用于調(diào)控t細(xì)胞的方法和組合物的制作方法

文檔序號：570943閱讀：1301來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>食品,飲料機(jī)械,設(shè)備的制造及其制品加工制作,儲藏技術(shù)

專利名稱：用于調(diào)控t細(xì)胞的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及免疫相關(guān)疾病和其它病理狀況的治療領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明關(guān)注用于調(diào)控與已活化T細(xì)胞中的CRTAM表達(dá)有關(guān)的分子事件的方法和組合物。
背景技術(shù)：
T細(xì)胞與APC之間的協(xié)調(diào)相互作用是有效的TCR活化和它們的效應(yīng)器功能形成所需要的(Dustin 和 Cooper, 2000 ；Friedl 等，2005 ；Huppa 和 Davis, 2003 ；Krummel 和 Macara, 2006 ；Vicente—Manzanares 禾口 Sanchez—Madrid，2004)。表面共同受體(包括 CD2、 CD4、CD8和CD28)在T細(xì)胞APC接觸區(qū)協(xié)調(diào)初始信號傳導(dǎo)平臺以誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成和效應(yīng) 器功能所需要的膜動力學(xué)、細(xì)胞極性和細(xì)胞形狀變化。許多TCR激活的基因控制后續(xù)細(xì)胞命運(yùn)和全集決策(Cantrell，1996)。轉(zhuǎn)錄因子(諸如 Tbx21/T_bet、Gata3、Rorc ( y t)、和 Foxp3)的上調(diào)調(diào)節(jié)分別變成Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞的T細(xì)胞子集分化(Lee等，2006 ； Tato等，2006)。細(xì)胞表面蛋白(諸如CD25)的上調(diào)賦予IL2響應(yīng)性并使得細(xì)胞能夠進(jìn)行細(xì) 胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞分裂(Ma等，2006)。相反，CTLA4的上調(diào)調(diào)控T細(xì)胞應(yīng)答并促進(jìn)TCR全集的成型(Teft等，2006)。因此，TCR活化后受到調(diào)節(jié)的分子表達(dá)可在決定T細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。CRTAM(—種含有V和C1樣Ig結(jié)構(gòu)域的I型跨膜蛋白質(zhì))(Du Pasquier, 2004) 是一種細(xì)胞毒性或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)分子，被鑒定為在結(jié)構(gòu)上與免疫球蛋白超家族有關(guān) 且在某些T細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物蛋白質(zhì)(Kennedy等；美國專利No. 5，686，257 ；和TO2006/098887)。已經(jīng)報告了在已活化CD8+T細(xì)胞、NK和NKT細(xì)胞中瞬時檢測到人 CRTAM轉(zhuǎn)錄物，而且CRTAM與其配體Necl2(也叫作CADM1)之間的相互作用可能在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用(Fuchs和Colonna，2006 ;Kennedy等，2000)。已經(jīng)披露了小鼠 Crtam是雙陰性(DN)胸腺細(xì)胞中一種激活誘導(dǎo)的基因(Kennedy等，2000)。由Abbas等 (Geneslmmun(2005)，6 :319_331 ；US2007/0184444 ；US2007/0185017 ；US2006/0263774)進(jìn) 行的微陣列分析指示CRTAM是在人CD4+和CD8+T細(xì)胞上上調(diào)的候選基因，盡管T細(xì)胞活化期間CRTAM表達(dá)的精確的T細(xì)胞亞群、性質(zhì)、程度、和生理學(xué)意義尚不清楚。Crtam的細(xì)胞質(zhì)C00H-末端序列含有高度保守的I類PSD-95/盤-大/Z0-1 (PDZ)-域蛋白質(zhì)相互作用基序，其促進(jìn)涉及多種信號傳導(dǎo)途徑(包括細(xì)胞粘附、極性和增殖)的大型蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配。在T細(xì)胞中，含PDZ的蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)(包括Scrib和Dlgl)在T細(xì)胞尾足形成、遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且促進(jìn)T細(xì)胞APC偶聯(lián)物形成(Ludford-Menting等，2005)。已經(jīng)證明了 Scrib和Dlgl在TCR參與后受到動態(tài)調(diào)節(jié)，并影響NFAT和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄活化(Round等， 2007 ；Round等，2005 ；Xavier等，2004)。Scrib充當(dāng)支架來裝配在上皮和神經(jīng)元細(xì)胞中調(diào) 節(jié)細(xì)胞極性的信號傳導(dǎo)復(fù)合物(Humbert等，2006)。果蠅中scribble (scrib)的突變或上皮細(xì)胞中Scrib的敲除導(dǎo)致極性喪失、G1至S期的細(xì)胞周期延長和細(xì)胞增殖加快(Bilder 等，2000 ；Nagasaka等，2006)。然而，不清楚CRTAM在已活化T細(xì)胞失調(diào)構(gòu)成眾多病理學(xué)病癥原因的該已活化T細(xì)胞(諸如CD4+細(xì)胞)中發(fā)揮什么作用(如果有的話)。因為T細(xì)胞在正常生理學(xué)背景中發(fā)揮關(guān)鍵作用，所以對T細(xì)胞活性的治療性調(diào)控會受益于對T細(xì)胞病理性子集的精細(xì)靶向，同時放過正常免疫功能所需要的旁觀T細(xì)胞。已經(jīng)完全確立了 T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要參與者，而且T細(xì)胞在其各種階段和形式中的精致平衡的不當(dāng)擾動可導(dǎo)致嚴(yán)重的病理學(xué)疾患，包括其中有不受檢查的和/或升高的免疫應(yīng)答的自身免疫性疾病，或其中有不足的免疫防御的持續(xù)感染和癌癥。因此，已經(jīng)使用多種治療劑來治療此類疾患。但是，臨床經(jīng)驗證明了這些藥劑達(dá)不到理想的功效和安全性特征，而且常常與短期和長期不良副作用有關(guān)。例如，顯然不是所有的藥劑在所有患者中都是有效的和/或安全的，因此需要開發(fā)靶向限制性地與根本病理學(xué)原因有關(guān)的新分子的新型藥劑，例如通過采取聚焦于靶向特定T細(xì)胞子集的更加細(xì)調(diào)的辦法。這樣的辦法需要鑒定只在如下的T細(xì)胞子集中存在的和/或只對如下的T細(xì)胞子集負(fù)責(zé)的靶物，該T細(xì)胞子集被引發(fā)和/或在生理學(xué)上注定引起構(gòu)成感興趣疾病原因的效應(yīng)。適合于治療性靶向的分子包括那些在限制性T細(xì)胞亞群上表達(dá)的，它們標(biāo)記和/ 或負(fù)責(zé)自寬的T細(xì)胞全集劃分出涉及特定免疫相關(guān)病癥的病因或病理的最小亞群。事實(shí) 上，理想的是，在限制性的T細(xì)胞標(biāo)志物之外，此類分子還可以是與可以為了治療性干預(yù)而被靶向的細(xì)胞活性有關(guān)的。不幸的是，迄今為止，缺少關(guān)于此類分子的信息。信息的短缺妨礙了開發(fā)會容許細(xì)調(diào)T細(xì)胞治療性調(diào)節(jié)的治療策略的努力。確實(shí)需要鑒定此類分子靶物和途徑，它們會成為上文所述新型治療性干預(yù)的焦點(diǎn)。本文所述發(fā)明滿足了這種需要并提供了其它好處。通過述及完整收錄本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請和出版物。發(fā)明概述本發(fā)明(至少部分)基于如下發(fā)現(xiàn)，即Crtam在特定T細(xì)胞子集(特別是特定 CD4+T細(xì)胞子集)上上調(diào)，而且它與以Scrib為中心的信號傳導(dǎo)復(fù)合物配合來控制先前未認(rèn) 識的T細(xì)胞極性晚期和選擇性調(diào)節(jié)某些細(xì)胞因子(包括IFN Y、IL22、和IL17)的生成。細(xì)胞蛋白質(zhì)的空間組構(gòu)在細(xì)胞極性的建立中發(fā)揮重要作用，而且是細(xì)胞分裂、分化、細(xì)胞遷移和器官發(fā)生的本質(zhì)特征?？乖蔬f細(xì)胞(APC)對T細(xì)胞的活化導(dǎo)致免疫學(xué)突觸 (immunological synapse, IS)的形成(即TCR接觸區(qū)處信號傳導(dǎo)支架的配合裝配)、肌動蛋白與微管的重新組構(gòu)及細(xì)胞間接觸后頭幾個小時里第二信使的生成。如本文所述，CRTAM 在⑶4+和⑶8+T細(xì)胞二者上上調(diào)，而且更具體的說和出乎意料的是，它在已活化T細(xì)胞的特定子集中在T細(xì)胞活化獨(dú)特(早)期之后上調(diào)，而且它與由Scrib極性蛋白錨定的信號傳導(dǎo)分子獨(dú)特集合配合來在T細(xì)胞活化晚期期間調(diào)節(jié)細(xì)胞極性以影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答的細(xì) 胞分裂、增殖和選擇性細(xì)胞因子生成。本文中顯示了 CRTAM表達(dá)來標(biāo)記T細(xì)胞全集的特定子集。CRTAM生物學(xué)功能在本文中顯示出與在T細(xì)胞中在活化晚期期間實(shí)現(xiàn)某些活性有聯(lián) 系，而且對CRTAM功能的干預(yù)在本文中展示出導(dǎo)致已活化T細(xì)胞活性的改變。如此，本文中所公開的數(shù)據(jù)揭示了一種重要的分子靶物/途徑，它專門與重要的已活化T細(xì)胞子集有關(guān) 且在干預(yù)時導(dǎo)致對與該已活化T細(xì)胞子集有關(guān)的關(guān)鍵活性的調(diào)控。本發(fā)明提供了對于調(diào)節(jié) 此類細(xì)胞的存在和/或活性有用的方法、組合物、試劑盒和制品，這通過調(diào)控CRTAM相關(guān)T細(xì)胞活性，例如通過對某些表達(dá)CRTAM的T細(xì)胞的存在和/或活性的選擇性靶向和/或消除(ablation)實(shí)現(xiàn)。一方面，本發(fā)明提供了在T細(xì)胞(例如已活化T細(xì)胞，諸如CD4+T細(xì)胞)中調(diào)控 CRTAM活性的CRTAM調(diào)控物。在一個實(shí)施方案中，所述CRTAM調(diào)控物調(diào)控與相關(guān)配體(例如 Necl2)結(jié)合CRTAM有關(guān)的CRTAM活性。在一個實(shí)施方案中，所述CRTAM調(diào)控物調(diào)控由CRTAM 與Scrib之間的復(fù)合物形成誘導(dǎo)的CRTAM活性。本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物可調(diào)控CRTAM_Scrib 途徑的一個或多個方面。例如，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物調(diào)控一種或多種與CRTAM和/或Scrib活性有關(guān)的細(xì)胞事件，包括例如免疫學(xué)突觸的形成和/或維持、T細(xì) 胞極化、T細(xì)胞活化的維持、等。例如，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物能夠在已活化T細(xì)胞(諸如CD4+T細(xì)胞)中拮抗和/或抑制CRTAM活性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā) 明的CRTAM調(diào)控物能夠在體外或在體內(nèi)調(diào)控已極化的已活化T細(xì)胞(諸如CD4+T細(xì)胞)的量。例如，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物能夠在已活化T細(xì)胞(諸如CD4+T細(xì) 胞)中拮抗和/或抑制CRTAM活性，使得已極化的T細(xì)胞的量減少。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物能夠在已活化T細(xì)胞(諸如CD4+T細(xì)胞中增強(qiáng)CRTAM活性。如此，例如，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物能夠在已活化T細(xì)胞(諸如CD4+T細(xì)胞)中增強(qiáng)CRTAM活性，使得已極化的T細(xì)胞的量增多?？梢砸匀魏芜m合于臨床使用的形式來提供本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物。例如，可以以核酸或多肽的形式來提供和/或施用本發(fā)明的調(diào)控物。因而，在一個實(shí)施方案中，所述核酸編碼能夠調(diào)控CRTAM(例如通過調(diào)控CRTAM的表達(dá))的抑制性/干擾性RNA(諸如siRNA) 或反義RNA。在一個實(shí)施方案中，所述核酸編碼或包含能夠調(diào)控CRTAM表達(dá)和/或活性的微 RNA(microRNA)序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)控物是能夠在細(xì)胞中干擾微RNA使得 CRTAM表達(dá)和/或活性受到調(diào)控的分子。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物包含編碼能夠拮抗CRTAM活性的多肽的核酸。例如，所述多肽可以包含至少包含CRTAM —部分的肽，其中所述肽能夠與CRTAM的相互作用配偶(例如它的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)合配偶)相互作用。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物多肽是包含與免疫球蛋白序列至少一部分(例如Ig Fc)融合的CRTAM至少一部分(例如CRTAM的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中能夠與CRTAM配體諸如Necl2 結(jié)合的一部分)的融合多肽。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物多肽包含截短的CRTAM，其包含Scrib結(jié)合序列。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物多肽是包含與免疫球蛋白序列至少一部分(例如Ig Fc)融合的CRTAM結(jié)合配偶至少一部分(例如Necl2中能夠與CRTAM結(jié)合的一部分)的融合多肽。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物多肽是與Ig Fc融合的Necl2細(xì) 胞外結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物多肽是抗體。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物多肽是抗CRTAM抗體。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物多肽是抗Necl2抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)控物包含適體(aptamer)。因而，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物包含在細(xì)胞(例如已活化⑶4+T 細(xì)胞)中存在時抑制該細(xì)胞中CRTAM活性(包括但不限于基因表達(dá))的核酸。在一個實(shí)施方案中，所述核酸包含反義寡核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，所述核酸包含抑制性/干擾性 RNA。在一個實(shí)施方案中，所述抑制性/干擾性RNA是抑制性/干擾性小RNA (siRNA)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物包含抗體。在一個實(shí)施方案中，抗CRTAM抗體可以是單克隆抗體，包括其片段。在一個實(shí)施方案中，抗CRTAM抗體可以是多克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是阻斷性的或非阻斷性的，其在每種情況中還可以是消減性的抗體。在一個實(shí)施方案中，所述抗體是消減性的抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體片段可以是例如Fab、 Fab'、F(ab' )2、scFv、(scFv)2、dAb、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、和多特異性抗體(例如自抗體片段形成的多特異性抗體)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有改變的效應(yīng)器功能，例如通過Fc序列突變、Fc糖基化改變(例如未巖藻糖基化)。用于改變抗體效應(yīng)器功能的方法是可變的和本領(lǐng)域公知的。在一個實(shí)施方案中，CRTAM抗體是消減性的抗體。在一個實(shí)施方案中，所述消減性的抗體是包含毒素的抗體偶聯(lián)物。在一個實(shí)施方案中，所述毒素是放射性同位素、酶、小分子毒素、和/或細(xì)胞毒劑。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物包含干擾CRTAM與其細(xì)胞內(nèi)結(jié)合配偶(例如Scrib)相互作用的分子。例如，此類分子可以包含核酸、肽、小分子、或抗體，施用它，使得它進(jìn)入靶T細(xì)胞以抑制該細(xì)胞中的CRTAM活性，即該分子被內(nèi)化。在一個實(shí)施方案中，肽或抗體是由導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)染)靶T細(xì)胞中的核酸編碼的。一方面，本發(fā)明提供了能夠與CRTAM結(jié)合的結(jié)合劑。在一個實(shí)施方案中，此類結(jié)合劑包含任何能夠檢測樣品中存在的或與細(xì)胞或組織結(jié)合的CRTAM的分子。在一個實(shí)施方案中，此類結(jié)合劑對于使感興趣分子(例如治療劑、毒素、等)靶向CRTAM+T細(xì)胞亞群是有用的。在一個這樣的實(shí)施方案中，CRTAM+T細(xì)胞亞群是⑶4+。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合劑包含本文所述CRTAM調(diào)控物中的一種或多種。一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定CRTAM調(diào)控物(諸如對于調(diào)控已活化T細(xì)胞中的 CRTAM活性有用的分子)的方法，該方法包括使候選物質(zhì)接觸CRTAM(或其功能性變體，如下文中所定義的)，并在存在和不存在所述候選物質(zhì)的情況中測量一種或多種如本文所述 CRTAM相關(guān)活性的量，其中在存在和不存在所述候選物質(zhì)時的所述CRTAM相關(guān)活性的量不同指示所述候選物質(zhì)是CRTAM調(diào)控物。CRTAM相關(guān)活性可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的定性或定量測量方法來測定。CRTAM相關(guān)活性包括例如對例如⑶4+Thl、Thl7和/或⑶8+ 細(xì)胞中的細(xì)胞因子水平(諸如IFN Y、白介素IL22、和/或IL17)的調(diào)節(jié)。例如，活性的量可以通過其活性受CRTAM調(diào)節(jié)的下游分子的活性量來指示。在另一個例子中，活性的量通過細(xì)胞表型(例如T細(xì)胞極性)的檢測和/或測量來指示。本發(fā)明的方法可用于鑒定CRTAM 拮抗劑或激動劑。例如，在一個實(shí)施方案中，CRTAM相關(guān)活性在存在候選物質(zhì)的情況中較低。在另一個實(shí)施方案中，CRTAM相關(guān)活性在存在候選物質(zhì)的情況中較高。通過本發(fā)明方法鑒定的調(diào)控物可具有在本發(fā)明方法中使用所需要的任何特征。例如，可選擇能夠調(diào)控T細(xì)胞活化和/或維持此類活化的候選物。在另一個例子中，可選擇能夠調(diào)控特定細(xì)胞因子表達(dá) (包括例如抑制IFN y、IL22、和/或IL17表達(dá))的CRTAM拮抗劑調(diào)控物。一方面，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物是如本文所述通過本發(fā)明的鑒定方法獲得的。如本文所述，本發(fā)明的抗體可以處于任何適合于在本發(fā)明方法中使用的形式。例如，本發(fā)明的抗體可以是人的、人源化的或嵌合的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是稱作 17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ； 34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464)的抗體的人源化形式或嵌合形式。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是與稱作17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物no. PTA-8464)的抗體結(jié)合CRTAM上相同表位的人源化抗體、嵌合抗體或人抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是與稱作17B2. 7. 12.9.2.2仏10保藏物11。.？1六-8463)； 32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460)； 6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464) 的抗體競爭對CRTAM的結(jié)合的人源化抗體、嵌合抗體或人抗體(例如在CRTAM位于無細(xì) 胞環(huán)境中或者在細(xì)胞上(在體外或在體內(nèi))的情況中)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作 17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464)的抗體的一個、兩個、三個、四個、五個或所有高變區(qū)、高變環(huán)和/或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā) 明的抗體包含稱作 17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464)的抗體的一個或所有 (兩個)可變域或其功能性部分。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作17B2的抗體的輕鏈(SEQ ID N0:31)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作17B2的抗體的輕鏈可變區(qū)(SEQ IDN0 35)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作17B2的抗體的輕鏈可變區(qū) CDR1(SEQ ID NO :37)、CDR2(SEQ ID NO :38)、或 CDR3 (SEQ ID NO 39)中至少一項。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作17B2的抗體的輕鏈可變區(qū)⑶R1 (SEQ ID NO 37)、 CDR2 (SEQ ID NO :38)、和CDR3 (SEQID NO :39)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作 17B2的抗體的重鏈(SEQ ID NO 32)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作17B2的抗體的重鏈可變區(qū)(SEQ ID N0:36)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作17B2的抗體的重鏈可變區(qū) CDR1(SEQ ID NO :40)、CDR2(SEQ ID NO :41)、或CDR3 (SEQ ID NO :42)中至少一項。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含稱作17B2的抗體的重鏈可變區(qū)CDR1 (SEQ ID NO :40)、CDR2(SEQ ID NO :41)、和 CDR3 (SEQ ID NO :42)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是稱作 17B2 的抗體 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物no. PTA-8462)；或20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC保藏物no. PTA-8464)的親和力成熟衍生物的人源化形式、嵌合形式或人形式。一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療疾病(例如自身免疫性疾病)的方法，包括對受試者施用有效量的本發(fā)明CRTAM調(diào)控物。在一個實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動物受試者，例如，人類受試者。在一個實(shí)施方案中，所述CRTAM調(diào)控物是CRTAM拮抗劑。在一個實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法治療和/或預(yù)防的疾病的特征為存在已活化CD4+CRTAM+T細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞的進(jìn)一步特征為細(xì)胞因子表達(dá)水平在與CD4+CRTAM—T細(xì)胞中的表達(dá)相比時升高。在又一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞的特征為細(xì)胞因子分泌水平在與CD4+CRTAMT細(xì)胞中的細(xì)胞因子分泌水平相比時升高。