專利名稱：生產(chǎn)分泌性三聚受體類似物和生物活性融合蛋白的方法與組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，更具體來(lái)說(shuō)涉及產(chǎn)生和表達(dá)例如三聚可溶性受體的 分泌性和生物活性的三聚蛋白的方法。
背景技術(shù)：
在例如人的多細(xì)胞生物體中，細(xì)胞通過(guò)所謂的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑彼此通訊，其中分泌性 配體(例如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或激素)結(jié)合其細(xì)胞表面受體，導(dǎo)致受體激活。受體是 膜蛋白，其由負(fù)責(zé)配體結(jié)合的胞外域、中心跨膜區(qū)和負(fù)責(zé)向下游發(fā)送信號(hào)的胞質(zhì)域組成。 取決于分泌信號(hào)的來(lái)源和表達(dá)受體的靶細(xì)胞的位置，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以以下三種方式發(fā)生 旁分泌(鄰近細(xì)胞間通訊)、自分泌(細(xì)胞自身通訊)和內(nèi)分泌(遠(yuǎn)端細(xì)胞之間通過(guò)循 環(huán)進(jìn)行通訊)。受體激活(其在細(xì)胞膜下面引起包括基因表達(dá)激活在內(nèi)的事件級(jí)聯(lián))的 一種一般機(jī)制是，多肽配體(例如細(xì)胞因子)以寡聚形式存在，例如同型二聚體(homo-dimmer)或三聚體，其當(dāng)在細(xì)胞外表面結(jié)合至其單體受體時(shí)導(dǎo)致受體的寡聚化。 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在正常細(xì)胞發(fā)育和分化以及響應(yīng)例如細(xì)菌和病毒感染的外部損害中起重 要作用。在此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，激活不足(例如缺乏配體)或過(guò)度激活(例如配體過(guò)多) 形式的異常是例如關(guān)節(jié)炎、癌癥、AIDS和糖尿病的病理病狀和疾病的根本原因。治療這些虛弱疾病的當(dāng)前策略之一涉及使用誘殺受體如僅由胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 組成的可溶性受體來(lái)攔截配體，從而克服受體的過(guò)度激活。此策略的最佳實(shí)例是由Immunex (其現(xiàn)在是Amgen —部分)產(chǎn)生的Enbrel---種二聚可溶性TNF-a受體免疫球蛋白(IgG)融合蛋白(Mohler等人，1993; Jacobs等人，1997)。細(xì)胞因子的TNF 家族是身體為響應(yīng)感染或組織損傷而產(chǎn)生的一種主要促炎信號(hào)。然而，已經(jīng)證明這些細(xì) 胞因子的異常產(chǎn)生(例如在不存在感染或組織損傷下)是諸如關(guān)節(jié)炎和牛皮癬的疾病的 根本原因。TNF-cc受體在結(jié)合至其配體TNF-a之前在細(xì)胞表面上天然以單體形式存在， 相反，TNF-a以同型三聚體(homotrimer)的形式存在(Locksley等人，2001 )。因此，將可 溶性TNF-a受體與能夠通過(guò)二硫鍵自發(fā)二聚化(Sledziewski等人，1992和1998)的免疫 球蛋白Gl的Fc區(qū)融合，使得可以分泌二聚可溶性TNF-a受體(Mohler等人，1993; Jacobs 等人，1997)。與單體可溶性受體相比，二聚TNF-a受體II-Fc融合體對(duì)同型三聚配體具 有極為增大的親和力。這為其在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中的臨床使用提供了分子基 礎(chǔ)，所述類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是其中組成性提高的TNF-ot (—種主要促炎細(xì)胞因子)起到重 要致病作用的自身免疫疾病。盡管已證明Enbrel對(duì)TNF-a具有pM范圍(ng/mL)內(nèi)的 Ki (Mohler等人，1993)，但是RA患者需要進(jìn)行每周兩次25 mg (其可變?yōu)橛胮g/mL 水平的可溶性受體的形式表示)皮下注射，以達(dá)到臨床效果(www.enbrel.com)。每個(gè) RA患者高水平反復(fù)消費(fèi)Enbrel已經(jīng)對(duì)藥物供應(yīng)造成極大壓力以及高額費(fèi)用，這僅在本 國(guó)(注指美國(guó))就限制數(shù)百萬(wàn)潛在患者得到所述藥物。除TNF-a家族的有效促炎細(xì)胞因子之外，引起AIDS的HIV病毒也使用同型三聚外 被蛋白gpl20以進(jìn)入我們身體內(nèi)的CD-4陽(yáng)性T輔助細(xì)胞(Kwong等人，1998)。 HIV感 染期間的一個(gè)最早期事件涉及gpl20結(jié)合其在T輔助細(xì)胞的細(xì)胞表面獨(dú)特表達(dá)的受體 CD-4 (Clapham等人，2001)。十多年前已證明單體可溶性CD-4是抗HIV感染的有效藥 劑(Clapham等人，1989)，然而，當(dāng)證實(shí)其功效僅限于實(shí)驗(yàn)室HIV分離物時(shí)(Daar等人, 1990)，人們的興奮黯然破滅。事實(shí)證明來(lái)自AIDS患者的HIV株與實(shí)驗(yàn)室分離物不同， 其對(duì)單體可溶性CD-4具有極低的親和力，可能是因?yàn)間pl20上的序列變異(Daar等人, 1990)。盡管已經(jīng)制成二聚可溶性CD-4-Fc融合蛋白，但是由于對(duì)gpl20的低親和力， 這些誘殺性CD-4 HIV受體無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)室還是在臨床上對(duì)來(lái)自AIDS患者的天然HIV 均表現(xiàn)出極弱的抗病毒作用(Daar等人，1990)。顯然，極其需要能夠產(chǎn)生分泌性同型三聚可溶性受體或生物活性蛋白，其可具有對(duì) 其天然同型三聚配體(例如TNF家族的細(xì)胞因子和HIV外被蛋白)的完美對(duì)接(dock) 結(jié)合位點(diǎn)，因而具有更高的親和力。理論上這種三聚誘殺受體對(duì)其三聚配體具有的親和 力應(yīng)比其二聚對(duì)應(yīng)物更高。這種合理設(shè)計(jì)的可溶性三聚受體類似物可顯著提高臨床效果 以及降低各患者的藥物注射量或頻率。為了在治療上切實(shí)可行，和免疫球蛋白Fc—樣， 所需的三聚蛋白部分理想地應(yīng)為在體內(nèi)含量豐富并能夠有效發(fā)生自身三聚化的天然分 泌蛋白的一部分。膠原是作為胞外基質(zhì)的主要組分的纖維狀蛋白質(zhì)的一個(gè)家族。其為哺乳動(dòng)物中含量最豐富的蛋白質(zhì)，構(gòu)成將近25%的體內(nèi)總蛋白質(zhì)。膠原在骨、腱、皮膚、角膜、軟骨、血管和牙齒的形成中起著主要的結(jié)構(gòu)作用(Stryer, 1988)。原纖型膠原I、 II、 III、 IV、V和XI均被合成為稱作前膠原的較大的三聚前體，其中由幾百個(gè)"G-X-Y"重復(fù)(或稱甘氨酸重復(fù))組成的中央連續(xù)三股螺旋結(jié)構(gòu)域的側(cè)翼為非膠原結(jié)構(gòu)域(NC)、 N-前肽和C-前肽(Stryer, 1988)。 C-末端和N-末端突出物均在前膠原分泌時(shí)被蛋白酶解加工，這是引發(fā)成熟蛋白質(zhì)組裝為形成不溶性細(xì)胞基質(zhì)的膠原原纖維的事件(Prockop等人, 1998)。