專利名稱：應(yīng)用同源重組定向克隆和亞克隆的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用細(xì)菌重組酶介導(dǎo)的同源重組技術(shù)進(jìn)行DNA克隆和 亞克隆的方法和組合物。在一個具體實施方案中，應(yīng)用RecE/T或Reda/(3 重組酶，或任何功能等價系統(tǒng)啟動細(xì)菌同源重組，如來自噬菌體P22的 erf。具體地說，本發(fā)明涉及克隆方法，診斷方法，含有用作克隆載體的 多核苷酸的組合物，含有所迷多核苷酸組合物的細(xì)胞，以及由RecE/T和 Reda/P介導(dǎo)的克隆試劑盒。
2.
背景技術(shù)：
在大腸桿菌中進(jìn)行DNA克隆和亞克隆是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。DNA 克隆是指一個過程，其中一個復(fù)制起點(diǎn)操作性連接于雙鏈DNA片段，并 在大腸桿菌或其他適宜宿主中擴(kuò)增。DNA亞克隆也是指一個過程，其中 雙鏈DNA片段取自 一個業(yè)已擴(kuò)增的DNA分子，所述擴(kuò)增可以在體外進(jìn) 行，如通過PCR，也可在體內(nèi)進(jìn)行，如在大腸桿菌或其他適宜宿主中擴(kuò) 增，然后將該DNA片段操作性連接于復(fù)制起點(diǎn)。在大腸桿菌中進(jìn)行的典 型克隆和亞克隆是將DNA片段的末端與線性化栽體末端連接，所迷栽體 包括大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記。栽體包括的可選擇標(biāo)記可以確 保新克隆的產(chǎn)物、含有插入片段的質(zhì)粒在導(dǎo)入其宿主細(xì)胞大腸桿菌時， 可以保留并擴(kuò)增。
傳統(tǒng)的克隆方法具有某些局限性。例如，因為傳統(tǒng)的克隆方法需要 應(yīng)用限制性酶，因此DNA片段的選擇就受到一定限制，即目標(biāo)DNA區(qū) 域內(nèi)必須有限制性酶的識別位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)必須使酶切位于所需DNA 片段之外，而不能存在其中。由于絕大多數(shù)有用的限制性酶發(fā)揮作用相 當(dāng)頻繁，因此所得線性DNA片段的大小也受到限制。
應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生DNA片段是傳統(tǒng)亞克隆的第二個主 要缺陷。PCR產(chǎn)物的末端不能用于連接反應(yīng)，因為耐熱聚合酶在擴(kuò)增的
10PCR產(chǎn)物3，末端添加了非模板核苷酸。而且，應(yīng)用PCR還具有突變的髙 風(fēng)險。因此，分子生物學(xué)家正在尋求新的更加有效的克隆DNA片段的方 法，特別是當(dāng)這些片段比通過傳統(tǒng)的限制性酶或PCR方法所能獲得的片 段長時。
同源重組是克隆和亞克隆DNA片段的另一種替代方法。在含有宿主 同源重組系統(tǒng)的大腸桿菌中亞克隆PCR產(chǎn)物的方法業(yè)已有迷(Olineret al., 1993， Nucleic Acids Res. 21: 5192-97; Bubeck et al.， 1993， Nucl. Acids. Res. 21: 3601-3602)。在這些方法中，用于擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段的PCR 引物，被設(shè)計為含有的末端序列與線性化的載體末端序列同源。然后將 PCR產(chǎn)物和線性化栽體導(dǎo)入大腸桿菌。在大腸桿菌宿主細(xì)胞中進(jìn)行的同 源重組使PCR產(chǎn)物序列插入到質(zhì)粒栽體中。盡管這些方法業(yè)已顯示可以 用于亞克隆PCR片段，但它們還沒有用于亞克隆較長的DNA片段，或 者克隆任何大小的DNA片段。
另 一種描述的體內(nèi)亞克隆方法是應(yīng)用兩個線性DNA分子轉(zhuǎn)化大腸 桿菌sbcBC宿主細(xì)胞，這兩個DNA分子中的一個具有復(fù)制起點(diǎn)，兩個分 子在其末端都有較長的同源區(qū)域。同源重組在體內(nèi)發(fā)生，導(dǎo)致新形成的 質(zhì)粒的環(huán)化和增殖(Degryse, 1996， Gene 170:45 )。然后，大腸桿菌sbcBC 宿主細(xì)胞介導(dǎo)同源重組的這種能力，又用于亞克隆來自腺病毒和皰疹病 毒基因組DNAs的大型DNA片段(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70: 4805; Messerle, et al.， 1997， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94， 14759- 14763; He, 1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514 )。如其所迷，通過在大腸 桿菌sbcBC宿主細(xì)胞中進(jìn)行同源重組需要至少兩個預(yù)先準(zhǔn)備的亞克隆步 驟，使較長的同源區(qū)域位于大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩側(cè)。而且，還沒有文 獻(xiàn)表明可以在大腸桿菌sbcBC菌林中進(jìn)行DNA克隆。
最近，由RecE/RecT ( RecE/T)或Reda/Re鄰(Reda/|3 )介導(dǎo)的同 源重組業(yè)已顯示可以用于在大腸桿菌中制備DNA分子(Zhang et al., 1998， Nature Genetics, 20， 123-128; Muyrers et al.， 1999, Nucleic Acids Res. 27: 1555-1557)。這些文獻(xiàn)顯示，在大腸桿菌中，任何完整獨(dú)立的復(fù)制，環(huán) 狀DNA分子都可通過RecE/T或Reda/(3介導(dǎo)的重組來改變，該重組應(yīng)用 線性DNA，該線性DNA分子的側(cè)翼短區(qū)域序列與環(huán)狀分子的對應(yīng)區(qū)域 一致。通過同源重組技術(shù)將線性DNA分子整合到環(huán)狀分子中，使其側(cè)翼 序列間的序列置換環(huán)狀DNA分子的相應(yīng)序列。
ii本文引用的文獻(xiàn)不應(yīng)理解為這就是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
3.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供應(yīng)用細(xì)菌重組酶介導(dǎo)的同源重組進(jìn)行DNA克隆和亞克 隆的方法和組合物。細(xì)菌重組酶優(yōu)選RecE/T和/或Reda/|3。這些方法可 以用來克隆、亞克隆、增殖和擴(kuò)增目標(biāo)多核苷酸或多核苷酸混合物，使 用包括與目標(biāo)指定靶DNA序列側(cè)翼序列同源的DNA短區(qū)域和一個復(fù)制 起點(diǎn)的栽體。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了 一種將雙鏈靶DNA導(dǎo)入栽體的方 法，包括培養(yǎng)表達(dá)功能性重組酶的細(xì)菌，所述細(xì)菌包括(a)耙DNA，含有 第一個雙鏈末端和第二個雙鏈末端，以及(b)栽體DNA，在栽體DNA鏈 上以下迷順序含有(i)第一個雙鏈同源臂(ii)復(fù)制起點(diǎn)，以及(iii)第二個 雙鏈同源臂，這樣，栽體DNA鏈的第一個同源臂序列與把DNA鏈的第 一個末端序列同源，栽體DNA鏈的第二個同源臂序列與靶DNA鏈的第 二個末端序列同源，這樣，靶DNA可以在同源臂之間插入栽體DNA中。
在另一個實施方案中，提供了制備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體導(dǎo)入細(xì)胞，所述細(xì)胞含有雙鏈靶DNA，并表達(dá)細(xì)菌重組酶， 所述栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，， 以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)的一條鏈，以及第二個同源 臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上， 從3，到5，，以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及第二個 末端，這樣栽體DNA鏈上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 一個 末端序列同源，載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 二個末端序列同源；以及b)將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件 下。
在另一個實施方案中，提供了制備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，所迷細(xì)胞含有 雙鏈靶DNA，并表達(dá)細(xì)菌重組酶，所述栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同 源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下迷順序存在第一個同源臂， 復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個同源臂；所迷靶DNA含有一個靶DNA序列和兩 個末端，在把DNA鏈上，從3，到5，第一個末端，靶DNA序列，以及 第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以