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是IFN y、IL22、和/或IL17。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞是自身反應(yīng) 性的。在一個實(shí)施方案中，治療或預(yù)防疾病的方法的特征為在施用本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物后受試者中的細(xì)胞因子表達(dá)與不施用所述CRTAM調(diào)控物的受試者相比降低。在另一個實(shí) 施方案中，所述治療或預(yù)防的進(jìn)一步特征為在施用本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物后受試者中的細(xì) 胞因子分泌水平與不施用所述CRTAM調(diào)控物的受試者相比降低。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是IFN Y、IL22、和/或IL17。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞是自身反應(yīng)性的。在另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制T細(xì)胞增殖或T細(xì)胞效應(yīng)器功能的方法。在一個實(shí)施方案中，T細(xì)胞是已活化T細(xì)胞，諸如CD4+T細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制T細(xì)胞增殖或T細(xì)胞效應(yīng)器功能的方法，包含使CRTAM調(diào)控物接觸T細(xì)胞，其中所述調(diào)控物抑制T細(xì)胞中的CRTAM活性，例如通過在所述T細(xì)胞中抑制配體結(jié)合CRTAM 來實(shí)現(xiàn)。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物包含如本文所述抗體，包括阻斷性的或非阻斷性的抗體，其在每種情況中還可以是消減性的抗體。在一個實(shí)施方案中，所述抗體是消減性的抗體。在一個實(shí)施方案中，所述抗體是抗體片段。在一個實(shí)施方案中，所述抗體是包含毒素的抗體偶聯(lián)物。在一個實(shí)施方案中，所述毒素包括放射性同位素、酶、小分子毒素、和/或具有細(xì)胞毒活性的藥劑。本發(fā)明提供了使用如本文所述能夠調(diào)控CRTAM生物學(xué)活性的本發(fā)明CRTAM調(diào)控物治療或預(yù)防疾病的方法。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控涉及一種或多種細(xì)胞事件，包括但不限于下述一項或多項細(xì)胞增殖、周期和/或分裂；細(xì)胞粘附；T細(xì)胞效應(yīng)器功能的形成；細(xì) 胞因子生成；某些分子自細(xì)胞內(nèi)募集至膜，所述分子包括但不限于Scrib、PKC (、和Cdc42 中的一項或多項；T細(xì)胞前緣處含Cdc42的復(fù)合物的裝配的細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)；晚期細(xì)胞骨架改造；和T細(xì)胞極性(polarity)。在一個實(shí)施方案中，CRTAM調(diào)控物的調(diào)控作用可影響某些 CRTAM+細(xì)胞類型，包括但不限于下述一項或多項⑶4+T細(xì)胞(例如Thl和Thl7細(xì)胞)、⑶8+T 細(xì)胞、NK細(xì)胞、和NKT細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，CRTAM調(diào)控物的調(diào)控作用涉及對細(xì)胞因子生成的影響，包括但不限于下述一項或多項IFNy、IL22、和/或IL17。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療或預(yù)防疾病的方法包括消減T細(xì)胞亞群，這與對受試者施用如本文中所提供的CRTAM調(diào)控物有關(guān)。在一個實(shí)施方案中，所消減的T細(xì)胞群體是CRTAM+⑶4+T細(xì)胞亞群，例如Thl和/或Thl7T細(xì)胞亞群。一方面，本發(fā)明提供了一種在受試者中檢測或診斷疾病的方法，包括(a)使CRTAM 調(diào)控物(例如CRTAM結(jié)合劑)接觸自所述受試者獲得的第一細(xì)胞(例如T細(xì)胞)樣品，(b) 比較所述樣品與對照樣品中CRTAM+細(xì)胞的量，其中所述第一樣品中的量較高指示所述受試者中存在所述疾病。在一個實(shí)施方案中，所述檢測疾病的方法進(jìn)一步包括下述步驟(c)自所述受試者獲得含有T細(xì)胞的第二樣品；(d)使CRTAM調(diào)控物(例如CRTAM結(jié)合劑)接觸所述第二樣品；并(e)比較所述第一和第二樣品中CRTAif細(xì)胞的量，其中所述第二樣品中的量較高指示所述受試者中疾病(例如自身免疫性疾病)發(fā)作(flare-up)。在一個實(shí)施方案中，來自受試者的樣品可含有T細(xì)胞，包括但不限于下述一種或多種CRTAM+T細(xì)胞，諸如CD4+細(xì)胞(例如Thl或Th 17)，和/或CD8+細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法檢測/診斷的免疫學(xué)病癥是活動性自身免疫性疾病。在一個實(shí)施方案中，所述活動性自身免疫性疾病的特征為存在已活化T細(xì)胞，其中所述T細(xì)胞是CRTAM+。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞是⑶4+和/或⑶8+。在一個實(shí)施方案中，所述⑶4+細(xì)胞是Thl或Thl7。在一個實(shí)施方案中，所述已活化T細(xì)胞的進(jìn)一步特征可以為細(xì)胞因子表達(dá) 水平與CRTAM—T細(xì)胞中的所述細(xì)胞因子表達(dá)相比升高，而在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞的進(jìn)一步特征為細(xì)胞因子分泌水平與CRTAM—T細(xì)胞中的所述細(xì)胞因子分泌水平相比升高。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞是⑶8+或⑶4+ (例如Thl或Thl7)。在一個實(shí)施方案中，所述已活化T細(xì)胞是自身反應(yīng)性的。這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞可以是已活化⑶4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì) 胞。在一個實(shí)施方案中，極化的T細(xì)胞的量(例如作為相對于其它細(xì)胞的比率)與無病參照相比升高。在一個實(shí)施方案中，這些細(xì)胞與自身免疫性疾病的病因和/或病理有關(guān)。一方面，本發(fā)明提供了用于制備、分離、和/或純化基本上純的已活化T細(xì)胞群體的方法。在一個實(shí)施方案中，所述群體包含特征為表達(dá)CRTAM的已活化⑶4+T細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞展現(xiàn)出相對于不表達(dá)CRTAM的CD4+已活化T細(xì)胞而言水平升高的細(xì)胞因子表達(dá)和/或分泌。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是IFN y、IL22、和/或IL17。在一個實(shí)施方案中，所述制備、分離、和/或純化方法包括使已知或懷疑包含混合T細(xì)胞群體的樣品接觸CRTAM結(jié)合劑(例如抗CRTAM抗體)，并自所述混合群體分出基本上不結(jié)合 CRTAM結(jié)合劑(例如CRTAM抗體)的任何細(xì)胞，由此受到所述CRTAM結(jié)合劑(例如CRTAM抗體)結(jié)合的已活化CD4+T細(xì)胞群體得到分離。所述方法可進(jìn)一步包括將結(jié)合的CRTAM結(jié)合劑與結(jié)合至所述CRTAM結(jié)合劑的已活化CD4+細(xì)胞群體分開。一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含基本上純的已活化T細(xì)胞群體。在一個實(shí)施方案中，所述群體包含特征為表達(dá)CRTAM的已活化CD4+T細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞展現(xiàn)出相對于不表達(dá)CRTAM的CD4+已活化T細(xì)胞而言水平升高的細(xì)胞因子表達(dá) 和/或分泌。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是IFN Y、IL22、和/或IL17。另一方面，本發(fā)明提供了 CRTAM調(diào)控物在制備用于治療疾病(例如自身免疫性疾病)的藥物中的用途。一方面，本發(fā)明提供了 CRTAM調(diào)控物，其用于治療疾病，例如自身免疫性疾病。一方面，本發(fā)明提供了用于治療各種與T細(xì)胞活化和/或功能失調(diào)有關(guān)的病癥的方法。例如，一方面，本發(fā)明提供了一種治療與異常T細(xì)胞活化和/或功能有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明CRTAM調(diào)控物，由此治療所述病癥。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物降低T細(xì)胞活化。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物降低T細(xì)胞活性，其在一個實(shí) 施方案中是自身反應(yīng)性活性。在一個實(shí)施方案中，所述調(diào)控物抑制與T細(xì)胞活化失調(diào)有關(guān) 的炎癥。一方面，本發(fā)明提供了一種通過增強(qiáng)T細(xì)胞活性(特別是CD4+T細(xì)胞活性)治療病癥的方法，所述方法包括對患有病癥的受試者施用有效量的增強(qiáng)CRTAM活性的CRTAM調(diào) 控物，由此所述病癥得到治療。在一個實(shí)施方案中，所述CRTAM調(diào)控物包括激動性分子，例如激動性抗體或包含CRTAM結(jié)合配體的融合多肽(例如Necl2的CRTAM結(jié)合域的至少一部分融合至免疫球蛋白序列諸如免疫球蛋白Fc)。本發(fā)明的此類方法對于治療會受益于增強(qiáng) 已活化CD4+T細(xì)胞活性的病癥(例如癌癥、免疫缺陷、和感染)是有用的。在其中本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物與另一治療劑聯(lián)合施用的本發(fā)明方法中，施用 CRTAM調(diào)控物的時機(jī)相對于施用所述另一治療劑的時機(jī)會是憑經(jīng)驗和/或在臨床上認(rèn)為在治療上有益的任何時機(jī)。例如，在一個實(shí)施方案中，在施用所述另一治療劑之前施用CRTAM 調(diào)控物。在一個實(shí)施方案中，在施用所述另一治療劑之后施用CRTAM調(diào)控物。在另一個實(shí) 施方案中，在施用所述另一治療劑的同時施用CRTAM調(diào)控物。在一個實(shí)施方案中，所述另一治療劑具有抗炎活性。在一個實(shí)施方案中，所述另一治療劑具有免疫遏制活性。在一個實(shí)施方案中，所述另一治療劑具有細(xì)胞毒活性。在一個實(shí)施方案中，所述另一治療劑具有抗感染活性。在一個實(shí)施方案中，作為分開的組合物施用所述兩藥劑。在一個實(shí)施方案中，作為單一組合物施用所述兩藥劑。在臨床上適宜或想要的情況中，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括別的治療步驟。例如，在一個實(shí)施方案中，一種方法進(jìn)一步包括其中將靶細(xì)胞和/或組織暴露于其它標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療方案(例如類固醇、或其它多肽或小分子抗炎藥)的步驟。如上所述，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物和方法在治療懷疑或已知與T細(xì)胞活性的不當(dāng) 調(diào)節(jié)有關(guān)的各種病癥中是有用的。例如，這些病癥包括但不限于那些屬于免疫學(xué)(諸如自身免疫)、癌癥或感染相關(guān)病癥范疇的。在一個實(shí)施方案中，所述病癥與組織炎癥(急性的或慢性的)有關(guān)，例如自身免疫性病癥。還應(yīng)當(dāng)注意，有些疾病可具有在兩個或更多個病癥范疇間交疊的特征。在一個實(shí)施方案中，自身免疫性疾病可以是例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)；多發(fā)性硬化(MS)；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；狼瘡腎炎；皮膚紅斑狼瘡(CLE)；自身免疫性肝炎；幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；傳染性肝炎；原發(fā)性膽汁性肝硬化；銀屑病；皮炎；特應(yīng)性皮炎；系統(tǒng)性硬皮??；系統(tǒng)性硬化病；克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎；呼吸窘迫綜合征；成人呼吸窘迫綜合征；ARDS ；腦脊膜炎；腦炎；葡萄膜炎；腎小球腎炎；天皰瘡；巨噬細(xì)胞活化綜合征；濕疹；哮喘；動脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；糖尿??；I型糖尿??；胰島素依賴性糖尿??；變應(yīng)性鼻炎；與器官移植有關(guān)的自身免疫性反應(yīng)；雷諾氏綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；橋本氏甲狀腺炎；變應(yīng)性腦脊髓炎；斯耶格倫氏綜合征；幼發(fā)型糖尿病；與由細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)有關(guān)的免疫應(yīng)答；結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，多肌炎，肉芽腫??；血管炎；惡性貧血(阿狄森氏病)；牽涉白細(xì)胞滲出的疾病沖樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血；冷球蛋白血癥；庫姆斯陽性貧血；重癥肌無力；抗原_抗體復(fù) 合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基底膜??；抗磷脂綜合征；變應(yīng)性神經(jīng)炎；格雷夫斯氏病；朗伊二氏肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌?。蝗R特氏??；僵人綜合征；貝切特病；巨細(xì)胞動脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎?。籌gM多神經(jīng)病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)和自身免疫性血小板減少癥。在一個實(shí)施方案中，更具體地，自身免疫性疾病可以是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，多發(fā) 性硬化(MS)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，皮膚紅斑狼瘡(CLE)，銀屑病，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié) 腸炎，葡萄膜炎，特應(yīng)性皮炎，哮喘，與器官移植有關(guān)的自身免疫性反應(yīng)，自身免疫性肝炎，幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，傳染性肝炎，腎小球腎炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，血管炎，天皰疫，巨噬細(xì)胞活化綜合征，變應(yīng)性鼻炎，1型糖尿病，和2型糖尿病。一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明CRTAM調(diào)控物和載體的組合物。在一個實(shí)施方案中，所述載體是藥學(xué)可接受的。一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明CRTAM調(diào)控物的核酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā) 明的核酸編碼CRTAM調(diào)控物，其是或包含多肽(例如寡肽)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼CRTAM調(diào)控物，其是或包含抗體或其片段。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼抑制CRTAM表達(dá)/活性(例如CRTAM基因轉(zhuǎn)錄或CRTAM蛋白翻譯)的核酸序列，例如siRNA、反義寡核苷酸、等。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的載體。
一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。載體可以是任何類型的，例如重組載體，諸如表達(dá)載體?？墒褂枚喾N宿主細(xì)胞之任一種。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌。在一個實(shí)施方案中，宿主是真核細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì) 胞，諸如中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞被遺傳工程改造以生成具有改變的效應(yīng)器功能的抗體，例如在由細(xì)胞生成的抗體包含與想要的效應(yīng)器功能改變有關(guān) 的糖基化序型的情況中(例如如在未巖藻糖基化抗體中觀察到的)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸或載體在已活化T細(xì)胞中表達(dá)。一方面，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明CRTAM調(diào)控物的方法。例如，本發(fā)明提供了一種制備是抗體(或其片段)的CRTAM調(diào)控物或包含抗體(或其片段)的CRTAM調(diào)控物的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述抗體(或其片段)的本發(fā)明重組載體，并回收所述抗體(或其片段)。在另一個例子中，本發(fā)明提供了一種制備是多肽(諸如寡肽) 的CRTAM調(diào)控物或包含多肽(諸如寡肽)的CRTAM調(diào)控物的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述多肽(諸如寡肽)的本發(fā)明重組載體，并回收所述多肽(諸如寡肽)。一方面，本發(fā)明提供了一種制品，其包含容器；和裝在該容器內(nèi)的組合物，其中所述組合物包含一種或多種本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物。在一個實(shí)施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的核酸。在一個實(shí)施方案中，包含CRTAM調(diào)控物的組合物進(jìn)一步包含載體，其在有些實(shí) 施方案中是藥學(xué)可接受的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的制品進(jìn)一步包含關(guān)于施用所述組合物(例如CRTAM調(diào)控物)來治療本文所述病癥的指令(說明)?！矫妫景l(fā)明提供了一種試劑盒，其包含第一容器，其中裝有包含一種或多種本發(fā)明CRTAM調(diào)控物的組合物；和第二容器，其中裝有緩沖液。在一個實(shí)施方案中，所述緩沖液是藥學(xué)可接受的。在一個實(shí)施方案中，包含CRTAM調(diào)控物的組合物進(jìn)一步包含載體，其在有些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。在一個實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含關(guān)于施用所述組合物(例如CRTAM調(diào)控物)來治療本文所述病癥的指令(說明)。附圖簡述

圖1。Crtam在TCR活化后在生成更多IFNy、IL22和IL17的CD4+T細(xì)胞亞群上表達(dá)。(A)用抗⑶3(10 iig/ml)和抗CD28(2iig/ml)mAb活化后脾CD4+CD62L+T細(xì)胞的 Crtam表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。(B)用抗CD3 (2 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ml)mAb活化來自 C57BL/6小鼠的脾幼稚⑶4+ (⑶4+⑶62L+) T細(xì)胞。14小時后，通過FACS分選來純化Crtam+* CrtanTT細(xì)胞。讓分選出的Crtam+和CrtanTT細(xì)胞靜息3天，并以5X 105細(xì)胞/ml的濃度用抗⑶3/28mAb用再刺激。然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢查再刺激的T細(xì)胞上的Crtam表達(dá)。(C) 將脾幼稚⑶4+T細(xì)胞用抗⑶3/28mAb活化14小時。自分選出的Crtam+和CrtanTT細(xì)胞提取mRNA，并進(jìn)行定量TaqMan分析(上部小圖)。如(b)中所述讓分選出的細(xì)胞靜息并再刺激，在48小時時收獲上清液并通過ELISA來分析(下部小圖)。(D，F(xiàn)，G)如所描述的那樣在Th分化條件下用抗⑶3/28mAb刺激來自C57BL/6小鼠的脾幼稚⑶4+ (⑶4+⑶62L+) T細(xì)胞。 TCR活化后14小時，通過FACS分選來純化Crtam+和CrtanTT細(xì)胞。讓分選出的Crtam+和 CrtanTT細(xì)胞靜息3天，并以5X105細(xì)胞/ml的濃度用抗⑶3 (10 y g/ml)和抗⑶28(2 yg/ ml)mAb再刺激。在48小時時自再刺激的T細(xì)胞收獲上清液并通過ELISA來分析。(E)在 Th1條件下活化⑶4+T細(xì)胞。14小時后，通過FACS分選來純化CrtanT和Crtam+⑶4+T細(xì)胞，此后在TH1條件性培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。然后在存在GolgiPlug(BD Pharmingen)的情況中將已分化的T細(xì)胞用PMA和伊屋諾霉素(ionomycin)再刺激4小時。然后為了細(xì)胞內(nèi)IFN Y 的免疫熒光染色，使用BD Cytofix/Cytoperm Plus試劑盒固定和透化細(xì)胞。所示FACS分析代表五個(A和B)和三個(E)獨(dú)立實(shí)驗。所示ELISA數(shù)據(jù)代表五個獨(dú)立實(shí)驗，其中細(xì)胞是自30只小鼠純化的。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。圖2。Crtam+CD4+和⑶8+T細(xì)胞在細(xì)胞因子生成中有缺陷。(A和B)通過流式細(xì) 胞術(shù)(A)禾P Western印跡分析⑶來分析活化了 12小時的Crtam+A和Crtam+T細(xì)胞的 Crtam表達(dá)。(C和D)自Crtam+A和Crtam+小鼠純化幼稚CD4+T細(xì)胞，并在TH0或TH1條件下活化。6天后，清洗T細(xì)胞，再活化并在普通培養(yǎng)基中再培養(yǎng)三天。在第10天，將已分化T細(xì)胞用PMA/伊屋諾霉素刺激4小時供TaqMan分析用(C)和用PMA/伊屋諾霉素加 GolgiPlug刺激供IFNy細(xì)胞內(nèi)染色用(D)。所示數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。(E)活化幼稚 Crtam+/+和Crtam+CD4+T細(xì)胞，并在TH分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。六天后，清洗細(xì)胞，計數(shù)并在普通培養(yǎng)基中以5 X 105細(xì)胞/ml的濃度用抗⑶3 (10 u g/ml)和抗⑶28 (2 u g/ml)mAb再刺激。刺激后48小時收集上清液，并通過ELISA來分析。(F)純化幼稚(⑶8+⑶62L+)和效應(yīng)/記憶 (CD8+CD62L-)CD8+T 細(xì)胞，并以 1X106 細(xì)胞/ml 的濃度用抗 CD3 (10 y g/ml)和抗 CD28 (2 y g/ ml) mAb刺激幼稚T細(xì)胞，而以5X105細(xì)胞/ml的濃度用抗CD3 (5 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ ml)mAb刺激效應(yīng)/記憶T細(xì)胞?；罨?0小時通過ELISA來分析細(xì)胞因子生成。(E)和 (F)中所示數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí)驗，其中細(xì)胞是自Crtamv+(n = 3)和Crtam^fc = 3)小鼠獨(dú)立純化和刺激的。(G)通過Speedy同基因策略將Crtam+小鼠回交至C57/BL-6遺傳背景。給來自N4代的10-13周齡小鼠(Crtam+/+, n = 5 ；Crtam+，n = 6) 口服接種200 u 1 PBS中的2X109CFU的鼠檸檬酸桿菌(C. rodentium)。感染后7和14天在MacConkey瓊脂上測定遠(yuǎn)端結(jié)腸和脾中可存活細(xì)菌的數(shù)目。在此圖中，誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。統(tǒng)計學(xué) 分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。圖3。Crtam+幼稚T細(xì)胞響應(yīng)APC-肽刺激而發(fā)生的過度增殖。(A)用經(jīng)照射的加載了 0VA肽的APC活化來自Crtam."(空心柱)和Crtam+(實(shí)心柱)小鼠的幼稚0T-II TCR+CD4+T細(xì)胞，并通過[3H]_胸苷摻入來評估細(xì)胞增殖。(B)通過羧基熒光素雙乙酸酯琥珀酰亞氨基酯(CFSE)標(biāo)記的0T-II TCR+⑶4+T細(xì)胞(5 y M OVA肽)的流式細(xì)胞術(shù)分析來監(jiān)測細(xì)胞分裂。