發(fā)現(xiàn)I型膠原的脫落三聚C-前肽在正常人的血液中濃度在100-600 ng/mL的范圍， 兒童具有較高水平，表明骨形成活躍。I型、IV型、V型和XI型膠原主要組裝為由兩條a-1鏈與一條a-2鏈(對(duì)于I型、 IV型、V型來(lái)說(shuō))或者在序列上高度同型的三條不同鏈(對(duì)于XI型來(lái)說(shuō))組成的異型 三聚形式。II型和III型膠原均為a-l鏈的同型三聚體。對(duì)于作為含量最豐富的膠原形式 的I型膠原來(lái)說(shuō)，也形成穩(wěn)定的a-l (I)同型三聚體，并且在不同組織中以不同水平存 在(Alvares等人，1999)。當(dāng)這些膠原C-前肽鏈在細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)過(guò)量表達(dá)時(shí)，大部分可以 自組裝為同型三聚體。盡管首先合成N-前肽結(jié)構(gòu)域，但是分子組裝為三聚膠原始于C-前肽的定位締合(in-register associatkm)。據(jù)認(rèn)為，C-前肽復(fù)合體通過(guò)形成鏈間二硫鍵 得以穩(wěn)定，但是為恰當(dāng)鏈定位(registration)而形成二硫鍵的必要性不明。甘氨酸的三 股螺旋重復(fù)出現(xiàn)，然后以拉鏈似的方式從發(fā)生締合的C-末端傳至N-末端。這一認(rèn)識(shí)導(dǎo) 致通過(guò)利用重組DNA技術(shù)交換不同膠原鏈的C-前肽而制造出非天然類型的膠原基質(zhì) (Bulleid等人，2001)。例如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的非膠原蛋白質(zhì)也已被融合到前膠原或 成熟膠原的N-末端，使得可以形成新的膠原基質(zhì)，這旨在使非膠原蛋白質(zhì)從細(xì)胞基質(zhì)緩 慢釋放(Tomita等人，2001)。然而，在此兩種情況下，均需要C-前肽在重組膠原原纖維 組裝為不溶性細(xì)胞基質(zhì)之前被切割。發(fā)明概述本文所公開(kāi)的發(fā)明使得可將任何可溶性受體或生物活性多肽制備成三聚形式的分 泌性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)在于使用重組DNA技術(shù)將任何可溶性受體和生物活性蛋白 質(zhì)同框融合到能夠自身三聚化的原纖維型膠原的C-前肽域。當(dāng)在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)所產(chǎn) 生的融合蛋白分泌為基本上全部為三聚形式的可溶性蛋白質(zhì)，所述三聚形式由在三條 C-前肽間所形成的分子內(nèi)二硫鍵共價(jià)加強(qiáng)。本發(fā)明的一個(gè)方面公開(kāi)生產(chǎn)分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟 (a)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建物，所述開(kāi) 放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的非膠原多肽的信號(hào)肽序列組成，而所述信號(hào)肽序列又 框內(nèi)連接至能夠自身三聚化的膠原的C-末端部分；(b)在生理?xiàng)l件下在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng) 基中生長(zhǎng)宿主細(xì)胞，使得可以分泌由所述DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(c)從宿 主細(xì)胞分離分泌性三聚融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)肽序列是待三聚化的蛋白質(zhì)的天然序列。在另一個(gè)實(shí)施方
案中，信號(hào)肽序列來(lái)源于與待三聚化分泌性蛋白質(zhì)不同的分泌性蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，待三聚化的非膠原多肽是由配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域所組成的可溶性受體。在一個(gè)實(shí)施方 案中，膠原的C-末端部分是無(wú)任何膠原三股螺旋區(qū)的C-前肽(序列ID: 3-4)。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，C-末端膠原由膠原三股螺旋區(qū)的一部分組成，所述部分作為與待三聚化 的非膠原蛋白質(zhì)的接頭(序列ID: 1-2)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，膠原的C-末端部分具 有突變的或缺失的BMP-1蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(序列ID: 3-4)。本發(fā)明的一個(gè)方面公開(kāi)生產(chǎn)分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建物，所述開(kāi) 放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的非膠原多肽的信號(hào)肽序列組成，而所述信號(hào)肽序列又 框內(nèi)連接可以自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自pro.ct.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)禾口 pro.a.3(XI); (b)在生理?xiàng)l件下在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)宿主細(xì)胞，使得可以分泌由 所述DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(c)從宿主細(xì)胞分離分泌性三聚融合蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，待三聚化的非膠原多肽是可溶性TNF-RII(p75)(序列ID: 9-12)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，待三聚化的非膠原多肽是可溶性CD-4，其為HIV的 共受體(序列ID: 13-16)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，待三聚化的非膠原多肽是分泌性 胎盤堿性磷酸酶(序列ID: 5-8)。