尼斯,H-U·德穆特,S·席林,S·格勞布納,W·亞格拉申請(qǐng)人:前體生物藥物股份公司