12下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列，所 述第一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同 源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源；所述 第二個寡核苷酸含有笫二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含 有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第三個核苷酸序列與 栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源，第四個核苷酸序列與 靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及b)將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì) 胞內(nèi)同源重組的條件下。
在另一個實施方案中，提供了制備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈耙DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞，所述細(xì)胞含有一個栽體，并表達(dá)細(xì)菌重組 酶，所述靶DNA含有一個耙DNA序列和兩個雙鏈末端，在耙DNA鏈 上，從3，到5，，以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及第 二個末端；所迷栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個同 源臂；這樣栽體DNA鏈上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 一個 末端序列同源，栽體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 二個末端序列同源；以及b)將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件 下。
在另一個實施方案中，提供了制備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈粑DNA分子以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，所述細(xì) 胞含有一個栽體，并表達(dá)細(xì)菌重組酶，所述靶DNA含有一個靶DNA序 列和兩個末端，在耙DNA鏈上，從3，到5',以下迷順序存在第一個 末端，把DNA序列，以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個 寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序 列和第二個核苷酸序列，所迷第 一 個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一 個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末 端核苷酸序列同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈 以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列， 所述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核普酸序列與耙DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；所 述栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，， 以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個同源臂；以及b)將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
在另一個實施方案中，提供了制備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體和雙鏈靶DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)菌重組酶的細(xì)胞，所述栽體含有一 個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3'，以下述順序 存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個同源臂；所述粑DNA含有 一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上，從3，到5，，以下迷順序 存在第一個末端，靶DNA序列，以及第二個末端；這樣載體DNA鏈 上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，載體DNA 鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA鏈上的笫二個末端序列同源；以及 b)將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
在該方法的一個特定實施方案中，宿主細(xì)胞還包括一個核苷酸序列， 該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點(diǎn)特異性重組酶，栽體還包括 位點(diǎn)特異性重組酶識別的第一個、第二個識別位點(diǎn)，第一個識別位點(diǎn)位 于第一個和第二個同源臂外部，第二個位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)位于 第一個和第二個同源臂內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或之后，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異 性重組酶的表達(dá)。
在該方法的另一個特定實施方案中，宿主細(xì)胞還包括一個核苷酸序 列，該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點(diǎn)特異性重組酶，栽體還 包括一個位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于第一個和第二個同源 臂內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或之后，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)。
在另一個實施方案中，提供了制備同源DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體，雙鏈靶DNA分子，以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導(dǎo)入 表達(dá)細(xì)菌重組酶的細(xì)胞，所述栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個雙鏈同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3',以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制 起點(diǎn)，以及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙 鏈末端，在粑DNA鏈上，從3，到5，，以下述順序存在第一個末端， 粑DNA序列，以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷 酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第 二個核苷酸序列，所述第一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源 臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷 酸序列同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第
14三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列同源，第 四個核苷酸序列與靶DN A鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及b)將細(xì) 胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