本發(fā)明的一個(gè)方面公開(kāi)生產(chǎn)分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a) 向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第一 DNA構(gòu)建物，所述開(kāi) 放讀碼框由框內(nèi)連接到到待三聚化的非膠原多肽的信號(hào)肽序列組成，而所述信號(hào)肽序列 又框內(nèi)連接可以自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和 pro.a.3(XI); (b)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第二 DNA 構(gòu)建物，所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號(hào)肽序列組 成，而所述信號(hào)肽序列又框內(nèi)連接可以自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所述第二 C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)在生理?xiàng)l件下在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)宿 主細(xì)胞，使得可以分泌由所述第一與第二DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(d)從宿 主細(xì)胞分離分泌性三聚融合蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面公開(kāi)生產(chǎn)分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟 (a)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第一DNA構(gòu)建物，所 述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的非膠原多肽的信號(hào)肽序列組成，而所述信號(hào)肽序 列又框內(nèi)連接可以自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和 pro.a.3(XI); (b)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第二 DNA 構(gòu)建物，所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號(hào)肽序列組 成，而所述信號(hào)肽序列又框內(nèi)連接可以自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所述第二膠 原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框 轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第三DNA構(gòu)建物，所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的第三非膠 原多肽的第三信號(hào)肽序列組成，而所述信號(hào)肽序列又框內(nèi)連接可以自身三聚化的第三膠 原C-末端部分，所述第三膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 p腦.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (d)在生理 條件下在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)宿主細(xì)胞，使得可以分泌由所述第一與第二 DNA序 列編碼的三聚融合蛋白；和(e)從宿主細(xì)胞分離分泌性三聚融合蛋白。以下為本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)所分泌的最豐富的蛋白質(zhì)，組成將近25%的體內(nèi)總蛋白質(zhì)；(2)膠原的主要形式天然以三聚螺旋出現(xiàn)，其球狀C-前肽負(fù)責(zé)引發(fā)三聚化；(3)據(jù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蛋白酶解從成熟膠原釋放的膠原的三聚C-前肽在哺乳動(dòng) 物血液中天然為亞微克/毫升水平，并且未知對(duì)身體有毒性；(4)膠原的線性三股螺旋區(qū) 可作為具有預(yù)測(cè)的每殘基2.9 A間距的接頭而被包括，或者被排除作為融合蛋白的一部 分，從而可以精確調(diào)節(jié)待三聚化蛋白質(zhì)與膠原C-前肽間的距離，以實(shí)現(xiàn)最佳生物活性；(5)可使將C-前肽從前膠原上切割下來(lái)的BMP1的識(shí)別位點(diǎn)突變或缺失，以防止三聚 融合蛋白被破壞；(6) C-前肽結(jié)構(gòu)域提供通用親和標(biāo)記物，其可以用于純化本發(fā)明所制 造的任何分泌性融合蛋白。與可以制造分泌性二聚融合蛋白的Fc標(biāo)簽技術(shù)(Sledziewski等人，1992和1998) 相反，本文所公開(kāi)的適時(shí)的本發(fā)明首次使制造和分泌可溶性三聚融合蛋白成為可能。已 知如下事實(shí)，即同型三聚體具有3重對(duì)稱性，而同型二聚體具有2重對(duì)稱性，因此所述 兩種截然不同結(jié)構(gòu)形式理論上不可能完全重疊(

圖1)。這樣，同型二聚可溶性TNF-R-Fc(例如Enbrel)和可溶性CD4-Fc融合蛋白均不可能具有分別結(jié)合其對(duì)應(yīng)的同型三聚配體TNF-a與HIV gpl20的最佳界面。相反，由本發(fā)明所制造的同型三聚可溶性TNF受體和CD4是三價(jià)的，在結(jié)構(gòu)上具有與對(duì)應(yīng)同型三聚配體完美對(duì)接的潛力。因此，這些三聚可溶性受體類似物可尤為有效地中和其三聚配體的生物活性。根據(jù)適時(shí)的本發(fā)明，可
以容易且合理地設(shè)計(jì)出更為有效且更便宜的藥物，例如優(yōu)選實(shí)施方案中所描述的三聚可 溶性TNF-R和CD4，用以對(duì)抗例如關(guān)節(jié)炎和AIDS的虛弱疾病。也可以根據(jù)本發(fā)明制造 三聚可溶性gp120，其可以更好地模擬HIV病毒上所發(fā)現(xiàn)的天然三聚gpl20外被蛋白復(fù) 合體，并且用作與先前所用的非三聚gpl20抗原相比更有效的疫苗。也可以根據(jù)本發(fā)明 制造三聚形式的嵌合抗體，這可使抗體在中和其抗原中親和力極大提高親合力。附圖簡(jiǎn)述圖1A、圖1B、圖1C和圖1D是本發(fā)明方法與已有二聚免疫球蛋白Fc融合體比較 的示意圖。圖1A是側(cè)視圖，且圖1B是俯視圖所示無(wú)配體或配體結(jié)合形式的同型二聚可溶性 sTNF RII受體-Fc融合體(例如Amgen的Enbrel)的結(jié)構(gòu)特征。標(biāo)記1的結(jié)構(gòu)域代表可溶性TNF-RII。應(yīng)注意，F(xiàn)c (標(biāo)記為2，具有鏈間二硫鍵3) 融合蛋白是二聚結(jié)構(gòu)。由于其2重對(duì)稱性，二聚Fc融合蛋白是二價(jià)的，并且因此理論 上不具有結(jié)合同型三聚配體(例如具有3重對(duì)稱性的TNF-a (標(biāo)記4))的最佳構(gòu)象。圖1C是側(cè)視圖，圖1D是俯視圖三聚可溶性sTNFRII受體-C-前肽融合的結(jié)構(gòu)特 征。由于其3重對(duì)稱性，sTNFRII-三聚體融合蛋白本質(zhì)上是三價(jià)的，因此可與其三聚配 體TNF-a完全對(duì)接。能夠自身三聚化的膠原的C-前肽標(biāo)記為5，其具有鏈間二硫鍵3。圖2A和圖2B說(shuō)明用于制造分泌性三聚融合蛋白的pTRIMER質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)。任 何編碼可溶性受體或生物活性多肽的cDNA均可克隆進(jìn)唯一Hind III位點(diǎn)或Bgl II位點(diǎn)， 以使可以在C-末端處框內(nèi)融合到含用于三聚化的C-前肽序列的a (I)膠原。圖2A: pTRIMER(TO)構(gòu)建物在C-前肽的上游含有部分甘氨酸重復(fù)(GXY)n;圖2B:而pTRIMER (T2)僅含有具有突變BMP-1蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的C-前肽域。圖3A和圖3B說(shuō)明二硫鍵連接的三聚膠原融合蛋白的表達(dá)和分泌。圖3A.人胎盤堿性磷酸酶(AP)當(dāng)融合到a (I)膠原的C-前肽時(shí)三聚化的Western 印跡分析。將pTRIMER載體中單獨(dú)編碼AP或編碼AP-C-前肽融合體的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染進(jìn)HEK293T細(xì)胞內(nèi)。48小時(shí)后，將所示各轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(20pL)在有或無(wú) 還原劑(巰基乙醇)的等體積2xSDS樣品緩沖液中煮沸5分鐘，在10% SDS-PAGE上 分離，并用抗AP多克隆抗體(GenHunter Corporation)進(jìn)行Western印跡分析。應(yīng)注意， 所分泌的67 kDa AP單獨(dú)不形成分子間二硫鍵，而所分泌的AP-T0和AP-T2融合體均有 效組裝為二硫鍵連接的三聚體。
