專利名稱：細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的新用途，特別是哺乳動物包括人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生中的新用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1(Cyclin B1；CCNB1)有稱之為G2/mitotic specific cyclin B1 CCNB。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在裂殖酵母有三種B型周期蛋白。其中之一是Cdc13，這是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂所必需的。Booher，Beach初次報道本發(fā)明所述的基因序列[Booher，Beach(1988)EMBO J 72321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91587]。其他兩個名為Cig1[Bueno et al.(1991)Cell 65149]和Cig2[Bueno，Russell(1993)Mol Cell Biol 132286；Connolly，Beach(1994)Mol CellBiol 14768]，)它們并非有絲分裂周期所必需的。Gautier等證明，與Cdc2結(jié)合成復(fù)合物的周期蛋白B是非洲爪蟾MPF的主要成分[Gautier et al.(1990)Cell 60487]。
Pines和Hunter克隆到編碼周期蛋白B的人類基因[Pines，Hunter(1989)Cell 58833]，他們與Giordano等一道[Giordano et al.(1989)Cell 58981]也證明人周期蛋白B和Cdc2之間所形成的復(fù)合物在有絲分裂期間作為激酶其活性最高。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在細(xì)胞周期的調(diào)控中，有三類分子起著重要作用，分別為細(xì)胞周期素(Cyclins)、細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制子(CKIs)。其中Cyclins和CDKs對細(xì)胞周期起正性調(diào)控作用，CKIs起負(fù)性調(diào)控作用。當(dāng)受到生長信號的刺激時，Cyclins表達(dá)上調(diào)，激活相應(yīng)CDKs，形成Cyclins/CDKs復(fù)合物，使多種底物蛋白磷酸化，從而推動細(xì)胞沿細(xì)胞周期不斷分裂增殖。CKIs可以與Cyclins、CDKs或兩者的復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而起到負(fù)性調(diào)控的作用。
目前已經(jīng)確定的Cyclins共有11種，其中Cyclins D和Cyclins E主要調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換，Cyclins A主要調(diào)控S期的進(jìn)展，而Cyclins B主要與G2/M期轉(zhuǎn)換有關(guān)。
細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1是Cyclin B家族的成員之一[Brandeis M，Rosewell I，Carrington M，Crompton T，Jacobs MA，Kirk J，Gannon J，Hunt T.CyclinB2-null mice develop normally and are fertile whereas cyclin B 1-null mice die in utero.Proc.Nat.Acad.Sci.954344-4349，1998]。其基因由九個外顯子和八個內(nèi)含子組成?；虻谋磉_(dá)從S期后期開始，G2期達(dá)到最高峰，進(jìn)入M期后其蛋白產(chǎn)物降解失活。在Cyclin B1的誘導(dǎo)下，CDC2(又稱CDK1、P34)的激活酶CAK(主要由CDK7和Cyclin H組成)將其磷酸化，緊接著在有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的Weel/Mik1作用下，它又被再次磷酸化而失活。在G2/M期過渡時，磷酸化酶CDC25C解除這一使CDK1失活的磷酸化，使之具有蛋白激酶活性，因此，Cyclin B1/CDC2被認(rèn)為是有活性的成熟促進(jìn)因子(MPF，也稱M期促進(jìn)因子)。反過來，激活的CyclinB1/CDC2又能磷酸化CDC25C來促進(jìn)Cyclin B1/CDK1的磷酸化，如此形成了一個正反饋環(huán)路[Poon RY，Chau MS，Yamashita K，Hunter T.The role of Cdc2feedback loop control in the DNA damage checkpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)5168-78.]。CDC25C的活化需要PLK激酶的參與，有證據(jù)表明，CDC2本身就能激活PLK的活性，這又構(gòu)成了另一條正反饋途徑。