在該方法的一個特定實施方案中，宿主細(xì)胞還包括一個核苷酸序列， 該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點(diǎn)特異性重組酶，栽體還包括 位點(diǎn)特異性重組酶識別的第一個、第二個識別位點(diǎn)，第一個識別位點(diǎn)位 于第一個和第二個同源臂外部，第二個位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)位于 第一個和第二個同源臂內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或之后，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異 性重組酶的表達(dá)。
在該方法的另一個特定實施方案中，其中，宿主細(xì)胞還包括一個核 苷酸序列，該序列編碼一個與啟動子操作性相連的位點(diǎn)特異性重組酶， 栽體還包括一個位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于第一個和第二 個同源臂內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或之后，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組酶的表 達(dá)。
在特定實施方案中，栽體還包括一個位于同源臂外部的可選擇標(biāo)記， 這樣，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，栽體可以下述兩種順序含有i)第 一個同源臂，可選擇標(biāo)記，復(fù)制起點(diǎn)和第二個同源臂，或ii)笫一個同源 臂，復(fù)制起點(diǎn)，可選擇標(biāo)記和第二個同源臂。在一個特定實施方案中， 可選擇標(biāo)記使含有該栽體的細(xì)胞呈現(xiàn)抗生素耐藥性。
在多個特定實施方案中，細(xì)菌重組酶是RecE/T或Reda/(3重組酶， 或者同時應(yīng)用RecE/T和Redot/(3。在另一些特定實施方案中，細(xì)胞是細(xì) 菌細(xì)胞。在另一些特定實施方案中，細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。在另一些特 定實施方案中，細(xì)胞是真核細(xì)胞，并重組表達(dá)RecE/T和/或Reda/p蛋白。 在另一些特定實施方案中，該方法還包括分離重組DNA分子，該分子含 有插入到栽體中的把DNA。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了用于定向克隆或亞克隆目標(biāo) 乾DNA分子的雙鏈DNA載體，該栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下迷順序存在第一個同源臂，復(fù)制 起點(diǎn)，以及笫二個同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂 的核苷酸序列與笫 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第 一 條靶DNA鏈上的第二個 末端核苷酸序列同源。在有關(guān)栽體的一個特定實施方案中，復(fù)制起點(diǎn)是細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。在另一個特定實施方案中，復(fù)制起點(diǎn)在大腸桿菌中發(fā)揮 作用。在另一個特定實施方案中，復(fù)制起點(diǎn)在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮作用。
本發(fā)明還提供了含有雙鏈DNA栽體的細(xì)胞，該栽體可用于定向克隆 或亞克隆目標(biāo)靶DNA分子，包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體 DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以 及第二個同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸 序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈 上的第二個同源臂的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈上的第二個末端核 普酸序列同源。在一個特定實施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了可用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，該 試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶DNA分 子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體 DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以 及第二個同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸 序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈 上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個末端核 苷酸序列同源；以及b)含有細(xì)菌重組酶的細(xì)胞。在一個有關(guān)試劑盒的特 定實施方案中，同源臂的序列與基于BAC， PAC,人，質(zhì)?；験AC的克 隆栽體同源。在另一個有關(guān)試劑盒的特定實施方案中，第一個和第二個 雙鏈寡核苷酸具有的核苷酸序列與基于BAC, PAC,人，質(zhì)?；験AC的 克隆栽體同源。
在另一個實施方案中，提供了用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的 試劑盒，該試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標(biāo) 把DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3'，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制 起點(diǎn)，以及第二個同源臂；b)第一個雙鏈寡核苷酸，含有第一個寡核苷 酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第 二個核苷酸序列，所述第 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一個同源 臂的核普酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷 酸序列同源；c)第二個寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核普酸序列與栽體DNA鏈上的笫二個同源臂的核苷酸序列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的笫二個末端核苷酸序列同源；以及d)含有 細(xì)菌重組酶的細(xì)胞。在一個有關(guān)試劑盒的特定實施方案中，細(xì)胞是大腸 桿菌細(xì)胞。在另一個有關(guān)試劑盒的特定實施方案中，細(xì)胞是具有攝取DNA 能力的凍存細(xì)胞。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于定向克隆或亞克隆靶DNA 分子的試劑盒，該試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克 隆目標(biāo)靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個 同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源 臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個同源臂；b)第一個雙鏈寡核苷酸，含有第一 個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有笫一個核苷酸 序列和第二個核苷酸序列，所述第 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第
一個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第一個 末端核苷酸序列同源；以及c)第二個寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈， 該鏈以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序 列，所述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序 列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源。 在一個有關(guān)試劑盒的特定實施方案中，DNA載體經(jīng)純化處理。在另一個 有關(guān)試劑盒的特定實施方案中，DNA載體、第一個雙鏈寡核苷酸和第二 個雙鏈寡核苷酸均經(jīng)純化處理。
在本發(fā)明提供的另 一個有關(guān)試劑盒的特定實施方案中，靶DNA分子 包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲或原生動物DNA。在另一個特定實施方案中， 耙DNA分子包括已知或懷疑與某種功能紊亂或疾病相關(guān)的基因突變或 多態(tài)性。在另一個特定實施方案中，細(xì)菌重組酶是RecE/T或Reda/(3重 組酶，或者是RecE/T和Reda/p兩種重組酶。
