專利名稱：基于sm-蛋白的分泌工程化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之領(lǐng)域。其系關(guān)于一種產(chǎn)生蛋白之方法以及一種產(chǎn)生 新表達(dá)載體及宿主細(xì)胞以供生物藥生產(chǎn)之方法。本發(fā)明另外系關(guān)于藥物組合物及治療方 法。
背景技術(shù)：
用于人類療法之生物藥品的市場繼續(xù)高速增長，有270種新穎生物藥品在臨床研 究中正得到評估且估計(jì)在2003年出售了 300億。生物藥品可自各種宿主細(xì)胞系統(tǒng)制造，所 述宿主細(xì)胞系統(tǒng)包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞，包括衍生 自人類之細(xì)胞株。目前，由于真核細(xì)胞之正確加工及修飾人類蛋白之能力，因此自真核細(xì)胞 制造愈來愈多數(shù)目之生物藥品。因此，自此等細(xì)胞成功且高產(chǎn)率地制造生物藥品系關(guān)鍵的 且高度視用于方法中之重組單克隆細(xì)胞株之特征而定。因此，急需產(chǎn)生具有改良特性之新 穎宿主細(xì)胞系統(tǒng)且建立以高的比生產(chǎn)率培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞株之的方法作為高產(chǎn)率方法之基礎(chǔ)。任何生物藥品制造方法之產(chǎn)率均很大程度上視當(dāng)在方法條件下生長時(shí)生產(chǎn)細(xì)胞 (producing cell)每次分泌之蛋白產(chǎn)物之量而定。許多復(fù)雜之生物化學(xué)細(xì)胞內(nèi)過程對于自 真核細(xì)胞合成及分泌治療用蛋白為必要的。所有此等步驟，諸如轉(zhuǎn)錄、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)譯、轉(zhuǎn)譯 后修飾及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)在野生型宿主細(xì)胞株中均經(jīng)嚴(yán)格調(diào)控且將影響衍生自此宿主之任何生 產(chǎn)細(xì)胞株的比生產(chǎn)率。在以往，大多數(shù)工程化方法系集中于推動諸如轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯之過程的分子網(wǎng)絡(luò)以提 高蛋白制造中此等步驟之產(chǎn)率。然而，就任何多步驟制造過程而言，在過程鏈之早期步驟期 間拓寬瓶頸均可能在遠(yuǎn)處下游(尤其分泌途徑中之轉(zhuǎn)譯后)產(chǎn)生瓶頸。上至某一臨限，已 報(bào)道生產(chǎn)細(xì)胞之比生產(chǎn)率系與產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄量線性相關(guān)。然而，進(jìn)一步增強(qiáng)產(chǎn)物在mRNA水平之表達(dá)可引起蛋白合成、折疊或轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制之超 負(fù)荷，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)累積。實(shí)務(wù)上，此現(xiàn)象可在目前制造過程中頻繁地觀察到。因 此，制造細(xì)胞株之分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為用于新穎宿主細(xì)胞工程化策略之引人關(guān)注之目標(biāo)。對工程化所分泌之治療用蛋白之細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的首次研究系圍繞如結(jié)合蛋白BiP/ GRP78及蛋白二硫化異構(gòu)酶(PDI)之分子伴隨蛋白的過度表達(dá)。伴隨蛋白為宿于內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER)中且有助于新合成蛋白之折疊及組裝的細(xì)胞蛋白。然而，與可預(yù)期之情況相反，已展示 哺乳動物細(xì)胞中之BiP過度表達(dá)降低而非增大其所締合之蛋白的分泌，而CHO細(xì)胞中之PDI 過度表達(dá)產(chǎn)生與不同蛋白產(chǎn)物抵觸之結(jié)果。描述在CHO細(xì)胞株中對于IFN-γ制造之ER至 順式高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)問題之報(bào)告(Hooker等人，1999)支持此等驚人發(fā)現(xiàn)(增大細(xì)胞之蛋白折 疊能力產(chǎn)生遠(yuǎn)處下游制造瓶頸)之可能解釋?？傊枰牧妓拗骷?xì)胞之分泌能力以便重組蛋白紙制造。此與新穎轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技 術(shù)及高滴度方法組合可甚至變得更重要以防止轉(zhuǎn)譯后瓶頸及蛋白產(chǎn)物之細(xì)胞內(nèi)累積。然 而，目前在通向分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制之目標(biāo)操作的道路上存在兩個(gè)主要障礙關(guān)于基本調(diào)控機(jī) 制之仍受限之了解及防止在分泌過程中瓶頸移至遠(yuǎn)處下游之挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述Secl/Munc 18 (SM)蛋白家族之成員，尤其兩個(gè)成員，亦即Munc-18c及 Slyl，藉由聯(lián)合促進(jìn)將所分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面及調(diào)節(jié)分泌小泡與細(xì)胞膜之融合中的若 干后續(xù)步驟而在刺激總體胞吐作用中的新穎及驚人作用。本發(fā)明亦提供有效改良自真核細(xì) 胞經(jīng)由分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)之蛋白之產(chǎn)量的方法。另外，其描述分泌途徑之目標(biāo)操作用于治療疾 病及發(fā)炎病況之用途。蛋白分泌為復(fù)雜之多步驟機(jī)制蛋白預(yù)定轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外空間或?qū)⑼獠考?xì)胞膜首先 以共轉(zhuǎn)譯方式轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。自此，將其封裝于脂質(zhì)小泡中且轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體(Golgi apparatus)且最終從穿越高爾基體的網(wǎng)絡(luò)至細(xì)胞膜中，其中將其釋放至培養(yǎng)基中。在各轉(zhuǎn)運(yùn)步驟中，自小泡及目標(biāo)膜之SNARE [可溶性NSF (N-乙基馬來酰亞胺敏感 因子)附接受體]蛋白均形成反式SNARE復(fù)合物，其構(gòu)成發(fā)生融合所需之核心機(jī)構(gòu)。為滿 足在各種情況下之生理需求，SNARE介導(dǎo)的融合機(jī)構(gòu)必須空間地且暫時(shí)地可調(diào)，以便能將來 自細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外兩方面的刺激正確地整合。Secl/Muncl8(SM)蛋白似乎為調(diào)節(jié)SNARE蛋白之關(guān)鍵。兩種SM蛋白，Slyl及 MimclS (包括a、b及c三種同工型)系與沿分泌途徑(ER-高爾基體-細(xì)胞膜)之小泡融 合有關(guān)。Slyl為融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)衍生COPII小泡之高爾基體所需，MunclS為融合至分 泌小泡之細(xì)胞膜(PM)所需。在本發(fā)明中，我們分析Slyl及MimclSc對分泌途徑之生理影響，且首次發(fā)現(xiàn)兩種 SM蛋白一致地刺激總體胞吐作用。MimclSc及Slyl之活化作用的分子機(jī)制可能亦保守。 基于本文之發(fā)現(xiàn)，我們領(lǐng)創(chuàng)了基于SM蛋白之分泌工程化，其導(dǎo)致增強(qiáng)哺乳動物細(xì)胞中的分 泌?；赟M蛋白之分泌工程化代表了代謝工程化的新穎策略，為工業(yè)化生產(chǎn)蛋白藥提供了 新的平臺。本發(fā)明所述方法在若干方面有利首先，我們證實(shí)，Munc-ISc或Sly-I單獨(dú)，或兩種蛋白一起異源表達(dá)，是一種通過 提高宿主細(xì)胞分泌能力來增加重組蛋白產(chǎn)量的策略。在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面，該研究通過在分泌途徑中引入轉(zhuǎn)譯后發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行 基因工程化，開拓了避過此瓶頸的激勵(lì)人心的前景。這看上去特別具有實(shí)用性，因?yàn)樽罱?一代高效表達(dá)載體的使用可能引起生產(chǎn)細(xì)胞株內(nèi)蛋白折疊、修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)構(gòu)的超負(fù)荷，因 此降低其理論最大生產(chǎn)率。異源引入SM家族的促分泌蛋白(諸如MimclS及/或Slyl)可 克服此限制。第二，SM蛋白系自酵母至人類保守進(jìn)化在酵母中，存在四種SM蛋白(Seclp、 Slylp、Vps33p 及 Vps45p)，在果蠅中有三種(R0P、Slyl 及 Vps33/康乃馨(carnation))，在 蠕蟲中有六種(Unc-18以及5種根據(jù)基因組序列數(shù)據(jù)庫之其它基因)以及在脊椎動物中有 七種蛋白(Munc 18-1、Munc 18-2 及 Muncl8-3、VPS45、VPS33_A 及 VPS33-B 及 Slyl)。鑒于跨 物種之高保守程度，似乎極有可能將SM蛋白用以調(diào)節(jié)所有真核宿主細(xì)胞物種(自酵母歷經(jīng) 蠕蟲及昆蟲細(xì)胞至哺乳動物系統(tǒng))中的蛋白分泌及細(xì)胞表面表達(dá)。第三，SM蛋白家族所有成員均展示在整個(gè)序列中之高序列相似性程度，表明其應(yīng) 顯示類似整體結(jié)構(gòu)。另外，已為四個(gè)物種中九種SM基因描述了功能損失突變，其所有均引
6起小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及融合之嚴(yán)重?fù)p傷，表明SM蛋白在小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌過程中應(yīng)起到類似及重要 之作用。因此，我們主張MimclS及/或Slyl對在本發(fā)明中所述之目的之適用性可同等地 轉(zhuǎn)移至SM蛋白家族之任何其它成員。第四，藉由調(diào)節(jié)SNARE介導(dǎo)之小泡融合機(jī)構(gòu)，SM蛋白家族之成員與自ER至高爾基 體、自高爾基體至細(xì)胞膜之小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及最終胞吐融合(exocytoticfusion)之所有不同步 驟均有關(guān)。因此，參與分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)鏈之后續(xù)步驟的多種SM蛋白之異源表達(dá)具有對跨膜蛋白 之總體胞吐作用或細(xì)胞表面表達(dá)產(chǎn)生附加或甚至協(xié)同效應(yīng)的潛力。另外，作為藉由轉(zhuǎn)錄因 子XBP-I異源性共表達(dá)之蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的起點(diǎn)之ER之同時(shí)工程化進(jìn)一步提高此分泌增強(qiáng)作用。作為第五優(yōu)勢，SM蛋白亦影響分泌途徑之最后一個(gè)步驟，亦即小泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜， 且藉此在不產(chǎn)生遠(yuǎn)處下游瓶頸之風(fēng)險(xiǎn)的情況下促進(jìn)蛋白分泌。總之，SM蛋白在小泡介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)(自ER至高爾基體及自高爾基體至細(xì)胞膜)之 所有步驟中的參與使得MimC18C、Slyl及所有其它SM家族蛋白均為用于目的在于增強(qiáng)真核 細(xì)胞分泌能力之(多)基因工程化方法的極誘人及有希望之目標(biāo)。在本發(fā)明中所述之小泡介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)之目標(biāo)工程化可具有廣泛應(yīng)用。詳言之，可 突出兩種基本方法(i)過度表達(dá)SM蛋白及/或增強(qiáng)SM蛋白之活性以提高細(xì)胞之分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)能力，或(ii)降低SM蛋白活性及/或表達(dá)以作為降低癌細(xì)胞增殖及/或侵入之基因療法 的手段。SM蛋白過度表達(dá)之適用性所述之本發(fā)明描述一種藉由SM家族蛋白之過度表達(dá)改良細(xì)胞之總體蛋白分泌能 力來產(chǎn)生用于制造異源蛋白之改良真核宿主細(xì)胞之方法。此使得在基于真核細(xì)胞之制造過程中提高蛋白產(chǎn)率。其藉此降低此等過程之物品 的成本且同時(shí)降低需經(jīng)制造以產(chǎn)生物質(zhì)之批料之?dāng)?shù)目，該物質(zhì)為治療用蛋白之調(diào)查研究、 診斷學(xué)、臨床研究或市場供應(yīng)所需。本發(fā)明另外加速藥物開發(fā)，因?yàn)楫a(chǎn)生足量的用于臨床前 研究之物質(zhì)常為關(guān)于時(shí)間表之關(guān)鍵工作包。本發(fā)明可用以提高用于產(chǎn)生一或若干種用于診斷目的、研究目的(目標(biāo)識別、先 導(dǎo)識別(lead identification)、先導(dǎo)最佳化(lead optimization))或在市場或在臨床開 發(fā)中制造治療用蛋白的特異性蛋白之所有真核細(xì)胞的蛋白制造能力。如在本申請案中所示，SM蛋白之異源表達(dá)引起所有類別蛋白(包括經(jīng)分泌之酶、 生長因子及抗體)之產(chǎn)量增加。因?yàn)榭缒さ鞍坠蚕硗恍∨萁閷?dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(其系由SM蛋 白與SNARE之相互作用來調(diào)節(jié))，所以此工程化方法同等地適用于改良跨膜蛋白之轉(zhuǎn)運(yùn)及 增強(qiáng)其在細(xì)胞表面上之豐度。因此，本文所述之方法亦可用于學(xué)術(shù)及工業(yè)研究目的，其旨在表征細(xì)胞表面受體 之功能。舉例而言，其可用于表面蛋白之制造及后續(xù)純化、結(jié)晶及/或分析。另外，藉由所 述方法產(chǎn)生之跨膜蛋白或表達(dá)此等蛋白之細(xì)胞可用于篩選試驗(yàn)，例如物質(zhì)之篩選、孤兒受 體之配位體的識別或在先導(dǎo)最佳化期間對改良效用之搜尋。因?yàn)榧?xì)胞表面受體為藥物目標(biāo) 之主要類別，所以此對于新穎人類藥物療法之開發(fā)至關(guān)重要。另外，本文所述之方法對于研究與細(xì)胞表面受體締合之細(xì)胞內(nèi)信號復(fù)合物或分析 細(xì)胞-細(xì)胞通訊(部分系由可溶性生長因子與在同一或另一細(xì)胞上之其相應(yīng)受體的相互作
7用所介導(dǎo))而言可為有利的。降低/抑制SM蛋白表達(dá)及/或活性之適用性在本發(fā)明中，我們提供SM表達(dá)降低引起可溶性細(xì)胞外蛋白分泌降低之證據(jù)，如為 MunclSc及Slyl所示。此使得SM蛋白為治療性操作之誘人目標(biāo)。自正常健康細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的特點(diǎn)之一為自外源生長因子之存在獲得獨(dú)立。與 正常細(xì)胞相反，腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生所有為其存活及自身增殖所必需之生長因子。除此自分 泌機(jī)制之外，癌細(xì)胞常展示在其表面上生長因子受體之上調(diào)表達(dá)，其導(dǎo)致對自周圍組織中 之細(xì)胞所分泌之旁分泌作用生長及存活因子的反應(yīng)性增強(qiáng)。例如藉由使用shRNA-方法、 siRNA-方法或反義RNA-方法，藉由靶向SM-蛋白，如腫瘤細(xì)胞中之Sly-I及Muncl8，可能 以兩種方式破壞自分泌以及旁分泌生長-刺激及/或存活機(jī)制(i)藉由降低生長因子轉(zhuǎn) 運(yùn)及分泌及(ii)藉由減少腫瘤細(xì)胞上相應(yīng)生長因子-受體之量。藉此，生長刺激信號之量 及癌細(xì)胞感知及響應(yīng)此等信號之能力均將降低。抑制在癌細(xì)胞中之SM蛋白表達(dá)或活性因 此應(yīng)代表防止癌細(xì)胞增殖及存活之強(qiáng)大手段。SM蛋白另外似乎為抑制腫瘤侵入及轉(zhuǎn)移之有效治療目標(biāo)。在大多數(shù)類型之人類癌 癥的晚期，原發(fā)腫瘤產(chǎn)生先驅(qū)細(xì)胞(pioneer cell)，所述先驅(qū)細(xì)胞移出、侵入相鄰組織且行 進(jìn)至遠(yuǎn)程位點(diǎn)，其中其可成功建立新群落(稱為轉(zhuǎn)移)。作為組織侵入之先決條件，癌細(xì)胞表達(dá)整套蛋白酶，所述蛋白酶使其能夠經(jīng)由周 圍健康組織而遷移，穿過基膜，進(jìn)入血流且最終侵入目標(biāo)組織。將此等蛋白酶中之一些表示 為膜結(jié)合蛋白，例如MT-MMP及ADAM。由于其在基質(zhì)重塑、生長因子排出(shedding)及腫瘤 侵入中之關(guān)鍵作用，因此將蛋白酶本身討論作為癌癥療法之藥物目標(biāo)。我們主張抑制腫瘤 細(xì)胞中SM蛋白表達(dá)及/或活性減少在目標(biāo)細(xì)胞表面上之膜結(jié)合蛋白酶之量。此應(yīng)降低或 甚至損傷腫瘤細(xì)胞之侵入能力以及其對生長因子排出之能力，從而使得腫瘤侵入性及轉(zhuǎn)移 潛力降低。因此，靶向SM家族之蛋白提供防止晚期腫瘤發(fā)生，尤其自良性/實(shí)體節(jié)結(jié)轉(zhuǎn)化 為侵襲性轉(zhuǎn)移腫瘤之新穎方式。因此，對于治療應(yīng)用而言，目標(biāo)在于降低及/或抑制SM蛋白之活性及/或表達(dá)。此 可藉由核苷酸組合物來達(dá)成，將該核苷酸組合物用作藉由抑制SM蛋白功能來治療疾病之 人類治療劑，藉以該藥物包含經(jīng)由結(jié)合其RNA之序列移動子(sequence motive)來特異性 抑制SM蛋白的shRNA、RNAi、siRNA或反義RNA。降低/抑制SM蛋白活性/表達(dá)亦可藉由 含有結(jié)合及沉默各別SM蛋白基因之啟動子的核苷酸之藥物物質(zhì)來達(dá)成。另外，藥物物質(zhì)或產(chǎn)物可包含抑制SM蛋白之表達(dá)或活性的新穎化學(xué)實(shí)體或肽或 蛋白。在蛋白為活性醫(yī)藥化合物之情況下，其可為(i)與SM蛋白之啟動子結(jié)合藉此抑制其 表達(dá)之蛋白，(ii)與SM蛋白或其相互作用搭配物(例如，SNARE復(fù)合物內(nèi)之突觸融合蛋白 (syntaxin)或蛋白)結(jié)合藉此阻礙SM蛋白與其結(jié)合搭配物之功能相互作用的蛋白，(iii) 類似于SM蛋白但并不履行其功能之蛋白，意謂"顯性負(fù)"SM蛋白變異體，或(iv)充當(dāng)SM 蛋白及其結(jié)合搭配物兩者之骨架從而使得蛋白不可逆結(jié)合且形成穩(wěn)定及非功能性蛋白復(fù) 合物的蛋白。根據(jù)本發(fā)明，提供使用本發(fā)明之化合物的新穎方法。因此，本發(fā)明之化合物可用以 治療癌癥或其它異常增殖性疾病。癌癥系以兩種方式分類癌癥起源之組織的類型(組織 類型)及原發(fā)部位，或在體內(nèi)癌癥首先發(fā)生之位置。癌癥發(fā)生之最常見部位包括皮膚、肺、女性乳房、前列腺、結(jié)腸及直腸、淋巴系統(tǒng)、子宮頸及子宮?