在這些正反饋途徑的綜合作用下，MPF在激酶活性上完成瞬間的爆發(fā)式增加[Roshak AK，Capper EA，Imburgia C，F(xiàn)ornwald J，Scott G Marshall LA.The human polo-like kinase，PLK.regulates cdc2/cyclin B through phosphorylation and activation of the cdc25Cphosphatase.Cell Signal.2000 Jun；12(6)405-11.；Yoshima-Morimoto F，Taniguchi E，Shinya N，Iwamatsu A，Nishida E.Polo-like kinase 1phosphorylates cyclin B1 andtargets it to the nucleus during prophase.Nature.2001 Mar 8；410(6825)215-20.Erratum inNature 2001 Apr 12；410(6830)847.；Yuan J，Eckerdt F，Bereiter-Hahn J，Kurunci-Csacsko E，Kaufmann M，Strebhardt K.Cooperative phosphorylationincluding the activity of polo-like kinase 1 regulates the subcellular localization ofcyclin B1.Oncogene.2002 Nov 28；21(54)8282-92.]。Cyclin B1/CDC2復(fù)合物從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，使相應(yīng)的底物磷酸化，推動G2/M期轉(zhuǎn)換。
Hunter等人認(rèn)為，在惡性細(xì)胞進(jìn)入S期和G2期時，Cyclin B1過表達(dá)并積累，與CDC2形成過多的成熟促進(jìn)因子，在活性和功能異常的Weel/Mik1、CAK的作用下形成不成熟激活的Cyclin B1/CDC2/CDC25C正反饋環(huán)，激活腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的成熟促進(jìn)因子，其高水平表達(dá)觸發(fā)并通過惡性細(xì)胞有缺陷的G2/M期監(jiān)測點(diǎn)而引發(fā)核內(nèi)重要蛋白結(jié)構(gòu)的改變，推動細(xì)胞進(jìn)入M期[Poon RY，Chau MS，Yamashita K.Hunter T.The role of Cdc2 feedback loop control in the DNA damagecheckpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)5168-78.；WatanabeN，Broome M，Hunter T.Regulation of the human WEE 1Hu CDK tyrosine 15-kinaseduring the cell cycle.EMBO J.1995 May 1；14(9)1878-91.]。
Cyclin B1蛋白也是一種公知的蛋白序列[參見Booher，Beach(1988)EMBO J72321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91587]，在腦膠質(zhì)瘤、喉鱗癌、舌鱗癌、血管瘤、小細(xì)胞肺癌、滋養(yǎng)細(xì)胞疾病、乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、非何杰金淋巴瘤、直腸癌以及肝癌等腫瘤中均有過表達(dá)。[Holtkamp N，Afanasieva A，Elstner A，Brain slice invasion model reveals genes differentially regulated in glioma invasion.Biochem Biophys Res Commun.2005 Nov 4；336(4)1227-33.；Bondi J，Husdal A，Bukholm G，Expression and gene amplification of primary(A，B1，D1，D3，and E)andsecondary(C and H)cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patientoutcome.J Clin Pathol.2005 May；58(5)509-14.；Mao Y，Wu J，Skog S，Expressionof cell proliferating genes in patients with non-small cell lung cancer byimmunohistochemistry and cDNA profiling.Oncol Rep.2005 May；13(5)837-46.；Bjorck E，Ek S，Landgren O，High expression of cyclin B1 predicts a favorable outcomein patients with follicular lymphoma.Blood.2005 Apr 1；105(7)2908-15.Epub 2004Dec 2.]?