本發(fā)明的方法還可用于診斷。例如，可以將質(zhì)?；蚓€性DNA片段設(shè) 計成能夠俘獲特異性靶DNA,以檢測該DNA是否存在于受試者樣本中， 如，病毒DNA存在于患者樣本中。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢 測當(dāng)發(fā)生基因突變時，已知或疑與功能紊亂或疾病相關(guān)的靶DNA的方 法。在特定實施方案中，該靶DNA是細(xì)菌、病毒、寄生蟲或原生動物 DNA。在一個特定實施方案中，提供了一種方法，該方法進(jìn)一步包括探 測含有插入到栽體中的靶DNA的重組DNA分子。在另一個實施方案中， 該方法還包括探測含有插入到栽體中的靶DNA的重組DNA分子。在另 一個實施方案中，本發(fā)明還提供了 一種探測感染性物質(zhì)存在的
方法，其中，靶DNA源自懷疑患有感染性疾病的患者，而且，第一個和 第二個同源臂與感染性物質(zhì)中存在的DNA序列同源。在一個特定實施方 案中，靶DNA源自懷疑患有感染性疾病的患者，而且，所述第二個和第 四個核苷酸序列與感染性物質(zhì)中存在的DNA序列同源。在另 一個特定實 施方案中，感染性物質(zhì)是病毒、細(xì)菌、原生動物、真菌或寄生蟲。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了一種探測遺傳性病況、疾病、 功能紊亂或多態(tài)性特征存在的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺傳性 病況、疾病、功能紊亂或多態(tài)性特征的患者，而且，第一個同源臂的序 列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態(tài)性特征相關(guān) 的位點(diǎn)上游序列同源，第二個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性 病況、疾病、功能紊亂或多態(tài)性特征相關(guān)的位點(diǎn)下游序列同源。在一個 特定實施方案中，提供了一種探測遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功 能紊亂或多態(tài)性特征存在的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺傳性病 況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態(tài)性特征的患者，而且，第一個 雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳 性功能紊亂或多態(tài)性特征相關(guān)的位點(diǎn)上游序列同源，第二個雙鏈寡核苷 酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂 或多態(tài)性特征相關(guān)的位點(diǎn)下游序列同源。在一個特定實施方案中，遺傳 性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態(tài)性特征使患者患有或易感 腫瘤，哮喘，關(guān)節(jié)炎，耐藥，藥物毒性，或神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)精神、代謝、 肌肉、心血管或皮膚病況、疾病或功能紊亂。
4.


圖1A-C。同源重組克隆和亞克隆方法的構(gòu)成。
A. 栽體，包括一個復(fù)制起點(diǎn)(起點(diǎn))， 一個可選擇標(biāo)記(Sm),和 兩個同源臂(以A和B代表)。
B. 備選雙鏈寡核普酸銜接子(adaptor)。每個銜接子包括與同源臂(分 別為A和B )同源的區(qū)域(以A，和B'代表)；與靶DNA末端(分 別以C和D代表)同源的第二個區(qū)域(以C，和D，代表)。
C. 把DNA。把DNA末端核苷酸序列(C和D)可以與栽體的一個 同源臂(分別為A和B)的核苷酸序列同源，也可以與備選銜接
18子寡核苷酸(分別以C，和D，代表)的核苷酸序列同源。 圖2。方法1的實驗要點(diǎn)。通過同源重組技術(shù)進(jìn)行亞克隆的栽體可以， 例如通過轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入大腸桿菌宿主，該宿主中已經(jīng)存在耙DNA以及 RecE/T或Reda/|3蛋白。該圖示意了攜帶大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo) 記基因(Sm)的線性DNA分子，并有"同源臂"側(cè)翼，所述Sm優(yōu)選其 產(chǎn)物具有抗生素耐藥性的基因。圖中所示的同源臂是位于線性DNA分子 兩端的灰色方框，同源臂是與靶DNA中位于亞克隆DNA區(qū)側(cè)翼的兩個 區(qū)域同源的短區(qū)域，該亞克隆DNA區(qū)側(cè)翼又稱為把DNA末端，在圖中 是被同源臂側(cè)翼包繞的粗線。轉(zhuǎn)化后，Sm基因的選擇性表達(dá)可用來鑒定 含有同源重組產(chǎn)物的細(xì)胞，所述同源重組位于線性DNA分子的同源臂與 把DNA之間。
圖3。以繪圖的方式代表方法2。該方法與用于圖1的方法類似，不 同點(diǎn)在于在該方法中，靶DNA分子沒有事先存在于大腸桿菌宿主中，而 是與線性DNA栽體分子一起，共同導(dǎo)入。靶DNA可以是任何來源的， 也可以是一種混合物，源自需要克隆的目標(biāo)DNA區(qū)域，或者是富含DNA 的分子，源自需要亞克隆的DNA區(qū)域。如圖1所示，同源臂以灰色方框 代表。
圖4。以繪圖的方式代表方法3?？寺』騺喛寺≡泽w包括一個大腸桿 菌復(fù)制起點(diǎn)和一個可選擇標(biāo)記基因(Sm),其側(cè)翼是兩個同源短臂，以 灰色方框顯示。此外，栽體還包括兩個重組靶位點(diǎn)(SSRTs),其中一 個位于起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記基因之間。最為簡單的是，首先將栽體構(gòu)建為 如圖所示的線性DNA片段。在環(huán)化基礎(chǔ)上，使第二個SSRT位于兩個同 源臂之間，定向成為相對于第一個SSRT的直接重復(fù)，這樣，在兩個SSRTs 之間的位點(diǎn)特異性重組就會產(chǎn)生兩個不同的環(huán)狀分子，從而將起點(diǎn)和可 選擇標(biāo)記基因分開。將環(huán)化栽體轉(zhuǎn)化到表達(dá)RecE/T或Reda/(3蛋白或可 以表達(dá)RecE/T或Reda/|3蛋白的大腸桿菌菌林中。大腸桿菌菌林還攜帶 一個可誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組酶(SSR)基因，該基因產(chǎn)物可以識別栽體 中的SSRTs，這樣，除非位點(diǎn)特異性重組酶基因被誘導(dǎo)或表達(dá)，SSRTs 間的位點(diǎn)特異性重組才會發(fā)生。制備攜帶栽體和調(diào)控位點(diǎn)特異性重組酶 基因的大腸桿菌細(xì)胞，使它們攜帶RecE/T或Reda/(3蛋白，并可用于轉(zhuǎn) 化。然后將含有預(yù)克隆區(qū)域的DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在同源臂間進(jìn)行 同源重組后，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組酶蛋白的表達(dá)，并篩選可選擇標(biāo)記基因的表達(dá)。在位點(diǎn)特異性重組前，細(xì)胞或者包括攜帶兩個SSRTs的未重 組栽體，或者包括所需同源重組產(chǎn)物，該產(chǎn)物僅攜帶一個SSRT，因為同 源重組將去除位于兩個同源臂之間的SSRT。位點(diǎn)特異性重組酶誘導(dǎo)表達(dá) 后，篩選可選擇標(biāo)記的表達(dá)，這樣，包括同源重組產(chǎn)物的細(xì)胞將獲得生 存能力，因為該產(chǎn)物不再是位點(diǎn)特異性重組的底物。
圖5。通過RecE/T或Reda/(3同源重組，應(yīng)用銜接子寡核苷酸克隆 或亞克隆。本示了上圖3所示方法2的變異。兩個銜接子寡核普酸， 每個都包括兩個同源區(qū)，其中一個同源區(qū)與栽體的一個同源臂同源，第 二個同源區(qū)與目標(biāo)把DNA區(qū)域兩個末端的一個同源。栽體的環(huán)化和目標(biāo) DNA區(qū)域的克隆可通過載體和銜接子之間、以及銜接子和靶DNA之間 的同源重組完成。在該實施方案中，載體和靶DNA之間沒有序列同源性。 因此，通過應(yīng)用相對于每個耙DNA的靶特異性銜接子寡核苷酸，可以應(yīng) 用相同的栽體克隆或亞克隆不同的靶DNA。銜接子寡核苷酸還可用于方 法1和3 ,如上圖1和3所示。
圖6。溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠，顯示應(yīng)用EcoRI消化DNA后的 結(jié)果。消化的DNA來自mAF4 BAC實驗的9個獨(dú)立克隆(泳道1 - 9 )。 泳道M是lkbDNA標(biāo)準(zhǔn)物(BRL， Bethesda, MD )。泳道10， EcoRI消 化的起始栽體。該實驗在部分6的實施例中將有詳細(xì)描述。
圖7A-B。從總酵母基因組DNA中克隆DNA區(qū)。