；衔镆虼诉m用于治療多種癌癥，包括(但不限于)以下AIDS相關(guān)之癌癥，諸如卡波氏肉瘤(Kaposi' s sarcoma)；骨相關(guān)癌癥，諸如尤因 (Ewing)家族腫瘤及骨肉瘤；腦相關(guān)癌癥諸如成人腦瘤、兒童腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童小腦星 形細(xì)胞瘤、兒童大腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童室管膜瘤、兒童神經(jīng)管胚細(xì)胞瘤、 兒童小腦幕上原始神經(jīng)外胚層瘤、兒童視覺途徑及下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤及其它兒童腦瘤；乳 癌；消化/胃腸相關(guān)癌癥，諸如肛門癌、肝外膽管癌、胃腸類癌、結(jié)腸癌、食道癌、膽囊癌、成 人原發(fā)性肝癌、兒童肝癌、胰腺癌、直腸癌、小腸癌及胃癌；內(nèi)分泌相關(guān)癌癥，諸如腎上腺皮 質(zhì)癌、胃腸類癌、胰島細(xì)胞癌(內(nèi)分泌胰腺)、副甲狀腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤及甲狀腺癌； 眼相關(guān)癌癥，諸如眼內(nèi)黑色素瘤及視網(wǎng)膜胚細(xì)胞瘤；泌尿生殖器相關(guān)癌癥，諸如膀胱癌、腎 臟(腎細(xì)胞)癌、陰莖癌、前列腺癌、移行細(xì)胞(transitional cell)腎盂及輸尿管癌、睪 丸癌、尿道癌、韋爾姆斯氏瘤(Wilms' tumor)及其它兒童腎臟腫瘤；生殖細(xì)胞相關(guān)癌癥， 諸如兒童顱外生殖細(xì)胞腫瘤、性腺外生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤及睪丸癌；婦科相 關(guān)癌癥，諸如子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(gestational trophoblastic tumor)、卵巢上皮癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢低惡性潛力腫瘤、子宮肉瘤、陰道癌及外陰 癌；頭及頸部相關(guān)癌癥，諸如下咽癌(hypopharyngeal cancer)、喉癌、唇及口腔癌、原發(fā)灶 隱匿之轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌及唾液腺癌；血液學(xué) /血液相關(guān)癌癥，諸如白血病，諸如成人急性淋巴母細(xì)胞白血病、兒童急性淋巴母細(xì)胞白血 病、成人急性骨髓白血病、兒童急性骨髓白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓白血病及 毛細(xì)胞白血病；及淋巴瘤，諸如AIDS相關(guān)之淋巴瘤、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、成人霍奇金氏淋 巴瘤(adultHodgkin' s lymphoma)、兒童霍奇金氏淋巴瘤、懷孕期間霍奇金氏淋巴瘤、蕈樣 真菌病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、兒童非霍奇金氏淋巴瘤、懷孕期間非霍奇金氏淋巴瘤、原 發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、賽謝癥候群(Sezarysyndrome)、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤及華氏巨球 蛋白血癥(Waldenstrsm's macroglobulinemia)及其它血液學(xué)/血液相關(guān)癌，諸如慢性 脊髓增生病癥、多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤、骨髓發(fā)育不良癥候群及骨髓發(fā)育不良/骨髓增 生?。环蜗嚓P(guān)癌癥，諸如非小細(xì)胞肺癌及小細(xì)胞肺癌；肌肉骨骼相關(guān)癌癥，諸如尤因氏家族 腫瘤、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤、兒童橫紋肌肉瘤、成人軟組織肉瘤、兒童軟組織肉瘤 及子宮肉瘤；神經(jīng)相關(guān)癌癥，諸如成人腦瘤、兒童腦瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、小腦星形細(xì)胞瘤、 大腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、神經(jīng)管胚細(xì)胞瘤、小腦幕上原始神經(jīng)外胚層 瘤、視覺途徑及下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤及其它腦瘤，諸如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、垂體瘤及原發(fā)性中樞神 經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤；呼吸道/胸相關(guān)癌癥，諸如非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤 及胸腺癌；皮膚相關(guān)癌癥，諸如皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、卡波氏肉瘤、黑色素瘤、梅克爾細(xì)胞癌 (Merkel cell carcinoma)及皮膚癌。此等病癥已在人類中充分表征，但于其它哺乳動物中亦以類似之病源學(xué)存在，且 可藉由本發(fā)明之藥物組合物來治療。對于治療用途而言，可以治療有效量、以任何習(xí)知?jiǎng)┬?、以任何?xí)知方式來投與化 合物。投與途徑包括(但不限于)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、滑液內(nèi)、藉由輸注、舌下、經(jīng)皮、經(jīng) 口、局部或藉由吸入、錠劑、膠囊、囊片、液體、溶液、懸浮液、乳液、口含劑、糖漿、可復(fù)水散 劑、顆粒、栓劑及經(jīng)皮貼片劑。制備此等劑型之方法為已知的(例如，參見，H. C. Ansel及
9N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第 5 版，Lea 及Febiger (1990))。治療有效量可由熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者基于諸如體重、代謝及疾患嚴(yán)重性等 因素來確定?；钚曰衔飪?yōu)選以每公斤體重每日約Img至約500mg來給藥。活性化合物更 優(yōu)選以每公斤體重每日約Img至約IOOmg來給藥?；衔锟蓡为?dú)或與佐劑組合投與，所述佐劑增強(qiáng)抑制劑之穩(wěn)定性，促進(jìn)在某些實(shí) 施例中含有其之藥物組合物的投與，提供增強(qiáng)之溶解或分散，提高抑制活性，提供輔助療 法，及其類似情況。有利地，此等組合可利用較低劑量之活性成份，由此降低可能之毒性及 不利副作用。與根據(jù)本發(fā)明之化合物一起使用的可藥用載劑及佐劑包括(例如)離子交換劑、 氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白、緩沖物質(zhì)、水、鹽或電解質(zhì)及基于纖維素之物質(zhì)。此并 非可能之可藥用載劑及佐劑的完整清單，且一般技術(shù)者知道其它可能性，其在此項(xiàng)技術(shù)中 為充分的?？傊?，本發(fā)明描述藉由異源表達(dá)MimclSc、Slyl或SM蛋白家族之其它成員及其組 合來增強(qiáng)在真核細(xì)胞中蛋白之分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)的新穎方法。此方法尤其適用于以增強(qiáng)之制造能 力產(chǎn)生最優(yōu)化宿主細(xì)胞系統(tǒng)以便表達(dá)及制造重組蛋白產(chǎn)物。Secl/Muncl8(SM)蛋白為在細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中膜融合所需的，但已長期提出其作 用之性質(zhì)為不同而非統(tǒng)一的，其部分系因?yàn)樵赟M蛋白與SNARE之間相互作用之非均質(zhì)性。 在本發(fā)明中，我們評估兩種SM蛋白對分泌途徑之生理影響?；景l(fā)現(xiàn)在于在小泡融合至細(xì) 胞膜及高爾基體中涉及之Muncl8c及Slyl —致地刺激總體胞吐作用。與此模型一致，我們展示當(dāng)敲低Slyl及MimclSc時(shí)，總體胞吐作用降低(圖3)。 相反地，藉由過度表達(dá)造成的增加水平之Slyl提高分泌能力(圖4)。重要及令人驚訝地， MimclSc亦顯著刺激宿主細(xì)胞之分泌能力。為支持此，我們論證MimclSc系與為融合至 PM (細(xì)胞膜)而特異性化之SNARE復(fù)合物直接結(jié)合(圖5)。先前研究指定Muncl8c在胞吐作用中之抑制作用(Riento等人，2000 ；Kanda等 人，2005 ；Tellam等人，1997 ；Thurmond等人，1998)，其與本發(fā)明之結(jié)果相抵觸。為提供 MunclSc在轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中之作用，詳言之其與由突觸融合蛋白4、SNAP-23及VAMP2組成之胞 吐SNARE蛋白之相互作用的分子理解，我們報(bào)道免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。如圖5中所示，MimclSc-特 異性抗體定量地使Muncl8c連同顯著量之突觸融合蛋白4、SNAP-23及VAMP 2 一起沉淀，表 明Muncl8c與此等SNARE之活體內(nèi)締合，其促進(jìn)在分泌途徑中的小泡-細(xì)胞器融合(Peng 及GallwitZ，2002 ；Shen等人，2007 ；Scott等人，2004)。此發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)類似于與完全組裝之 SNARE復(fù)合物結(jié)合且促進(jìn)融合高爾基體之Slyl,MimclSc亦與SNARE復(fù)合物直接相互作用， 提示藉由促進(jìn)SNARE介導(dǎo)之轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制之保守作用機(jī)制。因此，Slyl及Muncl8c功能之生理學(xué)作用及機(jī)制在SNARE介導(dǎo)分泌途徑中均為保 守的。當(dāng)Slyl、Munc 18c及通用細(xì)胞器擴(kuò)增因子Xbp-I過度表達(dá)時(shí)，基于SM蛋白之分泌 工程增強(qiáng)多種蛋白之胞吐作用，所述蛋白包括酶、生長激素及免疫治療單克隆抗體。本申請案之?dāng)?shù)據(jù)論證一旦在相同細(xì)胞內(nèi)兩種SM蛋白同時(shí)過度表達(dá)即對蛋白分泌 有附加或甚至協(xié)同之效應(yīng)，如為MimclSc及Slyl所示。我們的數(shù)據(jù)因此支持SM蛋白在刺 激SNARE介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中之統(tǒng)一功能的模型且表示用于增強(qiáng)分泌之轉(zhuǎn)譯后工程化的新穎策略?？傊?，在本申請案中，我們提供SM蛋白在胞吐/分泌途徑中之統(tǒng)一活化作用的第 一個(gè)驚人證據(jù)。基于此發(fā)現(xiàn)，我們開創(chuàng)了基于SM蛋白之轉(zhuǎn)譯后工程化，藉由其成功達(dá)成增 強(qiáng)之胞吐作用。有效產(chǎn)生蛋白治療劑對生物技術(shù)工業(yè)仍為大挑戰(zhàn)。迄今為止，已開發(fā)多種不同代 謝工程化策略。舉例而言，藉由增大轉(zhuǎn)錄(轉(zhuǎn)錄工程化)；藉由調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞之轉(zhuǎn)譯效 能(轉(zhuǎn)譯工程化)；藉由提高特異性糖型(glycoform)之產(chǎn)量(糖基化工程化)；藉由僅將 代謝能復(fù)位向至產(chǎn)物形成(受控增殖技術(shù))及藉由改良生產(chǎn)細(xì)胞株之活力(抗細(xì)胞凋亡 工程化)。然而，基于和諧配合之(orchestrated)分泌機(jī)構(gòu)的代謝工程仍為難懂的。基于 Slyl及MimclSc —致地刺激總體胞吐作用之發(fā)現(xiàn)，在本文中我們首次報(bào)道引起哺乳動物細(xì) 胞之分泌能力增強(qiáng)的基于SM蛋白之轉(zhuǎn)譯后工程化。該系統(tǒng)系與所用啟動子之表達(dá)組態(tài)、類 型及啟動子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄量無關(guān)，使得其尤其適于工業(yè)制造重組蛋白及醫(yī)藥。本發(fā)明另外提供藉由干擾SM蛋白表達(dá)來抑制或降低蛋白胞吐作用之手段。此將 為治療癌癥或發(fā)炎病況提供適用手段。先前已描述，在真核細(xì)胞中，膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)小泡使蛋白及脂質(zhì)在亞細(xì)胞區(qū)室/細(xì)胞 器之間穿梭。在各轉(zhuǎn)運(yùn)步驟，自小泡及目標(biāo)膜之SNARE [可溶性NSF (N-乙基馬來酰亞胺敏感 因子)附接受體]蛋白均形成反式SNARE復(fù)合物，其構(gòu)成發(fā)生融合所需之核心機(jī)構(gòu)。為滿 足在各種情況下之生理需求，SNARE介導(dǎo)融合機(jī)構(gòu)必須在空間上暫時(shí)地可調(diào)以自待適當(dāng)整 合之細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外來源均獲得刺激。因此，關(guān)鍵在于活體內(nèi)調(diào)節(jié)或微調(diào)SNARE功能以使 膜融合之特異性及速度均不受損。Secl/MimclS (SM)蛋白可為調(diào)節(jié)SNARE蛋白之關(guān)鍵。首 先在酵母及線蟲中識別之SM蛋白為融合所必需。除SNARE外幾乎不存在相互作用搭配物 之事實(shí)已得出SM蛋白系與SNARE蛋白功能偶聯(lián)之普遍觀點(diǎn)(Gallwitz及Jahn，2003 Jahn 等人，2003 ；Toonen及Verhage，2003)。然而，推廣SM蛋白之功能模型的嘗試已顯著地受阻 于其與SNARE相互作用之異質(zhì)性質(zhì)。在獨(dú)特轉(zhuǎn)運(yùn)步驟且在不同生物體中，單體突觸融合蛋 白(Dulubova 等人，1999 ；Yang 等人，2000 ；Peng 及 GalIwitz，2002)、小泡相關(guān) SNARE (Li 等 人，2005 ；Carpp 等人，2006 ；Peng 及 Gallwitz ；2004 ;Shen 等人，2007)、異二聚體 t-SNARE 復(fù)合物(Scott等人，2004 ;Zilly等人，2006)以及三元完全組裝之SNARE復(fù)合物(Carpp等 人，2006 ；Peng 及 Gallwitz ；2004 ；Shen 等人，2007 ；Togneri 等人，2006 ；Carr 等人，1999 ； Dulubova等人，2007)已展示易于與個(gè)別SM蛋白結(jié)合。因此，已為膜融合中之SM蛋白功能 以正面及負(fù)面觀點(diǎn)解釋了此等相互作用之生理學(xué)意義。因此，分子機(jī)制，尤其SM蛋白在分泌途徑中之生理作用仍為未知的。舉例而言， Slyl系與單體突觸融合蛋白5、單體小泡結(jié)合SNARE及完全組裝之SNARE復(fù)合物相互作用 (Li等人，2005 ；Peng及Gallwitz ；2004)，且已展示正面影響形成SNARE復(fù)合物及融合特異 性(Peng 及 Gallwitz, 2002 ；Kosodo 等人，2002)。另一方面，先前研究指定MimclS蛋白在膜融合及胞吐作用中之抑制作用突觸小 泡之經(jīng)調(diào)節(jié)胞吐作用尤其需要之神經(jīng)元特異性MimclSa呈現(xiàn)兩種與SNARE相互作用之功 能對立藉由與突觸融合蛋白1之封閉構(gòu)形結(jié)合，由此抑制SNARE復(fù)合物組裝(Dulubova 等人，1999 ；Yang等人，2000)，且與完全組裝之SNARE復(fù)合物結(jié)合，因此促進(jìn)膜融合(Shen 等人，2007 ；Dulubova等人，2007)。一致地，報(bào)道了 MunC18a對胞吐作用之抑制及促進(jìn)作用(Wu 等人，1998 ；Verhage 等人，2000 ；Voets 等人，2001)。Munc 18b 及 Munc 18c 在序列上 與MunC18a同源但無所不在地表達(dá)?；铙w外數(shù)據(jù)表明Muncl8c在SNARE結(jié)合方面類似于 Muncl8a(Latham等人，2006 ；D' Andrea-Merrins等人，2007)，且兩種蛋白之結(jié)構(gòu)為保守的 (Misura等人，2000 ；Hu等人，2007)。然而，遺傳學(xué)及生理學(xué)研究迄今為止已提供Muncl8b 及Muncl8c在胞吐作用中之抑制作用的專有證據(jù)(Riento等人，2000 ；Kanda等人，2005 ； Tellam等人，1997 ；Thurmond等人，1998)。舉例而言，1)蠅類中Muncl8a之過度表達(dá)抑制神 經(jīng)元傳輸(Wu等人，1998)，2)在Caco-2細(xì)胞中Muncl8b之過度表達(dá)抑制流感病毒血球凝集 素之頂端傳遞(apical delivery) (Riento等人，2000)，3)Muncl8c對突觸融合蛋白4與對 VAMP2競爭結(jié)合(Thurmond等人，1998) ；4)在脂肪細(xì)胞中經(jīng)胰島素刺激GLUT小泡之易位系 受Muncl8c過度表達(dá)抑制但在無Muncl8c小鼠中增強(qiáng)(Tellam等人，1997 ；Thurmond等人， 1998)。與此等報(bào)道相反且與主導(dǎo)預(yù)想不同，在本申請案中，我們藉由證明兩種蛋白通常 同等刺激胞吐作用來論證兩種SM蛋白slyl及Muncl8c之新穎及驚人之作用。藉由Muncl8c 及Slyl之活化作用的分子機(jī)制可能亦為保守的。基于此等驚人發(fā)現(xiàn)，我們開創(chuàng)了在哺乳動 物細(xì)胞中產(chǎn)生增強(qiáng)之分泌的基于SM蛋白之分泌工程化?；赟M蛋白之分泌工程化表示代 謝工程之新穎策略且為在工業(yè)中生產(chǎn)蛋白醫(yī)藥提供新穎平臺。詳言之，Slyl及MimclSc表達(dá)對哺乳動物細(xì)胞分泌能力之正面作用指出一種將增 大分泌之哺乳動物生產(chǎn)細(xì)胞株工程化之新穎轉(zhuǎn)譯后方法。在實(shí)施例5中說明slyl與munC18C同時(shí)過度表達(dá)引起SEAP產(chǎn)量增大8倍，相比 之下，藉由單獨(dú)之slyl或munC18C增大5倍。SAMY及VEGF121之分泌亦增大(圖4b、4c)。 slyl、muncl8c及xbp-1全部之過度表達(dá)將SEAP、SAMY及VEGF之分泌分別增大10倍、12倍 及8倍(圖4a、4b、4c)，明顯地說明在Slyl與Munc 18c之間及在兩種SM蛋白與通用細(xì)胞器 擴(kuò)增因子Xbp-I之間對分泌存在協(xié)同效應(yīng)。在實(shí)施例6中進(jìn)一步說明，藉由產(chǎn)生為slyl (CHO-Slyl16及CHO-Slyl23)或 munc 18c (CHO-Munc 18c8及CH0_Muncl8c9)之組成型表達(dá)而工程化的穩(wěn)定CH0-K1衍生細(xì)胞 株，CHO-Slyl16及CHO-Slyl23刺激SEAP分泌增加4倍及8倍(圖6a)及SAMY產(chǎn)量提高4倍 及5倍(圖6b)。有趣地，產(chǎn)生較多SEAP之CHO-Slyl23亦展示較高Slyl水平，表明SM與產(chǎn) 物蛋白之正相關(guān)性(圖6c)。類似地，為組成型mimclSc表達(dá)轉(zhuǎn)基因之細(xì)胞(CHO-MuncISc9) 產(chǎn)生多9倍及6. 5倍之SEAP及SAMY(圖6e及6f)且產(chǎn)生更多SEAP之CH0_Muncl89亦展 示較高M(jìn)uncl8c水平(圖6d)。與親本CHO-Kl相比，穩(wěn)定細(xì)胞株CH0-Slyl-Muncl8ci (為 組成型Slyl及Muncl8c表達(dá)之雙轉(zhuǎn)基因)及CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp_l7 (為組成型Slyl、 Munc 18c及Xbp-I表達(dá)之三轉(zhuǎn)基因)展示高13倍及16倍之SEAP產(chǎn)量(圖6g)。具體地，基于SM蛋白之分泌工程化提高生產(chǎn)細(xì)胞株之抗體的比生產(chǎn)率。實(shí)施 例7藉由在原型生物藥生產(chǎn)方案中使用基于SM蛋白之分泌工程化以在CHO-Slyl16及 CHO-Slyl23中(增大至多10倍)、在CH0-Slyl-Muncl8ci中(增大至多15倍)及在 CHO-Slyl-Xbp-I4 中(增大至多 13 倍)及在 CH0-Slyl-Muncl8c_Xbp-l7 中(增大至多 19 倍)表達(dá)稱為利妥昔單抗(Rituximab)之單克隆抗人類⑶20 IgGl來說明此(圖7a)。當(dāng) 在CH0-Slyl-MunC18C-Xbp-l7中產(chǎn)生利妥昔單抗時(shí)，可達(dá)到至多40pg/細(xì)胞/天之特別制 造水平，與同基因?qū)φ占?xì)胞株相比，其對應(yīng)于增大接近20倍(圖7a)。SDS-PAGE分析表明藉由CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17&野生型CHO-Kl細(xì)胞產(chǎn)生之抗體為結(jié)構(gòu)完整的且彼此不 可區(qū)分(圖7b、7c)。自在CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中產(chǎn)生之利妥昔單抗的N-連接Fc寡 糖之基于Maldi-TOF之糖基化概況分析(Glycoprofiling)揭示與原生生產(chǎn)細(xì)胞株相比無 差異，表明基于SM/Xbp-Ι之分泌工程化并不損害產(chǎn)物質(zhì)量(圖7d及7e)。