，F(xiàn)有技術(shù)中未見報道哺乳動物包括人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在促進(jìn)人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在制備抗促進(jìn)人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的用途，換言之，本發(fā)明涉及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，在人類食管癌中不僅存在Cyclin B1的過表達(dá)，并且CyclinB1的過表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，特別是高表達(dá)的Cyclin B1會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性度增加并且增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。尤其是高表達(dá)的CyclinB1導(dǎo)致特異性食管癌肺轉(zhuǎn)移的幾率增加。


圖1是食管癌Cyclin B1蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果，其中，采用免疫組織化學(xué)的方法，使用DAB染色檢測食管癌組織(圖A)與正常癌旁組織(圖B)中Cyclin B1的表達(dá)情況，圖中棕色為陽性(如果使用黑白件，棕色部分呈深色)。
圖2是Western blot檢測12株食管癌細(xì)胞Cyclin B1蛋白的表達(dá)圖，其中現(xiàn)有技術(shù)的方法提取KYSE2，KYSE30，KYSE140，KYSE150，KYSE180，KYSE410，KYSE450，KYSE510，COLO-680，EC9706，T12，KYSE70等12株食管癌細(xì)胞的總蛋白，采用Western blot方法檢測Cyclin B1蛋白的表達(dá)水平，圖中條帶深淺代表蛋白表達(dá)水平的高低。KYSE150作為Cyclin B1低表達(dá)的研究對象。
圖3是單克隆的篩選與鑒定(Western Blot)圖，其中提取不同單克隆細(xì)胞的總蛋白，采用Western blot方法檢測Cyclin B1蛋白的表達(dá)水平，圖中條帶深淺代表蛋白表達(dá)水平的高低。挑選編號為65、72的單克隆細(xì)胞作為高表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞。
圖4是免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測克隆Cyclin B1表達(dá)情況說明圖，其中采用免疫熒光(圖a，b，c)、免疫化學(xué)(圖d，e，f)檢測高表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞之間Cyclin B1表達(dá)的差異。圖a，b，c中蘭色為DAPI染色，紅色為TRITC染色，紅色的多寡代表Cyclin B1表達(dá)的高低。圖d，e，f中蘭色為蘇木素染色，棕色為DAB染色，棕色的多寡代表Cyclin B1表達(dá)的高低。
圖5是高表達(dá)Cyclin B1的穩(wěn)定細(xì)胞株細(xì)胞生長曲線圖，其中消化細(xì)胞后，進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后接種在六孔板中，每孔30000個細(xì)胞。每隔24小時取出一板，消化細(xì)胞后，再分別計(jì)數(shù)。最后計(jì)算均值，繪制曲線。
圖6是體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
圖7是裸鼠腫瘤體積曲線，其中于BALB/C裸鼠右側(cè)背部(近尾側(cè))接種人類食管癌細(xì)胞，200萬細(xì)胞/只，每7天觀察一次，測量腫瘤大小，依據(jù)公式v＝4/3πr12r2(r1為短徑，r2為長徑)，計(jì)算腫瘤大小，繪制曲線。
圖8是取接種人類食管癌細(xì)胞的裸鼠，28天處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。
圖9是接種人類食管癌細(xì)胞的28天取裸鼠的腫瘤，作病理H&E染色圖。
圖10是取接種人類食管癌細(xì)胞的裸鼠，70天處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移的情況。
圖11表示取接種人類食管癌細(xì)胞的裸鼠70天處死后的腫瘤，作病理H&E染色的圖片(腫瘤組織，上皮來源)，顯示高表達(dá)CyclinB1單克隆致腫瘤侵犯肌層。
圖12是取接種人類食管癌細(xì)胞的裸鼠連續(xù)觀察3個月，之后處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移的情況。
圖13是取接種人類食管癌細(xì)胞的裸鼠連續(xù)觀察3個月，之后處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，作病理H&E染色，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。高表達(dá)Cyclin B1單克隆致裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移。
圖14是注連續(xù)觀察3個月，之后處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，作病理H&E染色，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。高表達(dá)Cyclin B1單克隆致裸鼠腫瘤侵犯骨和橫紋肌。