A. 圖示了一個擴(kuò)增了 pl5A起點(diǎn)的PCR片段，其側(cè)翼是兩個98或 102 bp的同源臂，其任一側(cè)整合了 98或102 bp的酵母菌株MGD 353-13D中的氨芐青霉素耐藥基因。將PCR產(chǎn)物(0.5mg)和總 酵母基因組DNA(4.0mg)混和，電轉(zhuǎn)化到JC5519大腸桿菌中， 該菌株含有來自pBADa(3y的Reda/(3表達(dá)。通過篩選氨芐青霉素 耐藥來鑒定克隆。
B. 溴化乙啶染色的凝膠，確認(rèn)IO個備選克隆中的正確克隆。
圖8A-C。在ET亞克隆中，線性栽體末端出現(xiàn)的重復(fù)序列或5，磷酸 的作用。
A,顯示了用于PCR擴(kuò)增線性載體的寡核苷酸序列。斜體序列表示 PCR擴(kuò)增線性載體所必需的寡核苷酸部分，其他核苷酸構(gòu)成大 腸桿菌lacZ基因的同源臂。黑體序列在線性栽體的兩端都有出 現(xiàn)，這樣可以形成末端重復(fù)。線性栽體構(gòu)建物a-x具有不同長度的重復(fù)序列。該線性栽體包括pl5A復(fù)制起點(diǎn)，加上氯霉素耐藥 基因Cm，，側(cè)翼是兩個同源臂，以及圖示的末端重復(fù)序列。
B. 圖示了用于檢測栽體構(gòu)建物在ET亞克隆大腸桿菌lacZ基因效率 的策略，所示栽體構(gòu)建物含有A中所示的不同重復(fù)序列。
C. 列表顯示了重復(fù)序列長度和磷酸化對ET亞克隆效率的作用。應(yīng) 用含有A中所示重復(fù)序列的栽體得到的測試結(jié)果如表所示。
圖9A-B。應(yīng)用pBAD-a(3丫 (tet)進(jìn)行ET重組亞克隆。
A. 圖示pR6K/BADa(3丫質(zhì)粒，包括R6K起點(diǎn)，pir-116復(fù)制子，來 自pBR322 (tet，)的四環(huán)素耐藥基因，以及阿拉伯糖抑制子 (araC)。
B. 比較應(yīng)用pBAD-a(3y (tet) ( Co舊l ori)和pR6K/BAD a(3丫進(jìn)行 ET重組亞克隆。
圖IOA-B。在BAC上亞克隆AF-4基因的19kb片段。
A. 質(zhì)粒構(gòu)建物和亞克隆策略，tet，，四環(huán)素耐藥基因。AraC，阿拉 伯糖抑制子。
B. 分析5個獨(dú)立克隆。溴化乙啶染色HindIII消化DNA凝膠，該 DNA來自5個獨(dú)立正確克隆和線性栽體。膠質(zhì)亞克隆經(jīng)DNA序 列分析確認(rèn)。M， lkbDNA階梯。
圖UA-B。應(yīng)用基因組DNA作為靶DNA源進(jìn)行ET亞克隆。
A. 來自大腸桿菌的基因組DNA通過Xhol消化預(yù)線性化。該線性栽 體包括ColEl起點(diǎn)和卡那霉素耐藥基因kan，其側(cè)翼為同源臂， 可以將重組定位于大腸桿菌染色體的lacI/lacZ位點(diǎn)。
B, 對16個獨(dú)立克隆的限制性分析。泳道17代表線性載體。M, lkb DNA階梯。
圖12A-B。亞克隆來自鼠ES細(xì)胞基因組DNA的新霉素基因neo。
A. 亞克隆策略圖。
B. 卡那霉素耐藥克隆的限制性分析。 圖13。 ET克隆和亞克隆的組合。
5.
具體實施例方式
本發(fā)明涉及應(yīng)用細(xì)菌重組酶介導(dǎo)的同源重組技術(shù)進(jìn)行DNA克隆和 亞克隆的方法和組合物。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌重組酶可以某種特定
21方式，用來獲得高效靶克隆或亞克隆。
細(xì)菌重組酶優(yōu)選應(yīng)用RecE/T和/或Redoc/p。在大腸桿菌中，RecE/T 途徑以前業(yè)已有所描述，其組分也已被部分認(rèn)識(Hall and Kobdner， 1994， Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 91: 3205-3209; Gillen et al., 1981， J. Bacteriol. 145:521-532 )。通過RecE/T途徑的重組需要兩個基因的表達(dá)，rec E和 rec T,其DNA序列已經(jīng)公開(Hall et al.， 1993， J. Bacteriol. 175: 277-278 )。 RecE蛋白的功能與人外顯子相似，后者又被稱為Redot， RecT蛋白的功 能與Re鄰以及噬菌體P22的erf相似(Gillen et al., 1977， J. Mol. Biol. 113: 27-41; Little, 1967， J. Biol. Chem. 242: 679-686; Radding and Carter, 1971， J. Biol. Chem. 246: 2513-2518; Joseph and Kolodner, 1983, Biol. Chem. 258: 10411-17; Joseph and Kolodner, 1983， Biol. Chem. 258: 10418-24; Muniyappa and Radding， 1986, J. Biol. Chem. 261: 7472-7478; Kmiec and Hollomon， 1981， J. Biol. Chem. 256: 12636-12639; Poteete and Fenton， 1983, J. Mol. Biol. 163: 257-275; Passy et al., 1999， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4279-4284，以及這些文獻(xiàn)引用的參考文獻(xiàn))。
本文描述的是涉及應(yīng)用細(xì)菌重組酶指導(dǎo)DNA克隆和亞克隆的方法 和組合物。本文應(yīng)用的術(shù)語"DNA克隆"是指將任何來源的DNA插入 到自治復(fù)制栽體的過程，這樣，該DNA可以在宿主細(xì)胞中增殖。術(shù)語 "DNA亞克隆"是指將業(yè)已存在于自治復(fù)制載體的DNA片段穿梭于另 一自治復(fù)制栽體的過程，或者將來自富含DNA分子如純化病毒基因組的 DNA片段或經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段穿梭于另一自治復(fù)制栽體的過程。 術(shù)語"定向"或"靶"克隆和亞克隆是指應(yīng)用同源臂以及(在很多實施 方案中是)銜接子寡核苷酸來選擇靶DNA，并通過同源臂的選擇和定向 作用，指導(dǎo)或定向靶DNA的插入。應(yīng)該指出，本發(fā)明所有申請方法適用 于克隆和亞克隆DNA。
本發(fā)明組合物和方法的構(gòu)建將在這里給予詳盡闡述。具體地說，部 分5.1描述了本發(fā)明應(yīng)用同源重組技術(shù)靶向克隆DNA片段的介導(dǎo)重組克 隆方法。下面的部分5,2描述了本發(fā)明組合物，包括設(shè)計用來定位、俘獲 和克隆目標(biāo)靶DNA片段的DNA構(gòu)建物。該部分還描述了編碼細(xì)菌重組 酶如RecE/T和/或Reda/(3蛋白的核酸分子，含有這些組合物的細(xì)胞，以 及構(gòu)建這些核酸和細(xì)胞的方法。下面的部分5.3描述了細(xì)菌重組酶靶向克 隆方法的應(yīng)用，以及探測基因表達(dá)和診斷疾病狀態(tài)的試劑盒。5.1通過同源重組技術(shù)克隆和亞克隆的方法
通過細(xì)菌重組酶介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，可以應(yīng)用本文描述的不同方 法，高效靶向克隆任何目標(biāo)DNA。本文描迷的3種方法所需的常見組分 是一種表達(dá)細(xì)菌重組酶重組蛋白的細(xì)胞，和一個栽體。該栽體的一個示 例見圖1A。栽體包括3個必需元素 一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個雙鏈DNA短 區(qū)，本文又稱為"同源臂"。
同源臂被特意設(shè)計成可以通過同源重組技術(shù)，允許栽體在兩個同源 臂之間"俘獲"目標(biāo)把DNA。同源臂的序列、位置和定向性對于靶DNA 在兩臂之間的正確插入至關(guān)重要。在一個實施方案中，同源臂序列與粑 DNA的末端同源，兩個同源臂的DNA序列位于目標(biāo)靶DNA的側(cè)翼，其 中 一個臂(在圖1中以A代表)對應(yīng)于靶DNA (在圖1中以C代表)的 上游DNA序列，第二個臂(在圖1中以B代表)對應(yīng)于靶DNA (在圖 1中以D代表)的下游序列。兩個臂相對于所需插入的定向性必須與同 源序列相對于靶DNA的定向性相同(見圖1)，這樣，同源臂與靶DNA 之間的重組才會導(dǎo)致把DNA被插入到兩個同源臂之間或"內(nèi)部"(見圖 1)。在這里， 一個位置被定義為同源臂"內(nèi)部"是指，如果該位置位于 兩個同源臂之間，這樣，在一個方向上，第一個同源臂位于復(fù)制起點(diǎn)和 其本身之間，在另一個方向上，第二個同源臂位于復(fù)制起點(diǎn)和其本身之 間 反之， 一個位置被定義為同源臂"外部"是指，如果在一個方向上， 沒有同源臂可以將其本身與復(fù)制起點(diǎn)分開。因此，通過該定義，復(fù)制起 點(diǎn)和可選擇標(biāo)記位于載體同源臂的"外部"(見圖1)，這樣，靶序列的 插入不會影響質(zhì)粒上的復(fù)制起點(diǎn)和可逸擇標(biāo)記。相反，通過該定義，靶 DNA是插入到同源臂的"內(nèi)部"。圖1A形象地描繪出同源臂的"內(nèi)部" 和"外部"。
在另一個實施方案中，同源臂序列與一套雙鏈銜接子寡核苷酸同源。 這些銜接子寡核苷酸如圖1B所示。每個銜接子寡核苷酸序列都包括栽體 一個同源臂的序列，以及與目標(biāo)靶基因側(cè)翼序列同源的序列(見圖1C)。 因此， 一個銜接子寡核苷酸包括一個與同源臂DNA序列同源的序列(在 圖1中以A，代表)，以及靶DNA的上游核苷酸序列(在圖1中以C，代 表)。第二個銜接子寡核苷酸包括一個與同源臂DNA序列同源的序列(在 圖1中以B，代表)，以及位于靶DNA下游的核苷酸序列(在圖1中以D，