在每幅柱形圖上方呈現(xiàn)了每次分裂內(nèi)的％細(xì)胞。(C)用經(jīng)照射的加載了 0VA肽的APC活化來自Crtamv+和Crtam+小鼠的幼稚0T_I TCR+CD8+T細(xì)胞，并通過[3H]-胸苷摻入來評估細(xì)胞分裂。(D)刺激(10 y M 0VA肽)后3天檢查CFSE標(biāo)記的0T_I TCR+CD8+T細(xì) 胞的稀釋。A-D中所示數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí)驗。(E)OT-II TCR+Crtam+CD4+T細(xì)胞的增強(qiáng)的體內(nèi)表達(dá)。將CFSE標(biāo)記的、來自Crtam+/+和Crtam+小鼠的0T-II TCR+CD4+T細(xì)胞(8X106 細(xì)胞/小鼠)轉(zhuǎn)移入B6129SF2/J小鼠，并在T細(xì)胞轉(zhuǎn)移后12小時通過腳墊注射用20 y g OVA蛋白質(zhì)攻擊。抗原攻擊后三天對受體小鼠的引流淋巴結(jié)分析細(xì)胞周期。此數(shù)據(jù)代表四個獨(dú)立實(shí)驗。(F)對Crtamv+(空心柱)和Crtam+(實(shí)心柱)小鼠(6周齡，n = 16 ;10月齡，n = 10)定量來自頸淋巴結(jié)(LN)、脾和血液的總⑶4+和⑶8+T細(xì)胞及B220+B細(xì)胞。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。圖4。已活化Crtam+CD4+T細(xì)胞中對晚期T細(xì)胞極性的破壞。a_c，(A-C)將幼稚Crtamv+(上部小圖)或Crtam+(下部小圖)CD4+T細(xì)胞(或是未刺激的或是用抗 CD3 (10 u g/ml)和 CD28 (2 u g/ml)mAb 刺激 14 小時的)對 Crtam 和 Talin (A)、CD3 e (B)、 Crtam和CD44(C)染色，并通過解卷積顯微術(shù)來分析。(D)使用解卷積顯微術(shù)(DeltaVision) 通過細(xì)胞計數(shù)(n > 200)對Talin、CD44、和CD3極化的定量。(E)使用Imaris 5. 5自> 35 幅2D平板3D重建14小時抗CD3/28活化T細(xì)胞的Crtam、Talin、和CD44染色。(F)將幼稚OT-II TCR+Crtam+/+或Crtam+⑶4+T細(xì)胞(或是未刺激的或是用經(jīng)OVA肽脈沖的DC刺激 14小時的)對Talin、⑶44和⑶3染色，并通過解卷積顯微術(shù)來分析。(G)對已活化0T-II TCR+Crtam+/+ 和 Crtam+CDfT 細(xì)胞(n > 200)中 Talin、CD44、和 CD3 極化(polarization) 的定量。(H)對初始T細(xì)胞接觸形成的分析。將CMRA標(biāo)記的且經(jīng)OVA肽脈沖的DC與0T-II TCR+Crtam+/+和Crtam+⑶4+T細(xì)胞一起溫育30分鐘，并對F-肌動蛋白染色(鬼筆毒環(huán)肽)。 ⑴如(H)中所述活化細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)來分析Crtamv+或Crtam+OT-II TCR+⑶4+T 細(xì)胞與經(jīng)0VA肽脈沖的DC形成細(xì)胞偶聯(lián)物的能力。所示數(shù)據(jù)代表四個獨(dú)立實(shí)驗。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。圖5。Crtam經(jīng)由PDZ蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)控制細(xì)胞極性、增殖、和細(xì)胞因子生成。(A)將來自Crtamv+和Crtam+小鼠的幼稚⑶4+T細(xì)胞活化所示時間，并用針對Scrib (上部小圖) 或Dlgl (下部小圖)的Ab免疫沉淀細(xì)胞提取物。然后通過針對Crtam的免疫印跡來分析免疫復(fù)合物。所示數(shù)據(jù)代表五個獨(dú)立實(shí)驗。(B-D)將幼稚⑶4+T細(xì)胞用抗⑶3(10i!g/ml) 和抗CD28(2ii g/ml)mAb活化14小時。然后將已活化細(xì)胞對Crtam、Scrib、Cdc42或PKC € 染色，并通過解卷積顯微術(shù)來分析。圖像代表每項染色> 300個細(xì)胞。(E)將幼稚0T-II TCR+CD4+T細(xì)胞與經(jīng)0VA肽脈沖的DC —起溫育，在規(guī)定時間點(diǎn)固定，粘附到8孔腔式載玻片上，并用每幅小圖上方所示特異性抗體染色。圖像代表每個時間點(diǎn)每項染色> 50個細(xì)胞。圖6。Crtam與Scrib的相互作用是控制細(xì)胞極性、增殖和細(xì)胞因子生成所必需的。(A) Crtam和Crtam突變體的結(jié)構(gòu)示意圖。(B和C) Crtam+CD4+T細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒重建的Crtam、(汁3111(八1^)、或(汁3111(八￡51乂)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成。用GFP重建的Crtamv+和Crtam+CD4+T細(xì)胞充當(dāng)對照。數(shù)據(jù)代表五個獨(dú)立實(shí)驗。(D)TCR再刺激后14 小時檢查 Crtam、Crtam( A ICD)、或 Crtam( A ESIV)重建的 Crtam+CDAT 細(xì)胞的極性。(E 和F)用GFP對照、Crtam、或Crtam (A ESIV)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)自C57BL/6小鼠FACS分選出的Crtam+和Crtam_CD4T細(xì)胞。讓所有經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞靜息3天，并以2X105細(xì)胞/ml用抗 CD3 (10 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ml)mAb再刺激。TCR重建后48小時通過ELISA來分析細(xì) 胞因子生成(E)。ELISA數(shù)據(jù)代表四個獨(dú)立實(shí)驗。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，而統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。用抗⑶3/28mAb再刺激后14小時分析Crtam+⑶4+T 細(xì)胞(小圖1)或經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒重建的Crtam_CD4+T細(xì)胞(小圖2_4)中的Talin極性(F)。圖像代表每項染色檢查的> 100個細(xì)胞。圖7。Crtam功能是經(jīng)由Scrib來傳送的。(A和B)通過FACS分選自活化了 14小時的T細(xì)胞純化來自C57/BL6小鼠的Crtam+⑶4T細(xì)胞。將分選出的Crtam+CD4T細(xì)胞擴(kuò)增 4天，并通過Amaxa Nucleofector用對照或Scrib siRNA (QIAGEN)電穿孔。轉(zhuǎn)染后12小時，通過Western印跡來分析Scrib表達(dá)(A)。(A)中的箭頭指示內(nèi)源Scrib。將T細(xì)胞用抗CD3和CD28mAb再刺激8小時，并對Talin染色(B)。(C)再刺激后48小時通過ELISA 分析經(jīng)對照或Scrib siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞因子生成。所示數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。(D和E)純化幼稚Crtam+⑶4+T細(xì)胞，并用板結(jié)合的抗⑶3和抗⑶28mAb活化。刺激后四天，使用 Amaxa Nucleofector 用 pIRES-GFP 或 pIRES_Crtam( A ICD) :Scrib 電穿孔 T 細(xì)胞。通過Western印跡分析(D)和流式細(xì)胞術(shù)(E)來驗證Crtam( A ICD) :Scrib表達(dá)。箭頭指示 Crtam(AI⑶)Scrib嵌合物及其各種差異糖基化形式。⑶中的箭頭指示內(nèi)源Scrib。(F) 轉(zhuǎn)染后12小時，將T細(xì)胞用抗CD3和CD28mAb再刺激8小時，并為了染色而固定細(xì)胞。(G) TCR刺激后48小時收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，供ELISA分析用。所示數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí) 驗。圖8。Crtam在TCR活化后在T細(xì)胞上表達(dá)。用抗CD3 (10 y g/ml)和抗CD28(2iig/ ml)mAb活化后脾⑶8+CD62L+T細(xì)胞的Crtam表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。數(shù)據(jù)表達(dá)三個獨(dú)立實(shí)驗。圖9。Crtam+小鼠的生成。(A)基因打靶策略。描繪了 Crtam外顯子1周圍的基因組結(jié)構(gòu)(頂部)、尋靶載體(中部)和靶定等位基因(底部)。通過同源重組用新霉素抗性基因替換Crtam的外顯子1。箭頭指示用于PCR基因分型的引物。以灰色條顯示了用于Southern印跡的探針的位置。(B)使用PCR擴(kuò)增(左邊)和Southern印跡分析(右邊)對靶定等位基因的基因分型(+/+ :328bp和-/" :191bp)。5’探針與+/+小鼠的10. 5kB 和-/"小鼠的7. 6kB EcoRI片段雜交。3，探針與+/+小鼠的10. 5kB和-/-小鼠的2. 8kB EcoRI片段雜交。(C) Crtam+小鼠中缺失Crtam mRNA表達(dá)。自Crtam+/+和Crtam+小鼠提取脾的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并用對Crtam(外顯子4_8)或肌動蛋白特異性的引物擴(kuò)增。圖10。Crtam+小鼠中的正常T細(xì)胞發(fā)育。(A)對來自Crtamv+ (空心柱)和 Crtam+(實(shí)心柱)小鼠(6周齡，n = 16)的各種胸腺細(xì)胞子集定量，CD4_CD8_(DN)，CD4+， CD8+，和 CD4+CD8+(DP)。(B)對來自 0T-II TCR+Crtam+/+(空心柱)和 Crtam+(實(shí)心柱) 小鼠(6周齡，n = 10)的各種胸腺細(xì)胞子集定量。(C和D)對來自Crtamv+(空心柱)和 Crtam+(實(shí)心柱)小鼠(6周齡，n = 16)脾和血液的總CD4+和CD8+T細(xì)胞、B220+B細(xì)胞、 CD4+幼稚(CD62Lhi)、CD4+效應(yīng)(aMfiQMSRBhiCDeZL1。)、CD4+記憶(aMfiaMSRB^CDeZL1。)、 ⑶8+幼稚(⑶62Lhi)、和⑶8+效應(yīng)(⑶43-1811*^0621；°)T細(xì)胞定量。在頂部顯示了代表性流式細(xì)胞術(shù)分析。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。T =總細(xì)胞；N =幼稚細(xì)胞；E =效應(yīng)細(xì)胞；M =記憶細(xì)胞。圖11。Crtam+⑶4+T細(xì)胞響應(yīng)TCR刺激而發(fā)生的降低的IFNy分泌。純化幼稚野生型和Crtam+⑶4T細(xì)胞，并在TH1分化培養(yǎng)基中用板結(jié)合的抗⑶3 (1_10 y g/ml)和抗 CD28(2iig/ml)mAb刺激。六天后，清洗細(xì)胞，計數(shù)并在普通培養(yǎng)基中以5X 105細(xì)胞/ml的濃度用抗CD3 (1-10 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ml)mAb再刺激。刺激后48小時收集上清液，并通過ELISA來分析。此實(shí)驗代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。圖12。IL23處理時的IL22降低?；罨字蒀rtam+/+和Crtam+OM+T細(xì)胞，并在含有重組小鼠 IL23(10ng/ml, eBioscience)、抗 IFN y mAb (5 ii g/ml，BDPharmingen)禾口抗 IL4mAb(5ug/ml,BD Pharmingen)的TH17分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。六天后，清洗細(xì)胞，計數(shù)并在普通培養(yǎng)基中再刺激。刺激后48小時收集上清液，并通過ELISA來分析。所示數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí)驗，其中細(xì)胞是自Crtamv+(n = 3)和Crtam+(n = 3)小鼠獨(dú)立純化和刺激的。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。
圖13。TCR活化后Crtam+幼稚⑶4+T細(xì)胞的過度增殖。(A)用板結(jié)合的抗⑶3/ CD28mAb活化來自Crtamv+ (黑色)和Crtam+ (灰色)小鼠的幼稚CD4+T細(xì)胞。通過[3H]-胸苷摻入來分析細(xì)胞增殖。(B)活化后3天通過流式細(xì)胞術(shù)用CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞監(jiān)測細(xì) 胞分裂。(C和D)用來自Crtam+A(黑色)和Crtam+(灰色)小鼠的幼稚CD8+T細(xì)胞實(shí)施相同的實(shí)驗。此處所示數(shù)據(jù)代表四個獨(dú)立實(shí)驗。(E)用板結(jié)合的抗CD3和抗CD28mAb活化來自C57BL/6小鼠的幼稚⑶4+T細(xì)胞。通過FACS分選來純化Crtamhi和Crtam_CD4T細(xì)胞。四天后，用板結(jié)合的mAb再刺激細(xì)胞，并通過[3H]_胸苷摻入來分析細(xì)胞增殖。此處所示數(shù) 據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。此圖中的誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。(F)用板結(jié)合的抗⑶3和抗⑶28mAb刺激自C57BL/6 (⑶45. 2+)和同基因B6. SJL(CD45. 1+)小鼠純化的CD62L+CD4+幼稚脾T細(xì)胞。14小時后，通過限制的FACS分選自C57BL/6 (CD45. 2+)小鼠純化CrtamhiCD4T細(xì)胞和自同基因B6. SJL (CD45. 1+)小鼠純化 CrtamXD4T 細(xì)胞。靜息 4 天后，用 CFSE 標(biāo)記 CrtamhiCD45. 2+ 和 CrtanTCD45. 1+T 細(xì)胞，并作為單一或混合群體用板結(jié)合的mAb再刺激另外三天。將細(xì)胞對⑶45. 2染色，并通過FACS 分析來檢查CFSE稀釋。此處所示數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。(G)在TH1條件性培養(yǎng)基中用板結(jié)合的抗CD3和抗CD28mAb刺激自C57BL/6 (CD45. 2+)和同基因B6. SJL (CD45. 1+)小鼠純化的CD62L+CD4+幼稚脾T細(xì)胞。14小時后，通過限制的FACS分選自C57BL/6 (CD45. 2+)小鼠純化Crtamhira4T細(xì)胞和自同基因B6. SJL(⑶45. 1+)小鼠純化CrtamTD4T細(xì)胞。為了增強(qiáng)細(xì)胞存活力，使用BD FACSVantage細(xì)胞分選儀以20psi套管壓力(sheath pressure)和 2000例每秒分選細(xì)胞，并在所有時間保存于4°C。讓分選出的細(xì)胞靜息，并在Th1條件性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。72小時后，在存在GolgiPlug(BD Biosciences)的情況中將細(xì)胞用PMA加伊屋諾霉素再刺激4小時。將刺激后的細(xì)胞用抗CD45.2mAb染色，并為細(xì)胞內(nèi)IFNy染色而透化。此處所示數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。圖14。Crtam與Scrib PDZ3相互作用及逆轉(zhuǎn)錄病毒重建的Crtam+CDfT細(xì) 胞中相當(dāng)?shù)腃rtam表面表達(dá)。(A)將p⑶NA4-Crtam_Flag轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，并將細(xì)胞提取物與 GST-Scrib-PDZl、GST-Scrib-PDZ2、GST-Scrib-PDZ3、GST-Scrib-PDZ4 或 GST-Erbb2ip(Erbin)-PDZl 一起溫育。用抗GST (上部小圖)或抗Crtam(下部小圖)抗體通過免疫印跡分析使用抗Flag M2-瓊脂糖珠得到的免疫復(fù)合物。(B)用eGFP-IRES-Crtam、 eGFP-IRES-Crtam( A ICD)或 eGFP-IRES_Crtam( A ESIV)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒重建 Crtam+OM+T 細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)檢查Crtam、Crtam (A ICD)和eGFP-IRES_Crtam( A ESIV)的表面表達(dá)。圖15。Crtam的PDZ結(jié)合基序是控制細(xì)胞增殖所需要的。OT-II TCR+Crtam+CD4+T 細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒重建的Crtam、Crtam ( A ICD)、或Crtam ( A ESIV)響應(yīng)OVA肽/APC刺激而發(fā)生的細(xì)胞增殖。用GFP重建的0T-IITCR+Crtamv+和Crtam+CD4+T細(xì)胞充當(dāng)對照。數(shù) 據(jù)代表五個獨(dú)立實(shí)驗。誤差條指示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。圖16。Crtam的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域控制T細(xì)胞極性和增殖，而且Cadml與Crtam的相互作用能進(jìn)一步增強(qiáng)CD4T細(xì)胞的細(xì)胞因子生成。(A)將幼稚CD4+T細(xì)胞(或是未刺激的或是用抗⑶3和抗⑶28 (10 2mg/ml)mAb刺激14小時的)用抗Cadml家兔多克隆Ab (GNE)加 Talin或Crtam染色，并通過解卷積顯微術(shù)來分析。(B) Crtam和Crtam( A EOT)突變體的結(jié)構(gòu)。(C)純化幼稚Crtam+CD4+T細(xì)胞，并用板結(jié)合的抗CD3和抗CD28mAb活化。刺激后四天，用編碼GFP或Flag-Crtam( A EOT)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重建T細(xì)胞。TCR再刺激后8小時檢查GFP或Crtam ( A EOT)重建的Crtam+⑶4T細(xì)胞的極性。(D)通過[3H]-胸苷摻入來評估 Crtam或Flag-Crtam( A ECD)轉(zhuǎn)染的Crtam+CDfT細(xì)胞的細(xì)胞增殖。用GFP轉(zhuǎn)染的Crtam+/+ 和Crtam+⑶4+T細(xì)胞充當(dāng)對照。(E)在TCR刺激后48小時通過ELISA來分析細(xì)胞因子。(F) 純化幼稚Crtamv+和Crtam+CD4+T細(xì)胞，用板結(jié)合的mAb加板結(jié)合的Cadml (ECD) -Fc(lu g/ ml)或人IgGl (1 u g/ml)活化，并在48小時時測量細(xì)胞因子。N = 2個獨(dú)立實(shí)驗。圖17。Crtam在TCR活化后在CD8+T細(xì)胞上快速上調(diào)，而且是最佳IFN y , TNF a 和IL22生成而非溶胞活性所需要的。(A)自Crtamv+和Crtam+小鼠純化幼稚⑶8+T細(xì)胞，用板結(jié)合的抗CD3/28mAb活化并在所示時間點(diǎn)通過流式細(xì)胞術(shù)來分析。所示數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。(B)通過左腳墊注射用30 ill PBS中的20iig OVA蛋白質(zhì)攻擊OT-I TCR+小鼠。對來自經(jīng)免疫小鼠的左腳引流淋巴結(jié)和右腳對照淋巴結(jié)分析Crtam表達(dá)。數(shù)據(jù)代表每個時間點(diǎn)的三只小鼠。(C)自Crtamv+和Crtam+小鼠純化幼稚(CD8+CD62L+)和效應(yīng)/記憶 (⑶8+CD62L—)⑶8+T細(xì)胞，并用板結(jié)合的抗⑶3/28mAb刺激。刺激后40小時通過ELISA來分析細(xì)胞因子生成。數(shù)據(jù)代表五個獨(dú)立實(shí)驗。⑶將來自0T-ITCR+Crtam+和OT-I TCR+Crtam+/+ 小鼠的⑶8+T細(xì)胞用板結(jié)合的抗⑶3/28mAb活化5天。將⑶8+T細(xì)胞母細(xì)胞(T cell blast) 與經(jīng)10 u M0VA257_264脈沖的靶細(xì)胞(EL4) —起溫育4小時，并通過ELISpot來分析粒酶B生成。圖像代表兩個獨(dú)立實(shí)驗，其中有一式三份的反應(yīng)。右邊顯示了使用Leica M655手術(shù)顯微鏡對粒酶B染色細(xì)胞的定量。(E)將來自O(shè)T-I TCR+Crtam+和0T-ITCR+Crtamv+小鼠的第 5天⑶8+T細(xì)胞母細(xì)胞在存在GolgiStop和抗⑶107mAb的情況中用經(jīng)肽脈沖的EL4再活化 4小時，或者在普通培養(yǎng)基中活化16小時。通過流式細(xì)胞術(shù)來分析已活化CD8+T細(xì)胞表面上 4小時時的⑶107表達(dá)和16小時時的FasL表達(dá)。所示數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Dunnett氏方法帶對照實(shí)施的。(F)將來自0T_I TCR+Crtam+和0T-ITCR+Crtamv+ 小鼠的第5天⑶8+T細(xì)胞母細(xì)胞用51Cr標(biāo)記的、經(jīng)10 u M0VA257_264脈沖的EL4細(xì)胞再活化。溫育后4小時實(shí)施51Cr釋放測定法。數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗，其中有一式三份的反應(yīng)。圖18。⑶8+T細(xì)胞中的Crtam表達(dá)在活化后上調(diào)。通過腳墊注射入左腳用30 u 1 PBS中的20iig OVA蛋白質(zhì)攻擊OT-I TCR+小鼠。對來自經(jīng)免疫小鼠的左腳引流淋巴結(jié)和右腳對照淋巴結(jié)分析CD69表達(dá)。數(shù)據(jù)代表每個時間點(diǎn)三只小鼠。圖 19。Crtam 是最佳 IFN y , TNF a 禾口 IL22 生成所需要的。自 0T-I TCR+Crtam+/+ 和Crtam+小鼠純化幼稚和效應(yīng)/記憶⑶8+T細(xì)胞，并用經(jīng)照射的經(jīng)10 y M 0VA257_264脈沖的 APC刺激40小時。通過ELISA來分析細(xì)胞因子生成。數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。圖20。第5天OT-I TCR+Crtam+⑶8+T細(xì)胞母細(xì)胞上的正常TCR/⑶3表達(dá)。將來自O(shè)T-I TCR+Crtam+和0T-I TCR+Crtam+/+小鼠的CD8+T細(xì)胞用板結(jié)合的抗CD3/28mAb活化 5天。通過抗CD3和I類iTAg MHC四聚物(0VA肽，Beckman Coulter)染色來檢查表面CD3 和TCR表達(dá)。數(shù)據(jù)代表四個獨(dú)立實(shí)驗。圖21。Crtam經(jīng)由Scrib來維持晚期T細(xì)胞極性和選擇性細(xì)胞因子生成。(A)自 Crtam+/+和Crtam+小鼠純化幼稚⑶8+T細(xì)胞，并用板結(jié)合的抗⑶3/28mAb刺激16小時。用抗 Scrib mAb (H-300，Santa Cruz Biotechnology, [SCB])免疫沉淀細(xì)胞提取物。通過免疫印跡用針對 Crtam(17B2, GNE)、Cdc42 (B_8，SCB)、PKC I (H_l，SCB)、和 Scrib (H-300)的抗體來分析免疫復(fù)合物。⑶將OT-I TCR+Crtamv+和Crtam+CD8+T細(xì)胞在37°C溫箱中用肽/ APC活化14小時。于RT使已活化T細(xì)胞粘附到聚-D-賴氨酸包被的蓋玻片(BD BioCoat ) 上達(dá) 10-20 分鐘并固定，用抗 Crtam mAb (17B2, Genentech)或抗 CD3mAb (BDPharmingen)染色，用 0.2% Triton X-100 透化，并用抗 Scrib (H-300)、抗 Cdc42 (B_8)、或抗 PKC € (H_l)抗體(Santa Cruz Biotechnology)染色。(C)對 OT-I TCR+Crtam+/+和 Crtam+CDS+T 細(xì)胞(n