圖 1Slyl及Muncl8在HEK-293中之表達(dá)及定位。(a)及(b)將肌動蛋白用作內(nèi)源對 照物對slyl (a)及mimclS (b)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行基于RT-PCR之偵測。將I-Kb序列梯用作分子 量標(biāo)準(zhǔn)。(c)Muncl8a/b/c之Western印跡。(d)共焦顯微照片顯示Slyl及Muncl8c在經(jīng) YFP-Munc 18c (pRP23)力 Π CFP-突觸融合蛋白 4(Stx4，pRP29)組合或 YFP-Slyl (pRP32)加 CFP-突觸融合蛋白5 (Stx5,pRP40)組合轉(zhuǎn)柒的HEK-293中的亞細(xì)胞定位。箭頭表示Slyl與 突觸融合蛋白5 (上圖)或MimclSc與突觸融合蛋白4 (下圖)之共定位(colocalization)。圖 2基于shRNA而敲低slyl及Muncl8c。(a)圖示編碼雙順反子slyl/GFP的表達(dá)載 體PRP3，其用作不同的slyl特異性shRNA的slyl特異性敲低報(bào)道構(gòu)建體。(b)熒光顯微照 片顯示經(jīng)pRP3及編碼shRNA的不同表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染、且培養(yǎng)48h的CHO-Kl。(c)圖示編碼 雙順反子Muncl8c/GFP的表達(dá)載體pRP4，其用作不同的Muncl8c特異性shRNA的Muncl8c 特異性敲低報(bào)道構(gòu)建體。(d)熒光顯微照片顯示經(jīng)pRP4及編碼shRNA的不同表達(dá)載體共轉(zhuǎn) 染、且培養(yǎng)48h的HEK-293。圖 3基于shRNA而敲低slyl及muncl8c導(dǎo)致降低總體胞吐作用。(a)HEK_293的Slyl 特異性Western印跡，所述細(xì)胞被靶向slyl的shRNA表達(dá)載體(ShRNAslyl 1/2/3 ；pRP5_7)轉(zhuǎn) 染。將親本載體pmU6、對照物shRNA及p27Kipl用作對照物。(b)HEK-293的SEAP表達(dá)概 況，所述細(xì)胞被PSEAP2-對照物及不同的ShRNAslyl表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染(48h)。(c) HEK-293的 Munc 18c特異性Western印跡，所述細(xì)胞被靶向muncl8c的shRNA表達(dá)載體(shRNA_cl8 cl/2/3 ；PRP12,14，38，39)轉(zhuǎn)染。(d) HEK-293的SEAP表達(dá)概況，所述細(xì)胞被pSEAP2_對照物 及不同的shRNA_。18表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。圖 4Slyl及Muncl8c的異位表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后階段提高CHO-Kl的蛋白產(chǎn)量。(a_c) CHO-Kl之生產(chǎn)概況，所述細(xì)胞被SEAP(pSEAPl-對照物)(a)、SAMY (pSS 158) (b)或 VEGF121 (pffff276) (c)生產(chǎn)型載體及(不同組合的)編碼 Slyl (pRP24)、Muncl8c (pRP17)及 Xbp-I (pcDNA3. 1-Xbp-1)的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。(d)在有或無SM蛋白表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物mRNA水平 基于定量RT-PCR的概況分析(profiling)。圖 5Munc 18c與胞吐的SNARE復(fù)合物的相互作用。用親和純化的、蛋白A-S印harose-偶 聯(lián)的抗Muncl8c抗體使HEK-293溶胞物免疫沉淀之后，對Muncl8c、突觸融合蛋白4、 SNAP-23及VAMP2/突觸泡蛋白(synaptobrevin) 2 (Sybil)進(jìn)行Western印跡分析。用未沉 淀的蛋白(上清)及Slyl作對照物。
圖 6基于SM蛋白的分泌工程化提高了異源蛋白在CHO-KI衍生之細(xì)胞株中的產(chǎn)量。(a) 穩(wěn)定混合并克隆化的CHO-Kl衍生群體的SEAP產(chǎn)量，所述細(xì)胞是Slyl及SEAP組成型表達(dá) (CHO-Slyl16 及 CHO-Slyl23 及 CHO-SlyligJ 的轉(zhuǎn)基因體，且已培養(yǎng) 48h。(b)經(jīng) pSS158 瞬 時(shí)轉(zhuǎn)染的 CHO-Slyl16 及 CHO-Slyl23 及 CHO-Slyl 混合的 SAMY 產(chǎn)量。(c) CH0-K1、CHO-SlyI16 及 CHO-Slyl23 的 Slyl 特異性 Western 印跡，以 p27Kipl 作為負(fù)載對照物(loading control)。 (d)CHO-Kl、CHO-Munc 18c8 及 CHO-Munc 18c9 的 Muncl8c 特異性 Western 印跡，p27Kipl 作為 負(fù)載對照物。(e)穩(wěn)定混合并克隆化的CH0-K1衍生群體的SEAP產(chǎn)量，所述細(xì)胞為MunclSc 及SEAP組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因體(CH0-Muncl8c8、CHO-Munc 18c9及CHO-Munc 18cs纟)，并已 培養(yǎng) 4他。(f)經(jīng) pSSl58 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的 CH0-Muncl8c8、CHO-Munc 18c9 及 CHO-Muncl8 .混合的 SAMY產(chǎn)量。(g)穩(wěn)定細(xì)胞克隆培養(yǎng)48h之后的SEAP生產(chǎn)概況，所述細(xì)胞組成型表達(dá)Slyl 及 Muncl8c(CH0-Slyl-Muncl8Cl)、Slyl 及 Xbp-I (CHO-Slyl-Xbpl4)及 Slyl、Munc 18c 以及 Xbp-I (CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17)。圖 7在分泌工程化CH0-K1衍生物中產(chǎn)生的利妥昔單抗的產(chǎn)量及糖基化概況分析。 (a)不同的分泌工程化CH0-K1衍生物的利妥昔單抗比生產(chǎn)率。基于SM蛋白的代謝工程 化使人IgGl的分泌增加。(b、c)從CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17及CH0-K1細(xì)胞純化的利 妥昔單抗經(jīng)非還原型(b)和還原型(c) SDS-PAGE來分析。圖中示出了標(biāo)準(zhǔn)蛋白和IgGl重 鏈及輕鏈(HC、LC)的分子量(KDa)。(d、e)基于MALDI-T0F分析在CH0-K1及分泌工程化 CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中產(chǎn)生的利妥昔單抗的糖基化概況。圖 8表達(dá)構(gòu)建體的示意圖編碼至少一種目標(biāo)蛋白(GOI)及一種SM蛋白的載體，所述蛋白由不同的表達(dá)單元 (a)或由單個(gè)雙順反子單元(b)編碼。包含兩種SM蛋白的基因的表達(dá)載體，所述蛋白由不同的表達(dá)盒(C)編碼，或者兩 個(gè)基因通過IRES組件相連以雙順反子方式來編碼蛋白(d)。由單個(gè)多順反子表達(dá)單元編碼至少兩種SM蛋白及一個(gè)目標(biāo)基因(e)或多種SM蛋 白的表達(dá)載體。圖 9SM蛋白增強(qiáng)人類細(xì)胞的HRP分泌測量人HT1080細(xì)胞上清中的HRP活性，所述細(xì)胞用分泌型辣根過氧化物酶 (ssHRP)及空載體(Mock，黑條)、Muncl8c (灰條)、Slyl (陰影條)或編碼Munc 18c和Slyl 的雙順反子構(gòu)建體(Munc-IRES-Sly，橫紋條)共轉(zhuǎn)染。相對于設(shè)定為1.0之Mock對照物， 繪制轉(zhuǎn)染后24h及48h測量的相對ssHRP滴度以及比生產(chǎn)率的圖形。這些值對應(yīng)于三份試 樣的平均值，誤差條=SEM。圖 10SM蛋白在IgG生產(chǎn)細(xì)胞株中的過表達(dá)提高比生產(chǎn)率及最終IgG滴度(A)穩(wěn)定表達(dá)空載體(Mock)或 Sly-I (Slyl)、Munc_18c (Munc)或兩種 SM 蛋 白(Mimc/Slyl)的表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞的IgGl相對比生產(chǎn)率。所述生產(chǎn)率根據(jù)補(bǔ)料分批
14(fed-batch)生產(chǎn)過程期間的滴度及活細(xì)胞計(jì)數(shù)來計(jì)算。這些柱圖代表η = 2 (Mock)至η =6個(gè)單克隆轉(zhuǎn)基因IgG生產(chǎn)細(xì)胞株的平均值，且相對于設(shè)定為100%之Mock細(xì)胞中的比 生產(chǎn)率來描繪。(B)歷經(jīng)9天補(bǔ)料分批發(fā)酵過程穩(wěn)定地表達(dá)所述構(gòu)建體的穩(wěn)定細(xì)胞群的IgG滴度。實(shí)施方式一般實(shí)施例"包含"涵蓋更特定之實(shí)施例"由…組成"。另外，單數(shù)及復(fù)數(shù)形式 并非以限制方式使用。在本發(fā)明期間所用之術(shù)語具有以下含義。術(shù)語〃基因“意謂脫氧核酸(DNA)序列(例如，cDNA、基因組DNA或mRNA)。在本 發(fā)明中，基因優(yōu)選系指人類DNA序列，但包括自其它哺乳動物物種(優(yōu)選為小鼠、倉鼠及大 鼠)之同等同源序列，以及自額外真核物種(包括雞、鴨、苔蘚、蠕蟲、蠅及酵母)之同源序 列。集合術(shù)語"Secl/Munc-18蛋白〃或"SM蛋白〃或"Secl/Muncl8蛋白群" 或〃 SM-蛋白"或"編碼SM-蛋白之基因"或"SM家族"包含60-70kDa之親水性蛋白之 家族，其具有高的結(jié)構(gòu)相似性程度且自酵母至人類保守進(jìn)化。Munc 18及Slyl兩者均屬于Secl/Muncl8蛋白家族。此家族迄今進(jìn)一步包括在酵母中Seclp、Slylp、Vps33p及 Vps45p在果蠅中R0P、Slyl及Vps33/康乃馨在線蟲中Unc-18以及5種其它根據(jù)基因組序列數(shù)據(jù)庫之基因在脊椎動物中Muncl8-l、Munc18-2 及 Munc 18-3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B 及 Slyl。術(shù)語SM-蛋白亦涵蓋此等蛋白之衍生物、突變體及片段，例如帶flag-卷標(biāo)、帶 HIS-卷標(biāo)或帶另外卷標(biāo)之SM-蛋白。頻繁地將此等衍生物例如用于蛋白之簡易純化或分離 或觀測。SM蛋白展示在整個(gè)序列上之高同源性，表明其可能具有類似整體結(jié)構(gòu)。另外，已為 四個(gè)物種中九種SM基因描述了功能喪失突變，其均引起小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及融合之嚴(yán)重?fù)p傷，表明 SM蛋白在小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌之過程中起到類似及重要之作用。本發(fā)明之實(shí)施例使用MimclS及Slyl作為模型蛋白，然而，本發(fā)明可同樣轉(zhuǎn)移至SM 蛋白家族之其它成員。另外，鑒于跨物種之高保守程度，SM蛋白可用以調(diào)節(jié)在所有真核宿主細(xì)胞物種 (自酵母歷經(jīng)蠕蟲及昆蟲細(xì)胞至哺乳動物系統(tǒng))中蛋白之分泌及細(xì)胞表面表達(dá)。在真核細(xì)胞中，膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)小泡使蛋白及脂質(zhì)在亞細(xì)胞區(qū)室/細(xì)胞器之間穿梭。 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)小泡與細(xì)胞膜或與目標(biāo)區(qū)室(諸如溶酶體、高爾基復(fù)合體或細(xì)胞膜)之融合系由 SNARE[可溶性NSF(N-乙基馬來酰亞胺敏感因子)附接受體]蛋白介導(dǎo)。為滿足細(xì)胞之生 理需求且保持區(qū)室特異性膜組成，藉由SeCl/MimC18(SM)家族之小蛋白來在空間上暫時(shí)地 控制SNARE介導(dǎo)之融合機(jī)構(gòu)。藉由與SNARE及突觸融合蛋白直接結(jié)合，SM蛋白調(diào)節(jié)在細(xì)胞 內(nèi)區(qū)室/細(xì)胞器與細(xì)胞膜之間小泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)之所有步驟。術(shù)語〃 Munc-18"或〃 Munc-18蛋白〃或〃 Munc-18蛋白家族〃包括存在于真核 生物體中之所有Munc-18基因及基因產(chǎn)物/蛋白。此清楚地包括三種Munc-18旁系同源物(paralog)，亦即 Munc_18a (其亦稱為“Munc-18-l “ )、Munc_18b 及 Munc_18c，其已在脊椎 動物中進(jìn)化。更具體地，術(shù)語"Mimc-ISc"系指人類基因及亦稱為"突觸融合蛋白結(jié)合蛋 白3" (STXBP3)或〃血小板Secl蛋白〃 (PSP) (SEQ-ID NO 39)之蛋白Muncl8c，包括在其 它哺乳動物物種(包括小鼠、倉鼠、大鼠、狗及兔)中之其同源物。術(shù)語"Sly-I"或"Sly-I蛋白"系指所有自脊椎動物(優(yōu)選為哺乳動物)中 此等基因表達(dá)之Slyl基因及蛋白。更具體地，“Sly-I"系指人類Slyl蛋白，亦稱 為"含有Secl家族結(jié)構(gòu)域之蛋白1" (SCFDl)或"突觸融合蛋白結(jié)合蛋白_1狀蛋白 2“ (STXBP1L2)，SEQ-ID NO. 41 術(shù)語〃 XBP-1"同樣系指XBP-IDNA序列及所有自此基因表達(dá)之蛋白，包括XBP-I 拼接變異體。優(yōu)選地，XBP-I系指人類XBP-I序列且優(yōu)選系指XBP-I之拼接及活性形式，亦 稱為"XBP-1"。已知轉(zhuǎn)錄因子XBP-I為分泌細(xì)胞分化以及維持ER穩(wěn)態(tài)及擴(kuò)增之關(guān)鍵調(diào)節(jié) 子之一(Lee，2005 ；Iwakoshi，2003)。此等功能使得XBP-1為用于分泌工程方法之候選物。更具體地，“XBP-I〃系指人類 XBP-I 蛋白，SEQ-ID NO. 43。術(shù)語"生產(chǎn)率"或"比生產(chǎn)率"描述藉由限定數(shù)目之細(xì)胞在限定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生之 特異性蛋白之量。比生產(chǎn)率因此為細(xì)胞表達(dá)/合成/產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的能力之定量量度。 在工業(yè)制造中，通常將比生產(chǎn)率表示為每細(xì)胞及每天所產(chǎn)生之以皮克(‘Pg/細(xì)胞*天' 或'PCd')計(jì)的蛋白之量。測定所分泌蛋白之"比生產(chǎn)率"的一種方法為藉由酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 來定量測量分泌至培養(yǎng)基中的目標(biāo)蛋白之量。出于此目的，將細(xì)胞以限定密度接種至新鮮 培養(yǎng)基中。在限定時(shí)間之后，例如在24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)之后，對細(xì)胞培養(yǎng)液取樣且 使其經(jīng)受ELISA測量以測定目標(biāo)蛋白的滴度。可藉由將滴度除以平均細(xì)胞數(shù)目及時(shí)間來測 定比生產(chǎn)率。藉由均勻時(shí)間解析熒光(HTRF )試驗(yàn)來提供如何測量細(xì)胞〃比生產(chǎn)率〃之另一 實(shí)例。對于細(xì)胞內(nèi)、膜相關(guān)或跨膜蛋白而言之細(xì)胞的"生產(chǎn)率"亦可藉由Western印跡 法來偵測且定量。將細(xì)胞首先洗滌且隨后溶解于含有諸如Triton-X、NP-40或SDS之清潔 劑或高鹽濃度之緩沖液中。接著將細(xì)胞溶胞物中之蛋白藉由在SDS-PAGE上以尺寸分離，轉(zhuǎn) 移至耐綸膜，其中目標(biāo)蛋白隨后藉由使用特異性抗體來偵測及觀測。測定細(xì)胞之"比生產(chǎn)率"之另一方法為藉由針對目標(biāo)蛋白而提出之熒光標(biāo)記抗 體來免疫偵測目標(biāo)蛋白且在流式細(xì)胞儀中定量熒光信號。在細(xì)胞內(nèi)蛋白之情況下，首先將 細(xì)胞固定于中例如三聚甲醛(paraformaldehyde)緩沖液中，且接著滲透以允許偵測抗體 穿透至細(xì)胞中?？稍跓o需事先固定或滲透的情況下對活細(xì)胞定量細(xì)胞表面蛋白。細(xì)胞之"生產(chǎn)率"可另外藉由測量諸如綠熒光蛋白(GFP)之報(bào)道蛋白的表達(dá)來 間接測定，該綠熒光蛋白系表達(dá)為具有目標(biāo)蛋白之融合蛋白或來自與目標(biāo)蛋白相同之mRNA 作為二表達(dá)單元、三表達(dá)單元或多表達(dá)單元之部分。術(shù)語"提高/增加生產(chǎn)率"包含增加/提高細(xì)胞之比生產(chǎn)率的方法。若生產(chǎn)率在 所研究之細(xì)胞中較之各別對照細(xì)胞更高且若此差異為統(tǒng)計(jì)上顯著的，則比生產(chǎn)率增加或提 高。所研究之細(xì)胞可為經(jīng)處理、轉(zhuǎn)染或基因修飾之細(xì)胞的非均質(zhì)群體或克隆化細(xì)胞株；未經(jīng) 處理、未經(jīng)轉(zhuǎn)染或未經(jīng)修飾之細(xì)胞可充當(dāng)對照細(xì)胞。在所分泌之目標(biāo)蛋白的情形中，術(shù)語"
16提高/增加/改良之生產(chǎn)率"及"增強(qiáng)/提高/改良之胞吐作用"及"提高/增加/改良 之分泌"具有相同含義且可互換使用。術(shù)語"衍生物"通常包括適于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之預(yù)定用途的序列，其意謂所述序列介 導(dǎo)細(xì)胞中分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)之提高。術(shù)語"衍生物"當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)意謂在序列中與原始序列或其互補(bǔ)序列至少 70% —致之多肽分子或核酸分子。多肽分子或核酸分子優(yōu)選在序列中與原始序列或其互補(bǔ) 序列至少80%—致。多肽分子或核酸分子更優(yōu)選在序列中與原始序列或其互補(bǔ)序列至少 90%—致。最優(yōu)選為在序列中與原始序列或其互補(bǔ)序列至少95%—致且顯示與原始序列相 同或類似之對分泌之影響的多肽分子或核酸分子。序列差異可基于自不同生物體之同源序列的差異。其亦可能基于藉由取代、插入 或缺失一或多個(gè)核苷酸或氨基酸(優(yōu)選1、2、3、4、5、7、8、9或10個(gè))之序列的目標(biāo)修飾?？?使用位點(diǎn)特異性突變及/或基于PCR之突變技術(shù)來制造缺失、插入或取代突變體?？山逵?使用(例如)標(biāo)準(zhǔn)"對準(zhǔn)"算法，例如"BLAST"來測定參考序列之序列一致性。當(dāng)其在其 序列中配合在一起時(shí)，序列對準(zhǔn)，且可借助于標(biāo)準(zhǔn)"對準(zhǔn)"算法來識別。另外，在本發(fā)明中，術(shù)語"衍生物"意謂與其它核酸序列雜交之核酸分子(單股 或雙鏈)。雜交優(yōu)選在嚴(yán)格雜交及洗滌條件下進(jìn)行(例如在65°C下在含有5xSSC之緩沖液 中雜交；在42 °C下使用0，2XSSC/0，1% SDS洗滌)。術(shù)語"衍生物"另外意謂尤其在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸位置處蛋白缺失及/或 插入突變體、磷酸化突變體，及帶有蛋白激酶C(PKC)或酪蛋白激酶II (CKII)之結(jié)合位點(diǎn)缺 失的突變體。術(shù)語"活性"描述且定量在細(xì)胞內(nèi)或在活體外試驗(yàn)中蛋白之生物學(xué)功能。測量SM蛋白"活性"之一種試驗(yàn)為例如用于模型蛋白、抗體或目標(biāo)蛋白的分泌 試驗(yàn)。將細(xì)胞以ss-HRP-Flag質(zhì)粒連同空載體或所研究之基因(諸如Munc-18c或Sly-I) 一起共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞且在0、1、3及6h之后藉由一起培育澄 清細(xì)胞上清與ECL試劑對HRP分泌定量。以光度計(jì)(Lucy2，Anthos)在450nm下進(jìn)行測量。偵測就SM蛋白之功能結(jié)合而言之"活性"的另一方法將展示SM蛋白與其已知相 互作用搭配物之結(jié)合，例如Mimc-ISc與突觸融合蛋白_4之結(jié)合或Slyl與突觸融合蛋白_5 之物理相互作用。SM蛋白與其它蛋白之結(jié)合可藉由免疫共沉淀來證明，例如使用與珠粒偶 聯(lián)之特異性抗體使SM蛋白下沈(pull-down)，珠粒變性及之后藉由SDS-PAGE及Western印 跡之免疫共沉淀蛋白之分離及偵測。SM蛋白與另一蛋白(例如，突觸融合蛋白)之直接結(jié)合可進(jìn)一步在酵母_二-雜 交(yeast-two-hybrid)試驗(yàn)中偵測。在此試驗(yàn)中，兩種蛋白在酵母細(xì)胞中以分別與轉(zhuǎn)錄因 子之DNA結(jié)合域及轉(zhuǎn)錄活化域之融合蛋白的形式表達(dá)。兩種蛋白之直接相互作用均引起轉(zhuǎn) 錄因子重構(gòu)，該轉(zhuǎn)錄因子之活性系以比色方式或藉由酵母細(xì)胞在選擇性條件下生長之能力 來偵測。藉由SM蛋白與其結(jié)合搭配物之共免疫熒光法(co-immunof luorescence)及偵測 其在細(xì)胞內(nèi)之共定位來提供另一間接方法。測量XBP-I之〃活性〃的一種方法為進(jìn)行帶移實(shí)驗(yàn)以偵測XBP-I轉(zhuǎn)錄因子與其 DNA結(jié)合位點(diǎn)之結(jié)合。另一方法為偵測活性XBP-I拼接變異體自細(xì)胞溶質(zhì)至核之易位。或