23代表)。以這種方式，銜接子寡核普酸可以通過改變其序列，用來使普
通的同源克隆栽體適應(yīng)目標(biāo)特異靶基因序列(見圖5)。可以用來進(jìn)行本 發(fā)明多種實施方案的方法和組合物將在這里給予詳盡描述。
下面描述的方法包括三種不同方法，通過同源重組技術(shù)進(jìn)行定向克 隆。如下詳述，這三種方法的每一種都具有它們自己的優(yōu)勢，可以優(yōu)選 用來進(jìn)行具體的克隆應(yīng)用。這些方法和應(yīng)用將在下面給予詳述。在一個 方法中，如圖2所示，克隆栽體被導(dǎo)入含有目標(biāo)靶DNA的細(xì)胞。該方法 可用來將插入方便地從一個復(fù)制子穿梭于另一個復(fù)制子，而無需進(jìn)行累 人的限制性分析和體外操作。該方法可用于靶DNA業(yè)已存在于大腸桿菌 復(fù)制子的情況，它的進(jìn)一步應(yīng)用需要對選擇部分進(jìn)行亞克隆。例如，分 離自粘粒、噬菌體或BAC庫的DNA克隆可以通過將所選部分亞克隆到 新栽體中而方便地應(yīng)用，所述亞克隆是為了對插入序列進(jìn)行序列分析或 表達(dá)基因編碼的蛋白。在第二種方法中，如圖3所示，先制備克隆栽體 和目標(biāo)把DNA，然后一起導(dǎo)入細(xì)胞。此外，如圖4所示，目標(biāo)DNA被 加入到已經(jīng)包括克隆載體的細(xì)胞中。后兩種方法可用于靶DNA來自外源 的情況，例如，DNA來自腫瘤細(xì)胞。
5,1.1方法l:將栽體導(dǎo)入含有靶DNA的宿主細(xì)胞
在一個實施方案中，如圖2所示，靶DNA業(yè)已存在于表達(dá)細(xì)菌重組 酶的宿主細(xì)胞中。例如，耙DNA可能位于獨(dú)立復(fù)制的DNA分子上，例 如但不限于質(zhì)粒、噬菌體、細(xì)菌人工染色體(BAC)或大腸桿菌宿主細(xì) 胞中的大腸桿菌染色體。構(gòu)建表達(dá)細(xì)菌重組酶的宿主細(xì)胞的方法在部分 5.2.2中將給予詳述，所示細(xì)菌重組酶如RecE/T或Reda/(3。
將栽體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所示栽體DNA包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩 個同源臂，這兩個同源臂可以位于起點(diǎn)和標(biāo)記的任一側(cè)。優(yōu)選地，栽體 是線性分子，同源臂位于線性分子的兩端，盡管它們可以在內(nèi)部。進(jìn)入 細(xì)胞后，發(fā)生在載體DNA同源臂和靶序列之間的同源重組使靶DNA插 入到同源臂之間，并形成環(huán)狀游離體。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基 中，篩選載體上存在選擇標(biāo)記的細(xì)胞。由于只有環(huán)狀分子才能夠復(fù)制， 并在宿主細(xì)胞中被選擇，在選擇培養(yǎng)基中能夠生長的很多細(xì)胞都含有包 括把DNA的重組分子。
在一個實施方案中，線性栽體DNA片段的末端通過修飾核苷酸進(jìn)行阻斷，以降低除了同源重組之外的其他方法導(dǎo)致的線性片段末端的連接 事件數(shù)量，即非法重組。這些修飾核苷酸，如磷酸硫代核苷酸，可以整
合到同源臂的5，末端核苷酸中。修飾核苷酸可以在用于構(gòu)建栽體的寡核 苷酸引物合成過程中(見以下部分5.2.1 )導(dǎo)入，或者，也可以在合成后， 對線性栽體DNA的寡核普酸進(jìn)行酶或化學(xué)修飾來添加。對寡核苷酸和線 性DNA片段進(jìn)行這些修飾的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并在以下部分 5.2.2中有詳迷。
5.1.2方法2:將栽體和靶DNA共同導(dǎo)入宿主細(xì)胞
在另一個實施方案中，如圖3所示，體外混和栽體DNA和靶DNA, 然后共同導(dǎo)入含有RecE/T或Reda/p重組酶的細(xì)胞中。耙DNA可以是 任意來源的。例如，靶DNA可以來自生物樣本，例如但不限于全血，血 漿，血清，皮膚，唾液，尿液，淋巴液，活檢細(xì)胞，組織培養(yǎng)細(xì)胞，培
養(yǎng)基，也可以來自非生物樣本，如食物，水，或其他材料。從這些材料 中制備DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見，如Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
體外制備并混和栽體和靶DNA，然后共同導(dǎo)入表達(dá)細(xì)菌重組酶蛋白 的細(xì)胞中，優(yōu)選通過共同電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌。栽體DNA可以是線性 DNA形式，也可以是環(huán)狀質(zhì)粒DNA的形式。在一個優(yōu)選實施方案中， 栽體是線性DNA分子。靶DNA來源在重量上超過或多于，相對于栽體 DNA，這樣導(dǎo)入細(xì)胞中的目標(biāo)靶DNA區(qū)域的拷貝數(shù)可以盡量多，從而使 重組產(chǎn)物的產(chǎn)量最大化。使細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長，以篩選環(huán)狀產(chǎn)物。 在一個優(yōu)選實施方案中，載體包括一個抗生素耐藥標(biāo)記，細(xì)胞生長于含 有這種抗生素的培養(yǎng)基中。在這種選擇培養(yǎng)基中能夠生長的集落含有環(huán) 化、重組形式的線性片段。
在一個實施方案中，如以下部分5.2.1所述，線性栽體DNA片段的 末端應(yīng)用修飾核苷酸阻斷。這些修飾寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知 的，如以下部分5.2.2所述。
這種方法對于靶DNA不是源于大腸桿菌的情況特別有用，例如，靶 DNA來源于酵母或真核細(xì)胞。在一個實施方案中，該方法可以用于診斷 目的，探測在任意生物樣本中特定DNA的存在。例如，該方法可用來探測乳腺癌患者活檢樣本中特異性雌激素受體或BRCA 1等位基因的存在。 在另一個實施方案中，該方法可以作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù) 擴(kuò)增的替代方法，用來擴(kuò)增DNA區(qū)域。通過同源重組、克隆和在大腸桿 菌中增殖的擴(kuò)增方法，相對于基于PCR的技術(shù)，存在一些優(yōu)勢。首先， PCR誤差對于很多應(yīng)用目的來說是本質(zhì)障礙。聯(lián)合應(yīng)用PCR引物對可能 產(chǎn)生一些假反應(yīng)產(chǎn)物。而且，在一個誤差引入DNA樣本后，該誤差在最 終反應(yīng)產(chǎn)物中的數(shù)量隨著PCR擴(kuò)增的每一輪，以指數(shù)級上升。相反，通 過同源重組克隆技術(shù)擴(kuò)增在大腸桿菌中具有細(xì)胞閱讀前機(jī)制的優(yōu)勢，這 樣，至少更可靠1000倍。第二，應(yīng)用本方法，對待擴(kuò)增DNA區(qū)域的大 小限制較少。應(yīng)用PCR技術(shù)，擴(kuò)增長度超過幾千堿基對(超過5- 10kb) 的DNA區(qū)域就相當(dāng)困難。而本方法適用于克隆更大的區(qū)域，至少大約 IO萬堿基對。目前，克隆基因組包括創(chuàng)建大型隨機(jī)庫的冗長過程，隨后 還要進(jìn)行每個克隆的分類和排序。應(yīng)用本方法，可以設(shè)計同源臂，構(gòu)建 栽體，將基因組定向克隆到大型、非冗余、鄰近克隆中，即所謂的
"contigs"。第三，通過PCR技術(shù)制備DNA后，甚至還需要額外的過 程，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的克隆。同源重組克隆技術(shù)則避免了進(jìn)行額外亞克隆 步驟的需要。只需要將待擴(kuò)增的DNA區(qū)域插入到同源臂之間，然后與栽 體DNA —起轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主。
在該實施方案中的同源重組在將DNA加入細(xì)胞之前，可以體外進(jìn) 行。例如，分離的RecE和RecT,或者含有RecE/T的細(xì)胞提取物可以加 入DNAs混合物中。當(dāng)重組在體外發(fā)生時，DNA分子的篩選可以通過 應(yīng)用重組混合物轉(zhuǎn)化適宜宿主細(xì)胞并如前所述篩選陽性克隆來實現(xiàn)。
5.1.3方法3:將靶DNA導(dǎo)入含有栽體DNA的宿主細(xì)胞
在另 一個實施方案中，靶DNA被導(dǎo)入已經(jīng)含有栽體DNA的細(xì)胞中。 耙DNA可以是任意來源的，如上5.1.2所述，其形式可以是線性，也可 以是環(huán)狀。如上所迷，耙DNA—旦進(jìn)入細(xì)胞，在同源臂和耗DNA之間 進(jìn)行的同源重組就會使靶DNA插入到同源臂之間。但是，在這種情況下， 用來選擇未重組栽體的反選擇是必需進(jìn)行的，因為所需產(chǎn)物和未重組栽 體都表達(dá)可選擇標(biāo)記基因。本文將詳細(xì)描述多種進(jìn)行該反選擇過程的實 施方案。例如，在一個實施方案中，應(yīng)用了位點(diǎn)特異性重組和切除反應(yīng) 的方法。該方法在圖5給予了描述。在另一個實施方案中，可誘導(dǎo)核酸
26酶被誘導(dǎo)，裂解未重組栽體。在兩個實施方案中，不含重組產(chǎn)物的栽體 均被消除。