>200)中CD3極化的定量。(D)再刺激后14小時檢查GFP對照、Crtam或Crtam( A ESIV) 重建的Crtam+⑶8+T細(xì)胞的極性。(E)在TCR刺激后48小時分析Crtam (藍(lán)色)或 Crtam(AESIV)(紅色)重建的Crtam+CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子生成。GFP重建的Crtamv+(白色)或Crtam+(綠色)T細(xì)胞充當(dāng)D和E中的對照。數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí)驗。通過解卷積顯微術(shù)(Delta Vision)來分析載玻片。圖22。Crtam+CD8+T細(xì)胞中晚期T細(xì)胞極性的維持遭到破壞。㈧將⑶8+T細(xì)胞在37°C溫箱中用板結(jié)合的抗⑶3/28mAb活化16小時。通過用培養(yǎng)基溫和吹打使已活化T 細(xì)胞從板上洗下。于RT使洗脫的細(xì)胞粘附到聚-D-賴氨酸包被的蓋玻片(BD BioCoat ) 上達(dá)10-20分鐘，并實(shí)施固定和染色規(guī)程。(B)對Crtamv+和Crtam+⑶8+T細(xì)胞(n > 200) 中⑶3極化的定量。通過解卷積顯微術(shù)(Delta Vision)來分析載玻片。圖23。TCR活化后30分鐘Crtam+⑶8+T細(xì)胞中的細(xì)胞極性和初始活化是正常的。 (A)將 10 ii 1 抗 CD3/CD28Ab 包被的 Dynabead 與 1 X 106 個來自 Crtam+/+ 和 Crtami 小鼠的幼稚⑶8+T細(xì)胞一起在37°C溫箱中溫育30分鐘，并于RT使細(xì)胞粘附到聚_D_賴氨酸包被的蓋玻片(BD BioCoat )上達(dá)10-20分鐘。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗掉非粘附細(xì)胞，并用PBS中的4%低聚甲醛固定細(xì)胞，用抗Crtam mAb(17B2, Genentech)或抗CD3mAb (BD Pharmingen)染色，用 0. 2% Triton X-100 透化，并用抗粒周蛋白(anti-pericentrin) (BD Pharmingen)、抗 PKC e (細(xì)胞信號傳導(dǎo))、抗 Scrib (H-300)、或抗 PKC I (H_l)抗體(Santa CruzBiotechnology)染色。最后清洗后，用ProLong Gold不褪色試劑(Invitrogen)封固染色細(xì)胞。圖像代表每種實(shí)驗條件>50個細(xì)胞。用Leica SP5共焦顯微鏡分析載玻片。 ⑶用板結(jié)合的抗⑶3/28mAb活化來自Crtam+和Crtam+A小鼠的幼稚⑶8+T細(xì)胞?；罨?后6小時檢查表面⑶25和⑶69表達(dá)。數(shù)據(jù)代表五個獨(dú)立實(shí)驗。圖24。Scrib和PKC I是維持晚期T細(xì)胞極性所需要的，其繼而是IFN y , TNF a 和IL22調(diào)節(jié)所需要的。(A-G)如先前所述(Yeh等，Cell 132(5) :846_859 (2008))用對照、 Scrib (A、B、C 小圖 2、禾口 D)、或 PKC€ (C，小圖 3、E_G) siRNA(QIAGEN)電穿孔來自 Crtam+/+ 小鼠的第5天⑶8+T細(xì)胞母細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12小時通過Western印跡來分析Scrib和PKC I 表達(dá)(A和E)，并且將T細(xì)胞用抗⑶3/⑶28mAb再刺激8小時，固定細(xì)胞并在Scrib和/ 或PKCI之外對Crtam和Talin染色，如圖中所示。再刺激后48小時通過ELISA來分析對照、Scrib或PKCz siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞因子生成(D和G)。(H-J)將pIRES_GFP或 pIRES-Crtam(AICD) :Scrib電穿孔入來自Crtam+小鼠的第5天CD8+T細(xì)胞母細(xì)胞。通過 Western印跡(H)和流式細(xì)胞術(shù)(圖27)確定了 Crtam(AICD) :Scrib表達(dá)。此圖中的灰色箭頭指示內(nèi)源Scrib蛋白質(zhì)，而星號指示Crtam( A I⑶)Scrib嵌合物。在再刺激后8小時檢查Crtam ( A I⑶)Scrib表達(dá)細(xì)胞中的細(xì)胞極性(I)，并在再刺激后48小時通過ELISA 來分析這些細(xì)胞的細(xì)胞因子生成(J)。數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗。圖像代表每項染色檢查的
>50個細(xì)胞。
圖25。Talin極化在Scrib和PKCz敲低⑶8+T細(xì)胞中沒有得到維持。對再活化后 8 小時對照、Scrib (A)、或 PKC I (B) siRNA 轉(zhuǎn)染的 Crtam+/+CD8+T 細(xì)胞(圖 24B 和 24F 所示)(n > 50)中Talin極化的定量。圖26。Scrib和PKC I敲低⑶8+T細(xì)胞中正常的早期T細(xì)胞極性和活化。(A)將對照、Scrib、或 PKC I siRNA 轉(zhuǎn)染的 Crtam+/+CD8+T 細(xì)胞用抗 CD3/CD28Ab 包被的 Dynabead 再活化30分鐘并固定，供抗CD3和抗PKC0染色用(n>50)。(B)將對照、Scrib、或PKC € siRNA 轉(zhuǎn)染的Crtamv+CD8+T細(xì)胞用板結(jié)合的抗⑶3/⑶28Ab活化8小時，并通過流式細(xì)胞術(shù)來檢查表面CD25和CD69表達(dá)。圖27。細(xì)胞表面Crtam(DICD) :Scrib嵌合物的表達(dá)。將pIRES-GFP或 pIRES-Crtam(AICD) :Scrib電穿孔入來自Crtam+小鼠的第5天CD8+T細(xì)胞母細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)來評估Crtam(AICD) :Scrib表達(dá)。圖28。Crtam介導(dǎo)的⑶8T細(xì)胞應(yīng)答是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染期間宿主抵抗力所必需的。(A)在單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(L. monocytogenes)感染前一天給Rag2+小鼠靜脈內(nèi)注射1X107個CD8+Crtam+或Crtam+AT細(xì)胞。持續(xù)兩周每天跟蹤小鼠的存活力。 (B)在第14天對存活小鼠處以安樂死，并顯示了它們的脾的總體形態(tài)。(C)通過腦心浸液 (BHI)瓊脂板上的菌落計數(shù)來測定來自存活小鼠的脾的細(xì)菌負(fù)荷并定量。(D)自第5天受感染小鼠收集血清，并通過ELISA來分析。(E)將lX107ml來自第5天受感染小鼠的脾細(xì) 胞在有或無lX108CFU/ml熱殺死的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(HKLM)的情況中溫育。48小時后，通過ELISA來分析細(xì)胞因子生成。(F)將自第5天受感染小鼠純化的CD8+T細(xì)胞與單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染的IC-21靶細(xì)胞一起溫育3小時，并用Leica M655顯微鏡對特異性粒酶B斑點(diǎn)計數(shù)。數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí)驗。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。圖29。單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染后重建的Rag2+小鼠中的⑶8+T細(xì)胞檢查。(A)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染前一天給Rag2+小鼠靜脈內(nèi)注射1X107個 ⑶8+Crtam+或Crtamv+T細(xì)胞。在感染當(dāng)天(第0天)和第14天檢查血液中重建的⑶8+T 細(xì)胞。(B)第5天通過流式細(xì)胞術(shù)檢查脾中的CD8+T細(xì)胞。右邊小圖中顯示了每只小鼠中 ⑶8+T細(xì)胞的百分比。統(tǒng)計學(xué)分析是使用Durmett氏方法帶對照實(shí)施的。圖30。人CRTAM氨基酸序列。㈧顯示了帶信號序列的人CRTAM的氨基酸序列 (SEQ ID N0:1)。(B)顯示了缺信號序列的人CRTAM的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。圖31。小鼠CRTAM氨基酸序列。(A)顯示了帶信號序列的小鼠CRTAM(NM_019465) 的氨基酸序列(SEQ ID NO 3) 0 (B)顯示了缺信號序列的小鼠CRTAM(NM_019465)的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。圖32。人NeC12(Cadml)氨基酸序列。(A)顯示了帶信號序列的人Necl2 (Cadml) (NM_014333)的氨基酸序列(SEQ ID NO :5)。(B)顯示了缺信號序列的人Necl2 (Cadml) (NM_014333)的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)。圖33。小鼠Necl2 (Cadml)氨基酸序列。(A)顯示了帶信號序列的小鼠Necl2 (Cadm 1) (NM_207675)的氨基酸序列(SEQ ID NO 7)。(B)顯示了缺信號序列的小鼠Necl2 (Cadml) (NM_207675)的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。圖34?？笴RTAM抗體氨基酸序列。㈧顯示了倉鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗體(17B2)的輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID N0:31)。可變域標(biāo)有下劃線(SEQID NO 35) ；CDR1 (SEQ ID NO :37)、CDR2(SEQ ID NO 38)、和 CDR3 (SEQ ID NO 39)中每一項以方框標(biāo)示。(B)顯示了倉鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗體(17B2)的重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO :32)?？勺冇驑?biāo)有下劃線(SEQID NO 36) ；CDR1 (SEQ ID NO 40)、CDR2 (SEQ ID NO 41)、禾口 CDR3 (SEQ ID NO 42)中每一項以方框標(biāo)示。圖35?？笴RTAM抗體輕鏈核酸序列。顯示了倉鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗體(17B2) 的輕鏈的核酸序列(SEQ ID NO 33)。起始和終止密碼子標(biāo)有下劃線；成熟輕鏈的第一個密碼子以方框標(biāo)示。圖36?？笴RTAM抗體重鏈核酸序列。顯示了倉鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗體(17B2) 的重鏈的核酸序列(SEQ ID NO :34)。起始和終止密碼子標(biāo)有下劃線；成熟輕鏈的第一個密碼子以方框標(biāo)示。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過調(diào)控已活化T細(xì)胞中的CRTAM來診斷和治療各種病癥的方法、組合物、試劑盒和制品。本文中提供了這些方法、組合物、試劑盒和制品的詳情。通用技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。文獻(xiàn)中充分闡述了這些技術(shù)，諸如“Molecular Cloning :ALaboratory Manual”，第二版 (Sambrook 等，1989) ；"Oligonucleotide Synthesis”(M. J. Gait，編，1984) ；"Animal Cell Culture，，(R. I. Freshney,編，1987) ；"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)； "Current Protocols inMolecular Biology”(F. M. Ausubel 等，編，1987，及定期更新)； "PCR :ThePolymerase Chain Reaction”，(Mullis 等，編，1994) ；"A Practical Guide toMolecular Cloning，，(Perbal Bernard V. , 1988)。I.定義如本文中在CRTAM調(diào)控的語境中所使用的，“病癥”或“疾病”指任何會受益于本發(fā) 明的CRTAM調(diào)控物和/或方法的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥或疾病的病理狀況。本文中待治療的病癥或疾病的非限制性例子包括炎性(例如自身免疫性)和其它免疫學(xué)病癥/疾病?！白陨砻庖咝约膊　痹诒疚闹兄冈从谇裔槍€體自身組織的非惡性疾病或病癥。自身免疫性疾病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或疾患，尤其排除B細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、毛細(xì)胞白血病和慢性成髓細(xì)胞白血病。自身免疫性疾病或病癥的例子包括但不限于炎癥應(yīng)答，諸如炎性皮膚病，包括銀屑病和皮炎(例如特應(yīng)性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化；與炎性腸病有關(guān)的應(yīng)答(諸如克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS))；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過敏狀況，諸如濕疹和哮喘及牽涉T細(xì) 胞浸潤和慢性炎性應(yīng)答的其它狀況；動脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘著缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發(fā)性硬化；雷諾氏(Reynaud)綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；變應(yīng)性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征；幼發(fā)型糖尿病；通常在結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎中發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞因子和T_淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答；惡性貧血(阿狄森氏 (Addison)病)；牽涉白細(xì)胞滲出的疾?。恢袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥或庫姆斯氏(Coombs)陽性貧血)；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基膜病；抗磷脂綜合癥；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯氏(Graves)病；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌無力綜合癥；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內(nèi)分泌腺?。蝗R特氏(Reiter)??；僵人綜合癥；貝切特氏(Behcet)??；巨細(xì)胞動脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎病；IgM多神經(jīng)病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP) 或自身免疫性血小板減少癥等。本發(fā)明還關(guān)注活動性自身免疫性疾病?；顒有缘淖陨砻庖咝约膊≈钙渲惺茉囌?的免疫系統(tǒng)處于自身反應(yīng)性狀態(tài)(也就是受試者自身免疫系統(tǒng)的細(xì)胞被動員來攻擊受試者自身組織和/或器官)的自身免疫性疾病?；加谢顒有宰陨砻庖咝约膊〉氖茉囌咭话?會展現(xiàn)出疾病的相應(yīng)癥狀?；加谢顒有宰陨砻庖咝约膊〉牟溉閯游锸茉囌呖砂l(fā)生發(fā)作 (flare-up)，即一段時間的升高的疾病活動或相應(yīng)癥狀的復(fù)發(fā)。發(fā)作可響應(yīng)重度感染、變應(yīng) 性反應(yīng)、機(jī)體應(yīng)激、情緒創(chuàng)傷、手術(shù)、或環(huán)境因素而發(fā)生。如上所述，在治療本文所述炎性疾病(例如自身免疫性疾病或自身免疫相關(guān)疾患)時，可以用本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物與第二治療劑(諸如免疫抑制劑(即抗炎藥))聯(lián)合來處理受試者，諸如在多藥物方案中。所述CRTAM調(diào)控物可以與所述免疫抑制劑同時、序貫或交替施用。所述免疫抑制劑可以以與本領(lǐng)域提出的劑量相同或較小的劑量施用。適宜的輔助免疫抑制劑會取決于許多因素，包括所治療病癥的類型以及患者的歷史?！懊庖咭种苿痹谟糜诒疚臅r指作用于抑制或掩蓋患者的免疫系統(tǒng)和/或炎性應(yīng) 答的物質(zhì)。此類藥劑將包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。此類藥劑的例子包括類固醇，諸如糖皮質(zhì)類固醇，例如潑尼松(prednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone) ；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(參見美國專利第4，665，077號)；硫唑嘌呤(azathioprine)(或環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide)，如果對硫唑嘌呤有不良反應(yīng)的話)；溴隱亭(bromocryptine)；戊二醛(它掩蓋MHC抗原，如美國專利第4，120，649號中所記載的)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A ；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素、
或-a抗體；抗腫瘤壞死因子-a抗體；抗腫瘤壞死因子抗體；抗白介素_2抗體和抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；泛(pan) T抗體，優(yōu)選抗CD3或抗⑶4/⑶4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(W0 90/08187，公布于90年7月26 日)；鏈激酶；TGF-0 ；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA;H(506;RS-61443;脫氧精胍菌素 (deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin) ；T細(xì)胞受體(美國專利第5，114，721號)；T細(xì) 胞受體片段(Offner 等，Science251 430-432 (1991) ；W0 90/11294 ；W0 91/01133)；及 T 細(xì) 胞受體抗體(EP340, 109)，諸如T10B9。術(shù)語“細(xì)胞毒性或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)分子”、“I類MHC限制性T細(xì)胞相關(guān)分子” 和“CRTAM”(大寫或小寫字母，或其任意組合)在本文中可互換使用，涵蓋能夠以與野生型CRTAM相似的方式調(diào)控已活化T活性的天然序列多肽、多肽變體及天然序列多肽和多肽變體的片段(在本文中有進(jìn)一步定義)。本文中所描述的CRTAM多肽可以從多種來源分離，諸如人組織類型或其它來源，或者通過重組或合成方法制備。術(shù)語“CRTAM”、“CRTAM多肽”、“CRTAM蛋白質(zhì)”、和“CRTAM分子”還包括本文中所公開的CRTAM多肽的變體。本發(fā)明的“CRTAM調(diào)控物”指調(diào)控CRTAM的正常生物學(xué)功能/活性的分子?！疤烊恍蛄蠧RTAM多肽”包括與衍生自自然界的相應(yīng)CRTAM多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在一個實(shí)施方案中，天然序列CRTAM多肽包含SEQID NO 1 (見圖30A)或SEQ ID N0:2(見圖30B)的氨基酸序列。此類天然序列CRTAM多肽可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段生成。術(shù)語“CRTAM多肽”和“CRTAM蛋白質(zhì)”在用于本文時明確涵蓋天然存在的截短或其它翻譯后修飾形式的特定CRTAM多肽、該多肽的天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體。在用于本文時，術(shù)語“肽”和“多肽”可互換使用，只是術(shù)語“肽”一般指包含少于200個連續(xù)氨基酸的多肽。術(shù)語“載體”在用于本文時意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)粒”，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì) 胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱為“重組載體”)。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是載體的最常用形式?！岸嗪塑账帷被颉昂怂帷痹诒疚闹锌苫Q使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結(jié) 構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如“帽”，將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接 (例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)，諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如a端基異構(gòu)核酸(anomeric nucleic acid) 等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與另外的核苷酸的另外的連接，或者可偶聯(lián)至固相或半固相支持物。5'和3'末端 0H可磷酸化或者用胺或1-20個碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo) 準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物， a-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團(tuán)替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于如下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸酯，，(thioate)),P(S)S( “二硫代酸酯” (dithioate)),(0)NR2( “酰胺酯”(amidate))、P (0) R、P(0)0R'、C0或CH2 (“甲縮醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自獨(dú)立為H或者取代或未取代的烷基(1-20個C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。上述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA?！肮押塑账帷痹谟糜诒疚臅r通常指短多核苷酸，通常是單鏈，通常是合成的，長度通常但不是必需小于約200個核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述同樣且完全適用于寡核苷酸。術(shù)語“宿主細(xì)胞”(或“重組宿主細(xì)胞”)在用于本文時意圖指通過導(dǎo)入外源多核苷酸諸如重組質(zhì)?；蜉d體，遺傳上已經(jīng)改變或者能夠在遺傳上改變的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，此類術(shù)語意圖不僅指特定的受試細(xì)胞，還指此類細(xì)胞的后代。因為在后代中可能由于突變或環(huán) 境影響而存在某些改變，所以此類后代可能事實(shí)上與親本細(xì)胞不同，但是在用于本文時仍然包括在術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。CRTAM “胞外結(jié)構(gòu)域”或“ECD”指基本上不含相應(yīng)全長分子的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的 CRTAM多肽形式。術(shù)語“CRTAM配體”指結(jié)合CRTAM的物質(zhì)，包括但不限于天然CRTAM配體(無論是分離的和/或純化的、合成的、和/或重組的)，天然CRTAM配體的同系物(例如來自另一種哺乳動物)、抗體、此類分子的一部分、和其它物質(zhì)。術(shù)語CRTAM配體涵蓋作為CRTAM活性抑制劑或促進(jìn)劑的物質(zhì)，以及結(jié)合但缺乏抑制劑或促進(jìn)劑活性的物質(zhì)。CRTAM配體的例子包括但不限于柄蛋白樣蛋白2(Necl2)，也稱作Cadml。如本文中涉及CRTAM功能/活性所使用的術(shù)語“拮抗劑”和術(shù)語“CRTAM拮抗劑” 以最廣義使用，包括阻斷天然序列CRTAM多肽結(jié)合CRTAM配體，和/或部分或完全阻斷或中和(統(tǒng)稱“抑制”)或以其它方式降低天然序列CRTAM多肽的定量生物學(xué)活性(如本文中所定義的)的任何分子。合適的CRTAM拮抗劑分子具體包括但不限于如本文所述的CRTAM 調(diào)控物，例如包含阻斷性抗CRTAM抗體(包括抗體片段)、其它多肽(諸如本文中天然序列 CRTAM多肽的變體和融合物)、肽和非肽(有機(jī))小分子、抑制性和反義多核苷酸分子的調(diào) 控物。在一個實(shí)施方案中，CRTAM拮抗劑包括特異性結(jié)合天然CRTAM多肽且能夠阻斷其結(jié) 合CRTAM配體的抗CRTAM抗體，包括抗體片段。"CRTAM阻斷性抗體”或涉及CRTAM活性/功能使用的“阻斷性抗體”指能夠阻斷天然序列CRTAM多肽結(jié)合CRTAM配體，和/或部分或完全阻斷或中和(統(tǒng)稱“抑制”)或以其它方式降低天然序列CRTAM多肽的生物學(xué)活性(如本文中所定義的)的抗體。阻斷性抗體可以是如本文中所定義的消減性抗體。如本文中所使用的，術(shù)語“CRTAM結(jié)合劑”指能夠結(jié)合CRTAM的分子，諸如蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合劑結(jié)合CRTAM但不干擾CRTAM結(jié)合CRTAM配體的能力。在一個實(shí) 施方案中，CRTAM結(jié)合劑是CRTAM非阻斷性抗體。"CRTAM非阻斷性抗體”或涉及CRTAM功能/活性使用的“非阻斷性抗體”指能結(jié)合天然序列CRTAM多肽但不干擾或阻斷CRTAM配體結(jié)合天然序列CRTAM多肽的抗體。然而，在結(jié)合后，CRTAM非阻斷性抗體能夠介導(dǎo)表達(dá)CRTAM分子的細(xì)胞的消減或刪除。在一個實(shí) 施方案中，非阻斷性抗體結(jié)合CRTAM胞外結(jié)構(gòu)域。