17者，XBP-I “活性"可藉由測量真正(bona fide)XBP-I目標(biāo)基因(諸如結(jié)合蛋白(BiP))之 一旦XBP-I異源表達(dá)后的誘導(dǎo)表達(dá)來間接證實(shí)。在本發(fā)明之含義中〃宿主細(xì)胞〃為諸如倉鼠細(xì)胞之細(xì)胞，優(yōu)選為BHK21、BHK TK_、 CHO、CHO Pro-5、CHO 衍生之突變細(xì)胞株 Lecl 至 Lec35、CHO-KU CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl 及 CH0-DG44細(xì)胞或此等細(xì)胞株中任一者之衍生物/后代。尤其優(yōu)選為CH0-DG44、CH0-DUKX、 CHO-Kl及BHK21，且甚至更優(yōu)選為CH0-DG44及CHO-DUKX細(xì)胞。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中， 宿主細(xì)胞亦意謂鼠類骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選為NSO及Sp2/0細(xì)胞或此等細(xì)胞株中任一者之衍生 物/后代。亦將可用于本發(fā)明含義中之鼠類及倉鼠細(xì)胞之實(shí)例概括于表1中。然而，所述 細(xì)胞、其它哺乳動物細(xì)胞(包括(但不限于)人類、小鼠、大鼠、猴及嚙齒動物細(xì)胞株，或真 核細(xì)胞，包括(但不限于)酵母、昆蟲、植物及禽類細(xì)胞)之衍生物/后代亦可以本發(fā)明之 含義使用，尤其對于制造生物藥蛋白而言。表1 真核生物生產(chǎn)細(xì)胞株 宿主細(xì)胞當(dāng)在無血清條件下建立、適應(yīng)且完全培養(yǎng)，且任選地在不含動物來源之 任何蛋白/肽之培養(yǎng)基中時(shí)為最佳。市售培養(yǎng)基，諸如Ham' sF12 (Sigma, Deisenhofen, Germany)、RPMI-1640 (Sigma)、Dulbecco 改質(zhì)之 Eagle 培養(yǎng)基(Dulbecco ‘ s Modified Eagle ‘ s Medium，DMEM ;Sigma)、最低必需培養(yǎng)基(Minimal Essential Medium, MEM ； Sigma)、Iscove 改質(zhì)之 Dulbecco 培養(yǎng)基(Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium, IMDM ；Sigma)、CD-CH0 (Invitrogen，Carlsbad, CA)、CHO-S-Invtirogen、無血清 CHO 培養(yǎng)基 (Sigma)及無蛋白CHO培養(yǎng)基(Sigma)為例示性適當(dāng)營養(yǎng)溶液。必要時(shí)任何培養(yǎng)基均可補(bǔ) 充有多種化合物，其實(shí)例為激素及/或其它生長因子(諸如，胰島素、運(yùn)鐵蛋白、表皮生長因 子、胰島素樣生長因子)、鹽(諸如，氯化鈉、磷酸鈣、磷酸鎂)、緩沖液(諸如HEPES)、核苷 (諸如，腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它等效能源、抗生素、微量元素。亦可包括熟習(xí) 此項(xiàng)技術(shù)者已知之適當(dāng)濃度的任何其它必要補(bǔ)充劑。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用無血清培養(yǎng)基， 但補(bǔ)充有合適量血清之培養(yǎng)基亦可用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。對于表達(dá)可選基因之經(jīng)基因修飾之 細(xì)胞的生長及選擇而言，將合適選擇劑添加至培養(yǎng)基中。術(shù)語"蛋白"可與氨基酸殘基序列或多肽互換使用且系指任何長度之氨基酸的 聚合物。此等術(shù)語亦包括經(jīng)由包括(但不限于)糖基化、乙?；?、磷酸化之反應(yīng)或蛋白處理 而經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾之蛋白。在分子保持其生物學(xué)功能活性之同時(shí)，可在多肽結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生修飾 及改變(例如與其它蛋白融合)、氨基酸序列取代、缺失或插入。舉例而言，可在多肽或其基 本核酸編碼序列中產(chǎn)生某些氨基酸序列取代且可獲得具有類似特性之蛋白。術(shù)語"多肽"意謂具有10個(gè)以上氨基酸之序列且術(shù)語"肽"意謂至多10個(gè)氨基 酸長度之序列。本發(fā)明適于產(chǎn)生用于制造生物藥多肽/蛋白之宿主細(xì)胞。本發(fā)明尤其適于藉由展示增強(qiáng)之細(xì)胞生產(chǎn)率的細(xì)胞使大量不同之目標(biāo)基因高產(chǎn)率表達(dá)?！澳繕?biāo)基因"(GOI)、“所選序列"或"產(chǎn)物基因"在本文中具有相同含義且系 指編碼目標(biāo)產(chǎn)物或"目標(biāo)蛋白"(亦稱為"所需產(chǎn)物")的任何長度之多核苷酸序列。所 選序列可為全長或截短基因、融合或帶標(biāo)簽基因，且可為cDNA、基因組DNA或DNA片段，優(yōu)選 為cDNA。其可為原生序列，亦即天然存在之形式，或必要時(shí)可經(jīng)突變或另外經(jīng)修飾。此等修 飾包括密碼子優(yōu)化以便優(yōu)化密碼子在所選宿主細(xì)胞中、在人源化過程中或在標(biāo)記過程中的 利用情況。所選序列可編碼分泌型、胞質(zhì)型、核型、膜結(jié)合型或細(xì)胞表面型多肽?！澳繕?biāo)蛋白"包括蛋白、多肽、其片段、肽，其所有均可在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)。所 需蛋白可為(例如)抗體、酶、細(xì)胞因子、淋巴因子、粘附分子、受體及其衍生物或片段，及可 充當(dāng)激動劑或拮抗劑及/或具有治療或診斷用途之任何其它多肽。下文亦給出所需蛋白/ 多肽之實(shí)例。在諸如單克隆抗體等較復(fù)雜分子之情況下，GOI編碼兩個(gè)抗體鏈中之一或兩者。“目標(biāo)產(chǎn)物〃亦可為反義RNA、siRNA,RNAi或shRNA?！澳繕?biāo)蛋白"或"所需蛋白"為上述者。具體地，所需蛋白/多肽或目標(biāo)蛋白例 如為(但不限于)胰島素、胰島素樣生長因子、hGH、tPA、細(xì)胞因子(諸如介白素(IL)，例如 IL-UIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IUIL-12、IL-13、IL-14、 IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干擾素(IFN) α、IFNβ、IFNy、IFNco 或 IFNt、腫瘤壞死因 子(TNF)，諸如 TNF α 及 TNF β、TNF γ、TRAIL ；G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-I 及 VEGF。亦包 括制造紅細(xì)胞生成素或任何其它激素生長因子。根據(jù)本發(fā)明之方法亦可有利地用于制造抗 體或其片段。此等片段包括(例如)Fab片段(片段抗原-結(jié)合=Fab)。Fab片段系由藉 由相鄰恒定區(qū)保持在一起之兩個(gè)鏈的可變區(qū)組成。此等者可藉由自習(xí)知抗體例如以木瓜酶 進(jìn)行蛋白酶消化來形成，但在同時(shí)藉由基因工程亦可產(chǎn)生類似Fab片段。其它抗體片段包 括F(ab' )2片段，其可藉由用胃蛋白酶之蛋白水解來制備。目標(biāo)蛋白優(yōu)選系自培養(yǎng)基中以分泌之多肽的形式回收，或若在無分泌信號情況下 表達(dá)則其可自宿主細(xì)胞溶胞物中回收。有必要以獲得目標(biāo)蛋白的大體上均勻制劑之方式自 其它重組蛋白及宿主細(xì)胞蛋白純化目標(biāo)蛋白。作為第一步，自培養(yǎng)基或溶解物移除細(xì)胞及 /或微粒細(xì)胞碎片。此后例如藉由免疫親和或離子交換柱分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、 Sephadex層析、硅層析或諸如DEAE之陽離子交換樹脂層析將目標(biāo)產(chǎn)物從污染的可溶性蛋 白、多肽及核酸中純化。一般而言，在此項(xiàng)技術(shù)中熟知教示熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者如何純化由宿主 細(xì)胞異源表達(dá)之蛋白的方法。使用基因工程方法，可能產(chǎn)生僅由重鏈之可變區(qū)(VH)及輕鏈之可變區(qū)(VL)組成 的縮短抗體片段。將此等者稱為Fv片段(可變片段(Fragmentvariable)=可變部分之片 段)。因?yàn)榇说菷v片段缺乏兩個(gè)鏈藉由恒定鏈之半胱氨酸的共價(jià)鍵結(jié)，所以Fv片段經(jīng)常為 穩(wěn)定的。有利的在于藉由短肽片段(例如，具有10至30個(gè)氨基酸，優(yōu)選15個(gè)氨基酸)連 接重鏈之可變區(qū)與輕鏈之可變區(qū)。以此方式，獲得由藉由肽連接子連接之VH及VL組成的 單一肽鏈。將此類抗體蛋白稱為單鏈-Fv(ScFv)。自先前技術(shù)已知此類scFv-抗體蛋白之 實(shí)例。近年來，已開發(fā)各種策略用以制備呈多聚體衍生物之scFv。此尤其意欲產(chǎn)生具有 改良之藥物動力學(xué)及生物分布特性以及具有提高之結(jié)合親和力的重組抗體。為達(dá)成scFv
20之多聚化，將scFv制備為具有多聚化結(jié)構(gòu)域之融合蛋白。多聚化結(jié)構(gòu)域可為(例如)IgG 或卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(螺線結(jié)構(gòu))(諸如亮氨酸_拉鏈域(Leucin-zippeer domain))之CH3 區(qū)域。然而，亦存在將scFv之VH/VL區(qū)域之間的相互作用用于多聚化(例如，雙功能抗體 (diabodies)、三功能抗體(tribodies)及五功能抗體(pentabodies))之策略。對于熟習(xí) 此項(xiàng)技術(shù)者而言雙功能抗體意謂二價(jià)均二聚scFv衍生物。將scFv分子中之連接子縮短至 5-10個(gè)氨基酸使得形成內(nèi)部產(chǎn)生鏈間VH/VL迭加之均二聚體。雙功能抗體可另外藉由并入 二硫橋(disulphide bridge)而穩(wěn)定。自先前技術(shù)已知雙功能抗體-抗體蛋白之實(shí)例。對于熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者而言微型抗體意謂二價(jià)均二聚scFv衍生物。其系由融合蛋 白組成，該融合蛋白含有免疫球蛋白，優(yōu)選IgG，最優(yōu)選呈二聚化區(qū)域形式(其經(jīng)由鉸鏈區(qū) (例如，亦自IgGl)及連接區(qū)域來連接至scFv)之IgGl的CH3區(qū)域。自先前技術(shù)已知微型 抗體-抗體蛋白之實(shí)例。對于熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者而言三功能抗體意謂三價(jià)均三聚scFv衍生物。VH-VL在無 連接子序列之情況下直接融合之scFv衍生物使得形成三聚物。對于熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者而言，“骨架蛋白"意謂藉由基因克隆或藉由共轉(zhuǎn)譯過程與 另一蛋白或具有另一功能之蛋白之部分偶聯(lián)的蛋白之任何功能域。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者亦應(yīng)熟悉具有二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)結(jié)構(gòu)且衍生自scFv之所謂微型 抗體。藉由二聚、三聚或四聚卷曲螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行多聚化。據(jù)定義，即使所引入序列或基因與宿主細(xì)胞中之內(nèi)源序列或基因一致，仍將任何 引入宿主細(xì)胞中之序列或基因相對于宿主細(xì)胞稱作"異源序列"或"異源基因"或"轉(zhuǎn) 基因"或"重組基因"。甚至當(dāng)目標(biāo)序列為內(nèi)源序列，但序列已(人工地/有意地/實(shí)驗(yàn)地)被帶進(jìn)細(xì)胞中 且因此自不同于內(nèi)源基因座之宿主基因組中之基因座表達(dá)時(shí)，將序列稱作"異源序列"。甚至當(dāng)目標(biāo)序列(例如cDNA)為(人工地/有意地/實(shí)驗(yàn)地)再引入(=重組) 之內(nèi)源序列且此序列之表達(dá)系受調(diào)節(jié)序列之改變/修飾(例如，啟動子改變或藉由任何其 它手段)之影響時(shí)，將序列稱作"異源序列"?！爱愒?蛋白因此為自異源序列表達(dá)之蛋白。可藉由使用"表達(dá)載體"，優(yōu)選真核生物，且甚至更優(yōu)選哺乳動物表達(dá)載體將異 源基因序列引入目標(biāo)細(xì)胞中。用以構(gòu)建載體之方法為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知且描述于各 種出版物中。詳言之，在先前技術(shù)中已知用于構(gòu)建合適載體之技術(shù)，包括描述功能組件， 諸如啟動子、強(qiáng)化子、終止子(termination)及聚腺苷酸化信號、選擇標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)及拼 接信號。載體可包括(但不限于)質(zhì)粒載體、噬菌粒(Phagemid)、粘粒、人工/微型染色 體(例如ACE)或病毒載體，諸如桿狀病毒(baculovirus)、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺聯(lián)病毒 (adeno-associated virus)、單純皰疹病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體。真核生物表達(dá)載體通常 亦將含有促進(jìn)載體在細(xì)菌中繁殖(諸如復(fù)制起始)之原核序列及用于在細(xì)菌中選擇之抗生 素抗性基因。在此項(xiàng)技術(shù)中熟知多種含有克隆位點(diǎn)(多核苷酸可有效連接至其中)之真核 生物表達(dá)載體，且一些可購自諸如 Stratagene, La Jolla, CA ；Invitrogen, Carlsbad, CA ； Promega, Madison, WI 或 BDBiosciences Clontech, Palo Alto, CA 之公司。在一優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體包含至少一種核酸序列，該核酸序列為編碼目標(biāo)肽/ 多肽/蛋白之核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯所必需之調(diào)節(jié)序列。
如本文中所用之術(shù)語"表達(dá)"系指異源核酸序列在宿主細(xì)胞中之轉(zhuǎn)錄及/或轉(zhuǎn) 譯。所需產(chǎn)物/目標(biāo)蛋白在宿主細(xì)胞中之表達(dá)程度可取決于存在于細(xì)胞中之相應(yīng)mRNA 之量，或藉由如在本發(fā)明實(shí)例中之所選序列編碼的所需多肽/目標(biāo)蛋白之量。舉例而言， 自所選序列所轉(zhuǎn)錄之mRNA可藉由Northen印跡雜交、核糖核酸酶RNA保護(hù)、與細(xì)胞RNA 之原位雜交或藉由PCR來定量。由所選序列編碼之蛋白可藉由以下各種方法來定量例 如藉由ELISA、藉由Western印跡法、藉由放射免疫分析、藉由免疫沉淀、藉由檢測蛋白之 生物活性、藉由將蛋白免疫染色，接著FACS分析或藉由均勻時(shí)間解析熒光(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF)試驗(yàn)。在本發(fā)明中，術(shù)語"表達(dá)"同樣系用于基因(意謂DNA序列)之情形中，以及DNA 序列所轉(zhuǎn)譯之蛋白產(chǎn)物之情形中。術(shù)語"基因"及"蛋白"因此在表達(dá)之情形中可互換使 用，例如"目標(biāo)蛋白之表達(dá)"及"目標(biāo)基因之表達(dá)"可互換使用且兩個(gè)用語系指同一事實(shí) 問題。在本發(fā)明中，此等術(shù)語優(yōu)選系指人類基因及蛋白，但包括來自其它哺乳動物物種(優(yōu) 選為小鼠、倉鼠及大鼠)之同等同源序列，以及來自額外真核物種(包括雞、鴨、苔蘚、蠕蟲、 蠅及酵母)之同源序列。如本文中所用之術(shù)語"實(shí)現(xiàn)"目標(biāo)蛋白的表達(dá)或"實(shí)現(xiàn)"目標(biāo)蛋白的分泌系指 正面影響該事件或引起該事件。如本文中所用之此等術(shù)語優(yōu)選系指"增加表達(dá)"或"提高 分泌"。可藉由在此項(xiàng)技術(shù)中熟知之任何方法對真核宿主細(xì)胞進(jìn)行以多核苷酸或表達(dá)載 體"轉(zhuǎn)染"，從而產(chǎn)生經(jīng)基因修飾之細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法包括(但不限于)脂質(zhì) 粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、聚陽離子(諸如DEAE-葡聚糖)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融 合、病毒感染及顯微注射。轉(zhuǎn)染優(yōu)選為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在特定宿主細(xì)胞株及細(xì)胞類型中提供異 源基因之最佳轉(zhuǎn)染頻率及表達(dá)的轉(zhuǎn)染方法為有利的?？山逵沙Ｒ?guī)程序確定合適方法。為了 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建體整合至宿主細(xì)胞之基因組或人工染色體/微型染色體中或以游離方式 (episomally)定位以便穩(wěn)定地保持在宿主細(xì)胞內(nèi)。除非另作說明，否則本發(fā)明之實(shí)踐將采用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、免 疫學(xué)及在熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者之技術(shù)中的類似學(xué)科之習(xí)知技術(shù)。在目前文獻(xiàn)中充分揭示此等技 術(shù)。本發(fā)明系關(guān)于在細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)異源蛋白的方法，其包含a)增加至少一種編碼 SM-蛋白之基因的表達(dá)或各別蛋白或其至少一種衍生物、突變體或片段之活性，及b)實(shí)現(xiàn) 該目標(biāo)異源蛋白的表達(dá)。本發(fā)明具體地系關(guān)于在細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)異源蛋白的方法，其包含a)增加至少一 種編碼來自SEC1/Mimcl8蛋白群(SM-蛋白)之蛋白的基因之表達(dá)，及b)實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)異源 蛋白的表達(dá)。在方法步驟b)中目標(biāo)蛋白的分泌優(yōu)選得以提高。本發(fā)明因此優(yōu)選系關(guān)于在 細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)異源蛋白的方法，其包含a)增加至少一種編碼來自SEC1/Mimcl8蛋白群 (SM-蛋白)之蛋白的基因之表達(dá)，及b)提高該目標(biāo)異源蛋白的分泌。本發(fā)明優(yōu)選系關(guān)于在細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)異源蛋白的方法，其包含a)增加至少一種 編碼選自SEC1/Muncl8蛋白群(SM-蛋白)之蛋白的基因之表達(dá)，該SEC1/Muncl8蛋白群系 由以下各物組成Seclp、Slylp、Vps33p 及 Vps45p、R0P、Slyl 及 Vps33/ 康乃馨、Unc-18、Muncl8_l、