栽體首先被構(gòu)建成質(zhì)粒，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞中增殖。
如圖5所示，栽體含有(i)復(fù)制起點(diǎn)(任意起點(diǎn))；(ii)可選擇標(biāo)記(Sm ); (iii)兩個同源臂；以及(iv)可選擇的反標(biāo)記，例如但不限于一對位點(diǎn)特異 性重組酶的識別位點(diǎn)，第一個識別位點(diǎn)位于同源臂外部，第二個識別位 點(diǎn)位于同源臂之內(nèi)，或者核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，該酶可用于篩選起始 質(zhì)粒栽體。在這里， 一個位置被定義為同源臂"內(nèi)部"是指，如果該位 置位于兩個同源臂之間，這樣，在一個方向上，第一個同源臂位于復(fù)制 起點(diǎn)和其本身之間，在另一個方向上，笫二個同源臂位于復(fù)制起點(diǎn)和其
本身之間。反之， 一個位置被定義為同源臂"外部"是指，如果在一個 方向上，沒有同源臂可以將其本身與復(fù)制起點(diǎn)分開。(見圖1,圖示了同 源臂"內(nèi)部，，和"外部"含意)。復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記必須位于同源 臂的外部，如上部分5.1所述，這樣，把序列的插入才不會影響質(zhì)粒上的 復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記?？蛇x擇反標(biāo)記、核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)或兩個位點(diǎn)特 異性重組酶靼位點(diǎn)的其中一個優(yōu)選位于同源臂的"內(nèi)部"(見圖5)，在 復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記的另 一側(cè)。
可以應(yīng)用任何本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行反選擇非重組載體。例如，在 一個實施方案中，反選擇可以通過一個可誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組酶(SSR) 來實現(xiàn)。位點(diǎn)特異性重組酶是可以識別兩個靶位點(diǎn)的酶，這兩個靶位點(diǎn) 又稱為位點(diǎn)特異性重組酶耙位點(diǎn)(SSRTs),該酶通過這兩個位點(diǎn)發(fā)揮 作用，介導(dǎo)DNA鏈的交換和切除反應(yīng)(Hallet et al.， FEMS Microbiol, Rev., 1997， 21: 157-78; Sauer， 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 521-7; Stark et al.， 1992, Trends Genet,，8: 432-9)。位點(diǎn)特異性重組酶的示例是本領(lǐng)域眾所 周知的，包括但不限于Cre， Flp， Kw或R重組酶(Nunes-Duby et al., 1998， Nucleic Acids Res. 26: 391-406; Ringrose et al.， 1997, Eur. J. Biochem. 248: 903-912; Utatsuetal.， 1987， J. Bacteriol. 169: 5537-5545 )。當(dāng)兩個直接重 復(fù)SSRTs位于環(huán)狀質(zhì)粒上時，兩個SSRTs之間的位點(diǎn)特異性重組就會形 成兩個環(huán)狀質(zhì)粒。只有含有復(fù)制起點(diǎn)的產(chǎn)物保留在細(xì)胞中。因此，位于 環(huán)狀質(zhì)粒兩個直接重復(fù)SSRTs之間的位點(diǎn)特異性重組，可以去除位于兩 個SSRTs之間、不包括復(fù)制起點(diǎn)的DNA序列。
DNA栽體可以構(gòu)建包括兩個SSRTs，定向如直接重復(fù)，其中一個位于同源臂的內(nèi)部，第二個位于同源臂的外部，在可選擇標(biāo)記(SM)和復(fù) 制起點(diǎn)之間。以這種方式定位的SSRTs間發(fā)生的重組，可以導(dǎo)致復(fù)制起 點(diǎn)與可選擇標(biāo)記的分離(見圖5)。因此，SSR可以作用于含有兩個SSRTs 的非重組DNA栽體，導(dǎo)致該質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的消失。
然后通過標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)用栽體DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在該實施方案中， 宿主細(xì)胞必須包括1)RecE/T和/或Redoc/l3基因，以及2)編碼SSR的 基因。優(yōu)選地，RecE/T和/或Reda/(3基因的表達(dá)是可以誘導(dǎo)的，但固定 表達(dá)也是可以的。編碼能夠識別SSRTs的位點(diǎn)特異性重組酶(SSR)的 基因必須是可誘導(dǎo)的。可誘導(dǎo)和固定啟動子在本領(lǐng)域是眾所周知的；它 們在重組基因構(gòu)建和表達(dá)過程中的應(yīng)用方法將在以下部分5.2.3中給予 描述。如果RecE/T和/或Reda/(3基因需要誘導(dǎo)表達(dá)，在制備功能細(xì)胞之 前，含有栽體的細(xì)胞必須在可以誘導(dǎo)表達(dá)的條件下生長。含有栽體DNA 的宿主細(xì)胞可以通過接種、生長于選擇培養(yǎng)基來篩選、維持。
然后從含有栽體的宿主細(xì)胞中制備功能細(xì)胞。應(yīng)用靶DNA轉(zhuǎn)化細(xì) 胞，所述靶DNA可以是任意來源的，如從任何細(xì)胞中制備的總基因組 DNA。細(xì)胞短暫培養(yǎng)，使同源重組可以發(fā)生。同源重組可以去除含有一 個SSRT的同源臂之間的序列，并插入靶基因序列。然后誘導(dǎo)SSR的表 達(dá)。SSR會作用于未重組栽體的直接重復(fù)SSRTs,使可選擇標(biāo)記與質(zhì)粒 復(fù)制起點(diǎn)分開。含有插入靶序列的質(zhì)粒只有一個SSRT，因此會保持完整。 在進(jìn)行該步驟時，可以進(jìn)行篩選，也可以不進(jìn)行篩選，但在SSR誘導(dǎo)后， 即在位點(diǎn)特異性重組發(fā)生后，必須很快進(jìn)行篩選步驟。以這種方式，SSR 的誘導(dǎo)可以篩選含有插入靶基因的質(zhì)粒。
在另一個實施方案中，可以在同源重組發(fā)生之前、期間或之后，體 內(nèi)應(yīng)用核酸內(nèi)切酶在兩個同源臂之間使栽體線性化。在重組之前進(jìn)行栽 體線性化可以選擇正確重組產(chǎn)物，因為除非線性質(zhì)粒發(fā)生環(huán)化，否則在 細(xì)胞中不能存活。重組后，核酸內(nèi)切酶的持續(xù)活性將有助于篩選含有插 入序列的質(zhì)粒，因為在重組期間，SSR去除了核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，并 在該位置插入靶DNA。因為核酸內(nèi)切酶只裂解非重組栽體，而使含有插 入靶序列的質(zhì)粒保持完整，因此重組后核酸內(nèi)切酶的持續(xù)活性可以篩選 非重組產(chǎn)物。在該實施方案中，必須應(yīng)用識別位點(diǎn)非常少見的核酸內(nèi)切 酶，這樣，在宿主細(xì)胞DNA中沒有其他識別位點(diǎn)存在。這些"少見切割 者"的示例在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括但不限于人cos,酵母HO或內(nèi)
28含子編碼的核酸內(nèi)切酶如PI-Scel。核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)應(yīng)該克隆在兩 個同源臂之間，這樣，核酸內(nèi)切酶的酶切消化就會在同源臂之間形成線 性化栽體。核酸內(nèi)切酶基因的表達(dá)必須是可誘導(dǎo)的。可誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的 構(gòu)建和方法將在下面部分5.2.3加以探討。
在另一個實施方案中，可以應(yīng)用SSR,例如Cre重組酶來代替核酸 內(nèi)切酶，體內(nèi)線性化未重組栽體(見MulUns et al., 1997, Nucleic Adds Res 25:2539-40 )。在這種情況下，構(gòu)建的栽體只有一個位于同源臂內(nèi)部的 SSRT位點(diǎn)。含有相同SSRT拷貝的超量寡核苷酸與靶DNA混和，并與 靶DNA—起，共轉(zhuǎn)化宿主。優(yōu)選地，寡核苷酸是雙鏈短DNA分子。當(dāng) 一個重組分子含有位于短寡核苷酸上的SSRT時，位點(diǎn)特異性重組酶將 在SSRT位點(diǎn)線性化栽體(Mullinsetal.， 1997,supra)。
在另一個實施方案中，可以將上述位點(diǎn)特異性重組和核酸內(nèi)切酶方 法聯(lián)合應(yīng)用。在這種情況下，未重組載體在同源臂內(nèi)部含有SSRT和核 酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。在該方法的一個實施方案中，SSR和核酸內(nèi)切酶可以在 一個單獨(dú)的可誘導(dǎo)啟動子控制下共同調(diào)節(jié)。這些蛋白質(zhì)共同調(diào)節(jié)、可誘 導(dǎo)表達(dá)的構(gòu)建和方法將在以下部分5.2.3中加以探討。