如此，在一個實(shí)施方案中，CRTAM非阻斷性抗體不干擾CRTAM配體結(jié)合但能夠誘導(dǎo)表達(dá)CRTAM的T細(xì)胞的消減。非阻斷性抗體可以是如本文中所定義的消減性抗體。如本文中所使用的，“消減”指細(xì)胞的清除、消減、或刪除。在一個實(shí)施方案中，被消減的細(xì)胞是特定T細(xì)胞群體的一部分，例如，已活化的CD4+或CD8+T細(xì)胞群體。一般而言，被消減的細(xì)胞表達(dá)特定細(xì)胞表面標(biāo)志物。所述標(biāo)志物可以是CD4或CD8，單獨(dú)的或與CRTAM 組合的。在一個實(shí)施方案中，所述表面標(biāo)志物是CRTAM。如本文中所定義的，“消減性抗體”指對包含其抗原靶的細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致對抗原或細(xì)胞功能的抑制或?qū)е录?xì)胞死亡的抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的消減性抗體結(jié)合 CRTAM,且可以阻斷或不阻斷CRTAM配體結(jié)合CRTAM。如此，消減性抗體具體包括如上文所定義的阻斷性的和非阻斷性的抗體。在某些實(shí)施方案中，消減性抗體可誘導(dǎo)凋亡或程序性細(xì)胞死亡，例如T細(xì)胞的，如通過標(biāo)準(zhǔn)凋亡測定法所測定的，諸如膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破裂、和/或膜囊(稱作凋亡小體)形成?！罢T導(dǎo)細(xì)胞死亡”的消減性抗體指引起可存活細(xì)胞變得不能存活的消減性抗體。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是CRTAM+細(xì)胞。體外細(xì)胞死亡可在不存在補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞時測定，以區(qū)分由抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。如此，用于細(xì)胞死亡的測定法可使用熱滅活血清(即不含補(bǔ)體)在不存在免疫效應(yīng)細(xì)胞時進(jìn) 行。為了確定抗體、寡肽或其它有機(jī)分子是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可相對于未處理細(xì)胞評估膜完整性的喪失，它是通過碘化丙啶(propidium iodide) (PI)、錐蟲藍(lán)(參見Moore等， Cytotechnology 17:1-11(1995))或7AAD的攝取來評估的。在一個實(shí)施方案中，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體是消減CRTAM+細(xì)胞的抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的消減性抗體結(jié)合CRTAM且包含毒素偶聯(lián)物，其中所述毒素誘導(dǎo)結(jié)合所述抗體偶聯(lián)物的細(xì)胞消減。本發(fā)明的消減性抗體還可經(jīng)由偶聯(lián)的毒素或細(xì)胞毒劑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。術(shù)語“細(xì)胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊昔(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法倉(melphalan)、絲裂霄素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體。下文記載了其它細(xì)胞毒劑?！翱贵w” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)指具有相似結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體展現(xiàn) 出對特定抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體及通常缺乏抗原特異性的其它抗體樣分子二者。后一類多肽例如由淋巴系統(tǒng)以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì) 描述的)?？贵w可以是嵌合的、人的、人源化的和/或親和力成熟的。術(shù)語“抗CRTAM抗體”或“能結(jié)合CRTAM的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合CRTAM，使得該抗體可用作靶向CRTAM的治療劑和/或診斷劑的抗體。在一個實(shí)施方案中，抗CRTAM抗體結(jié)合無關(guān)、非CRTAM蛋白的程度小于抗體對CRTAM結(jié)合的約10 %，所述程度例如根據(jù)放射免疫測定法(RIA)測量的。在某些實(shí)施方案中，能結(jié)合CRTAM的抗體具有彡1 P M、彡lOOnM、彡lOnM、彡InM、或彡0. InM的解離常數(shù)(Kd)。在某些實(shí)施方案中，抗CRTAM抗體能結(jié)合在來自不同物種的CRTAM多肽間保守的CRTAM表位。術(shù)語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體而非如下文所定義的抗體片段。該術(shù)語具體指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體。“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個剩余的“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab' )2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。術(shù)語“Fc區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C-端區(qū)域，其可以通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體而產(chǎn)生。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變異Fc區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為自Fc區(qū)的大約Cys226位置或大約Pro230 位置的氨基酸殘基至羧基末端的區(qū)段。免疫球蛋白的Fc區(qū)一般包含兩個恒定域，即CH2結(jié) 構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，而且任選包含CH4結(jié)構(gòu)域?！癋c區(qū)鏈”在本文中指Fc區(qū)的兩條多肽鏈之一?！癋v”是包含完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在一個實(shí)施方案中，雙鏈Fv種類由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。六個CDR —起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的三個 CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段包含重鏈可變域和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHI)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHI結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab' _SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在成對Fab' 片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun，在Rosenburg和Moore編的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第 113卷中，Springer_Verlag,New York, pp.269-315(1994)。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (VH-VL)中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(\)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整的記載于例如 EP 404，097 ；W093/1161 ；Hudson 等(2003)Nat. Med. 9 :129_134 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四抗體(tetrabody)也記載于 Hudson 等(2003) Nat. Med. 9 129-134。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此，修飾語“單克隆”表明抗體不是不同的抗體的混合物的特征。在某些實(shí)施方案中，此類單克隆抗體典型地包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler 等，Nature256 495(1975) ；Harlow 等，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,2nd ed. 1988 ；Hammerling 等，于:MonoclonalAntibodies and T—Cell Hybridomas, 563-681，Elsevier,N. Y.，1981)、重組DNA法(參見例如美國專利No. 4,816, 567)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson 等，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1992) ；Sidhu 等， J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472 (2004) ；Lee 等，J. Immunol. Methods 284(1-2) : 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如W0 98/24893 ； W0 96/34096 ；W0 96/33735 ；W0 91/10741 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature362 255-258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 33(1993)；美國專利 No. 5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ； 5, 633, 425 ；5, 661, 016 ；Marks 等，Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg 等， Nature 368 856-859(1994) ；Morrison,Nature 368 812-813(1994) ；Fishwild Nature Biotechnol. 14 845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) ；Lonberg andHuszar,Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性(美國專利第4，816，567號；Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855 (1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實(shí)施方案上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū) (FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基?？梢赃M(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié) 參見 Jones 等，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323_329 (1988)； Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。還可參見以下綜述及其引用的參考文獻(xiàn)Vaswani andHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998)； Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 1035-1038(1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428_433(1994)?！叭丝贵w”指包含與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。此類技術(shù)包括篩選人衍生的組合文庫，諸如噬菌體展示文庫(參見例如Marks等，J. Mol. Biol. , 222 581-597 (1991)和 Hoogenboom 等，Nucl. Acids Res.，19 :4133_4137 (1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系來生成人單克隆抗體(參見例如Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51 頁-第 63 頁(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)；禾口 Boerner 等，J. Immunol. ,147 86(1991))；和在轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中生成單克隆抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物能夠在沒有內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況中生成人抗體的完全全集(參見例如 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature, 362 255(1993) ；Bruggermann 等，Year in Immunol.，7 :33 (1993))。人抗體的這種定義明確排除包含來自非人動物的抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?！坝H和力成熟的”抗體指在其一個或多個CDR中具有導(dǎo)致抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的一處或多處改變的抗體。在一個實(shí)施方案中，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知流程生成。Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)記載了通過VH 和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。下列文獻(xiàn)記載了 HVR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變BarbaS 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813(1994) ；Schier 等，Gene 169:147-155(1995)； Yelton 等，J. Immunol. 155 :1994-2004 (1995) ；Jackson 等，J. Immunol. 154(7) 3310-9 (1995) ；Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226 :889_896 (1992)。“小分子”或“有機(jī)小分子”在本文中定義為分子量小于約500道爾頓的有機(jī)分子。“CRTAM結(jié)合寡肽”或“結(jié)合CRTAM的寡肽”指能夠以足夠的親和力結(jié)合CRTAM以使得該寡肽作為靶向CRTAM中的診斷劑和/或治療劑是有用的寡肽。在某些實(shí)施方案中， CRTAM結(jié)合寡肽對無關(guān)的、非CRTAM的蛋白質(zhì)的結(jié)合程度小于約10%的該CRTAM結(jié)合寡肽對CRTAM的結(jié)合，如通過例如表面等離振子共振測定法所測量的。在某些實(shí)施方案中， CRTAM結(jié)合寡肽具有小于等于1 P M、小于等于100nM、小于等于10nM、小于等于InM、或小于等于0. InM的解離常數(shù)(Kd)。"CRTAM結(jié)合有機(jī)分子”或“結(jié)合CRTAM的有機(jī)分子”指與如本文中所定義的寡肽或抗體不同的、能夠以足夠的親和力結(jié)合CRTAM以使得該有機(jī)分子作為靶向CRTAM中的診斷劑和/或治療劑是有用的有機(jī)分子。在某些實(shí)施方案中，CRTAM結(jié)合有機(jī)分子對無關(guān)的、非CRTAM的蛋白質(zhì)的結(jié)合程度小于約10%的該CRTAM結(jié)合有機(jī)分子對CRTAM的結(jié)合，如通過例如表面等離振子共振測定法所測量的。在某些實(shí)施方案中，CRTAM結(jié)合有機(jī)分子具有小于等于1 P M、小于等于100nM、小于等于10nM、小于等于InM、或小于等于0. InM的解離常數(shù)(Kd)?？梢允褂帽砻娴入x振子共振測定法來方便地測量任何分子結(jié)合靶多肽的解離常數(shù)(Kd)。此類測定法可以采用于 25°C 的 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore，Inc.， PiSCataWay，NJ)，其中固定化靶多肽CM5芯片在約10個響應(yīng)單位(RU)。簡言之，依照供應(yīng) 商的說明書用鹽酸N-乙基-N’ _(3_ 二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸鈉 pH 4. 8將靶多肽稀釋至5 u g/ml (約0. 2 y M)，然后以5 yl/分鐘的流速注入至獲得約10 個響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入靶多肽后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動力學(xué)測量，于25°C以約25 u 1/分鐘的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS(PBST) 中兩倍連續(xù)稀釋的結(jié)合分子(0. 78nM至500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結(jié) 合模型(BIAcore Evaluation Softwareversion 3.2)通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖來計算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計算。參見例如Chen，Y.，等，(1999)J. Mol. Biol. 293 :865-881。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測定法，抗體的結(jié)合速率超過lO^-is-1，那么結(jié)合速率可以使用熒光淬滅技術(shù)來測定，即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(a stop-flow equippedspectrophometer) (Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS，pH 7. 2中的20nM抗體(Fab形式)于 25°C的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm ；發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低。涉及CRTAM功能/活性使用的“調(diào)控”或如本文中所使用的“對CRTAM生物學(xué)活性的調(diào)控”指例如對如下細(xì)胞事件的調(diào)控(i)其是涉及CRTAM+細(xì)胞的免疫應(yīng)答的一部分，和(ii)其受到CRTAM調(diào)控物的調(diào)控，所述CRTAM調(diào)控物包括CRTAM抗體(例如拮抗性抗體)。此調(diào)控發(fā)生在T細(xì)胞活化的初始階段之后，一般包括細(xì)胞活化的第一個小時期間對T 細(xì)胞骨架的改造。在此初始改造期間，細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)物(諸如Was/WaSp、Vavl/Vav、WaSf2/ WAVE2和Hclsl/HSl)在早期T細(xì)胞微管和肌動蛋白改造中發(fā)揮作用。其它早期事件包括但不限于下述一項或多項抗原呈遞細(xì)胞(APC)對T細(xì)胞的活化；免疫學(xué)突觸的形成；T細(xì)胞抗原受體(TCR)接觸區(qū)處信號傳導(dǎo)支架的協(xié)同裝配；Scrib和Dlgl被募集至免疫學(xué)突觸和脂筏；Scrib和Dlgl遠(yuǎn)離CD3的極化；肌動蛋白聚合的初始階段；和細(xì)胞骨架改造以在細(xì)胞間接觸后產(chǎn)生第二信使。T細(xì)胞活化晚期在初始T細(xì)胞活化后發(fā)生，期間CRTAM表達(dá)上調(diào)。 CRTAM調(diào)控物對此晚期的調(diào)控可影響各種T細(xì)胞活化事件，包括但不限于下述一項或多項細(xì)胞增殖、周期或分裂；細(xì)胞粘附；T細(xì)胞效應(yīng)器功能的形成；細(xì)胞因子生成；某些分子自細(xì) 胞內(nèi)募集至膜，所述分子包括但不限于Scrib腫瘤阻抑物、PKC (、和Cdc42中的一項或多項；T細(xì)胞前緣處含Cdc42的復(fù)合物的裝配的細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)；晚期細(xì)胞骨架改造；和T細(xì)胞極性。CRTAM調(diào)控還可影響某些CRTAM"細(xì)胞類型，包括但不限于下述一項或多項⑶4+T細(xì)胞， ⑶8+T細(xì)胞，NK細(xì)胞，和NKT細(xì)胞。由CRTAM調(diào)控物進(jìn)行的調(diào)控包括例如對細(xì)胞因子生成的影響，包括但不限于下述細(xì)胞因子中的一項或多項IFNy，IL22和/或IL17。如本文中所使用的，“CRTAM+細(xì)胞”指在其表面上具有或表達(dá)天然序列CRTAM的細(xì) 胞。在某些實(shí)施方案中，CRTAM+細(xì)胞是處于T細(xì)胞活化晚期的T細(xì)胞。CRTAM+細(xì)胞包括但不限于⑶8+T細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、或NKT細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，CRTAM+細(xì)胞是細(xì) 胞因子生成細(xì)胞，所述細(xì)胞因子包括但不限于IFNy、IL22、和/或IL17。在一個實(shí)施方案中，CRTAM+細(xì)胞還是⑶4+的。在一個實(shí)施方案中，CRTAM+細(xì)胞還是⑶8+的。在一個實(shí)施方案中，CRTAM+細(xì)胞是已活化的CD4+T細(xì)胞?！翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc 受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì) 胞)識別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá) FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá) FcyRI、FcyRII 禾口 FcyRIII。Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 =457-492 (1991)第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測定法，諸如美國專利No. 5，500, 362或5，821，337中所記載的?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK) 細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes 等，PNAS(USA)95 =652-656(1998)中所披露的。術(shù)語“Fc受體”和“FcR”用于描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)cR 是天然序列人FcR。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的FcR(Y受體)，包括FcyRI、 Fc y RII和Fc Y RIII亞類的受體，包括這些受體的各等位變體和各可變剪接形式。FcyRII 受體包括FcyRIIA( “活化受體”)和FCYRIIB( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFcyRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見DaSron，Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234 (1997))。FcR 的綜述參見 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457_492 (1991) ；Cape 1 等，Immunomethods 4:25-34(1994)；及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 :330_341 (1995)。術(shù)語“FcR” 在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，其負(fù)責(zé) 將母體 IgG 轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer 等，J. Immunol. 117 587(1976)及 Kim 等，J. Immunol. 24 249(1994))?！把a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指在存在補(bǔ)體時分子溶解靶物的能力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(例如抗體)起始的。為了評估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行⑶C測定法，例如如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods 202 163(1996)中所記載的。“免疫效應(yīng)細(xì)胞”指能夠結(jié)合抗原并介導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括但不限于T細(xì)胞(例如⑶4+、⑶8+)、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL)。在一個實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞包含已活化的細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，CRTAM+ 細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞?！坝字?naiVe)”免疫效應(yīng)細(xì)胞指從未暴露于能夠活化T細(xì)胞的抗原的免疫效應(yīng)細(xì) 胞。幼稚免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化需要對肽:MHC復(fù)合物的識別及同時專職APC對共刺激信號的傳遞二者以增殖和分化成抗原特異性的、經(jīng)武裝的效應(yīng)T細(xì)胞。