具體實(shí)施例方式
以下將結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的效果。下述的實(shí)施例僅僅是說明目的，而無限定之意。
實(shí)施例1采用免疫組織化學(xué)的方法分別比較205例配對食管癌癌組織和癌旁組織的Cyclin B1蛋白表達(dá)水平的差異，分析Cyclin B1蛋白表達(dá)水平與臨床預(yù)后、病理分級、腫瘤分化之間的相關(guān)性。其試驗(yàn)結(jié)果見圖1，試驗(yàn)中表明，CycinB1蛋白主要表達(dá)在胞漿(部分可見合并核陽性。試驗(yàn)中采用的評分標(biāo)準(zhǔn)如下陽性強(qiáng)度評分

陽性細(xì)胞比例評分

兩者的乘積8.1～12分強(qiáng)陽性(++)4.1～8分弱陽性(+)0～4分陰性(一)。(重復(fù)取材的相同病例相同階段病變按平均值計(jì))作為最后結(jié)果。
試驗(yàn)中還采用了205例正常對照的人食管粘膜，187例取到食管正常上皮(其余取到的為間質(zhì)或組織脫片而造成信息損失。正常鱗狀上皮陰性(-)129者例，弱陽性(+)42例，強(qiáng)陽性(++)161例。
對于食管浸潤癌組織的獲得是205例病例中9例未取到浸潤癌或組織脫片造成信息損失，196例有信息(informative)41例(一)，72例+，83例++。因此，試驗(yàn)中，癌旁的癌前病變64例-，77例+，8例++原位癌67例22例-，43例+，2例++重度不典型增生48 22例-，20例+，6例++中度不典型增生19 7例-，12例+輕度不典型增生15 13例-，2例+經(jīng)過采用SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果，表明ESCC的表達(dá)較正常鱗狀上皮明顯上調(diào)(X2＝98.634，p＜0.001)。在癌中的表達(dá)與分化程度有關(guān)(X2＝9.599，p＝0.048)。中、低分化者比高分化者有較高表達(dá)(高分化陰性16例，弱陽性18例，強(qiáng)陽性13例，陽性率31/47＝65.95％，中分化陰性14例，弱陽性32例，強(qiáng)陽性47例，陽性率79/93＝84.95％，低分化陰性11例，弱陽性22例，強(qiáng)陽性23例，陽性率45/56＝80.36％。
試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)Cyclin B1蛋白表達(dá)水平與性別無關(guān)(X2＝3.735，p＝0.154)，與年齡(小于等于50歲和大于50歲組)無關(guān)(X2＝0.753，p＝0.686)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(X2＝4.234，p＝0.120)，與腫瘤深度無關(guān)(X2＝11.324，p＝0.079)，與TNM分期無關(guān)(X2＝11.880，p＝0.157)。
在癌前病變中表達(dá)較正常鱗狀上皮明顯上調(diào)(X2＝30.950，p＜0.001)，比浸潤癌的表達(dá)低(X2＝61.762，p＜0.001)。
實(shí)施例2發(fā)明人利用現(xiàn)有技術(shù)的方法，例如Western blot檢測KYSE2，KYSE30，KYSE140，KYSE150，KYSE180，KYSE410，KYSE450，KYSE510，COLO-680，EC9706，T12，KYSE70等12種市售的食管癌細(xì)胞系，篩選出Cyclin B1蛋白低表達(dá)的KYSE150細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1 Cyclin B1質(zhì)粒(參照LipofectamineTM2000說明)，通過細(xì)胞免疫熒光(UltraSensitive S-P試劑盒說明書進(jìn)行操作)、RT-PCR、Western blot檢測手段挑選Cyclin B1蛋白高表達(dá)的單克隆，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。再采用生長曲線、Transwell等細(xì)胞生物學(xué)方法觀察高表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照在細(xì)胞生物學(xué)方面的差異。
RT-PCR所采用的引物Cyclin B1上游5-TCC AAG CCC AAT GGA AAC AT-3下游5-ATG CTC TCC GAA GGA AGT GC-3產(chǎn)物大小551kbpGAPDH上游5-GCT GAG AAC GGG AAG CTT GT-3下游5-GCC AGG GGT GCT AAG CAG TT-3產(chǎn)物大小299kbpWestern Blot采用的抗體

生長曲線的繪制
(1).消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種在六孔板中，每孔30000個。
(2).每隔24小時取出一板，消化細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)。
(3).七天后統(tǒng)計(jì)數(shù)值，繪制生長曲線。