22Munc 18-2 及 Munc 18-3、VPS45、VPS33-A、VPS33-B 及 Slyl，及b)實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)異源蛋白的表達(dá)，優(yōu)選增加該目標(biāo)異源蛋白的表達(dá)或尤其優(yōu)選 其之分泌。步驟a)中之蛋白優(yōu)選系選自SEC1/Mimcl8蛋白群(SM-蛋白)，該群系由以下各物 組成Seclp、Slylp、Vps33p、Vps45p、Munc 18-1、Munc 18-2 及 Muncl8_3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B 及 Slyl。步驟a)中之蛋白更優(yōu)選系選自SEC1/Mimcl8蛋白群(SM-蛋白)，該群系由 Muncl8-l、Muncl8-2、Muncl8-3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B 及 Slyl 組成。步驟 a)中之蛋 白最優(yōu)選系選自SEC1/Muncl8蛋白群(SM-蛋白)，該群系由Muncl8_3/Muncl8c及Sly-I組 成。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于步驟a)中之一基因編碼Mimc-18蛋 白或Mimc-18蛋白家族成員。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于步驟a)中之一 基因編碼三種Muncl8同工型，Muncl8a、b或c中之一者，優(yōu)選Muncl8c。在本發(fā)明之另一特定實(shí)施例中，方法之特征在于步驟a)中之一基因編碼 Munc18c(SEQ ID NO 39)。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于步驟a)中之一基因編碼Sly-I蛋白 或Sly-I蛋白家族成員，優(yōu)選Sly-1。在本發(fā)明之另一特定實(shí)施例中，方法之特征在于步驟a)中之一基因編碼 Sly-I(SEQ ID NO 41)。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于步驟a)包含增加至少兩種編碼 SM-蛋白之基因的表達(dá)或活性，藉此所述SM蛋白系與小泡轉(zhuǎn)運(yùn)之兩個(gè)不同步驟有關(guān)。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于a) —基因編碼調(diào)節(jié)小泡與細(xì)胞膜 之融合的SM蛋白，b)第二基因編碼調(diào)節(jié)小泡與高爾基復(fù)合體之融合的SM蛋白。在本發(fā)明之一尤其優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于MimC18C(SEQ IDNO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)之表達(dá)或活性增加。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于步驟a)包含a)增加編碼SM蛋白家族 之一成員的第一基因之表達(dá)或活性，b)第二基因編碼SM蛋白家族之另一成員，及c)第三 基因編碼XBP-I。在本發(fā)明之一尤其優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于Muncl8c (SEQ IDNO 39)、 Sly-I (SEQ ID NO 41) R XBP-I (SEQ ID NO 43)之表達(dá)或活性增加。本發(fā)明另外系關(guān)于將細(xì)胞工程化之方法，其包含a)將一或多種包含為至少兩種 多肽編碼之核酸序列的載體系統(tǒng)引入細(xì)胞中，藉以i)至少一種第一核酸序列編碼SM-蛋白 或其衍生物、突變體或片段，及ii)第二核酸序列編碼目標(biāo)蛋白，b)在該細(xì)胞中表達(dá)該目標(biāo) 蛋白及該至少一種SM-蛋白或其衍生物、突變體或片段。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于將核酸序列依次引入該細(xì)胞中。在本發(fā)明之另一特定實(shí)施例中，方法之特征在于引入至少一種編碼SM蛋白之核 酸序列，隨后引入編碼該目標(biāo)蛋白的核酸序列。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于引入至少一種編碼目標(biāo)蛋白的核酸序 列，隨后引入編碼該SM蛋白的核酸序列。
23
在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于將核酸序列同時(shí)引入該細(xì)胞中。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于SM-蛋白為Mimc-18同工型中之任 一者，優(yōu)選為 Munc-18c(SEQ ID NO 39)或 Sly-I (SEQ ID NO :41)。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于在步驟a) i)中組合使用兩種SM-蛋 白，藉以所述SM蛋白系與小泡轉(zhuǎn)運(yùn)之兩個(gè)不同步驟有關(guān)。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于a) —基因編碼調(diào)節(jié)小泡與細(xì)胞膜之 融合的SM蛋白，b)第二基因編碼調(diào)節(jié)小泡與高爾基復(fù)合體之融合的SM蛋白。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于組合使用之兩種SM-蛋白為 Munc-18c(SEQ ID NO 39)及 Sly-I(SEQ ID NO 41)。 在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于在步驟a) i)中，將兩種SM-蛋白與 XBP-I組合使用。在本發(fā)明之一尤其優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于SM蛋白為與XBP-I (SEQ ID NO 43)組合之 Munc-18c (SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ IDNO :41)。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于該細(xì)胞為真核細(xì)胞，諸如酵母、植物、 蠕蟲、昆蟲、禽類、魚、爬行動物或哺乳動物細(xì)胞。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于該細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選為脊椎動 物細(xì)胞，最優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞。該脊椎動物細(xì)胞優(yōu)選為禽類細(xì)胞，諸如雞或鴨細(xì)胞。在本發(fā)明之另一特定實(shí)施例中，方法之特征在于該哺乳動物細(xì)胞為中國倉鼠卵巢 (Chinese Hamster Ovary, CH0)、猴腎CV1、猴腎COS、人類晶狀體上皮PER. C6 、人類胚腎 HEK293、人類骨髓瘤、人類羊水細(xì)胞(humanamniocyte)、嬰兒倉鼠腎臟、非洲綠猴腎臟、人類 宮頸癌、犬腎、水牛大鼠肝臟、人類肺臟、人類肝臟、小鼠乳腺腫瘤或骨髓瘤細(xì)胞、NS0、狗、豬 或恒河猴細(xì)胞、大鼠、兔、貓、山羊細(xì)胞，優(yōu)選為CHO細(xì)胞。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于該CHO細(xì)胞為野生型CH0、CHO Kl、 CHO DG44、CH0 DUKX-B11,CHO Pro_5或由其衍生之突變體，包括CHO突變體Lecl至Lec35， 優(yōu)選為CHO DG44。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于目標(biāo)蛋白為治療用蛋白。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于目標(biāo)蛋白為膜或分泌蛋白，優(yōu)選為 抗體或抗體片段。在本發(fā)明之另一特定實(shí)施例中，方法之特征在于抗體為單克隆、多克隆、哺乳動 物、鼠類、嵌合、人源化、靈長化、靈長類、人類或其抗體片段或衍生物，諸如抗體、免疫球蛋 白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈及重鏈、Fab、F (ab' ) 2、Fe、Fc-Fc融合蛋白、Fv、 單鏈Fv、單結(jié)構(gòu)域Fv、四價(jià)單鏈Fv、二硫鍵聯(lián)Fv、結(jié)構(gòu)域缺失、微型抗體、雙功能抗體，或以 上片段中一者與另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于該異源SM蛋白存在于包含至少一種 SNARE蛋白之小泡融合復(fù)合物中。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，方法之特征在于該異源SM蛋白存在于包含至少一 種SNARE蛋白及突觸融合蛋白4或突觸融合蛋白5之小泡融合復(fù)合物中。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于在該細(xì)胞中該目標(biāo)異源蛋白的比生產(chǎn)率為每細(xì)胞每天至少5pg，每細(xì)胞每天15pg，每細(xì)胞每天20pg，每細(xì)胞每天25pg。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，方法之特征在于該方法引起該目標(biāo)蛋白在該細(xì)胞中與 表達(dá)該目標(biāo)蛋白之對照細(xì)胞相比提高之比細(xì)胞生產(chǎn)率，但藉以該對照細(xì)胞并不具有任何 SM-蛋白之增加之表達(dá)或活性。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，方法之特征在于生產(chǎn)率之提高為約5%至約10%、 約11%至約20%、約21%至約30%、約31%至約40%、約41%至約50%、約51%至約 60%、約61%至約70%、約71%至約80%、約81%至約90%、約91%至約100%、約101% 至約149%、約150%至約199%、約200%至約299%、約300%至約499%，或約500%至約 1000%。本發(fā)明另外系關(guān)于一種提高目標(biāo)膜或分泌蛋白在細(xì)胞中之比細(xì)胞生產(chǎn)率或滴度 的方法，其包含a)將一或多種包含為至少兩種多肽編碼之核酸序列的載體系統(tǒng)引入細(xì)胞 中，藉以i)至少一種第一多核苷酸編碼SM-蛋白或其衍生物、突變體或片段，及ii)第二多 核苷酸編碼目標(biāo)蛋白，及b)在該細(xì)胞中表達(dá)該目標(biāo)蛋白及該SM-蛋白或其衍生物、突變體 或片段。本發(fā)明另外系關(guān)于包含編碼至少兩種多肽之表達(dá)單元的表達(dá)載體，藉以a)至少 一種多肽為SM-蛋白或其衍生物、突變體或片段，及b)第二多肽為目標(biāo)蛋白。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于目標(biāo)蛋白為治療用蛋白，優(yōu)選 為抗體或抗體片段。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于抗體為單克隆、多克隆、哺乳動 物、鼠類、嵌合、人源化、靈長化、靈長類、人類或其抗體片段或衍生物，諸如抗體、免疫球蛋 白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈及重鏈、Fab、F (ab' ) 2、Fe、Fc-Fc融合蛋白、Fv、 單鏈Fv、單結(jié)構(gòu)域Fv、四價(jià)單鏈Fv、二硫鍵聯(lián)Fv、結(jié)構(gòu)域缺失、微型抗體、雙功能抗體，或以 上片段中之一者與另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于表達(dá)單元為多順反子，優(yōu)選為雙 順反子。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于載體包含在圖8中所述之表達(dá) 構(gòu)建體的任一者。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于載體包含至少一個(gè)配置如下之 雙順反子表達(dá)單元a)編碼SM蛋白之基因，b) IRES組件及c)編碼SM蛋白之第二基因。參 見圖8d)。在本發(fā)明之另一優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于自分離之表達(dá)單元(圖8a) 或自一種雙順反子單元(圖8b)編碼至少一種目標(biāo)蛋白(GOI)及一種SM蛋白。在本發(fā)明 之另一優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于其包含自分離之表達(dá)盒(圖8c)編碼或以雙順 反子而其中兩個(gè)基因經(jīng)由一個(gè)IRES組件連接(圖8d)編碼兩種SM蛋白的基因。在本發(fā)明 之另一實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于其編碼至少兩種SM蛋白及一個(gè)目標(biāo)基因(圖8e)或 自一種多順反子表達(dá)單元編碼幾種SM蛋白。在本發(fā)明之一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于SM-蛋白為Mimc-18同工型 Munc a、b、c之一，優(yōu)選為Munc-18c(SEQ ID NO :39)。在本發(fā)明之另一優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于SM-蛋白為Sly-1(SEQ IDNO 41)。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于組合使用至少兩種SM-蛋白。在本發(fā)明之一個(gè)特定實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于該至少兩種SM蛋白涉及小 泡轉(zhuǎn)運(yùn)之兩個(gè)不同步驟。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于a) —種SM蛋白調(diào)節(jié)小泡與細(xì)胞 膜之融合，b)第二 SM蛋白調(diào)節(jié)小泡與高爾基復(fù)合體之融合。在本發(fā)明之一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于SM蛋白為Munc-18c (SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)。在本發(fā)明之另一優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體之特征在于至少兩種SM-蛋白與XBP-I 組合使用，優(yōu)選 Munc-18c(SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)與 XBP-1 (SEQ ID NO: 43)組合。本發(fā)明另外系關(guān)于表達(dá)至少兩種異源基因之細(xì)胞a)至少一種編碼SM-蛋白或其 衍生物、突變體或片段之基因，及b)編碼目標(biāo)蛋白的基因。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于目標(biāo)蛋白為治療用蛋白，優(yōu)選為抗 體或抗體片段。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于抗體為單克隆、多克隆、哺乳動物、 鼠類、嵌合、人源化、靈長化、靈長類、人類或其抗體片段或衍生物，諸如抗體、免疫球蛋白輕 鏈、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈及重鏈、Fab、F (ab' ) 2、Fe、Fc-Fc融合蛋白、Fv、單鏈 Fv、單結(jié)構(gòu)域Fv、四價(jià)單鏈Fv、二硫鍵聯(lián)Fv、結(jié)構(gòu)域缺失、微型抗體、雙功能抗體，或以上片 段中之一者與另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于SM蛋白之表達(dá)量顯著在內(nèi)源量以 上，優(yōu)選10%。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于該蛋白之表達(dá)量系在內(nèi)源量以上 5%，優(yōu)選在內(nèi)源量以上 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65 % ,70 % ,75 % ,80 % ,85 % ,90 % ,95 % UOO % ,120 % ,150 % ,175 % ,200 % ,300 % ,400 %, 500%、1000%。在本發(fā)明之另一實(shí)施例中，細(xì)胞包含本發(fā)明之表達(dá)載體之任一者。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于該細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選為脊椎動 物細(xì)胞，最優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞。尤其優(yōu)選為嚙齒動物細(xì)胞。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于該真核細(xì)胞為禽類細(xì)胞。在本發(fā)明之另一特定實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于該哺乳動物細(xì)胞為嚙齒動物細(xì) 胞，優(yōu)選為倉鼠或鼠類細(xì)胞。在本發(fā)明之一優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于該哺乳動物細(xì)胞 為中國倉鼠卵巢(CHO)、猴腎CV1、猴腎COS、人類晶狀體上皮PER. C6 、人類骨髓瘤、人類羊 水細(xì)胞、人類胚腎HEK293、嬰兒倉鼠腎臟、非洲綠猴腎臟、人類宮頸癌、犬腎、水牛大鼠肝臟、 人類肺臟、人類肝臟、小鼠乳腺腫瘤或骨髓瘤細(xì)胞、NS0、狗、豬或恒河猴細(xì)胞、大鼠、兔、貓、 山羊細(xì)胞，優(yōu)選為CHO細(xì)胞。在本發(fā)明之另一優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于該CHO細(xì)胞為野生型CHO、CHO KU CHO DG44、CHO DUKX-BlU CHO Pro-5或由其衍生之突變體，包括CHO突變體Lecl至 Lec35，優(yōu)選為 CHO DG44。在本發(fā)明之一尤其優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞之特征在于該細(xì)胞為CHO細(xì)胞，優(yōu)選為CHO