病癥(諸如自身免疫性疾病)的“病理”或“病理學(xué)”包括所有危及患者康樂的現(xiàn) 象。這包括但不限于異常的或不可控的細(xì)胞生長(嗜中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、抗體生成、自身抗體生成、補(bǔ)體生成、對鄰近細(xì)胞正常機(jī)能的干擾、細(xì)胞因子或其它分泌產(chǎn)物的異常水平釋放、任何炎性應(yīng)答或免疫學(xué)應(yīng)答的抑制或惡化(aggration)、炎癥細(xì)胞(嗜中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)浸潤入細(xì)胞間隙(cellular spaces)寸。如本文中所使用的，術(shù)語“自身反應(yīng)性的”指具有自身免疫性疾病的哺乳動物的免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞的狀況。免疫系統(tǒng)的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞一般牽涉如本文所述的自身免疫性疾病的病理。自身反應(yīng)性T細(xì)胞可推動各種促成自身免疫性應(yīng)答啟動和持續(xù)的事件，包括但不限于下述一項或多項對B細(xì)胞自身抗體生成的誘導(dǎo)，對巨噬細(xì)胞的活化，細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的升高，和分泌的細(xì)胞因子水平的升高。術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TP0)；神經(jīng)生長因子，諸如 NGF-0 ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-0 ；胰島素樣生長因子-I和-II ；紅細(xì)胞生成素(EP0)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor)；干擾素，諸如干擾素-a、干擾素和干擾素；集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如IL1、IL1 a、IL2、 IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL17、IL22 ；腫瘤壞死因子，諸如 TNF-a或TNF-0 ；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物?！胺蛛x的”核酸分子指已經(jīng)鑒定且與核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)所編碼多肽的細(xì)胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時?！胺蛛x的”多肽(包括分離的抗體)指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的多肽?？贵w的天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將多肽純化至(1)根據(jù)Lowry法的測定，多肽重量超過95%且最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù) 使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然化合物的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的化合物(例如抗體或其它多肽)包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位化合物。然而，分離的化合物通常通過至少一個純化步驟來制備。
在用于本文時，術(shù)語“免疫粘附素”指將異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定域的效應(yīng)器功能聯(lián)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不同于抗體的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)(即是“異源”的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以從任何免疫球蛋白獲得，諸如 IgG-l、IgG-2、IgG-3 或 IgG-4 亞型、IgA (包括 IgA_l 和 IgA_2)、IgE、IgD 或1#。短語“基本上相似”或“基本上相當(dāng)”在用于本文時表示兩個數(shù)值之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為在用所述數(shù)值所測量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學(xué)顯著性。所述兩個數(shù)值之間的差異優(yōu)選小于約50%，優(yōu) 選小于約40%，優(yōu)選小于約30%，優(yōu)選小于約20%，優(yōu)選小于約10%。術(shù)語“激動劑”以最廣義使用，包括部分或完全模擬或增強(qiáng)多肽(包括但不限于 CRTAM和Necl2 (Cadml))的生物學(xué)活性，或者提高編碼該多肽的核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯的任何分子。例示性的激動劑分子包括但不限于激動性抗體、多肽片段、寡肽、有機(jī)分子(包括小分子)、和包含CRTAM結(jié)合序列的融合多肽。術(shù)語“診斷”在用于本文時指分子或病理狀態(tài)、疾病或狀況的鑒定或分類。例如， “診斷”可以指自身免疫性疾病(諸如特定類型的狼瘡疾患，例如SLE)存在、階段和/或程度，或者類型/亞型的鑒定?！霸\斷”還可以指特定亞型的狼瘡的分類，例如通過組織/器官累及(例如狼瘡腎炎)、通過分子特征(例如以特定基因或核酸區(qū)域中的遺傳變異為特征的患者亞群)。在用于本文時，“治療”指試圖改變所治療個體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù) 發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物在試圖延遲疾病或病癥的發(fā)生/發(fā)展中是有用的。如本發(fā)明的語境中所使用的，術(shù)語“預(yù)防”、“抑制”、和“防止”包括其中病理狀態(tài)、疾病或狀況的發(fā)生得到完全或部分阻斷，病理狀態(tài)、疾病或狀況的發(fā)作得到部分或完全延遲，或者對現(xiàn)有病理狀態(tài)、疾病或狀況的刺激得到部分或完全逆轉(zhuǎn)的情形。雖然預(yù)見到現(xiàn)有病理狀態(tài)、疾病或狀況可得到完全或部分逆轉(zhuǎn)，但是這不是此定義的必要條件。如本文中所使用的，“改善”在本文中定義為使之變得更好或改進(jìn)?！坝行Я俊敝冈诒匦璧膭┝亢蜁r間上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。治療劑的“治療有效量”可根據(jù)諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該抗體在個體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該治療劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量?！邦A(yù)防有效量”指在必需的劑量和時間上有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量?！皞€體”、“受試者”或“患者”指脊椎動物。在某些實(shí)施方案中，脊椎動物指哺乳動物。哺乳動物包括但不限于牲畜(諸如牛)、運(yùn)動用動物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、靈長類動物(包括人和非人靈長類)、和嚙齒類動物(例如小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，哺乳動物指人。術(shù)語“測試樣品，，指來自懷疑具有病理狀態(tài)、疾病或狀況(諸如自身免疫性疾病) 的受試者的樣品。測試樣品可源自受試者中的各種來源，包括但不限于血液、血清、骨髓、寸。術(shù)語“對照”指預(yù)期其中的陰性結(jié)果有助于關(guān)聯(lián)測試樣品中的陽性結(jié)果的陰性對照。適合于本發(fā)明的對照包括但不限于已知不含表達(dá)CRTAM的已活化T細(xì)胞的樣品、已知不含表達(dá)CRTAm的已活化CD4+T細(xì)胞的樣品、和自已知沒有有關(guān)病理狀態(tài)、疾病或狀況的受試者獲得的樣品。另外，對照可以是含有與測試樣品中所含細(xì)胞具有相同起源的正常細(xì)胞的樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會適合于在本發(fā)明中使用的其它對照?！八幬铩被颉八巹敝赣糜谥委煵±頎顟B(tài)、疾病、和/或狀況的活性藥物。在一個實(shí)施方案中，所述病理狀態(tài)、病癥、和/或狀況是本文所列自身免疫性病癥或其癥狀或副作用。II.本發(fā)明的組合物和方法本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物(包括抗CRTAM抗體及其片段)可用于調(diào)控涉及CRTAM+ 細(xì)胞的生物學(xué)活性。在一個實(shí)施方案中，所述方法可用于通過給有需要的受試者施用有效量的CRTAM調(diào)控物來治療或預(yù)防疾病，諸如自身免疫性疾病。如此，本文中的CRTAM調(diào)控物 (例如CRTAM拮抗劑)可用于治療或預(yù)防與涉及受CRTAM調(diào)控物調(diào)控的CRTAM"細(xì)胞的生物學(xué)活性有關(guān)的疾病。在一個實(shí)施方案中，CRTAM調(diào)控物包含拮抗性抗CRTAM抗體或其片段，其可以起阻斷性抗體的作用。在另一個實(shí)施方案中，CRTAM調(diào)控物包含阻斷性抗體或其片段，其可誘導(dǎo)CRTAM+細(xì) 胞的消減。針對細(xì)胞表面分子的抗體已經(jīng)顯示出有效消減或清除特定淋巴細(xì)胞子集或抑制細(xì)胞功能。例如，認(rèn)為針對細(xì)胞表面受體CD45RB的單克隆抗體的使用導(dǎo)致表達(dá)具有相應(yīng)CD45RB抗原的受體的T細(xì)胞克隆的功能和/或?qū)嶋H消減(Lazarovits，等U. S. Patent No. 7，160，987)。此類抗體表現(xiàn)出能夠選擇性抑制炎性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答而不破壞記憶T細(xì)胞集合。這些類型的抗體具有作用于特定T細(xì)胞群體(而非具有全面免疫抑制效應(yīng))和賦予針對特定抗原的長期耐受(當(dāng)在暴露于抗原的同時施用它們時，諸如恰好在組織或器官移植之前和之后，或者在自身免疫性疾病急性期期間)的潛力。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠作用于特定T細(xì)胞亞群，而非具有全面免疫抑制效應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞亞群包含CRTAM+T細(xì)胞亞群，例如已活化CD4+CRTAM+T細(xì)胞亞群。本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物(包括抗CRTAM抗體及其片段)可用于消減受此類CRTAM 調(diào)控物消減的CRTAM+細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述CRTAM+細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞或免疫效應(yīng)細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，通過給有需要的受試者施用有效量的CRTAM調(diào)控物，所述方法可用于治療或預(yù)防疾病(諸如自身免疫性疾病)。如此，本文中的CRTAM調(diào)控物可用于治療或預(yù)防可通過消減CRTAM+細(xì)胞來改善的疾病。CRTAM調(diào)控物可包含抗CRTAM抗體或其片段，其可以起非阻斷性抗體的作用。在本文中方法的一個實(shí)施方案中，不給受試者施用CRTAM調(diào)控物(諸如抗CRTAM 抗體)以外的藥物來治療或預(yù)防疾病。在一個實(shí)施方案中，可以與CRTAM調(diào)控物一起給受試者施用有效量的第二藥物，其中CRTAM調(diào)控物(例如抗CRTAM抗體)是第一藥物。所述第二藥物可以是一種或多種藥物，包括例如免疫抑制劑、細(xì)胞因子拮抗劑(諸如細(xì)胞因子抗體)、生長因子、激素、整聯(lián)蛋白、整聯(lián)蛋白拮抗劑或抗體、或其任意組合。所述第二藥物的類型取決于多種因素，包括免疫性疾病的類型、免疫性疾病的嚴(yán)重程度、受試者的狀況和年齡、所采用的第一藥物的類型和劑量、等。本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物在自身免疫性疾病診斷和預(yù)后測定法及成像方法中特別有用。在一個實(shí)施方案中，使用抗CRTAM抗體或其片段實(shí)施所述測定法。本發(fā)明還提供了對于CRTAM蛋白的檢測和定量有用的多種免疫學(xué)測定法。這些測定法是在本領(lǐng)域公知的各種免疫學(xué)測定形式內(nèi)實(shí)施的，包括但不限于各種類型的放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定法(ELIFA)、等等。另外，本發(fā)明還提供了能夠檢測以CRTAM 表達(dá)為特征的自身免疫性疾病的免疫學(xué)成像方法，包括但不限于使用例如經(jīng)標(biāo)記CRTAM抗體進(jìn)行的放射閃爍成像法。此類測定法在臨床上可用于以CRTAM表達(dá)為特征的自身免疫性疾病的檢測、監(jiān)測、和預(yù)后。本發(fā)明的另一個方面涉及用于鑒定表達(dá)CRTAM的細(xì)胞的方法。CRTAM的表達(dá)序型使之成為病癥(諸如自身免疫性疾病)的診斷標(biāo)志物。因而，CRTAM表達(dá)的狀態(tài)提供了對于預(yù)測下述多種因素有用的信息，包括對疾病晚期的易感性、進(jìn)展速率、和/或活動性疾病 (例如活動性自身免疫性疾病)中癥狀的突然和嚴(yán)重發(fā)作，即發(fā)作(flare-up)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測病癥(諸如自身免疫性疾病)的方法。例如，使來自受試者和對照的測試樣品各自接觸例如抗CRTAM抗體或其片段。在一個實(shí)施方案中，所述測試樣品含有具有某些細(xì)胞表面標(biāo)志物的T細(xì)胞(例如已活化T細(xì)胞)，所述細(xì) 胞表面標(biāo)志物包括但不限于下述一項或多項CRTAM+，⑶4+，和⑶8+。在一個實(shí)施方案中，所述測試樣品含有作為已活化CRTAM+、⑶4+T細(xì)胞的T細(xì)胞。測量CRTAM+細(xì)胞的量，而且與對照相比測試樣品中較高相對量的細(xì)胞指示獲取所述測試樣品的受試者中的疾病(諸如自身免疫性疾病)。所述檢測方法可進(jìn)一步包括以下步驟，自所述受試者獲得含有T細(xì)胞的第二測試樣品，使所述第二測試樣品和初始測試樣品接觸抗CRTAM抗體，與初始測試樣品相比在第二測試樣品中檢測到較高相對量的CRTAM+細(xì)胞指示獲取測試樣品的受試者中疾病 (諸如自身免疫性疾病)的發(fā)作。在另一個實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法檢測的自身免疫性疾病是活動性自身免疫性疾病。在有些實(shí)施方案中，采用所述方法來檢測活動性自身免疫性疾病的發(fā)作。在初步檢測到自身免疫性疾病后，可以自發(fā)現(xiàn)具有自身免疫性疾病的受試者獲得另外的測試樣品。可以在采集初始樣品后幾小時、幾天、幾周、或幾個月獲得另外的樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會用于獲得所述另外的樣品(可以包括第二、第三、第四、第五、第六、等測試樣品)的適宜時間表。使初始測試樣品和另外的樣品(或者如本文所述的對照)接觸例如抗CRTAM抗體。測量CRTAM+細(xì)胞的量，而且與初始測試樣品相比另外的測試樣品中較高相對量的細(xì)胞指示獲取測試樣品的受試者中活動性自身免疫性疾病的發(fā)作。本發(fā)明提供了用于檢測組織或其它生物學(xué)樣品(諸如血清、精液、骨、前列腺、尿液、細(xì)胞制備物、等等)中CRTAM的存在的測定法。用于檢測CRTAM的方法也是公知的，包括例如免疫沉淀、免疫組織化學(xué)分析、Western印跡分析、分子結(jié)合測定法、ELISA、ELIFA 等等。例如，檢測生物學(xué)樣品中CRTAM蛋白的存在的一種方法包括首先使樣品接觸例如抗 CRTAM抗體、其CRTAM反應(yīng)性片段、或含有抗CRTAM抗體之抗原結(jié)合區(qū)的重組蛋白；然后檢測樣品中CRTAM蛋白的結(jié)合。
在另一方面，本發(fā)明提供了提供分離的已活化CD4+T細(xì)胞群體的方法。分離已活化CD4+T細(xì)胞的方法包括使含有來自受試者的混合T細(xì)胞群體的生物學(xué)樣品接觸CRTAM結(jié) 合分子(例如如本文所述的CRTAM調(diào)控物，諸如抗CRTAM抗體)的步驟?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知方法自受試者獲得樣品。使含有T細(xì)胞混合物的樣品接觸特異性結(jié)合CRTAM的分子。在一個實(shí)施方案中，所述分子是抗CRTAM抗體或其片段。任何表達(dá)CRTAM的細(xì)胞會結(jié)合CRTAM 結(jié)合分子，由此將它們與不表達(dá)CRTAM的細(xì)胞區(qū)分開并容許分開和分離。將結(jié)合分子與它們所結(jié)合的細(xì)胞分開的方法是本領(lǐng)域公知的例如，可以通過短時間暴露于低PH溶液或用蛋白酶(諸如糜蛋白酶)將抗體與細(xì)胞分開?；蛘?，可以經(jīng)由加速鑒定和分離的偶聯(lián)標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)CRTAM+細(xì)胞群體的分離。此類標(biāo)記物的例子包括磁珠；生物素，其可以借助其對親合素或鏈霉親合素的親和力來鑒定或分離；熒光染料，其可以借助熒光活化細(xì)胞分選儀 (FACS，見下文)來鑒定或分離；等等。可以使用任何技術(shù)來進(jìn)行分離，只要該技術(shù)不過度傷害CRTAM+細(xì)胞。許多此類方法是本領(lǐng)域已知的。在一個實(shí)施方案中，將CRTAM結(jié)合分子附著至固體支持物。一些合適的固體支持物包括硝酸纖維素、瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纖維膜、磁珠、和塑料皮氏皿。例如，可以將結(jié)合分子共價連接至Pharmacia Sepharose 6MBmacro珠。固相連接的結(jié)合分子與粗制細(xì) 胞混合物溫育的精確條件和持續(xù)時間會取決于所采用的系統(tǒng)特異的數(shù)項因素，正如本領(lǐng)域公知的。通過將固體支持物與剩余細(xì)胞懸浮液物理分離，自細(xì)胞懸浮液取出結(jié)合至結(jié)合分子的細(xì)胞。例如，在容許固體支持物結(jié)合CRTAM+細(xì)胞足夠時間之后，用生理緩沖液系統(tǒng)洗脫或洗掉未結(jié)合的細(xì)胞。通過任何適宜的方法(主要取決于固相和結(jié)合分子的性質(zhì))，將結(jié)合的細(xì)胞與固相分開。例如，可以通過劇烈攪動自塑料皮氏皿洗脫結(jié)合的細(xì)胞?；蛘?，可以通過酶促“切割”或消化固相與抗體之間的酶敏感性“間隔物”序列來洗脫結(jié)合的細(xì)胞。合適的結(jié)合至瓊脂糖珠的間隔物序列可購自例如Pharmacia。然后可以通過離心用緩沖液清洗洗脫的、富集的細(xì)胞級分，并以可存活狀態(tài)低溫保存，供稍后依照本領(lǐng)域已知方法使用。III.已活化⑶4+T細(xì)胞群體在另一方面，本發(fā)明涉及分離的已活化CD4+T細(xì)胞群體，其中例如所述分離的群體中的大多數(shù)或基本上所有T細(xì)胞處于晚期活化。在一個實(shí)施方案中，所述分離的群體的特征為(1)表達(dá)CRTAM，和(2)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平相對于不表達(dá)CRTAM的CD4+已活化T細(xì)胞升高。另外，過表達(dá)細(xì)胞因子mRNA的細(xì)胞可展現(xiàn)出升高的細(xì)胞因子分泌水平。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子優(yōu)選是IFN Y、IL22、和/或IL17。在另一個實(shí)施方案中，純化所述分離的群體，使得它比用于分離已活化CD4+T細(xì) 胞的粗制細(xì)胞群體含有更高比例的已活化CD4+T細(xì)胞。純化的已活化CD4+T細(xì)胞群體可以如下分離，即使含有表達(dá)已活化T細(xì)胞特征性抗原的T細(xì)胞群體的粗制細(xì)胞混合物接觸特異性結(jié)合該抗原細(xì)胞外部分的分子。此類技術(shù)稱作正選擇。已活化T細(xì)胞對該分子的結(jié)合容許將T細(xì)胞與不表達(dá)該抗原的污染性細(xì)胞充分區(qū)分，以容許自污染性細(xì)胞分離T細(xì)胞。一般而言且優(yōu)選的是，所述抗原包含CRTAM。用于將已活化CD4+T細(xì)胞與污染性細(xì)胞分開的CRTAM結(jié)合分子可以是特異性結(jié)合在要分離的已活化CD4+細(xì)胞上表達(dá)的CRTAM的任何分子。所述分子可以是例如如本文所述的抗體或其片段。在一個實(shí)施方案中，所述分子是CRTAM阻斷性抗體或CRTAM非阻斷性抗體。在一個實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的分離的已活化CD4+T細(xì)胞群體含有一種或多種如本文中所定義的CRTAM+細(xì)胞。IV.調(diào)控物抗體在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可在本文中用作治療劑和/或診斷劑的CRTAM 調(diào)控物抗體。例示性的抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、多特異性的、和異源偶聯(lián)的抗體。下文列出了抗體的生成、鑒定、表征、修飾和生產(chǎn)方面，而且它們是本領(lǐng)域已經(jīng)建立的技術(shù)，例如記載于美國專利申請公布號2005/0042216，第522-563段、第604-608段和第 617-688 段。⑴抗原制備可溶性抗原或其片段(任選偶聯(lián)有其它分子的)可作為免疫原用于生成抗體。對于跨膜分子，諸如受體，它們的片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原?；蛘撸磉_(dá) 跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。此類細(xì)胞可衍生自天然來源(例如癌細(xì)胞系)，或者可以是經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。對于制備抗體有用的其它抗原及其形式對于本領(lǐng) 域技術(shù)人員會是顯而易見的。(ii)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選在動物中生成，通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞氨基苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12或 RiN = C = NR(其中R和隊是不同的烴基)，將相關(guān)抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，所述免疫原性的蛋白質(zhì)例如匙孔1威血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過將例如100 y g或5 y g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個部位，將動物針對抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。1個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10 的肽或偶聯(lián)物對動物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，采集動物的血液并測定血清的抗體滴度。對動物進(jìn)行加強(qiáng)免疫直到滴度達(dá)到平臺(Plateau)。優(yōu)選的是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(iii)單克隆抗體單克隆抗體可以使用最初由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)記載的雜交瘤方法來生成，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No. 4，816，567)來生成。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠或獼猴，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢栽隗w外免疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press,1986)。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定且高水平的生成抗體、且對培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些自可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)獲得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤和可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection, Rockville, Md. USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也有用于生成人單克隆抗體的記載(Kozbor, J. Immunol.，133 3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, pp. 51—63, Marcel Dekker, Inc., NewYork,1987)?？蓪﹄s交瘤細(xì)胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。在鑒定出生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，所述克隆就可通過有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103, AcademicPress, 1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析，將由亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，就可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。抗體的重組生產(chǎn)在下文中有更詳細(xì)描述。在另一個實(shí)施方案中，可從使用McCafferty等，Nature，348 :552_554 (1990)中記載的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫中分離抗體或抗體片段。Clackson 等，Nature，352 :624_628 (1991)及 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫進(jìn)行的鼠和人抗體的分離。后續(xù)出版物記載了通過鏈改組生成高親和力(nM范圍)的人抗體(Marks等，Bio/Technology 10: 779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略 (Waterhouse 等，Nucl. Acids Res. 21 :2265_2266 (1993))。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。也可以修飾DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替代同源鼠序列 (美國專利 No. 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 6851 (1984))，或通