體外侵襲實(shí)驗(yàn)(Trans-well)使用Chemotaxis Chamber(Neuro Probe，USA)檢測細(xì)胞的侵襲能力。在上層小室的50μl培養(yǎng)基中包含1×104個細(xì)胞，下層小室的30μl基質(zhì)中含有5μg/mlfibronectin(Sigma，USA)。帶有8μm小孔的聚碳酸脂膜置于兩層小室之間，37℃5％CO2的孵箱孵育6小時。小心刮下沒有遷移的上層細(xì)胞后，聚碳酸脂膜在甲醇中固定10分鐘，Giemsa染色1小時。顯微鏡下觀察，照相計(jì)數(shù)。隨機(jī)取10個視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)數(shù)值，繪制柱形圖。
試驗(yàn)結(jié)果在上述12種食管癌細(xì)胞系中，KYSE150細(xì)胞系Cyclin B1的蛋白表達(dá)量低(見圖2)。通過轉(zhuǎn)染KYSE150細(xì)胞系，并利用細(xì)胞免疫熒光、Western blot檢測方法獲得穩(wěn)定高表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞株(見圖3、4)。高表達(dá)Cyclin B1的穩(wěn)定細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空載體的陰性對照組細(xì)胞株相比，細(xì)胞生長旺盛，生長曲線呈明顯上升趨勢(見圖5)。Transwell檢測表明高表達(dá)Cyclin B1細(xì)胞株穿透能力明顯高于轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空載體的陰性對照組細(xì)胞株(見圖6)。說明Cyclin B1可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性度增加、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。
實(shí)施例3裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)選用4周齡BALB/C裸鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動物中心)，雄性，于裸鼠右側(cè)背部(近尾側(cè))接種人類食管癌細(xì)胞，200萬細(xì)胞/只，每7天觀察一次，測量腫瘤大小，觀察裸鼠一般情況，連續(xù)觀察3個月，分別在28天、70天以及3個月之后處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，作病理H&E染色，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了三次。
裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)共分為四組接種，分別為KYSE150、空載、高表達(dá)Cyclin B1的克隆1、克隆2，每組10只裸鼠。重復(fù)3次。
依據(jù)公式v＝4/3πr12r2(r1為短徑，r2為長徑)，計(jì)算腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。(見圖7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果H&E染色結(jié)果顯示，腫瘤為上皮來源，確為接種的人類食管癌細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。高表達(dá)Cyclin B1的克隆1、2接種裸鼠后，腫瘤生長速度快，腫瘤體積明顯大于KYSE150組、pCDNA3.1空載組?？寺?、2接種裸鼠后，腫瘤侵犯肌層、橫紋肌、骨，遠(yuǎn)處可見肺轉(zhuǎn)移，而KYSE150組、pCDNA3.1空載組未見(見圖8-14)，特別是肺轉(zhuǎn)移比例為50-70％。其中圖8所示為取接種人類食管癌細(xì)胞的裸鼠，28天處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。圖9所示為28天取裸鼠的腫瘤，作病理H&E染色，證實(shí)為上皮來源，確為接種的人類食管癌細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生。
表1顯示本實(shí)施例的腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移情況統(tǒng)計(jì)情況。
表1

換言之，本發(fā)明實(shí)施例證實(shí)了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在促進(jìn)人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
權(quán)利要求
1.哺乳動物包括人的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動物包括人的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
文檔編號A61P35/00GK1868536SQ20061009576
公開日2006年11月29日 申請日期2006年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月4日
發(fā)明者詹啟敏, 宋詠梅, 黃振, 趙春玲, 薛麗燕, 呂寧, 陳阿梅, 付明, 董立佳 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所