26DG44細(xì)胞。本發(fā)明另外系關(guān)于目標(biāo)蛋白，優(yōu)選藉由任何本發(fā)明之方法產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明另外系關(guān)于一種藥物組合物，其包含適用于阻斷或降低一或若干種SM-蛋 白之活性或表達(dá)(優(yōu)選為表達(dá))之化合物及可藥用載劑。在本發(fā)明之一特定實(shí)施例中，藥物組合物之特征在于化合物為多核苷酸序列。多 核苷酸序列優(yōu)選為shRNA、RNAi、siRNA或反義-RNA，最優(yōu)選為shRNA。在本發(fā)明之另一特定實(shí)施例中，藥物組合物之特征在于SM-蛋白為Mimc-ISc (SEQ ID NO 39)或 Sly-I (SEQ ID NO 41)或兩者之組合。本發(fā)明另外系關(guān)于一種識別SM-蛋白功能之調(diào)節(jié)劑的方法，其包含a)提供至少一 種SM-蛋白或其衍生物、突變體或片段，優(yōu)選為Mimc-ISc，b)使步驟a)之該SM-蛋白與測 試劑接觸，c)測定與細(xì)胞表面蛋白之增加或減少之蛋白分泌或表達(dá)相關(guān)的效應(yīng)。本發(fā)明另外系關(guān)于一種治療癌癥、自身免疫病及炎癥之方法，其包含向有此需要 之患者投與治療有效量之根據(jù)本發(fā)明之藥物組合物。本發(fā)明亦系關(guān)于一種包含應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明之藥物組合物以治療癌癥、自身免疫病 及炎癥之方法。本發(fā)明亦系關(guān)于一種抑制或降低細(xì)胞增殖或遷移之方法，其包含使該細(xì)胞與根據(jù) 本發(fā)明之藥物組合物接觸。本發(fā)明之可能治療應(yīng)用包括防止諸如自細(xì)胞或組織之發(fā)炎性介體、生長因子、血 管生成因子之蛋白的分泌以在癌癥療法、自身免疫病及炎癥中控制細(xì)胞-細(xì)胞通訊，或?yàn)?了促進(jìn)在懸浮液中生長及防止細(xì)胞聚集之目的藉由減少錨定跨膜蛋白之細(xì)胞表面存在來 減少細(xì)胞附接。本發(fā)明另外系關(guān)于SM-蛋白或編碼SM-蛋白之多核苷酸在活體外細(xì)胞或組織 培養(yǎng)系統(tǒng)中增加目標(biāo)蛋白的分泌及/或產(chǎn)量之用途。SM蛋白優(yōu)選為MimclS蛋白，諸如 Munc 18c (SEQ ID NO :39)。亦優(yōu)選的為 Sly-I 蛋白，諸如 Sly-I (SEQ ID NO :41)。本發(fā)明另外系關(guān)于本發(fā)明之任何方法、表達(dá)載體、細(xì)胞或藥物組合物的診斷用途。本發(fā)明另外系關(guān)于一種提高細(xì)胞之蛋白分泌/將細(xì)胞工程化/在細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo) 異源蛋白的方法，其包含a)將人類Secl/Muncl8及Slyl/SCFDl克隆至表達(dá)載體(例如，哺乳動物BI-HEX 表達(dá)平臺)中，藉以所述蛋白可藉由一種或不同雙順反子/多順反子表達(dá)單元來編碼且藉 以可在同一或不同質(zhì)粒上含有所述蛋白，b)以單獨(dú)或組合方式，同時(shí)或依次將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至真核生物宿主細(xì)胞中，所 述真核生物宿主細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞，諸如CHO、BHK、NSO、HEK293、PerC. 6，c)任選地核對轉(zhuǎn)基因表達(dá)，d)引入編碼目標(biāo)基因(GOI)之構(gòu)建體，優(yōu)選為分泌蛋白或跨膜蛋白，e)例例如藉由ELISA、Western印跡法或流式細(xì)胞儀進(jìn)行GOI之表達(dá)分析?；蛘?，步驟(b+c)及(d+e)之順序可變化，藉此首先引入G0I，或步驟(b)及(d)可 同時(shí)進(jìn)行。參考僅出于說明本發(fā)明之某些實(shí)施例之目的而包括于本文中之以下實(shí)施例，將較 易于理解上文一般描述之本發(fā)明。以下實(shí)施例并非限制性的。其僅展示本發(fā)明之可能實(shí)施例。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可易于調(diào)節(jié)條件以將其應(yīng)用于其它實(shí)施例。實(shí)驗(yàn)材料及方法質(zhì)粒設(shè)計(jì)。人slyl從HEK-293總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，使用寡核苷酸 0RP70(5 ‘ -CGCGGATCCACCATGGCGGCGG CGGCGGCAGCG-3 ‘ ， SEQ ID NO 1)及 0RP71(5 ‘ -CCGCTCG AGTTACTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3 ‘，SEQID NO 2)，將克隆 的 BamHI/XhoI 弓丨入 pcDNA3. 1 (Invitrogen)中，得到 pRP24(PhCMV-slyl-pAsv4。)。同樣 地，將 muncl8c 克隆(0RP69，5 ‘ -CGCGGATCCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAG AGAGG-3 ‘，SEQ ID NO 3;0RP66，5' -CCCTCGAGCTATTCA TCTTTAATTAAGGAGAC-3 ‘，SEQ ID NO 4)，得到 pRP17(PhCMV-muncl8c-pAsv40)。pRP32 (P請-EYFP-slyl-pAsv4(1)通過插入 slyl 來構(gòu)建，所述 slyl,使用 0RP29(5' -CTCAGATCTGCGGCGGCGGCGGCAGCG-3‘，SEQ ID NO 5)及 0RP30(5' -ACCGTCGACCTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3'，SEQ ID NO 6)從 pRP24 經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得，再 經(jīng) Bglll/Sall 引入 pEYFP-Cl (Clontech)。pRP23 (PhCMV-EYFP-muncl8c-pAsv4Q)的設(shè)計(jì)是從 PRP17 切取 muncl8c BamHI/XhoI，將其經(jīng) Bglll/Sall 處理克隆至 pEYFP-Cl 中。pRP3 通過 插入 syl 1 來產(chǎn)生，所述 syl 1 用 0RP9 (5 ‘ -CGCGCGGCCGCACCATGGCGGCGGCGGCGGCAGC G-3 ‘， SEQ ID N07)及 0RP10(5' -CCGGGATCCTTACTTTTGTCCAAGTTGT GACMCTG-3 ‘，SEQ ID NO 8) 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，經(jīng)Notl/BamHI引入pRPl中，該pRPl來自pIRESneo (Clontech)，是將新 霉素抗性基因替換為Smal/Xbal GFP而衍生的，所述GFP用0RP5 (5 ‘ -CCCCCGGGATGGTGAG CAAGGGCG AGG-3‘ ， SEQ IDNO 9)及 0RP6(5‘ -TTTCTAGATTACTTGTACAGCTCG TCC-3‘ ， SEQ ID NO10)自pLEGFP-Nl (Clontech)經(jīng)PCR擴(kuò)增制得。同樣地，pRP4通過插入muncl8c來構(gòu) 建，所述 muncl8c 用 0RP15，5' -CGCGCGGCCGCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAGAGAGG-3 ‘，SEQ ID NO 11 ；0RP16,5' -CCGGATCCCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC-3‘，SEQ ID NO 12)從pRP 17 經(jīng) PCR擴(kuò)增獲得，并經(jīng)Notl/BamHI引入pRPl中。pRP29 (Pmv-ECFP-突觸融合蛋白4_pAsv4(1)的 構(gòu)建是，用 PCR 擴(kuò)增突觸融合蛋白 4 (0RP127, 5 ‘ -CCCAAGCTTTGCGCGACAGGACCCACGAG-3 ‘， SEQ ID NO 13 ；0RP128,5' -CGCGTCGACTTATCCAACGGTTATGG TGATGCC-3‘，SEQ ID NO 14)， 接著將Hindlll/Sall克隆至pECFP-Cl (Clontech)中。同樣地，將突觸融合蛋白5克隆 (0RP136,5' -GGMGATCTATCCCGCGGAAACGCTAC-3‘，SEQ ID NO 15 ；0RP137,5' -CCCMGCTT TCAAGCAAGGAAGACCAC-3 ‘，SEQ ID NO 16)，得到 pRP40 (Phcw-ECFP-突觸融合蛋白 5_pAsv40)。 帶slyl-或muncl8c-特異性shRNA的表達(dá)載體通過將雙鏈DNA片段經(jīng)Bbsl/Xbal插入pmU6 中來克隆(i) slyl (ShRNAslyl ！ ；pRP5, 5 ‘ -TTTGGAAGTAAACT GGAAGATATTTTCAAGAGAAATATCT TCCAGTTTACTTCTTTTT-3‘ ，SEQ ID NO 23，及5' -CTAGAAAAAGAAGTAAACTGGAAGATATTTCTCTT GAMATATCTTCCAGTTTACTTC-3‘ ；SEQ ID NO 24,shRNAslyl 2 ；pRP6,5' -TTTGGCAGTGAMCTAGA CAAGAAATTCMGAGATTTCTTGTCTAGTTTCACTGCTTTTT-3'，SEQ ID NO 25及 5' -CTAGAAAAAGCA GTGAAACTAGACAAGAAATCTCTTGAATTTCTTGTCTAGTTTCACTGC-3 ‘ ； SEQ ID NO 26 ShRNAslyl 3； pRP7，5‘ -TTTGGGAGGCAACTACATTGAATATTTCAAGAGAATATTCAATGTAGTTGCCTCCTTTTT-3‘，SEQ ID NO 27，及 5' -CTAGAAAAAGGAGGCAACTACATTGAATATTCTCTTGAAATATTCAATGTAGTTGCCTCC-3'，SEQ ID NO 28) ； (ii)muncl8c (shRNA_cl8c 丄；pRP12，5' -TTTGCACATGAATCTC AGGTGTAT ATTCAAGAGATATACACCTGAGATTCATGTGTTTTT-3' ， SEQ ID NO 29，及 5' -CTAGAAAAACACATGA
28ATCTCAGGTGTATATCTCTTGAATATACACCTGAGATTCATGTG-3 ‘ , SEQ ID NO 30 ； ShRNAmuncl8c 2 ； pRP14，5 ‘ -TTTGGCTTGAAGACTACTACAAGATTTCAAGAGAATCTTGTAGTAGTCTTCAAGCTTTTT-3 ‘， SEQ ID NO 31，及 -CTAGAAAAAGCTTGAAGACTACTACAAGATTCTCTTGAAATCTTGTAGTAGTCTTC AAGC-3 ‘，SEQ ID NO 32 ；ShRNAmuncl8c 3 ；pRP38,5' -TTTGCGCCAGAAAC CCAGAGCTAATTTCAA GAGAATTAGCTCTGGGTTTCTGGCGTTTTT-3' , SEQ ID N033，及 5' -CTAGAAAAACGCCAGAAA CCC AGAGCTAATTCTCTTGAAATTAGCTCTGGGTTTCTGG CG-3'，SEQ ID NO 34 ； ShRNAmuncl8c 4 ；pRP39, 5 ‘ -TTTGGCTGAATAAACCCAAGGATAATTCAAGAGATTATCCTTGGGTTTATTCAGCTTTTT-3 ‘ ， SEQ ID NO 35，及 5 ‘ -CTAGAA AAAGCTGAATAAACCCAAGGATAATCTCTTGAATTATCCTTGGGTTTATTCAGC-3'，SEQ IDNO 360 ； (iii)對照 shRNA(pRP9，5 ‘ -TTTGCACAAGCTGGAGTACAACTACTTCAAGA GAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGTTTTT-3‘ ，SEQ ID N037，及-CTAGAAAAACACAAGCTGGAGTACAA CTACTCTCTTGAAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTG-3 ‘，SEQ ID NO 38)。編碼人類胎盤堿性磷酸酶(SEAP)的pSEAP2對照購自Clontech，攜嗜熱脂肪芽孢 桿菌衍生的分泌型α-淀粉酶(SAMY)的pSS158已被在先文獻(xiàn)49描述。含有人類血管內(nèi) 皮生長因子121 (VGEF121)的pffff276以及分別編碼人類IgGl利妥昔單抗之重鏈及輕鏈的 PWW943 及 pffff946 由 Wilfried Weber 友情提供。xbp_l 表達(dá)載體 pcDNA3. I-Xbp-I (PhCMV-xbp-l-pASV40)之前已描述(Tigges 及 Fussenegger，2006)。細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染a)貼壁細(xì)胞之培養(yǎng)在37 °C下在含有5 % CO2之濕潤氣氛中，在補(bǔ)充有5 % FCS (PAN Biotech, Aidenbach, Germany ；目錄號 3302，批號 P231902)之 ChoMaster HTS 培養(yǎng)基(Cell Culture Technology, Gravesano, Switzerland)或 Dulbecco 改質(zhì)之 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM ； Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培養(yǎng)中國倉鼠卵巢(CH0-K1 ；ATCC CCL-61)及人類胚腎 細(xì)胞(HEK-293 ；ATCC CRL-1573)。為了瞬間轉(zhuǎn)染，將1 X IO5個(gè)細(xì)胞接種于12孔組織培養(yǎng) 板之一個(gè)孔中，24h后，用改良的基于磷酸鈣的方案47或FUGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Basel, Switzerland)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用表達(dá)及選擇載體以及抗生素之以下組合來產(chǎn)生為組成型轉(zhuǎn) 基因表達(dá)而工程化之單轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定CH0-K1衍生物(i)CHO-Slyl16及CHO-Slyl23 ；pRP24 ； 400 μ g/ml G418 (Merck) ； (ii) CH0_Muncl8c8 及 CH0_Muncl8c9、pRP17 ;400 μ g/ml G418。雙 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株 CH0-Slyl-Muncl8ci 及 CHO-Slyl-Xbpl4 系藉由將 pRP17 與 pPUR(Clontech)、 pcDNA3. I-Xbp-I35與pPUR分別共轉(zhuǎn)染至CHO-Slyl23中，接著以G418及嘌呤霉素(4 μ g/ ml)進(jìn)行克隆選擇來構(gòu)建。藉由將pcDNA3. I-Xbp-I與pZeoSV2 (Invitrogen)共轉(zhuǎn)染至 CH0-Slyl-Muncl8ci 中，接著以 G418 (400 μ g/ml)、嘌呤霉素(4yg/ml)及零霉素(zeocin) (150 μ g/ml)進(jìn)行選擇來產(chǎn)生使能夠組成型表達(dá)slyl、muncl8c及xbp-Ι之三轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 株 CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17。b)懸浮液培養(yǎng)物將產(chǎn)生單克隆抗體(mAB)的CH0-DG44細(xì)胞的懸浮液培養(yǎng)物(Urlaub等人，1986) 及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物培育于BI專屬(ΒΙ-proprietary)化學(xué)確定的(chemically defined) 無血清培養(yǎng)基中。每2-3天轉(zhuǎn)種(sub-cultivated)晶種儲備培養(yǎng)物，接種密度分別為 3X 105-2X 105個(gè)細(xì)胞/毫升。使細(xì)胞生長于T-燒瓶或搖瓶(Nunc)中。在5%C02、37°C及 120rpm下，在濕潤培育箱(Thermo)中培育T-燒瓶且在Multitron HT培育箱(Infors)中培育搖瓶。使用血球計(jì)通過臺盼藍(lán)排除法(trypan blue exclusion)，來測定細(xì)胞濃度及活 力。補(bǔ)料分批培養(yǎng)將細(xì)胞以3X IO5個(gè)細(xì)胞/毫升接種于IOOOml搖瓶中，于250ml無抗生素或 MTX(Sigma-Aldrich,Germany)之BI-專屬生產(chǎn)型培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在120rpm、37°C、5% CO2中攪拌，稍后，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目增加時(shí)將CO2降至2%。每日測定培養(yǎng)參數(shù)，包括pH值、葡萄 糖及乳酸鹽濃度，根據(jù)需要用NaCOjfpH值調(diào)節(jié)至pH 7.0。每24hr添加BI-專屬補(bǔ)料溶 液。用自動化CEDEX細(xì)胞定量系統(tǒng)(Irmovatis)通過臺盼藍(lán)排除法來測定細(xì)胞密度及活力。 收集來自細(xì)胞培養(yǎng)液之試樣，通過ELISA測量滴度。為進(jìn)行ELISA，使用抗人類-Fe片段之抗體(Jackson Immuno ResearchLaboratories)及偶聯(lián) HRP 的人類 κ 輕鏈(Sigma)。將累積的比生產(chǎn)率(cumulative specific productivity)計(jì)算為指定日的產(chǎn)物 濃度除以直至該時(shí)間點(diǎn)的〃活細(xì)胞總數(shù)〃 (integral of viable cells，IVC)。RNA分離、RT-PCR及定量實(shí)時(shí)PCR用 NucleoSpin RNA II 試劑盒(Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland), 從哺乳動物細(xì)胞制備總RNA,用TITANIUM One-Step RT-PCR試劑盒(Clontech)根 據(jù)制造商方案進(jìn)行RT-PCR。seap、samy及Vegf121 mRNA之相對定量系以Applied Biosystems 7500 實(shí)時(shí) PCR 裝置，使用 25 μ 1 含有 Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems，Warrington，UK)、IOOng cDNA、900nM 正向及反向引物(特異 于 seap(5 ‘ -AGGCCCGGGACAGGAA-3 ‘，SEQID NO 17 ；5 ‘ -GCCGTCCTTGAGCACATAGC-3 ‘， SEQ ID NO 18)、特異于 samy(5 ‘ -AAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTC-3 ‘，SEQ ID NO 19; 5' -AACACGACATCGGCGTACACT-3‘，SEQ ID NO 20)及特異于 Vegf121 (5‘ -CTTGCTGCTCTACC TCCACCAT-3‘，SEQ ID NO 21 ；5' -TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3‘，SEQ ID NO 22))之反應(yīng) 液來進(jìn)行。使用核糖體ISs-RNA特異性轉(zhuǎn)錄物試驗(yàn)(Applied Biosystems)將所有試樣均 標(biāo)準(zhǔn)化且對所有擴(kuò)增子(amplicons)均進(jìn)行解鏈曲線分析，以證實(shí)不存在非特異性擴(kuò)增。共焦顯微法在48h之后將接種且轉(zhuǎn)染于涂布聚賴氨酸之玻璃載片上的HEK-293以磷酸鹽緩 沖鹽水(PBS)洗滌，以低聚甲醛(paraformaldehyde，3固定，以PBS再次洗滌，且藉 由共焦顯微法分析。以Leica TCS SPl (Leica, Heerbrugg, Switzerland)記錄影像且藉由 Adobe Photoshop 10 力口以分析?？贵w、免疫沉淀及Western印跡法將哺乳動物細(xì)胞在冰上溶胞緩沖液(50mM Tris-HCL, pH 7. 5、150mMNaCl、ImM DTTUmM EDTAU % Triton X-100)中裂解。4°C、14，000X g 離心 lOmin，接著 4°C 與蛋白 A-Sepharose 珠粒(Amersham Biosicences, Uppsla, Sweden) 一起培育 30min,—次獲得總 蛋白溶胞物。4°C旋轉(zhuǎn)過夜，使2mg總蛋白與親和純化的Muncl8c抗體(與蛋白A-S印harose 偶聯(lián))混合于最終體積為500μ 1的溶胞緩沖液中，進(jìn)行免疫沉淀。接著將珠粒用500μ 1 溶胞緩沖液洗滌四次，洗脫蛋白，用SDS-PAGE分離，接著進(jìn)行Western印跡分析。特異于 Slyl 的抗體由 Jesse Hay (University of Montana,Missoula,MO, USA)友情提供。