39過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列共價連接。典型地，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備用于抑制T細(xì)胞活化的針對CRTAM的單克隆抗體的方法。(iv)人源化和人抗體人源化抗體具有一個或多個導(dǎo)入其中的來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變域。人源化可基本上遵循Winter 及其同事的方法進(jìn)行(Jones 等，Nature，321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature，332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534_1536 (1988))，即用嚙齒類 CDR 或 CDR 序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中本質(zhì)上少于整個人可變域用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。用于制備人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性非常重要。依照所謂的“最適”(best-fit)法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變域序列的整個文庫進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類序列最接近的人序列作為人源化抗體的人框架 (FR) (Sims 等，J. Immunol.，151 2296 (1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol.，196 901 (1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285 (1992)； Presta 等，J. Immunol.，151 2623 (1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對靶抗原的親和力提高。通常，CDR殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對抗原結(jié)合的影響?；蛘?，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn) 移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊時生成人抗體。參見例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature，362 :255_258 (1993)； Bruggermann 等，Yearin Immunol.，7 :33 (1993)；及 Duchosal 等，Nature, 355 258 (1992)。還可從噬菌體展示庫衍生人抗體(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227 =381 (1991) ；Marks等， J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991) ；Vaughan 等，Nature Biotech.，14 309 (1996))。下文進(jìn) 一步描述了自抗體噬菌體展示文庫生成人抗體。
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(v)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science，229 :81 (1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可以從上文討論的噬菌體抗體庫分離抗體片段?；?者，可直接從大腸桿菌回收Fab' _SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段(Carter等， Bio/Technology 10 163-167 (1992))。在另一個實(shí)施方案中，如下文實(shí)施例所述，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進(jìn)F(ab' )2分子的裝配來形成F(ab‘ )2。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W0 93/16185。(vi)多特異性抗體多特異性抗體具有對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性，其中所述表位通常來自不同抗原。盡管此類分子通常只結(jié)合兩種不同表位(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表述在用于本文時涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。BsAb的例子包括那些一個臂針對CRTAM而另一個臂針對另一種在免疫復(fù)合物清除中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)，諸如選自CR1、 CR2、CR3、和CR4的巨噬細(xì)胞受體。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn) 基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等， Nature, 305 :537_539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的規(guī)程披露于 W093/08829 及 Traunecker 等，EMB0 J.，10 :3655_3659 (1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體_抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供所期望的最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達(dá)載體。在該方法的一個實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于W094/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Suresh等， Methodsin Enzymology,121 :210(1986)。依照W096/27011中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的至少部分 CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可以將異源偶聯(lián)物中的一種抗體與親合素偶聯(lián)，而將另一種抗體與生物素偶聯(lián)。此類抗體已經(jīng)建議用于例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利No. 4，676，980)和用于治療HIV感染(W0 91/00360,W0 92/200373)。異源偶聯(lián)抗體可以使用任何方便的交聯(lián)方法來制備。合適的交聯(lián)劑連同許多交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，而且披露于美國專利No. 4，676，980。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brerman等，Science，229 81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab' )2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab'片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼?基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成 Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' _TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。也可以從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，而且可以將這些片段化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med.，175 :217_225 (1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol. , 148 (5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，90 6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J. Immunol.，152 =5368(1994)。設(shè)想了具有超過兩種特異性的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol.，147 60(1991)。另外，具有超過一種針對同一抗原的結(jié)合特異性的多價(例如二價)抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(vii)效應(yīng)器功能工程改造可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，從而增強(qiáng)抗體的效力。例如，可向 Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見 Caron 等，J.Exp. Med.，176 1191-1195 (1992)和 Shopes，B.，J. Immunol.， 148 :2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff等， Cancer Research, 53 =2560-2565(1993)中記載的異雙功能交聯(lián)劑來制備?；蛘撸贵w可改造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等， Anti-Cancer Drug Design, 3 :219_230(1989)。(viii)抗體-補(bǔ)救受體結(jié)合表位融合物在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可能希望使用抗體片段，而非完整抗體，來例如提高腫瘤穿透。在這種情況中，可能希望修飾抗體片段以延長其血清半衰期。這可通過例如將補(bǔ) 救受體結(jié)合表位摻入抗體片段中來實(shí)現(xiàn)(例如通過抗體片段中適宜區(qū)域的突變或通過將表位摻入肽標(biāo)簽中然后將該肽標(biāo)簽融合至抗體片段的任一末端或中部，后者通過例如DNA 或肽合成來實(shí)現(xiàn))。補(bǔ)救受體結(jié)合表位優(yōu)選構(gòu)成這樣一個區(qū)域，其中將來自Fc結(jié)構(gòu)域的一個或兩個環(huán)的任何一個或多個氨基酸殘基轉(zhuǎn)移至抗體片段的類似位置。甚至更優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)移來自 Fc結(jié)構(gòu)域的一個或兩個環(huán)的三個或更多殘基。仍更優(yōu)選的是，表位取自Fc區(qū)(例如IgG 的)的CH2結(jié)構(gòu)域并轉(zhuǎn)移至抗體的011、013、或￥11區(qū)，或超過一個此類區(qū)域?；蛘?，表位取自Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域并轉(zhuǎn)移至抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)或二者。(ix)抗體的其它共價修飾抗體的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果適用，它們可通過化學(xué)合成或者通過酶促或化學(xué)切割抗體來生成?？贵w的其它類型共價修飾如下引入分子，即通過使抗體的目標(biāo)氨基酸殘基與能夠與選定側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化試劑起反應(yīng)。共價修飾的例子記載于美國專利No. 5，534，615，明確收入本文作為參考。一類優(yōu)選的抗體共價修飾包括將抗體連接至多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯，以美國專利 No. 4，640,835 ；4，496，689 ；4，301，144 ；4，670，417 ；4，791，192 ；或 4，179，337所列方式。(x)從合成的抗體噬菌體文庫中產(chǎn)生抗體在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用獨(dú)特的噬菌體展示法來產(chǎn)生和挑選新的抗體的方法。該方法包括產(chǎn)生基于單個框架模板的合成抗體噬菌體文庫，設(shè)計可變域內(nèi)的足夠的多樣性，展示具有多樣化可變域的多肽，選擇對靶抗原具有高親和力的候選抗體，和分離所選的抗體。噬菌體展示方法的詳情可在例如2003年12月11日公開的W003/102157中找到，將其完整公開內(nèi)容明確收入本文作為參考。在一個方面，本發(fā)明中所用的抗體文庫可通過在抗體可變域的至少一個⑶R中突變?nèi)軇┛杉暗暮?或高度多變的位置來產(chǎn)生。一些或全部CDR可用本文提供的方法來突變。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選突變⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成單個文庫或突變 ⑶RL3和⑶RH3中的位置以形成單個文庫或突變⑶RL3和⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成單個文庫，由此產(chǎn)生多樣的抗體文庫。例如，可產(chǎn)生這樣的抗體可變域文庫，其在⑶RH1、⑶RH2和/或⑶RH3中溶劑可及的和/或高度多變的位置上有突變。產(chǎn)生的另一種文庫在⑶RL1、⑶RL2和/或⑶RL3中有突變。這些文庫也可互相結(jié)合使用以產(chǎn)生具有期望親和力的結(jié)合物。例如，在一輪或多輪選擇對靶抗原結(jié)合的重鏈文庫后，在其它輪次的選擇中可將輕鏈文庫替換入重鏈結(jié)合物群中以提高結(jié)合物的親和力。文庫優(yōu)選通過用重鏈序列可變區(qū)⑶RH3區(qū)中的變異氨基酸替代原始氨基酸來產(chǎn)生。所得文庫可包含多種抗體序列，其中所述序列多樣性主要位于重鏈序列的CDRH3區(qū)中。在一個方面，所述文庫在人源化抗體4D5序列、或人源化抗體4D5序列的框架氨基酸序列的背景中產(chǎn)生。所述文庫優(yōu)選通過用DVK密碼子集編碼的氨基酸至少替代重鏈殘基95-lOOa來產(chǎn)生，其中DVK密碼子集用于編碼這些位置中每個位置的變異氨基酸集?？?用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)7。在一些實(shí)施方案中，文庫通過用 DVK和NNK兩個密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-lOOa來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK) 6 (NNK)。在另一個實(shí)施方案中，文庫通過用DVK和NNK兩個密碼子集編碼的氨基酸至少替代殘基95-lOOa來產(chǎn)生。可用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)5(NNK)。可用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的另一個例子包括序列(NNK)6。根據(jù)本文所述標(biāo)準(zhǔn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適寡核苷酸序列的其它例子。在另一個實(shí)施方案中，利用不同的CDRH3設(shè)計來分離高親和力結(jié)合物和分離針對各種表位的結(jié)合物。該文庫中產(chǎn)生的CDRH3的長度范圍是11至13個氨基酸，盡管也可產(chǎn) 生不同于此的長度。通過用NNK、DVK和NVK密碼子集也可拓展H3多樣性，以及在N和/或 C-末端處的較有限的多樣性。⑶RH1和⑶RH2中也可產(chǎn)生多樣性。⑶R-H1和H2多樣性的設(shè)計遵循目標(biāo)為模擬所述帶有如下修飾的天然抗體全集的策略，所述修飾使多樣性較前述設(shè)計更緊密地與天然多樣性相匹配。對于CDRH3中的多樣性，可分開構(gòu)建多個文庫，它們具有不同長度的H3，然后組合起來以選擇針對靶抗原的結(jié)合物。可合并多個文庫并用前述和本文下述的固體支持物選擇和溶液分選法來選擇?？刹捎枚喾N選擇策略。例如，一種變化涉及在結(jié)合至固相的靶物上選擇，然后分選可能在融合多肽上存在的標(biāo)簽(例如抗gD標(biāo)簽)，然后再一次在結(jié)合至固相的靶物上分選。或者，文庫可首先在結(jié)合至固體表面的靶物上選擇，然后用靶抗原濃度逐漸減低的溶液相結(jié)合來分選所洗脫的結(jié)合物。利用不同分選方法的組合來最低限度地只選擇高度表達(dá)的序列并選擇許多不同的高親和力克隆。針對靶抗原的高親和力結(jié)合物可由文庫分離。H1/H2區(qū)中的有限多樣性可降低簡并性約104至105倍并允許為更多高親和力結(jié)合物提供更大的H3多樣性。利用在CDRH3中具有不同類型多樣性的文庫(例如利用DVK或NVT)可分離能與靶抗原的不同表位結(jié)合的結(jié)合物。對于如上所述合并的文庫中分離的結(jié)合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)親和力可通過提供輕鏈中的有限多樣性來進(jìn)一步提高。在該實(shí)施方案中，輕鏈多樣性如下產(chǎn)生，在CDRL1中氨基酸第 28位由RDT編碼；氨基酸第29位由RKT編碼；氨基酸第30位由RVW編碼；氨基酸第31位由ANW編碼；氨基酸第32位由THT編碼；任選的，氨基酸第33位由CTG編碼；在CDRL2中氨基酸第50位由KBG編碼；氨基酸第53位由AVC編碼；任選的，氨基酸第55位由GMA編碼；在CDRL3中氨基酸第91位由TMT或SRT或這兩者編碼；氨基酸第92位由DMC編碼；氨基酸第93位由RVT編碼；氨基酸第94位由NHT編碼；和氨基酸第96位由TWT或YKG或這兩者編碼。在另一個實(shí)施方案中，產(chǎn)生在⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3區(qū)中具有多樣性的一個或多個文庫。在該實(shí)施方案中，用各種長度的H3區(qū)并主要用密碼子集XYZ和NNK或NNS來產(chǎn)生 CDRH3中的多樣性?？捎酶鞴押塑账嵝纬晌膸觳⒑喜ⅲ蛘呖珊喜⒐押塑账醽硇纬晌膸熳蛹?。該實(shí)施方案的文庫可針對結(jié)合至固體的靶物進(jìn)行分選。分離自多次分選的克隆可利用 ELISA測定法來篩選特異性和親和力。對于特異性，克隆可以針對期望靶抗原以及其它非靶抗原進(jìn)行篩選。然后，在溶液結(jié)合競爭ELISA測定法或點(diǎn)競爭測定法中對那些針對靶抗原的結(jié)合物篩選親和力?？梢杂萌缟纤鲋苽涞腦YZ密碼子集由文庫分離高親和力結(jié)合物。可方便地在細(xì)胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率將這些結(jié)合物制備成抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，可能希望產(chǎn)生在⑶RH3區(qū)長度方面具有更大多樣性的文庫。例如，可能希望產(chǎn)生⑶RH3區(qū)的長度范圍為約7至19個氨基酸的文庫。由這些實(shí)施方案中的文庫分離的高親和力結(jié)合物可方便地在細(xì)菌和真核細(xì)胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率產(chǎn)生?？稍O(shè)計載體以方便地去除如下序列諸如gD標(biāo)簽、病毒外殼蛋白成分序列，和/或增加恒定區(qū)序列來高產(chǎn)率地產(chǎn)生全長抗體或抗原結(jié)合片段。可以將⑶RH3中有突變的文庫與包含不同型式的其它⑶R(例如⑶RL1、⑶RL2、 ⑶RL3、⑶RH1和/或⑶RH2)的文庫組合。因此，例如，在一個實(shí)施方案中，將⑶RH3文庫與 ⑶RL3文庫組合，所述⑶RL3文庫用預(yù)先確定的密碼子集在第28、29、30、31、和/或32位有變異氨基酸的人源化4D5抗體序列的背景中產(chǎn)生。在另一個實(shí)施方案中，可將CDRH3有突變的文庫與包含變異CDRH1和/或CDRH2重鏈可變域的文庫組合。在一個實(shí)施方案中，所述 ⑶RH1文庫用第28、30、31、32和33位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生。⑶RH2文庫可用預(yù)先確定的密碼子集用第50、52、53、54、56和58位有變異氨基酸的人源化抗體4D5 序列產(chǎn)生。(xi)抗體突變體可進(jìn)一步修飾噬菌體文庫產(chǎn)生的新抗體以產(chǎn)生抗體突變體，所述抗體突變體具有比親本抗體改善了的物理、化學(xué)和/或生物學(xué)性質(zhì)。當(dāng)所用的測定法是生物學(xué)活性測定法時，優(yōu)選抗體突變體在所選測定法中的生物學(xué)活性比親本抗體在該測定法中的生物學(xué)活性好至少約10倍，優(yōu)選好至少約20倍，更優(yōu)選好至少約50倍，有時好至少約100倍或200倍。例如，優(yōu)選抗CRTAM抗體突變體針對CRTAM的結(jié)合親和力比親本抗體的結(jié)合親和力強(qiáng)至少約10倍，優(yōu)選強(qiáng)至少約20倍，更優(yōu)選強(qiáng)至少約50倍，有時強(qiáng)至少約100倍或200倍。為了產(chǎn)生抗體突變體，將一處或多處氨基酸改變(例如替代)導(dǎo)入親本抗體的一個或多個高變區(qū)?；蛘?另外，可將框架區(qū)殘基的一處或多處改變(例如替代)導(dǎo)入親本抗體，這些改變導(dǎo)致抗體突變體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所改善。要修飾的框架區(qū)殘基的實(shí)例包括那些直接非共價結(jié)合抗原的(Amit等(1986)Science 233 747-753)；相互作用于 / 影響 CDR 構(gòu)象的(Chothia 等(1987) J. Mol. Biol. 196 901-917)；和/或參與VfVH界面的(EP 239 400B1)殘基。在某些實(shí)施方案中，一個或多個這類框架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所增強(qiáng)。例如，在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，可改變約1個至約5個框架殘基。