圖3B.可溶性人TNF-RII當(dāng)融合到a (I)膠原的C-前肽時(shí)三聚化的Western印跡 分析。將所示pTRIMER載體內(nèi)編碼AP-C-前肽融合體(T2)(作為抗體特異性的陰性對(duì) 照)或者人可溶性TNF-RII-C-前肽融合體的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞內(nèi)。48 小時(shí)后，將所示各未經(jīng)轉(zhuǎn)染和經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(20 ^L)在有或無(wú)還原劑(巰 基乙醇)的等體積2xSDS樣品緩沖液中煮沸5分鐘，在10% SDS-PAGE上分離，并用 抗人TNF-RII單克隆抗體(克隆226, R&D Systems, Inc.)進(jìn)行Western印跡分析。應(yīng) 注意，單克隆抗體僅可識(shí)別具有二硫鍵的分泌性TNF-RII。可溶性TNF-RII-TO和 TNF-RII-T2融合體均有效組裝為二硫鍵連接的三聚體。圖4和圖5說(shuō)明顯示三聚可溶性人TNF-RII-C-前肽融合蛋白對(duì)抗人TNF-a所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的有效中和活性的生物測(cè)定。圖4. TNF-a敏感性WEHI-13VAR細(xì)胞(ATCC)以1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升濃度重懸于 含有10% FBS的RPMI培養(yǎng)基中。100 細(xì)胞懸浮液鋪于96孔微量滴定板的各孔內(nèi)。 向各孔內(nèi)加入500 ng/mL濃度的放線菌素D，接著在所示三聚可溶性人TNF-RII-T2的存 在或不存在下加入500 pg/ml人TNF-a (R&D Systems)。加入三聚AP-T2替代 TNF-RII-T2作為陰性對(duì)照。在組織培養(yǎng)箱內(nèi)溫育16小時(shí)之后，用倒置顯微鏡以20x放 大倍數(shù)檢查細(xì)胞生存力，或者通過(guò)向各孔加入10。/。(v/v)的細(xì)胞生存力指示劑染料Alamar Blue (BioSonrce,Inc.)來(lái)進(jìn)行檢査?；罴?xì)胞能夠?qū)⑷玖蠌乃{(lán)色變?yōu)榉奂t色。應(yīng)注意，三 聚可溶性人TNF-RII-T2顯示出抗TNF-a的有效中和活性，從而保護(hù)細(xì)胞免受TNF-a介 導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖5.三聚可溶性人TNF-RII-T2抗人TNF-a的中和活性的定量分析。如圖4A進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)。加入AlamarBlue染料兩小時(shí)后，在OD575下分析來(lái)自各孔的所示培養(yǎng)基。對(duì)比 未添加TNF-a (100%生存力)或者添加TNF-a但未添加中和劑(0%生存力)的各孔， 將讀數(shù)進(jìn)行歸一化。序列表簡(jiǎn)述SEQIDNO:l (963個(gè)堿基)編碼人膠原a(I)T0構(gòu)建物的C-前肽的核苷酸序列。將cDNA構(gòu)建物克隆進(jìn)pAPtag2 載體，以代替AP編碼區(qū)。下劃線序列代表用于構(gòu)建對(duì)應(yīng)pTRIMER載體的限制酶切位 點(diǎn)。粗體密碼子代表TO編碼區(qū)的起點(diǎn)和終點(diǎn)。SEQIDNO:2 (311個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的人膠原a (I) C-前肽T0蛋白質(zhì)序列。下劃線序列代表C-前肽上游的"甘氨
酸重復(fù)"區(qū)。紅色的氨基酸殘基表示BMP-1蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。 SEQ ID NO: 3 (771個(gè)堿基)編碼人膠原a(I)T2構(gòu)建物的C-前肽的核苷酸序列。將cDNA構(gòu)建物克隆進(jìn)pAPtag2 載體，以代替AP編碼區(qū)。下劃線序列代表用于構(gòu)建對(duì)應(yīng)pTRIMER載體的限制性酶切 位點(diǎn)。粗體密碼子代表T2編碼區(qū)的起點(diǎn)和終點(diǎn)。SEQIDNO:4 (247個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的人膠原a(I)C-前肽T2蛋白質(zhì)序列。紅色的氨基酸殘基表示經(jīng)突變的BMP-1 蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的位置。SEQ ID NO: 5 (2487個(gè)堿基)編碼融合到人a (I)膠原的TOC-前肽的人胎盤堿性磷酸酶(AP) (AP-T0)的核苷 酸序列。下劃線序列表示用于融合構(gòu)建物的限制位點(diǎn)。標(biāo)記序列中部所示的融合位點(diǎn)的 限制位點(diǎn)是Bgl II。SEQ ID NO: 6 (819個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的AP-T0融合蛋白的蛋白質(zhì)序列。藍(lán)色的氨基酸殘基表示人胎盤堿性磷酸酶 (AP)與a (I)膠原TO多肽間的融合位點(diǎn)。粗體密碼子代表融合蛋白的起點(diǎn)和終點(diǎn)。 下劃線序列代表人a (I)膠原的C-前肽上游的"甘氨酸重復(fù)"區(qū)。紅色的氨基酸殘基表 示BMP-1蛋白酶識(shí)別序列。SEQ ID NO: 7 (2294個(gè)堿基)編碼融合到人a (I)膠原T2C-前肽的人胎盤堿性磷酸酶(AP) (AP-T2)的核苷酸 序列。粗體密碼子代表融合蛋白的起點(diǎn)和終點(diǎn)。下劃線序列表示用于融合構(gòu)建物的限制 位點(diǎn)。標(biāo)記序列中部所示的融合位點(diǎn)的限制位點(diǎn)是BglII。SEQ ID NO: 8 (755個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的AP-T2融合體的蛋白質(zhì)序列。藍(lán)色的氨基酸殘基表示人胎盤堿性磷酸酶(AP) 與a (I)膠原T2多肽間的融合位點(diǎn)。紅色的氨基酸殘基表示經(jīng)突變的BMP-1蛋白酶識(shí) 別位點(diǎn)的位置。SEQ ID NO: 9 (1734個(gè)堿基)編碼融合到人a (I)膠原的TOC-前肽的人可溶性TNF-RII (sTNF-RII-TO)的核苷 酸序列。粗體密碼子代表融合蛋白的起點(diǎn)和終點(diǎn)。下劃線序列表示用于融合構(gòu)建物的限 制位點(diǎn)。標(biāo)記序列中部所示的融合位點(diǎn)的下劃線序列是BamHI/BglII連接接界。SEQ ID NO: 10 (566個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的人可溶性TNF-RII-T0融合體的蛋白質(zhì)序列。藍(lán)色的氨基酸殘基表示人可溶