特異于Muncl8a>^Mffi-n SS 4 R Vamp2 的自 SynapticSystems (Goettingen, Germany), 抗 Munc 18b、Munc 18c 及 p27Kipl 的抗體來自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz，CA， USA)。使用 ECL-Plus 偵測試劑及偶聯(lián) HRP 的第二抗體(Amersham，Piscataway，NJ，USA)來 觀測經(jīng)印跡之蛋白。蛋白生產(chǎn)蛋白生產(chǎn)在培養(yǎng)48h之后用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來評估SEAP，基于對硝基苯磷酸鹽之光 吸收時(shí)間過程；SAMY，藍(lán)淀粉 Phadebas .試驗(yàn)(Pharmacia Upjohn, Peapack，NJ，目錄 號 10-5380-32) ；VEGF121，人 VEGF121 特異性 ELISA(R&DSystem, Minneapolis, MN,目錄號 DY293)；利妥昔單抗，ELISA (Sigma,目錄號 12136 及 A0170)。如下測定生長于懸浮液培養(yǎng)物中之細(xì)胞的抗體滴度及比生產(chǎn)率以雙順反子載體轉(zhuǎn)染產(chǎn)抗體的CH0-DG44，分析異源蛋白表達(dá)對mAb生產(chǎn)率之影 響。為評定種子儲用培養(yǎng)物之生產(chǎn)率，自三個(gè)連續(xù)繼代收集來自細(xì)胞培養(yǎng)物上清之試樣。接 著藉由酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來分析產(chǎn)物濃度。為進(jìn)行ELISA，使用抗人類-Fc片段抗 體(Jackson Immuno ResearchLaboratories)及偶聯(lián) HRP 的人類 κ 輕鏈(Sigma)。連同細(xì) 胞密度及活力一起，如下計(jì)算比生產(chǎn)率， qp =比生產(chǎn)率(pg/細(xì)胞/天)mAb =抗體濃度(mg/L)t=時(shí)點(diǎn)(天)cc =細(xì)胞計(jì)數(shù)(X IO6細(xì)胞/毫升)P =代 利妥昔單抗之N-連接糖基化概況利妥昔單抗用蛋白A-Siipharose純化，以IOmM甘氨酸緩沖液(pH 2. 8)洗脫，接著 以2M Tris (pH 9.0)中和。藉由SDS-PAGE證實(shí)純度/完整性。接著在37°C以2mM Tris (pH7) 中之 0. 05mU/mg 蛋白進(jìn)行 N-糖苷酶消化(PNGaseF, EC 3. 5. 1. 52，QA-Bio, San Mateo, CA) 歷時(shí)3h，從而使寡糖自抗體中酶促釋放。在150mM乙酸中培育所釋放之寡糖，隨后以DHB 作為基質(zhì)(Papac 等人，1998)，使用 Autoflex MALDI/TOF (Bruker Daltonics, Faellanden, Switzerland)，以陽離子模式操作來進(jìn)行MALDI分析。HRP轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)以編碼分泌型辣根過氧化物酶(ssHRP)的構(gòu)建體與空載體、表達(dá)MimC18C、Slyl的 構(gòu)建體或編碼Muncl8c及Slyl兩者的雙順反子表達(dá)單元中之任一者來共轉(zhuǎn)染人類HT1080 纖維肉瘤細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24h及48h后，自細(xì)胞培養(yǎng)液取樣，將澄清細(xì)胞的上清與TMB試劑 (BD Biosciences, Pharmingen) 一起培育，偵測報(bào)道蛋白ssHRP之分泌。3min后，停止反 應(yīng)，以ELISA讀取器(Spectra Rainbow Thermo)在450nm測量光吸收度，以確定ssHRP滴 度。為進(jìn)一步分析比生產(chǎn)率，在最后一次測量之后將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用CASY 細(xì)胞 計(jì)數(shù)器(Schaerfe System)計(jì)數(shù)，將ssHRP滴度除以細(xì)胞總數(shù)來計(jì)算比生產(chǎn)率。
實(shí)施例實(shí)施例1 將Slyl及Muncl8c沿分泌途徑在HEK-293中定位。我們使用基于RT-PCR之分析以描繪SM蛋白Slyl及Muncl8之同工型(a、b、c)在 HEK-293 中之表達(dá)。如在圖 Ia 及 Ib 中所示，slyl(NM_016160)及 muncl8c (NM_007269)表達(dá) 水平較高，mucl8b (NM_006949)痕量表達(dá)，未能偵測到神經(jīng)元特異性muncl8a (NM_003165) 之轉(zhuǎn)錄物。藉由Western印跡法(圖Ic)來證實(shí)SM蛋白概況。藉由在HEK-293中共表達(dá) YFP-Slyl (pRP32)與 CFP-突觸融合蛋白 5 (pRP40)或 YFP-Munc 18c (pRP23)與 CFP-突觸融 合蛋白4(pRP29)來分析Slyl及Muncl8主要同工型Muncl8c之細(xì)胞內(nèi)定位。突觸融合蛋 白5為定位于高爾基體之結(jié)合Slyl的SNARE，突觸融合蛋白4為與細(xì)胞膜結(jié)合之與MimclSc 相互作用的SNARE。共焦顯微法展示，Slyl顯示與突觸融合蛋白5在高爾基體處極致密之 核周共定位，MimclSc與突觸融合蛋白4之細(xì)胞膜共染色(co-stain)(圖Id)。此等結(jié)果證 明Slyl及MimclSc在HEK-293中表達(dá)且定位于高爾基體與細(xì)胞膜，此系與其在各個(gè)細(xì)胞器 處之兩個(gè)獨(dú)特融合步驟中之作用一致(Jahn等人，2003)。實(shí)施例2 =Slyl及Muncl8對蛋白分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)。已知SM蛋白控制對細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)必需之小泡融合，但其對于蛋白分泌之作用 仍未知。為表征Slyl及MimclS對總體胞吐作用之影響，我們設(shè)計(jì)了這些SM蛋白的特異性 shRNA。Slyl及MimclSc的敲低用以下方法證明細(xì)胞用雙順反子性質(zhì)的編碼Slyl (pRP3 ； PhCMV-slyl-IRES-eGFP-pA)及編碼 Munc 18c (pRP4 ;PhCMV-munc 18c-IRES_eGFP-pA)的報(bào)道構(gòu) 建體與特異性以及非特異性對照物shRNA共轉(zhuǎn)染，進(jìn)行熒光顯微鏡檢(圖2)。在HEK-293 中證實(shí)，各個(gè)shRNA將內(nèi)源Slyl及Muncl8c表達(dá)最多敲低70%之能力(圖3a及3c)。為 分析Slyl及MimclSc敲低對哺乳動物細(xì)胞之總體蛋白分泌能力的影響，我們將pSEAP2 對照物及 PRP5 (ShRNAslylj)、pRP6 (shRNAslyl 2)、pRP7 (shRNAslyl 3)或 pRP12 (shRNAmuncl8c l)、 pRP14 (ShRNAmuncl8c 2)、pRP38 (shRNAmuncl8c 3)、pRP39 (shRNAmuncl8c 4)共轉(zhuǎn)染至 HEK-293 中，確定 培養(yǎng)上清中的SEAP水平。Slyl及MimclSc的敲低與SEAP產(chǎn)量減少直接相關(guān)，表明此等SM 蛋白在哺乳動物分泌途徑中起重要作用(圖3b及3d)。實(shí)施例3 =Slyl及Muncl8c之異位表達(dá)提高哺乳動物細(xì)胞之分泌能力。在Slyl 或 Muncl8c 于 CH0-K1 中異位表達(dá)(圖 4a 4b,4c)之后，SEAP、SAMY 或 VEGF121之異源生產(chǎn)提高至多5倍，這與用以啟動產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄的啟動子(PSV4C1、Phctw> PefiJ 無關(guān)。當(dāng)使用HEK-293細(xì)胞時(shí)，亦觀察到類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未展示)。因?yàn)镾EAP、SAMY及VEGF 之mRNA水平在有或無升高之Slyl、MimC18C或兩者之情況下都基本恒定(圖4d)，所以異源 蛋白產(chǎn)量之提高系由轉(zhuǎn)譯后機(jī)制介導(dǎo)。我們的結(jié)果與主張MimclS蛋白在一系列細(xì)胞類型 (包括脂肪細(xì)胞及肌細(xì)胞)中對胞吐有抑制作用的先前研究(Riento等人，2000 ；Kanda等 人，2005 ；Tellam等人，1997 ；Thurmond等人，1998)形成鮮明對比，，這是首次提供Muncl8c 及Slyl均促進(jìn)總體胞吐作用的證據(jù)。實(shí)施例4 :SM蛋白及Xbp-I對分泌途徑之協(xié)同效應(yīng)。因?yàn)镾lyl及MunclS以及Xbp-I (最近被鑒定為通過增大分泌細(xì)胞器之尺寸來增 強(qiáng)蛋白分泌(Tigges及Fussenegger，2006))在分泌途徑中具有不同目標(biāo)，所以其可能能夠 協(xié)同地提高蛋白產(chǎn)量。因此我們將編碼Slyl、MunclSc及Xbp-I的表達(dá)載體以及含SEAP、 SAMY及VEGF121的表達(dá)載體的不同組合共轉(zhuǎn)染至CHO-Kl中，確定培養(yǎng)上清中的報(bào)道蛋白水平。如圖4a中所示，slyl與munC18C同時(shí)過度表達(dá)引起SEAP產(chǎn)量提高8倍，相比之下，單 獨(dú)之slyl或muncl8c僅導(dǎo)致提高5倍。SAMY及VEGF121之分泌亦增多(圖4b,4c)。slyl、 muncl8c及xbp_l全都過度表達(dá)將SEAP、SAMY及VEGF之分泌分別增多10倍、12倍及8倍 (圖4a、4b、4c)，明顯地說明在Slyl與Muncl8c之間及在兩種SM蛋白與通用細(xì)胞器擴(kuò)張因 子Xbp-I之間存在對分泌的協(xié)同效應(yīng)。實(shí)施例5 =SM蛋白藉由刺激SNARE介導(dǎo)之轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來提高分泌能力。先前研究指定MimclSc在胞吐中起抑制作用，其與在本文中報(bào)道之結(jié)果形成對比 (Riento 等人，2000 ；Kanda 等人，2005 ；Tellam 等人，1997 ；Thurmond 等人，1998)。為從分子 水平研究Muncl8c在轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中之作用，尤其是其與由突觸融合蛋白4、SNAP-23及VAMP2 組成之胞吐SNARE蛋白之相互作用，我們進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。如圖5中所示，MimclSc-特異 性抗體定量沉淀Muncl8c以及顯著量的突觸融合蛋白4、SNAP-23及VAMP 2，表明Muncl8c 與這些SNARE在體內(nèi)相關(guān)(association)，其在分泌途徑中促進(jìn)小泡-細(xì)胞器融合(Peng and Gallwitz，2002 ；Shen等人，2007 ；Scott等人，2004)。此發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)，類似于與完全組裝 之SNARE復(fù)合物結(jié)合且促進(jìn)融合高爾基體之Slyl，Munc 18c亦與SNARE復(fù)合物直接相互作 用，提示抑制通過促進(jìn)SNARE介導(dǎo)之轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制而起作用的保守機(jī)制。實(shí)施例6 對哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基于SM蛋白的工程化以提高哺乳動物細(xì)胞中的分 泌能力。Slyl及Muncl8c表達(dá)對哺乳動物細(xì)胞分泌能力之正面效應(yīng)提出一種對哺 乳動物生產(chǎn)細(xì)胞株進(jìn)行工程化以提高分泌的新穎轉(zhuǎn)譯后方法。因此我們制得穩(wěn)定的 CHO-Kl衍生細(xì)胞株，它們經(jīng)工程化后能組成型表達(dá)slyl (CHO-Slyl16及CHO-Slyl23)或 muncl8c (CH0_Muncl8c8 及 CH0_Muncl8c9)。CHO-Slyl16 及 CHO-Slyl23 刺激 4 倍和 8 倍的 SEAP 分泌(圖6a)及4倍和5倍的SAMY生產(chǎn)(圖6b)。有趣的是，產(chǎn)生較多SEAP之CHO-Slyl23 亦展示較高的Slyl水平，表明SM與產(chǎn)物蛋白正相關(guān)(圖6c)。類似地，因轉(zhuǎn)基因而為組成型 表達(dá)muncl8c的細(xì)胞(CHO-Munc 18c9)的SEAP產(chǎn)量多9倍，SAMY產(chǎn)量多6. 5倍(圖6e及6f)， 產(chǎn)生更多SEAP的CH0-Muncl89亦展示較高的Muncl8c水平(圖6d)。與親本CHO-Kl相比，組 成型表達(dá)Slyl及Muncl8c的雙轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定細(xì)胞株CH0-Slyl-Muncl8ci的SEAP產(chǎn)量高出13 倍，組成型表達(dá)Slyl、Munc 18c及Xbp-I的三轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定細(xì)胞株CH0-Slyl-Muncl8c_Xbp-l7 的SEAP產(chǎn)量高出16倍(圖6g)。實(shí)施例7 基于SM蛋白的分泌工程化提高生產(chǎn)細(xì)胞株對抗體的比生產(chǎn)率。為在原型生物藥生產(chǎn)方案中驗(yàn)證基于SM蛋白之分泌工程化，我們使稱為利 妥昔單抗之單克隆抗人類⑶20 IgGl在CHO-Slyl16及CHO-Slyl23中表達(dá)(增加至多 10倍)、在CH0-Slyl-Muncl8ci中表達(dá)(增加至多15倍)及在CHO-Slyl-Xbp-I4中表 達(dá)(增加至多13倍)及在CH0-Slyl-MunC18C-Xbp-l7中表達(dá)(增加至多19倍)(圖 7a)。當(dāng)在CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中產(chǎn)生利妥昔單抗時(shí)，可達(dá)到至多40pg/細(xì)胞/天 之特別制造水平，其比同基因?qū)φ占?xì)胞株增加近20倍(圖7a)。SDS-PAGE分析表明，由 CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17及野生型CHO-Kl細(xì)胞產(chǎn)生的抗體結(jié)構(gòu)完整且彼此無法區(qū)別 (圖7b,7c)。對CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中產(chǎn)生的利妥昔單抗的N-連接Fc寡糖進(jìn)行 基于Maldi-TOF的糖基化概況分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與天然生產(chǎn)細(xì)胞株相比無差異，表明基于SM/ Xbp-I之分泌工程化并不損害產(chǎn)物質(zhì)量(圖7d及7e)。
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實(shí)施例8 基于SM蛋白的分泌工程化提高生產(chǎn)過程中的抗體總產(chǎn)量。a)為測試SM蛋白之異源表達(dá)是否亦可用以在工業(yè)制造之相關(guān)條件下提高治療 用蛋白的分泌，以空載體(MOCK對照物)或編碼Slyl(SEQ ID NO. 41)或Munc-18 (SEQ ID NO. 39)或兩者之表達(dá)構(gòu)建體作為雙順反子表達(dá)單元來穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分泌人源化抗⑶44v6 IgG 抗體BIWA 4的產(chǎn)抗體CHO細(xì)胞株(CH0DG44)。接著使細(xì)胞經(jīng)受選擇以獲得穩(wěn)定細(xì)胞池(cell pool)。在六次后續(xù)傳代期間，自所有穩(wěn)定細(xì)胞池之種子儲用培養(yǎng)物取上清，藉由ELISA測 定MCP-I滴度，將其除以細(xì)胞平均數(shù)來計(jì)算比生產(chǎn)率。在所有表達(dá)任一 SM蛋白之細(xì)胞中， 與MOCK或未經(jīng)轉(zhuǎn)染之細(xì)胞相比，IgG表達(dá)均顯著提高，最高值見于同時(shí)表達(dá)兩種SM蛋白之 細(xì)胞池中。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物進(jìn)行分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵可獲得類似結(jié)果。每日測量細(xì)胞總數(shù) 及細(xì)胞活力，且在第3天、第5天、第7天、第9天及第11天，自細(xì)胞培養(yǎng)液取樣以測定IgG滴 度及比生產(chǎn)率(圖10AU0B)。在此等條件下，與MOCK對照物及未經(jīng)轉(zhuǎn)染之親本細(xì)胞株相比， SM蛋白轉(zhuǎn)基因細(xì)胞展示類似生長特性。然而與MOCK對照物相比，在表達(dá)Slyl或Munc-18 或同時(shí)表達(dá)兩種SM蛋白之細(xì)胞中IgG比生產(chǎn)率顯著提高(高至多50%)(圖10A)，造成在 制造過程中單克隆抗體滴度明顯增加(圖10B)。這些數(shù)據(jù)一起證明，基于SM蛋白之細(xì)胞工程化方法可用于以多種培養(yǎng)形式(包括 系列培養(yǎng)、生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)及補(bǔ)料分批培養(yǎng))提高治療用蛋白的產(chǎn)量。b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID N0. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白一起 之載體轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞(CH0 DG44)。使細(xì)胞經(jīng)受選擇壓力，挑選異源表達(dá)SM蛋白的細(xì) 胞株。隨后，此等細(xì)胞株及CHO DG 44野生型細(xì)胞平行地以編碼人類單克隆IgG型抗體作 為目標(biāo)基因的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。在第二輪選擇之后，自所有歷經(jīng)六次后續(xù)傳代的穩(wěn)定細(xì)胞 池之種子儲用培養(yǎng)物取上清，藉由ELISA測定IgG滴度，將其除以細(xì)胞平均數(shù)來計(jì)算比生產(chǎn) 率。最高值見于同時(shí)攜兩種SM蛋白之細(xì)胞池，其次是表達(dá)單獨(dú)之Slyl或Munc-18者， 其仍產(chǎn)生與不表達(dá)任一 SM蛋白之CHO DG-44細(xì)胞相比顯著更高之抗體滴度。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 物進(jìn)行分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵可獲得類似結(jié)果。在上述每一種情況中，兩種SM蛋白都過 度表達(dá)引起抗體滴度及比生產(chǎn)率均顯著提高。此表明，單獨(dú)之Slyl或Munc-18之異源表達(dá) 足以增強(qiáng)治療用抗體的分泌。另外，兩種蛋白之異源表達(dá)以組合形式聯(lián)合地以協(xié)同方式在 瞬間以及在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中增強(qiáng)總體胞吐作用。實(shí)施例9 :SM蛋白之過度表達(dá)提高成纖維細(xì)胞活化蛋白 α (FibroblastActivation Protein alpha, FAP)之生物藥蛋白產(chǎn)量。(a)表達(dá)跨膜明膠酶成纖維細(xì)胞活化蛋白α (FAP)之人類纖維肉瘤細(xì)胞株 (ΗΤ1080, ATCC CCL-121)以空載體(M0CK 對照物)、或以編碼 Slyl (SEQ IDN0. 41)或 Munc-18 (SEQ ID NO. 39)或編碼兩種蛋白作為雙順反子表達(dá)單元的表達(dá)構(gòu)建體來轉(zhuǎn)染。接 著使細(xì)胞經(jīng)受選擇以獲得穩(wěn)定細(xì)胞池。自此等池之種子儲用培養(yǎng)物收集細(xì)胞，將其固定以 便藉由FACS測定FAP表面表達(dá)，或制備細(xì)胞溶胞物以便使用抗FAP抗體進(jìn)行Western印跡 法。與MOCK細(xì)胞相比，細(xì)胞表面FAP量在所有表達(dá)SM蛋白之細(xì)胞中均顯著增大，且在表達(dá) Slyl及Munc-18兩者之細(xì)胞中表達(dá)為最高。此等結(jié)果表明，兩種SM蛋白協(xié)同地增強(qiáng)細(xì)胞產(chǎn) 生及轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞表面跨膜蛋白的能力。