有時，這可足以產(chǎn) 生適用于臨床前試驗中的抗體突變體，甚至其中沒有高變區(qū)殘基被改變?？墒峭ǔ＃贵w突變體將包含別的高變區(qū)改變。改變的高變區(qū)殘基可以是隨機(jī)改變的，尤其是在其中親本抗體的起始結(jié)合親和力使得這類隨機(jī)產(chǎn)生的抗體突變體可方便地被篩選出來?？捎糜谏纱祟惪贵w突變體的一種方法稱作“丙氨酸掃描誘變”(Cunningham和 Wells (1989) Science 244 1081-1085)。這里，一個或多個高變區(qū)殘基用丙氨酸或多丙氨酸殘基替代，以影響氨基酸與來自第二哺乳動物物種的抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ?代位點(diǎn)引入更多或其它突變，推敲那些對替代展現(xiàn)出功能敏感性的高變區(qū)殘基。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。如本文所述對如此生成的丙氨酸突變體篩選它們的生物學(xué)活性。通常，從保守替代諸如下文顯示在標(biāo)題“優(yōu)選替代”下的那些開始。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)的改變，那么引入下表中稱為“例示替代”的更實(shí)質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。例示/優(yōu)選替代對抗體生物學(xué)特性的甚至更實(shí)質(zhì)性修飾通過選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的替代來完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積?；诠餐膫?cè)鏈特性，將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile ；(2)中性、親水性的cys、ser、thr、asn、gin ；(3)酸性的asp、glu ；(4)堿性的his、lys、arg ；(5)影響鏈取向的殘基gly、pro ’及(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守替代將需要用這些類別之一的一個成員替換另一個類別的。在另一個實(shí)施方案中，利用噬菌體展示(見上)，對為修飾而選擇的位點(diǎn)進(jìn)行親和力成熟。編碼氨基酸序列突變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于，寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變、和盒式誘變早先制備的突變或非突變型式的親本抗體。制備突變體的優(yōu)選方法是定點(diǎn)誘變(參見例如Kimkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488)。在某些實(shí)施方案中，抗體突變體僅有單個高變區(qū)殘基被替代。在其它實(shí)施方案中，有親本抗體的兩個或更多個高變區(qū)殘基被替代，例如約2個至約10個高變區(qū)替代。通常，生物學(xué)特性得到改善的抗體突變體所具有的氨基酸序列與親本抗體重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列有至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少 90%，和最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對序列并在必要時引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與親本抗體殘基相同(即相同殘基)或相似(即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來自同一組的氨基酸殘基，見上文)的氨基酸殘基的百分比。N-末端、C-末端、或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入可變域以外的抗體序列都不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性。產(chǎn)生抗體突變體后，測定該分子相對于親本抗體的生物學(xué)活性。如上所示，這可包括測定抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)活性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，制備一組抗體突變體并篩選針對抗原或其片段的結(jié)合親和力。任選將該初始篩選中選出的一個或多個抗體突變體進(jìn)行一種或多種其它生物學(xué)活性測定法以確證結(jié)合親和力增強(qiáng)的抗體突變體是真正有用的，例如可用于臨床前研究。這樣選出的抗體突變體可進(jìn)一步修飾，修飾時常取決于抗體的預(yù)期用途。此類修飾可包括進(jìn)一步改變氨基酸序列，融合異源多肽和/或共價修飾，諸如下文所詳述的那些。對于氨基酸序列改變，示例性的修飾上文有詳述。例如，也可替代任何不涉及保持抗體突變體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基，一般替代為絲氨酸，用以改善分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反地，可向抗體中加入半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是在抗體是抗體片段，諸如Fv片段時)。另一類氨基酸突變體具有改變的糖基化模式。這可通過刪除抗體中發(fā)現(xiàn)的一個或多個碳水化合物模塊和/或增加不存在于抗體中的一個或多個糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。抗體糖基化通常是N-連接的或0-連接的。N-連接的指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，多肽中存在這些三肽序列之任一產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。0-連接的糖基化指糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附著于羥基氨基酸(最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸)。在抗體上增加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列使之包含一個或多個上述的三肽序列來方便地實(shí)現(xiàn)(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。也可在原始抗體序列中通過添加、或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來產(chǎn)生改變(用于0-連接的糖基化位點(diǎn))。(xii)抗體的重組生產(chǎn)為了重組生產(chǎn)抗體，分離編碼抗體的核酸，并插入可復(fù)制載體中，用于進(jìn)一步克隆 (DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？梢垣@得許多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列(例如如美國專利No. 5，534，615中所記載的，明確收入本文作為參考)。適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E. coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公布的 DD 266，710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌 (P. aeruginosa)、和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌 294仏了031，446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌8、大腸桿菌乂1776仏10 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是編碼抗體的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒糖酵母或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌株且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K. lactis)、脆壁克魯維酵母 (K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克魯維酵母 (K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K. marxianus)；亞羅酵母屬(Yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183, 070)；假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；禾口絲狀真菌，諸如例如脈抱菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu) 巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。適于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無脊椎動物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的允許昆蟲宿主細(xì)胞，它們來自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L_1變體和家蠶(Bombyx mori)NPV的Bm_5株，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。然而，脊椎動物細(xì)胞得到最多關(guān)注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動物細(xì)胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系 (C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(293或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細(xì)胞， Graham 等，J. Gen Virol. ,36 59(1977))；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK, ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CH0，Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216(1980))；小鼠塞托利 (sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather, Biol. R印rod. ,23 :243_251 (1980))；猴腎細(xì)胞(CV1, ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76, ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK, ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(ff 138, ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51) ；TRI 細(xì)胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci.，383 44-68 (1982) ；MRC5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞；和人肝瘤系(Hep G2)。用上文所述用于生產(chǎn)抗體的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如 Ham 氏 F10 (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基:Ham等，Meth. Enz. 58 44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 255(1980)；美國專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；W0 87/00195 ；或美國專利復(fù)審30，985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù) 需要補(bǔ)充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如 GENTAMYCIN )、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的適宜濃度包含任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng) 條件，諸如溫度、PH等，就是先前為表達(dá)而選擇用于宿主細(xì)胞的，這對于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。在使用重組技術(shù)時，可以在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng) 基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過例如離心或超濾除去宿主細(xì)胞或裂解細(xì)胞的微粒碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮來自此類表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來污染物的生長。可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化由細(xì)胞制備的抗體組合物，優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人Yl、Y2或重鏈的抗體(Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62 1-13 (1983)) 蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人Y3(Guss等，EMBO J.5 :1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯) 苯容許獲得比瓊脂糖所能獲得的更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含Ch3結(jié)構(gòu)域，則可使用Bakerbond ABX 樹脂(J. T. Baker，Phi 11 ipsburg，NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAR0SE 上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。(xiii)抗體偶聯(lián)物在另一個方面，本發(fā)明涉及包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的抗體偶聯(lián)物或免疫偶聯(lián) 物，所述胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富疃舅?及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、a-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹 (dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌毒素 (tricothecenes)。有多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括212Bi、mI、mIn、 90Y 和 186Re。使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如3_(2_吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞氨基酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞胺二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2， 4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見W094/11026。本領(lǐng) 域技術(shù)人員會領(lǐng)會別的適合于本發(fā)明偶聯(lián)物的偶聯(lián)劑。在另一個實(shí)施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)，用于組織的預(yù) 定位，其中對患者施用抗體_受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與胞毒劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(例如親合素)。CRTAMV. CRTAM調(diào)控物多肽—方面，本發(fā)明的CRTAM調(diào)控物包括多肽。在一個實(shí)施方案中，調(diào)控物多肽拮抗已活化T細(xì)胞中的CRTAM活性。在一個實(shí)施方案中，調(diào)控物多肽拮抗已活化T細(xì)胞中的 Scrib活性。在一個實(shí)施方案中，所述多肽結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合CRTAM或與CRTAM相互作用的胞內(nèi)分子，使得與CRTAM-Scrib相互作用有關(guān)的生物學(xué)活性得到抑制。在一個實(shí)施方案中，調(diào)控物多肽激動已活化T細(xì)胞中的CRTAM活性。在一個實(shí)施方案中，所述多肽結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合CRTAM，使得與CRTAM有關(guān)的生物學(xué)活性得到模擬或增強(qiáng)。在一個實(shí)施方案中，所述多肽結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合與CRTAM相互作用的胞外分子，使得與CRTAM-胞外分子有關(guān)的生物學(xué)活性得到模擬或增強(qiáng)。多肽可以使用已知的肽合成方法學(xué)化學(xué)合成，或者可以使用重組技術(shù)制備和純化。在一個實(shí)施方案中，CRTAM調(diào)控物多肽的長度是至少約 5 個氨基酸，或者長度為至少約 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99或100個氨基酸或更長，其中此類多肽能夠調(diào)控CRTAM活性。這些多肽無需過多試驗就可使用公知技術(shù)來鑒定。在這點(diǎn)上，注意到用于對寡肽文庫篩選能夠特異性結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見例如美國專利號5，556，762，5，750，373，4，708，871， 4，833，092，5，223，409，5，403，484，5，571，689，5，663，143 ;PCT 公布號 TO 84/03506 和 W0 84/03564 ；Geysen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 =3998-4002 (1984) ；Geysen 等， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 178-182 (1985) ；Geysen in Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986) ；Geysen 等，J. Immunol. Meth. 102 :259_274 (1987) ；Schoofs 等， J. Immunol. 140 611-616 (1988) ；Cwirla, S. E.等，(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378 ；Lowman, H. B.等，(1991)Biochemistry 30 10832 ；Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ；Marks, J. D.等，(1991), J. Mol. Biol. 222 581 ；Kang，A. S.等，(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 8363 ；Smith, G. P. ， (1991)Current Opin. Biotechnol. 2 668)。在這點(diǎn)上，噬菌體展示是一種可以篩選大型寡肽文庫來鑒定那些文庫中能夠特異性結(jié)合多肽靶物的成員的公知技術(shù)。噬菌體展示是將變體多肽作為與外殼蛋白的融合蛋白展示在噬菌體顆粒表面的一種技術(shù)(Scott, J. K. andSmith, G. P. (1990) Science 249 386)。噬菌體展示的效用在于，可以對選擇性隨機(jī)化蛋白質(zhì)變體(或隨機(jī)克隆cDNA)的大型文庫迅速且有效的分選那些以高親和力結(jié)合靶分子的序列。在噬菌體上展示肽(Cwirla， S.E.等，(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378)或蛋白質(zhì)(Lowman, H. B.等，(1991) Biochemistry 30 10832 ；Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ；Marks, J. D.等， (1991) J. Mol. Biol. 222 581 ；Kang, A. S.等，(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 8363) 文庫已經(jīng)用于對數(shù)百萬多肽或寡肽篩選具有特異結(jié)合特性的那些(Smith，G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol. 2 668)。分選隨機(jī)突變體的噬菌體文庫需要構(gòu)建和擴(kuò)增大量變體的策略，使用靶受體進(jìn)行親和純化的流程，及評估結(jié)合富集的結(jié)果的手段。參見美國專利 5，223，409，5，403，484，5，571，689 和 5，663，143。盡管大多數(shù)噬菌體展示方法已經(jīng)使用絲狀噬菌體，入類(lambdoid)噬菌體展示系統(tǒng)(TO 95/34683 ；US 5，627，024)、T4 噬菌體展示系統(tǒng)(Ren 等，Gene, 215 439(1998)； Zhu 等，Cancer Research, 58 (15) :3209_3214 (1998) Jiang 等，Infection & Immunity, 65(11) 4770-4777(1997) ； Ren 等，Gene, 195(2) :303_311 (1997) ； Ren, Protein Sci.，5 1833(1996) ；Efimov 等，Virus Genes，10 173 (1995))和 T7 噬菌體展示系統(tǒng)(Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217 228-257 (1993) ；U. S. 5, 766, 905)也是已知的?，F(xiàn)在已經(jīng)對基礎(chǔ)噬菌體展示概念開發(fā)了很多其它改進(jìn)和變異。這些改進(jìn)增強(qiáng)了展示系統(tǒng)對肽文庫篩選與選定靶分子的結(jié)合及展示功能性蛋白質(zhì)的能力，所述功能性蛋白質(zhì) 具有對這些蛋白質(zhì)篩選期望特性的潛力。已經(jīng)開發(fā)了用于噬菌體展示反應(yīng)的組合反應(yīng)裝置(W0 98/14277)，而且噬菌體展示文庫已經(jīng)用于分析和控制生物分子相互作用(W0 98/20169 ；W098/20159)和受約束螺旋肽的特性(W0 98/20036)。W0 97/35196描述了分離親和配體的方法，其中使噬菌體展示文庫接觸第一種溶液和第二種溶液以選擇性分離結(jié)合的配體，在第一種溶液中配體將結(jié)合靶分子，而在第二種溶液中親和配體將不會結(jié)合靶分子。W0 97/46251描述了這樣一種方法，即用親和純化的抗體生物淘選隨機(jī)噬菌體展示庫，然后分離結(jié)合的噬菌體，隨后使用微量板的孔進(jìn)行淘選過程以分離高親和力結(jié)合的噬菌體。已經(jīng)報道了金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白 A 作為親和標(biāo)簽的使用(Li 等，(1998)Mol. Biotech. 9 187)。W0 97/47314描述了底物扣除文庫用于區(qū)別酶特異性的用途，其中使用可以是噬菌體展示庫的組合文庫。W0 97/09446描述了使用噬菌體展示選擇適用于洗滌劑的酶的方法。美國專利5，498，538，5，432，018和W0 98/15833中描述了選擇特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的其它方法。產(chǎn)生肽文庫和篩選這些文庫的方法還公開于美國專利5，723，286,5, 432，018， 5，580，717，5，427，908，5，498，530，5，770，434，5，734，018，5，698，426，5，763，192，和 5，723，323。用于生成、鑒定、表征、修飾和生產(chǎn)調(diào)控物多肽的方法是本領(lǐng)域已經(jīng)建立的，例如記載于美國專利申請公布號2005/0042216第606-608段和第614-688段。VI. CRTAM調(diào)控物小分子在一個實(shí)施方案中，CRTAM調(diào)控物小分子指本文所定義的寡肽或抗體以外，調(diào) 控CRTAM活性的有機(jī)分子。CRTAM調(diào)控物小分子可以使用已知方法學(xué)來鑒定和化學(xué)合成 (參見例如PCT
發(fā)明者葉江華, 安德魯·陳申請人:健泰科生物技術(shù)公司

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