性TNF-RII與a (I)膠原TO多肽間的融合位點(diǎn)。下劃線序列代表人a (I)膠原C-前肽 上游的"甘氨酸重復(fù)"區(qū)。紅色的氨基酸殘基表示BMP-1蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。 SEQIDNO:ll (1542個(gè)堿基)編碼融合到人a (I)膠原的T2C-前肽的人可溶性TNF-RI1 (sTNF-RII-T2)的核苷酸序列。粗體密碼子代表融合蛋白的起點(diǎn)和終點(diǎn)。下劃線序列表示用于融合構(gòu)建物的限 制位點(diǎn)。標(biāo)記序列中部所示的融合位點(diǎn)的下劃線序列是BamHI/BglII連接接界。 SEQIDNO: 12 (502個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的人可溶性TNF-RII-T2融合蛋白的蛋白質(zhì)序列。藍(lán)色的氨基酸殘基表示人可 溶性TNF-RII與a(I)膠原T2多肽間的融合位點(diǎn)。紅色的氨基酸殘基表示經(jīng)突變的BMP-l 蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的位置。SEQIDN0:13 (2139個(gè)堿基)編碼融合到人a (I)膠原T0C-前肽的人可溶性CD4的核苷酸序列。下劃線序列表 示用于融合構(gòu)建物的限制位點(diǎn)。標(biāo)記序列中部所示的融合位點(diǎn)的下劃線序列是BglII位點(diǎn)。SEQIDNO: 14 (699個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的人可溶性CD4-T0融合體的蛋白質(zhì)序列。藍(lán)色的氨基酸殘基表示人可溶性 CD4與a (I)膠原TO多肽間的融合位點(diǎn)。下劃線序列代表人a (I)膠原C-前肽上游的 "甘氨酸重復(fù)"區(qū)。紅色的氨基酸殘基表示BMP-1蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。 SEQIDNO:15 (1947個(gè)堿基)編碼融合到人a (I)膠原T2 C-前肽的人可溶性CD4的核苷酸序列。下劃線序列表 示用于融合構(gòu)建物的限制位點(diǎn)。標(biāo)記序列中部所示的融合位點(diǎn)的下劃線序列是BglII位點(diǎn)。SEQIDNO:16 (635個(gè)氨基酸)預(yù)測(cè)的人可溶性CD4-T2融合體蛋白質(zhì)序列。藍(lán)色的氨基酸殘基表示人可溶性CD4 與a (I)膠原T2多肽間的融合位點(diǎn)。紅色的氨基酸殘基表示經(jīng)突變的BMP-1蛋白酶識(shí) 別位點(diǎn)的位置。發(fā)明詳述在闡述本發(fā)明之前，先闡述下文將使用的某些術(shù)語(yǔ)的定義可能有助于理解本發(fā)明。DNA構(gòu)建物:通常是質(zhì)?；虿《据d體形式的單鏈或雙鏈DNA分子，其經(jīng)過(guò)重組DNA技術(shù)修飾含有以一定方式連接的DNA節(jié)段，所述連接方式使其作為整體不會(huì)存在
于自然界。DNA構(gòu)建物含有指導(dǎo)表達(dá)和/或分泌所編碼的目的蛋白質(zhì)所需的信息。信號(hào)肽序列:起到指導(dǎo)成熟多肽或蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌的作用的一段氨基酸序列。信 號(hào)肽的特征在于疏水氨基酸核心，并且通常發(fā)現(xiàn)于待分泌或錨定在細(xì)胞表面上的新近合 成蛋白質(zhì)的氨基末端。信號(hào)肽通常在分泌期間從成熟蛋白切割下來(lái)。這種信號(hào)肽含有的 加工位點(diǎn)使得當(dāng)其經(jīng)過(guò)蛋白分泌途徑時(shí)信號(hào)肽可以從成熟蛋白切割下來(lái)。信號(hào)肽序列當(dāng) 連接到另一種無(wú)信號(hào)肽的蛋白質(zhì)的氨基末端時(shí)，可以指導(dǎo)融合蛋白的分泌。大部分分泌 性蛋白質(zhì)，例如生長(zhǎng)因子、肽激素、細(xì)胞因子和膜蛋白(例如細(xì)胞表面受體)，當(dāng)合成 為新生蛋白質(zhì)時(shí)含有信號(hào)肽序列。可溶性受體:細(xì)胞表面受體的部分或全部胞外結(jié)構(gòu)域，其能夠結(jié)合其配體。其通常 不含有任何一段負(fù)責(zé)膜錨定的內(nèi)部疏水性氨基酸序列。膠原的C-前肽:膠原的C-末端球狀非三股螺旋結(jié)構(gòu)域，其能夠自組裝為三聚體。 與膠原的三股螺旋區(qū)相反，C-前肽不含有任何甘氨酸重復(fù)序列，并且通常在前膠原分泌 時(shí)膠原原纖維形成之前經(jīng)蛋白酶解從前膠原前體除去。甘氨酸重復(fù):膠原的中央線性三股螺旋形成區(qū)，其在氨基酸序列中含有數(shù)百個(gè)(Gly-X-Y)n重復(fù)。這些重復(fù)在X或/和Y位置也富含脯氨酸。在N-前肽和C-前肽除去 時(shí)，含甘氨酸重復(fù)的膠原三股螺旋可以組裝為更為有序的不溶性膠原原纖維，其構(gòu)成細(xì) 胞基質(zhì)的主要組分。cDNA:代表互補(bǔ)DNA或者說(shuō)與信使RNA互補(bǔ)的DNA序列?？傮w來(lái)說(shuō)，cDNA序 列不含有任何內(nèi)含子(非蛋白質(zhì)編碼)序列。在本發(fā)明之前，幾乎所有的治療用抗體和可溶性受體-Fc融合蛋白(例如Enbrel) 都是二聚體結(jié)構(gòu)(圖1)。盡管已證明這些分子與其單體對(duì)應(yīng)物相比以更高的親合力結(jié)合 其靶抗原或配體，但是由于結(jié)構(gòu)限制，預(yù)計(jì)它們?nèi)圆荒芡耆浣Y(jié)合其具有同型三聚結(jié)構(gòu) 的靶標(biāo)。這種治療上重要的三聚配體的實(shí)例包括TNF家族的細(xì)胞因子和HIV外被蛋白 gpl20。因此，從結(jié)構(gòu)角度來(lái)說(shuō)，希望也可以產(chǎn)生可完全對(duì)接其靶標(biāo)三聚配體或抗原(圖 1)從而完全封閉配體活動(dòng)的三聚可溶性受體或抗體。期望這種三聚可溶性受體或嵌合 抗體對(duì)其耙標(biāo)具有最高親和力，并且因此可以更加有效果和有效率地治療例如關(guān)節(jié)炎和 AIDS的疾病。本發(fā)明公開(kāi)通過(guò)將其融合到膠原的C-前肽(其能夠自組裝為三聚體)來(lái)產(chǎn)生這種分泌性三聚受體和生物活性蛋白質(zhì)的方法。以下為本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(l)膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)所分泌的最豐富的蛋白質(zhì)，構(gòu)成將近25%的體內(nèi)總蛋白質(zhì)；(2)膠原的主要形式天然以三聚螺旋出現(xiàn)，其球狀C-前肽負(fù)責(zé)三聚化的引發(fā)，其隨后在三股螺旋形成時(shí)經(jīng)蛋白酶