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b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID NO. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白一起 之載體轉(zhuǎn)染人類HT1080或HEK293細(xì)胞。使細(xì)胞經(jīng)受選擇壓力，挑選異源表達(dá)SM蛋白的細(xì) 胞株。隨后，此等細(xì)胞株及1111080或冊1(293野生型細(xì)胞平行地以編碼？4 0作為目標(biāo)基因 的載體轉(zhuǎn)染。在第二輪選擇之后，自所有穩(wěn)定細(xì)胞池之培養(yǎng)物取細(xì)胞，藉由FACS或Western 印跡法來測定FAP表達(dá)量。最高值見于攜兩種SM蛋白之細(xì)胞池，其次是表達(dá)單獨(dú)之Slyl 或Mimc-18者，其仍表達(dá)與不表達(dá)任一 SM蛋白之親本細(xì)胞相比顯著更高之FAP水平。使 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物適應(yīng)于在懸浮液中生長且經(jīng)受分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵，則可獲得類似結(jié)果。 在所述每一種情況中，兩種SM蛋白一起過度表達(dá)引起FAP表達(dá)顯著增多。此表明Slyl及 Mimc-18之異源表達(dá)引起跨膜蛋白之產(chǎn)量及細(xì)胞表面定位的改進(jìn)，在異源引入組合之兩種 蛋白后，效果為最佳。實(shí)施例10 =SM蛋白之過度表達(dá)增佳跨膜蛋白表皮生長因子受體(EGFR)之生物藥
蛋白產(chǎn)量。(a)表達(dá)跨膜蛋白表皮生長因子受體(EGFR)之CHO細(xì)胞株(例如CH0-DG44)以 空載體(MOCK對照物)或編碼Slyl (SEQ ID NO. 41)或Munc_18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋 白作為雙順反子表達(dá)單元之表達(dá)構(gòu)建體來轉(zhuǎn)染。接著使細(xì)胞經(jīng)受選擇以獲得穩(wěn)定細(xì)胞池。 在四次后續(xù)傳代期間，自此等池之種子儲用培養(yǎng)物取細(xì)胞，藉由FACS或Western印跡法測 定EGFR表達(dá)量。與MOCK細(xì)胞相比，細(xì)胞表面EGFR量在所有表達(dá)SM蛋白之細(xì)胞中均顯著 增大，在表達(dá)Slyl及Mimc-18兩者之細(xì)胞中為最高。使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物經(jīng)受分批發(fā)酵或補(bǔ)料分 批發(fā)酵，可獲得極類似結(jié)果。在所述每一種情況中，Slyl或Mimc-18之過度表達(dá)引起EGFR 表達(dá)與對照物相比中等增加，而一旦Slyl與Mimc-18同時(shí)過度表達(dá)后EGFR水平即顯著提 高，表明兩種SM蛋白協(xié)同地增強(qiáng)細(xì)胞在多種培養(yǎng)形式(包括系列培養(yǎng)、生物反應(yīng)器分批培 養(yǎng)及補(bǔ)料分批培養(yǎng))中產(chǎn)生及轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞表面跨膜蛋白的能力。b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID N0. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白一起 之載體轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞(CH0 DG44)。使細(xì)胞經(jīng)受選擇壓力，挑選異源表達(dá)SM蛋白的細(xì) 胞株。隨后，此等細(xì)胞株及CHO DG 44野生型細(xì)胞平行地以編碼EGFR作為目標(biāo)基因的載體 轉(zhuǎn)染。在第二輪選擇之后，從六次連續(xù)傳代的所有穩(wěn)定細(xì)胞池之種子儲用培養(yǎng)物取細(xì)胞，藉 由FACS或Western印跡法來測定EGFR表達(dá)量。最高值見于攜兩種SM蛋白之細(xì)胞池，其次 是表達(dá)單獨(dú)之Slyl或Mimc-18者，其仍表達(dá)與不表達(dá)任一 SM蛋白之CHO DG-44細(xì)胞相比 顯著更高之EGFR水平。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物進(jìn)行分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵可獲得類似結(jié)果。在 所述每一種情況中，兩種SM蛋白一起之過度表達(dá)引起EGFR表達(dá)顯著增加。此表明Slyl及 Mimc-18之異源表達(dá)使跨膜蛋白之產(chǎn)量及細(xì)胞表面定位都改進(jìn)，一旦異源引入組合之兩種 蛋白后，效果最好。實(shí)施例11 =SM蛋白之過度表達(dá)增加單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-I)之生物藥蛋白產(chǎn)量。(a)分泌單核細(xì)胞趨化蛋白I(MCP-I)之CHO細(xì)胞株(CH0 DG44)以空載體(M0CK 對照物)或編碼Slyl (SEQ ID N0. 41)或Munc_18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白作為雙順反 子表達(dá)單元之表達(dá)構(gòu)建體來轉(zhuǎn)染。接著使細(xì)胞經(jīng)受選擇以獲得穩(wěn)定細(xì)胞池。在六次后續(xù)傳 代期間，自所有穩(wěn)定細(xì)胞池之種子儲用培養(yǎng)物取上清，藉由ELISA測定MCP-I滴度，將其除 以細(xì)胞平均數(shù)來計(jì)算比生產(chǎn)率。在所有表達(dá)任一 SM蛋白之細(xì)胞中，與MOCK或未經(jīng)轉(zhuǎn)染之細(xì)胞相比，IgG表達(dá)均顯著增加，最高值見于同時(shí)表達(dá)兩種SM蛋白之細(xì)胞池中。對穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染物進(jìn)行分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵可獲得類似結(jié)果。在所述每一種情況中，兩種SM蛋白之 過度表達(dá)引起MCP-I分泌增強(qiáng)，表明兩種SM蛋白協(xié)同改進(jìn)細(xì)胞在多種培養(yǎng)形式(包括系列 培養(yǎng)、生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)及補(bǔ)料分批培養(yǎng))中產(chǎn)生蛋白的能力。b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID NO. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白一起 之載體轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞(CHO DG44)。使細(xì)胞經(jīng)受選擇壓力，挑選異源表達(dá)SM蛋白的細(xì)胞 株。隨后，此等細(xì)胞株及CHO DG 44野生型細(xì)胞平行地以編碼單核細(xì)胞趨化蛋白I(MCP-I) 作為目標(biāo)基因的載體轉(zhuǎn)染。在第二輪選擇之后，自所有歷經(jīng)六次后續(xù)傳代的穩(wěn)定細(xì)胞池之 種子儲用培養(yǎng)物取上清，藉由ELISA測定MCP-I滴度，將其除以細(xì)胞平均數(shù)來計(jì)算比生產(chǎn) 率。最高值見于攜兩種SM蛋白之細(xì)胞池，其次是表達(dá)單獨(dú)之Slyl或Mimc-18者，其仍 產(chǎn)生與不表達(dá)任一 SM蛋白之CHO DG-44細(xì)胞相比顯著更高之MCP-I滴度。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物 進(jìn)行分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵可獲得類似結(jié)果。在所述每一種情況中，兩種SM蛋白一起之 過度表達(dá)引起MCP-I滴度及比生產(chǎn)率均顯著提高。此表明單獨(dú)之Slyl或Mimc-18之異源 表達(dá)足以增強(qiáng)MCP-I分泌。然而，兩種蛋白之異源表達(dá)以組合形式聯(lián)合地以協(xié)同方式在瞬 間以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之細(xì)胞株中增強(qiáng)總體胞吐作用。實(shí)施例12 :SM蛋白增強(qiáng)人類細(xì)胞的HRP分泌。為解決SM蛋白過度表達(dá)是否亦可用以在非嚙齒動物細(xì)胞、尤其人類細(xì)胞中增強(qiáng) 分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)之問題，我們使用了編碼分泌型辣根過氧化物酶(ssHRP)之質(zhì)粒，其可用作組 成型蛋白分泌之報(bào)道物。人類纖維肉瘤細(xì)胞株(HT1080，ATCC CCL-121)以編碼ssHRP的表達(dá)質(zhì)粒，與空載 體(MOCK對照物)或編碼Slyl (SEQ ID NO. 41)、Munc 18 (SEQ IDN0. 39)或兩種蛋白作為雙 順反子表達(dá)單元之表達(dá)構(gòu)建體來共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)及48小時(shí)，自細(xì)胞培養(yǎng)物上清取 樣，分析過氧化物酶活性。在測量之后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)以測定細(xì)胞之比生產(chǎn)率。在24小時(shí)之后，可在表達(dá)Muncl8或Muncl8與Slyl兩者之細(xì)胞中偵測到與對照 細(xì)胞相比ssHRP分泌之略微增強(qiáng)(圖9)。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，與mock對照物相比，所有表達(dá) SM蛋白之細(xì)胞均展示提高之ssHRP滴度(圖9)。在MimclS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的試樣中測量到最 高值，其HRP活性比對照試樣提高約1. 4倍。經(jīng)MimclS或Slyl或兩種SM蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 與對照細(xì)胞相比，比生產(chǎn)率亦顯著提高(圖9)。此證實(shí)，兩種SM蛋白均功能性表達(dá)，且增強(qiáng)人類細(xì)胞的蛋白分泌。參考文獻(xiàn)清單Ansel, H. 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權(quán)利要求
一種在細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)異源蛋白的方法，其包括a)增加至少一種基因的表達(dá)，所述基因編碼來自SEC1/Munc18群(SM蛋白)的蛋白，及b)實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)異源蛋白的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1之方法，其中在步驟b)中該目標(biāo)異源蛋白的表達(dá)增加，優(yōu)選在步驟b)中 該目標(biāo)異源蛋白的分泌增加。
3.權(quán)利要求1或2之方法，其中步驟a)中的一個(gè)基因編碼三種MimclS同工型 (isoforms) :Muncl8a、b 或 c 中的一種，優(yōu)選為 Munc 18c (SEQ ID NO 39)。
4.權(quán)利要求1或2之方法，其中步驟a)中的一個(gè)基因編碼Sly-I(SEQ IDNO :41)。
5.權(quán)利要求1或2之方法，其中步驟a)包含增加至少兩個(gè)編碼SM-蛋白的基因的表 達(dá)，其中所述SM蛋白參與小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的兩個(gè)不同步驟。
6.權(quán)利要求5之方法，其中a)一個(gè)基因編碼能調(diào)節(jié)小泡與細(xì)胞膜融合的SM蛋白，b)第二基因編碼能調(diào)節(jié)小泡與高爾基復(fù)合體融合的SM蛋白。
7.權(quán)利要求5 或 6 之方法，其中 Muncl8c(SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ IDNO 41)的 表達(dá)增加。
8.權(quán)利要求1或2之方法，其中步驟a)包含i)增加編碼該SM蛋白家族之一個(gè)成員的第一基因之表達(dá)， )增加編碼該SM蛋白家族之另一成員的第二基因之表達(dá)，及iii)增加編碼XBP-I之第三基因的表達(dá)。
9.權(quán)利要求8 之方法，其中 Muncl8c(SEQ ID NO :39)、Sly-I (SEQ ID NO :41)及 XBP-I (SEQ ID NO 43)之表達(dá)增加。
10.一種細(xì)胞工程化之方法，其包含a)將一或多種載體系統(tǒng)引入細(xì)胞中，所述載體系統(tǒng)包含編碼至少兩種多肽之核酸序 列，其中i)至少一種第一核酸序列編碼SM-蛋白，及 )第二核酸序列編碼目標(biāo)蛋白，b)表達(dá)該目標(biāo)蛋白及該至少一種SM-蛋白。
11.權(quán)利要求10之方法，其中該SM-蛋白為Munc-18同工型之一，優(yōu)選為Munc-18c(SEQ ID NO :39)，或 Sly-I (SEQ ID NO :41)。
12.權(quán)利要求10之方法，其中在步驟a)i)中組合使用兩種SM-蛋白，其中所述SM蛋白 參與小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的兩個(gè)不同步驟。
13.權(quán)利要求12之方法，其中a)一個(gè)基因編碼能調(diào)節(jié)小泡與細(xì)胞膜融合的SM蛋白，b)第二基因編碼能調(diào)節(jié)小泡與高爾基復(fù)合體融合的SM蛋白。
14.權(quán)利要求13之方法，其中組合使用的兩種SM-蛋白為Munc-18c(SEQ ID NO 39)及 Sly-KSEQ ID NO 41)。
15.權(quán)利要求10或12之方法，其中在步驟a)i)中兩種SM-蛋白與XBP-I組合使用。
16.權(quán)利要求15之方法，其中所述SM蛋白為Munc-18c(SEQID NO :39)及Sly-I (SEQ ID NO 41)與 XBP-I (SEQ ID NO 43)組合。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)之方法，其中該細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選為脊椎動物細(xì)胞，最 優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)之方法，其中該目標(biāo)蛋白為治療用蛋白。
19.權(quán)利要求18之方法，其中該目標(biāo)蛋白為抗體或抗體片段。
20.一種表達(dá)載體，其包含編碼至少兩種多肽的表達(dá)單元，其中a)至少一種多肽為SM-蛋白，及b)第二多肽為目標(biāo)蛋白。
21.權(quán)利要求20之表達(dá)載體，其中該目標(biāo)蛋白為治療用蛋白，優(yōu)選為抗體或抗體片段。
22.權(quán)利要求20或21之表達(dá)載體，其中所述表達(dá)單元為多順反子，優(yōu)選為雙順反子。
23.權(quán)利要求20-22之一的表達(dá)載體，其中該SM-蛋白為Munc-18同工型Munc_18a、 b、c 之一，優(yōu)選為 Munc-18c(SEQ ID NO :39)。
24.權(quán)利要求20-22之一的表達(dá)載體，其中該SM-蛋白為Sly-1(SEQIDNO :41)。
25.權(quán)利要求20-24之一的表達(dá)載體，其中組合使用至少兩種SM-蛋白。
26.權(quán)利要求25之表達(dá)載體，其中該載體包含至少一個(gè)配置如下之雙順反子表達(dá)單元a)編碼SM蛋白之基因，b)IRES組件，及c)編碼SM蛋白之第二基因。
27.權(quán)利要求20-26之一的表達(dá)載體，其中至少兩種SM-蛋白與XBP-I組合使用，優(yōu)選 為 Munc-18c (SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)與 XBP-1 (SEQ ID NO 43)組合。
28.一種細(xì)胞，其表達(dá)至少兩種異源基因a)至少一種基因編碼SM-蛋白，及b)另一基因編碼目標(biāo)蛋白。
29.權(quán)利要求28之細(xì)胞，其中該目標(biāo)蛋白為治療用蛋白，優(yōu)選為抗體或抗體片段。
30.權(quán)利要求28或29之細(xì)胞，其中該SM蛋白之表達(dá)量顯著高于內(nèi)源表達(dá)量，優(yōu)選高 10%。
31.權(quán)利要求28-30之一的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求20至27的任一表達(dá)載體。
32.權(quán)利要求28-31之一的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選為脊椎動物細(xì)胞，最優(yōu) 選為哺乳動物細(xì)胞。
33.權(quán)利要求32之細(xì)胞，其中該細(xì)胞為CHO細(xì)胞，優(yōu)選為CHODG44細(xì)胞。
34.一種目標(biāo)蛋白，優(yōu)選為抗體，其藉由權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)之方法所產(chǎn)生。
35.一種藥物組合物，其包含化合物及可藥用載劑，所述化合物適用于阻斷或降低一或 多種SM-蛋白之活性或表達(dá)。
36.權(quán)利要求35之藥物組合物，其中該化合物為多核苷酸序列。
37.權(quán)利要求36之藥物組合物，其中該多核苷酸序列為shRNA、RNAi、siRNA或反 義-RNA，優(yōu)選為shRNA。
38.權(quán)利要求35-37之一的藥物組合物，其中該SM-蛋白為Munc-18c(SEQ ID NO 39) 或Sly-I (SEQ ID NO 41)或該兩者之組合。
39.鑒別SM-蛋白功能的調(diào)節(jié)劑的方法，其包含a)提供至少一種SM-蛋白，優(yōu)選為Munc-18c，b)使步驟a)之該SM-蛋白與測試劑接觸，c)測定與增加或減少蛋白分泌或細(xì)胞表面蛋白表達(dá)相關(guān)的效應(yīng)。
40.治療癌癥、自身免疫病及炎癥的方法，包括對有此需要的患者施用治療有效量的權(quán) 利要求35-38之一的藥物組合物。
41.抑制或減少細(xì)胞增殖或遷移的方法，包括將所述細(xì)胞與權(quán)利要求35-38之一的藥 物組合物接觸。
42.SM-蛋白或編碼SM-蛋白之多核苷酸在活體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)系統(tǒng)中增加目標(biāo)蛋 白的分泌及/或生成的用途。
43.權(quán)利要求1-42之一的方法，表達(dá)載體，細(xì)胞或藥物組合物的診斷用途。全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之領(lǐng)域。其描述一種藉由異源表達(dá)Munc18c、Sly1或其它SM蛋白家族成員來增強(qiáng)蛋白在真核細(xì)胞中分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)的新穎方法。此方法尤其適用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)之制造能力之最優(yōu)化宿主細(xì)胞系統(tǒng)以表達(dá)及制造重組蛋白產(chǎn)物。
文檔編號C12N15/113GK101903529SQ200880122185
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者喬伊·M·斯圖茨, 勞爾·弗洛林, 埃里克·貝克, 希托·考夫曼, 彭仁旺, 馬丁·弗森尼格 申請人:貝林格爾英格海姆法瑪兩合公司