解切割；(3)據(jù)發(fā)現(xiàn)，膠原的被切割可溶性三聚C-前肽在哺乳動(dòng)物血液中天然為亞微克 /毫升水平；(4)膠原的線性三股螺旋區(qū)可作為接頭而被包括，或者被排除作為融合蛋白 的一部分，因此可以精確調(diào)節(jié)待三聚化蛋白與膠原C-前肽之間的距離，以獲得最佳生物 活性；(5)可使從前膠原切割下來(lái)的C-前肽的BMP 1的識(shí)別位點(diǎn)突變或刪除，以防止 三聚融合蛋白被破壞；(6) C-前肽域提供通用親和標(biāo)記物，其可以用于純化本發(fā)明所制 造的任何分泌性融合蛋白；(7)與已知具有其它生物功能(例如結(jié)合其自身細(xì)胞表面受 體)的IgGlFc標(biāo)簽不同，膠原C-前肽的僅有已知生物功能是其引發(fā)新生前膠原鏈的三 聚化并在新近產(chǎn)生的前膠原三聚體組裝為不溶性細(xì)胞基質(zhì)之前保持可溶的能力。膠原 C-前肽的這種獨(dú)特特性意味著此獨(dú)特三聚化標(biāo)簽不可能有毒性或免疫原性，這使其成為 治療應(yīng)用的理想候選者。為了證明制造分泌性三聚融合蛋白的可行性，使用購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所 (ATCC)的EST克隆，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增編碼人al (I)完整C-前肽的cDNA序列， 所述人al完整C-前肽含有一些甘氨酸重復(fù)三股螺旋區(qū)(T0構(gòu)建物，序列ID No. 1-2)， 或不含甘氨酸重復(fù)但具有突變的BMP-1識(shí)別位點(diǎn)(T2構(gòu)建物，序列ID No. 3-4)。將所 擴(kuò)增的cDNA各自作為Bgl II-XbaI片段克隆進(jìn)pAPtag2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體內(nèi)(GenHunter Corporation; Leder等人，1996和1998)，以代替AP編碼區(qū)(圖2)。所產(chǎn)生的載體分別 稱為pTRIMER T2和T0。所述載體使得任何編碼可溶性受體或生物活性蛋白的cDNA 模板在唯一的Hind III和Bgl II位點(diǎn)處可以方便地進(jìn)行框內(nèi)融合。與天然前膠原類似， 這種融合蛋白具有位于C末端的膠原三聚化標(biāo)簽。 實(shí)施例1:為了證明本發(fā)明的可行性，將編碼人分泌性胎盤堿性磷酸酶(AP)的cDNA (包括其天然信號(hào)肽序列)從pAPtag4載體(GenHunter Corporation; Leder等人，1996和1998)上作為Hind III-Bgl II片段切下，并且克隆進(jìn)pTRIMER-TO和pTRMER-T2載體的相應(yīng)位點(diǎn)。所產(chǎn)生的AP-膠原融合構(gòu)建物(序列ID No. 5-8)在轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(GenHunterCorporation)之后在其中進(jìn)行表達(dá)?？扇菀椎赜盟D(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基通過(guò)AP活性分析來(lái)測(cè)定AP-膠原融合蛋白的成功分泌。在轉(zhuǎn)染2天后，AP活性達(dá)到約1單位/毫升(或者相當(dāng)于約lpg/mL融合蛋白)。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的HEK293T細(xì)胞，在與嘌羅霉素(puromycine)抗性載體pBabe-Puro (GenHunter Corporation)共轉(zhuǎn)染之后，選擇穩(wěn)定克隆。將表達(dá)AP活性的克隆擴(kuò)增并且保存，以供長(zhǎng)期生產(chǎn)融合蛋白。為了確定AP-膠原融合蛋白是否組裝為二硫鍵連接的三聚體，將單獨(dú)含有AP或者含有AP-TO與AP-T2融合體的條件培養(yǎng)基在不含卩-巰基乙醇(非還原)或含有P-巰基乙醇(還原)的SDS樣品緩沖液中煮沸，通過(guò)SDSPAGE分離，并用抗AP多克隆抗體 (GenHunter Corporation)進(jìn)行Western印跡分析。無(wú)融合體的單獨(dú)AP在非還原和還原 條件下均顯示為67 kDa條帶，如所預(yù)期其與缺少任何分子間二硫鍵的情況一致(圖3A)。 相反，所分泌的AP-TO和AP-T2融合蛋白顯示在非還原條件下(約300kDa)是在還原 條件下(90-100 kDa)的三倍大，表明兩種融合蛋白均完全組裝為同型三聚體(圖3A)。 此結(jié)果實(shí)質(zhì)上使本發(fā)明的概念能付諸實(shí)踐。 實(shí)施例2:為了提供證據(jù)證明可以賦予三聚融合蛋白新的治療上有益的生物功能，接著用購(gòu)自 ATCC的相應(yīng)EST克隆構(gòu)建三聚可溶性TNF-RII (p75)受體。如實(shí)施例1所描述，將人 TNF-RII的N-末端區(qū)(包括完整配體結(jié)合區(qū)但排除跨膜結(jié)構(gòu)域)作為BamHI片段框內(nèi) 克隆進(jìn)pTRIMER-T0和pTRIMER-T2載體的Bgl II位點(diǎn)(序列ID No. 9-12)。所產(chǎn)生的 融合構(gòu)建物在轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞之后在其中表達(dá)。如實(shí)施例1所描述，通過(guò)嘌羅霉素 共選擇獲得穩(wěn)定克隆。在非還原條件和還原條件下均進(jìn)行Western印跡分析，以確定所 產(chǎn)生的可溶性TNF-RII-膠原融合蛋白是否確實(shí)表達(dá)、分泌且組裝為三聚形式。如所預(yù)期， 抗人TNF-RII的單克隆抗體(購(gòu)自R&D Systems, Inc.的克隆226)明顯識(shí)別由TO和T2 融合載體表達(dá)為220-240 kDa條帶的三聚可溶性TNF-融合蛋白，所述三聚可溶性TNF-融合蛋白大約是相應(yīng)單體融合蛋白的三倍大(圖3B)。在還原條件下，TNF-RII抗體未 能檢測(cè)單體融合蛋白，這符合抗體廠商所說(shuō)明的特性。作為抗體特異性的陰性對(duì)照，單 獨(dú)HEK293T細(xì)胞及表達(dá)AP-T2融合蛋白的細(xì)胞均不表達(dá)任何TNF-RI1 (圖3B)。為了確定三聚可溶性TNF-RII受體是否是其三聚配體TNF-a的有效抑制劑，基本上 如前所述用細(xì)胞因子敏感細(xì)胞系WEHI-13VAR (ATCC)進(jìn)行TNF-a生物測(cè)定(Mohler 等人，1993)。圖4所示的結(jié)果清楚表明，三聚可溶性TNF-RII-C-前肽融合蛋白在放線菌 素D (500ng/mL) (Sigma)存在下極為有效地中和TNF-a介導(dǎo)的WEHI-13VAR細(xì)胞的 細(xì)胞凋亡。當(dāng)使用0.5 ng/mL的TNF-a (R&D Systems)時(shí)，三聚可溶性TNF-RII-T2 (均來(lái)自無(wú)血清培養(yǎng)基或?yàn)榧兓问?具有約2 ng/mL或8xl0—12 M (假設(shè)240 kDa的分 子量屬同型三聚體)的表觀Ki-M) (50%抑制)。此對(duì)TNF-a的親和力比單體TNF-RII四 個(gè)大數(shù)量級(jí)，比二聚可溶性TNF-RII-Fc融合體(例如Enbrel)大至少10-100倍(Mohler 等人，1993)。此關(guān)鍵性實(shí)施例證明，本發(fā)明可以制造具有新的生物特性的三聚融合蛋白，其可能具有極大治療應(yīng)用?？梢宰C明，這種可溶性三聚人TNF受體在治療自身免疫疾病(例如RA)中比當(dāng)前市售的二聚可溶性TNF受體(例如Enbrel)更為有效。三聚TNF受體的
極大提高的效價(jià)可以大大減少每個(gè)患者每周所注射的TNF阻斷劑的量，同時(shí)有改善治療 并顯著降低患者的花費(fèi)。三聚TNF受體的改善的效價(jià)也應(yīng)該能緩和目前二聚TNF受體 生產(chǎn)中存在的瓶頸，所述生產(chǎn)目前僅可滿足治療美國(guó)約100，000個(gè)患者的需求。 實(shí)施例3:作為AIDS病因的HIV病毒主要感染并破壞我們身體內(nèi)特殊譜系的T淋巴細(xì)胞。這 些所謂的CD4+ T細(xì)胞表達(dá)稱為CD4的細(xì)胞表面蛋白，其是HIV的受體。HIV通過(guò)其 結(jié)合CD4的病毒外被蛋白gpl20識(shí)別CD4+細(xì)胞。值得注意的是，gpl20作為巨大的同 型三聚復(fù)合體存在于病毒表面上，而CD4是細(xì)胞表面上的單體。目前提出的HIV感染 模式是，病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞需要HIV與CD4+ T細(xì)胞的完全對(duì)接，此時(shí)gpl20三聚體 的所有三個(gè)亞單位均各結(jié)合至CD4。顯然， 一種阻止HIV感染的直接了當(dāng)?shù)牟呗允怯每?溶性CD4來(lái)蒙蔽病毒。確實(shí)，已經(jīng)證明這種使用單體可溶性CD4和CD4-Fc融合體的 方法在抑制實(shí)驗(yàn)室分離物的HIV感染中十分有效(Clapham等人，1989; Daar等人， 1990)?？上У氖?，這些可溶性CD4在阻止AIDS患者中所發(fā)現(xiàn)的HIV病毒株的感染中 不夠有效，這可能是由于gpl20氨基酸序列變異降低與單體CD4和二聚可溶性CD4的 親和力所致。為了顯著提高可溶性CD4與HIV病毒上的任何gpl20變異體的親和力，理想的是， 可溶性CD4應(yīng)是三聚形式，以使其可完全對(duì)接至其三聚配體即gpl20同型三聚體。與 AIDS作斗爭(zhēng)的一個(gè)主要難題在于病毒基因組的高突變率，其導(dǎo)致藥物抗性。因此，由 于病毒突變，直接靶向例如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(例如AZT)和蛋白酶的病毒基因的任何藥 物可能被致無(wú)效。相反，無(wú)論其突變程度多少，HIV病毒都不得不結(jié)合細(xì)胞CD4受體來(lái) 引發(fā)感染。因此，高親和力可溶性CD4三聚體應(yīng)該不受病毒突變的影響，因?yàn)椴《驹?gpl20基因中的突變將使得病毒既不能結(jié)合三聚可溶性CD4，也不能結(jié)合細(xì)胞上的CD4。為了制造這種三聚可溶性CD4 HIV受體類似物，使用購(gòu)自ATCC的EST克隆，擴(kuò) 增編碼完整人可溶性CD4的cDNA，其包括其天然信號(hào)肽序列，但排除掉跨膜結(jié)構(gòu)域和 短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。隨后將所產(chǎn)生的cDNA作為Hind III-Bgl II片段克隆進(jìn)pTRIMER-TO和 pTRIMER-T2表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)。所產(chǎn)生的可溶性CD4-膠原融合構(gòu)建物(序列ID No. 13-16)在轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(GenHunter Corporation)之后在其中進(jìn)行表達(dá)。為了獲 得穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的HEK293T細(xì)胞，在用嘌羅霉素抗性載體pBabe-Puro (GenHunter Corporation)共轉(zhuǎn)染之后，選擇穩(wěn)定克隆。將表達(dá)融合蛋白的克隆擴(kuò)大并保存，以供長(zhǎng) 期生產(chǎn)融合蛋白。為了確定可溶性人CD4-膠原融合蛋白是否組裝為二硫鍵連接的三聚體，將含有可 溶性CD4-T0與CD4-T2融合體的條件培養(yǎng)基在不含P-巰基乙醇(非還原)或含有P-巰 基乙醇(還原)的SDS樣品緩沖液中煮沸，通過(guò)SDSPAGE分離，并用抗人CD4的單 克隆抗體(R&D Systems)進(jìn)行Western印跡分析。證明所分泌的可溶性CD4-T0和 CD4-T2融合蛋白在非還原條件下(約300kDa)均是在還原條件下(90-100 kDa)的三倍大，表明其基本上完全組裝為同型三聚體(數(shù)據(jù)未顯示)。然后可容易地測(cè)試這些三 聚可溶性CD4的gpl20結(jié)合和抗HIV感染情況。
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)生分泌三聚融合蛋白的方法，其包含(a)構(gòu)建包含連接到編碼信號(hào)肽序列的模板的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建物，所述信 號(hào)肽序列框內(nèi)融合到待三聚化的多肽，所述待三聚化的多肽又框內(nèi)連接到能夠自身三聚 化的多肽，所述多肽與待三聚化的第一多肽異源(heterologous) ; (b)將所述DNA構(gòu) 建物引入真核細(xì)胞內(nèi)；(c)在生理?xiàng)l件下在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)所述宿主細(xì)胞，使得 可以分泌由所述DNA序列編碼的三聚融合體蛋白；(d)從所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基分離 所述三聚化融合蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述三聚化多肽融合體是同型三聚體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述三聚化多肽部分包含能夠自組裝為三聚體的膠 原C末端部分，所述膠原C末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro,a.l(II)、 pro,a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI)。
4. 一種產(chǎn)生分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括(a)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第一DNA構(gòu)建物， 所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的非膠原多肽的信號(hào)肽序列組成，而所述信號(hào)肽 序列又框內(nèi)連接能夠自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自 pro.a.l(I)、pro.a.2(I)、pro.a.l(II)、pro.a.l(III)、pro.a.l(V)、pro.a.2(V)、pro.a.l(XI)、pro.a.2(XI) 和pro.a.3(XI); (b)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第二 DNA構(gòu)建物，所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號(hào)肽序 列組成，而所述第二信號(hào)肽序列又框內(nèi)連接能夠自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所 述第二膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)在生理?xiàng)l件下在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培 養(yǎng)基中生長(zhǎng)所述宿主細(xì)胞，使得可以分泌由所述第一與第二 DNA序列編碼的三聚融合 蛋白；和(d)從所述宿主細(xì)胞分離所述分泌性三聚融合蛋白。
5. —種產(chǎn)生分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括(a)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第一DNA構(gòu)建物， 所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的非膠原多肽的信號(hào)肽序列組成，而所述信號(hào)肽 序列又框內(nèi)連接能夠自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自 pro.a.l(I)、pro.a.2(I)、pro.a.l(II)、pro.a.l(III)、pro.a.l(V)、pro.a.2(V)、pro.a.l(XI)、pro.a.2(XI) 和pro.a.3(XI);(b)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū)動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第二 DNA構(gòu)建物，所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號(hào)肽序 列組成，而所述第二信號(hào)肽序列又框內(nèi)連接能夠自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所 述第二膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)引入包含驅(qū) 動(dòng)開(kāi)放讀碼框轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第三DNA構(gòu)建物，所述開(kāi)放讀碼框由框內(nèi)連接到待三聚 化的第三非膠原多肽的第三信號(hào)肽序列組成，而所述第三信號(hào)肽序列又框內(nèi)連接能夠自 身三聚化的膠原的第三C-末端部分，所述第三膠原C-末端部分選自pro.a,l(I)、pro.a.2(1)、 p歸,l(II)、 p歸.l(in)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI);(d)在生理?xiàng)l件下在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所述宿主細(xì)胞，使得可以分泌由所述第 一與第二DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(e)從所述宿主細(xì)胞分離所述分泌性三聚 融合蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述信號(hào)肽序列和所述待三聚化的 非膠原多肽均來(lái)源于相同的天然分泌性蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述信號(hào)肽序列和所述待三聚化的 非膠原選自兩種不同的分泌性蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l、 4和5任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主真核細(xì)胞是真菌細(xì) 胞或昆蟲細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l、 4和5任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主真核細(xì)胞是培養(yǎng)的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述膠原C-末端部分包括連接到 C-前肽的膠原"甘氨酸重復(fù)"三股螺旋區(qū)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述膠原C-末端部分由序列ID No. 1-2標(biāo)示。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述膠原三聚化C-末端部分僅包 含C-前肽，而無(wú)任何膠原甘氨酸重復(fù)三股螺旋區(qū)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述膠原三聚化C-末端部分包 含發(fā)生突變或缺失的BMP-1蛋白酶識(shí)別序列，從而賦予所述融合蛋白對(duì)所述蛋白酶降 解的抗性。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12-13任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述膠原三聚化C-末端部分由 序列ID No. 3-4標(biāo)示。
15. 融合蛋白的組合物，所述融合蛋白由根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3、 10、 11、 12、 13 和14任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生，是序列ID No. 9-12所標(biāo)示的可溶性三聚人TNF-a受體 II (p75)。
16. 融合蛋白的組合物，所述融合蛋白由根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3、 10、 11、 12、 13 和14任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生，是序列IDNo. 13-16所標(biāo)示的可溶性三聚人CD4。
17. 融合蛋白的組合物，所述融合蛋白由根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3、 10、 11、 12、 13 和14任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生，是序列ID No. 5-8所標(biāo)示的可溶性三聚可溶性人胎盤 堿性磷酸酶。
18. —種三聚化多肽融合體，所述三聚化多肽融合體包含三條多肽鏈，其中每條所述 鏈均包含連接到膠原C-前肽的受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽融合體的三聚化導(dǎo) 致生物活性增強(qiáng)。
19. 一種阻斷TNF-oc生物活性的方法，所述方法使用由權(quán)利要求15所產(chǎn)生的三聚化 可溶性TNF-a受體II。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)生產(chǎn)三聚形式的分泌性可溶性受體和生物活性多肽的方法與組合物。所述方法包括將編碼具有配體結(jié)合域的可溶性受體或生物活性多肽的DNA模板融合到編碼膠原C-前肽的DNA序列，所述膠原C-前肽能夠自組裝為共價(jià)連接的三聚體。所產(chǎn)生的融合蛋白作為三聚可溶性受體類似物而分泌，可用于更有效地中和其天然三聚配體的生物活性。
文檔編號(hào)C12P21/04GK101146818SQ200480028746
公開(kāi)日2008年3月19日 申請(qǐng)日期2004年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
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