在另一個實施方案中，可以聯(lián)合采用這些位點(diǎn)特異性重組技術(shù)進(jìn)行 反篩選。在該實施方案中，采用兩對SSR/SSRTs，例如Cre/lox和Flp/FRT。 載體包括針對第一個SSR, SSR1的兩個位點(diǎn)， 一個位于同源臂內(nèi)部，第 二個位于同源臂外部，復(fù)制起點(diǎn)與可選擇標(biāo)記之間。此外，該栽體還包 括針對第二個SSR, SSR2的一個位點(diǎn)，位于同源臂內(nèi)部。SSR2的另一 個位點(diǎn)位于雙鏈短寡核苷酸上，并在細(xì)胞轉(zhuǎn)化期間，以超過靶DNA的量， 與靶DNA—起添加。在一個特定實施方案中，例如，線性化步驟的一個 SSR/SSRT對是Cre/loxP，去除步驟的第二對是Flp/FRT。
在另一個實施方案中，可以直接應(yīng)用細(xì)胞反篩選。在這種情況下， 質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)在大腸桿菌中只有單一拷貝(或者拷貝數(shù)量非常低)。這 種類型的復(fù)制起點(diǎn)包括iteron型起點(diǎn)，如噬菌體P1起點(diǎn)，以及基于大腸 桿菌染色體的質(zhì)粒起點(diǎn)，oriC。選擇適宜的復(fù)制起點(diǎn)，見Helinski， D.R., Toukdarian, A.E.， Novick, R.P. Chapter 122， pp 2295-2324 in "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" 2nd edition Frederick C. Niedhardt， Ed. ASM Press, Washington, 1996， ISBN 1-55581-084-5。在這 種情況下，構(gòu)建的栽體可以沒有任何SSRTs,但在同源臂之間不能不包括反篩選基因。這些反篩選標(biāo)記基因是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，可應(yīng)
用sacB， ccdB或四環(huán)素耐藥基因(適宜的反篩選基因和方法列表還見， Reyratet al.， 1998， Infect. Immun. 66: 4011-7)。預(yù)期的同源重組反應(yīng)將去 除反篩選基因，這樣，攜帶預(yù)期重組產(chǎn)物的細(xì)胞將在反篩選壓力下存活， 而攜帶未重組栽體的細(xì)胞將死亡。
5.2通過同源重組技術(shù)進(jìn)行克隆和亞克隆的組合物
本文描述了在多種實施方案中，通過同源重組技術(shù)進(jìn)行克隆的組合 物。在以下部分5.2描述的每一種克隆方法，在一個單一細(xì)胞中都必須同 時存在以下三種組分第一，攜帶兩個DNA短區(qū)域(本文稱為"同源臂，，) 的栽體，該DNA短區(qū)域的序列與靶序列同源；第二， RecE/T和/或Reda/卩 蛋白對，或其他細(xì)菌重組酶；第三，靶DNA序列。由細(xì)菌重組酶介導(dǎo)的， 在同源臂與靶基因側(cè)翼區(qū)域存在的同源序列間發(fā)生的重組，可以將靶 DNA插入或"俘獲"到兩個同源臂之間。這里將詳細(xì)描述它們構(gòu)建的組 合物和方法。
5.2.1同源克隆栽體
同源克隆栽體可以是線性或環(huán)狀DNA載體，包括一個復(fù)制起點(diǎn)，一 個可選擇標(biāo)記和兩個被設(shè)計成可以俘獲目標(biāo)靶DNA的DNA短區(qū)域?？?以根據(jù)所用手段或方法，選擇數(shù)種形式的克隆栽體。它們構(gòu)建的優(yōu)選形 式和方法如圖1 -5所示，并將在這里給予詳細(xì)描述。
5.2.1,1復(fù)制起點(diǎn)
栽體需要一個復(fù)制起點(diǎn)，使質(zhì)粒復(fù)制、增殖。如果在大腸桿菌中克 隆和增殖，可以應(yīng)用任何大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，這些復(fù)制起點(diǎn)的示例是本 領(lǐng)域眾所周知的(見Miller, 1992， A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,及其引用參考文獻(xiàn))。目前可 以獲得的非限制性質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的示例是Co舊l衍生性復(fù)制起點(diǎn) (Bolivar et al.， 1977， Gene 2: 95-113;見Sambrook et al., 1989， supm)， 在如pACYC184質(zhì)粒上存在的pl5A起點(diǎn)(Chang and Cohen, 1978， J. Bacteriol. 134: 1141-56;還見Miller, 1992, p. 10.4-10.11 ),以及適用于低 拷貝質(zhì)粒表達(dá)的pSClOl起點(diǎn)，它們都是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，在一個實施方案中，應(yīng)用了從高拷貝質(zhì)粒中獲得的復(fù)制起點(diǎn)，
如含有Co舊l衍生性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒的示例是本領(lǐng)域眾所周 知的(見Sambrook et al.， 1989, supra;還見Miller, 1992， A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 及其引用參 考文獻(xiàn))。 一個示例是來自pUC19的起點(diǎn)及其衍生物(Yanisch-Perron et al.， 1985， Gene 33: 103-119 ) 。 pUC載體的存在水平是每個細(xì)胞300 - 500 拷貝，并具有插入異源基因的便利克隆位點(diǎn)。為了極高水平表達(dá)，可以 應(yīng)用X栽體，如人gtl 1 ( Huynh et al，， 1984， in "DNA Cloning Techniques: Vol I: A Practical Approach", D. Glover, ed， pp 49-78， IRL Press, Oxford), 或在含有T7和Sp6聚合酶表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞中應(yīng)用T7或SP6噬菌體啟動 子(Srudier et al.， 1990， Methods Enzymol. 185: 60-89 )。
在需要低水平表達(dá)時，可以應(yīng)用中等或低拷貝的復(fù)制起點(diǎn)。中等拷 貝質(zhì)粒在本領(lǐng)域是眾所周知的，如pBR322,具有Co舊l衍生性復(fù)制起點(diǎn)， 每個細(xì)胞中有20-IOO拷貝(Bolivar etal., 1977, Gene 2: 95-113;見 Sambrook et al.， 1989， supra),或pACYC100質(zhì)粒系列中的pACYC184 質(zhì)粒，具有pl5A起點(diǎn)，每個細(xì)胞中有10- 12拷貝(Chang and Cohen, 1978， J. Bacteriol. 134: 1141-56;還見Miller, 1992， p. 10.4-10.11)。低拷貝質(zhì)粒 在本領(lǐng)域也是眾所周知的，例如，pSClOl，具有pSC101起點(diǎn)，每個細(xì) 胞中大約有5個拷貝。與pBR和pUC質(zhì)粒一樣，pACYC和pSC101質(zhì) 粒栽體都具有便利的克隆位點(diǎn)，并可在同一細(xì)胞中共同存在，因為它們 具有可兼容的復(fù)制起點(diǎn)和獨(dú)特的選擇性抗生素標(biāo)記。其他適宜的質(zhì)粒復(fù) 制起點(diǎn)包括基于質(zhì)粒的X或噬菌體P1復(fù)制子，例如Lorist系列(Gibson etal.， 1987， Gene 53: 283-286)。
當(dāng)所需表達(dá)水平更低時，可以應(yīng)用來自細(xì)菌染色體的復(fù)制起點(diǎn)(見 Miller, 1992, supra; Niedhardt， F.C.， ed., 1987, Escherichia coli and Salmonella typhimurmm， American Society for Microbiology, Washington D.C.; Yarmolmsky， MB. and Sternberg, N.， 1988, pp. 291-438, in Vol. 1 of The Bacteriophages, H. Calendar, ed., Plenum Press, Mew York) 。 jt匕夕卜，還 可應(yīng)用合成復(fù)制起點(diǎn)。
5.2.1.2可選擇標(biāo)記
為了在細(xì)胞中維持質(zhì)粒栽體，典型的載體還包括一個可選擇標(biāo)記。
31可以應(yīng)用任何本領(lǐng)域已知的可選擇標(biāo)記。在構(gòu)建大腸桿菌栽體時，可以 應(yīng)用任何使大腸桿菌有效產(chǎn)生抗生素耐藥的基因，以及任何使大腸桿菌 產(chǎn)生穩(wěn)定的可鑒別或可篩選表型變化的基因。優(yōu)選應(yīng)用抗生素耐藥標(biāo)記，
如來自TN903的卡那霉素耐藥基因(Friedrich and Soriano, 1991, Genes. Dev. 5: 1513-1523 ),或其他氨基糖戒類抗生素耐藥基因(所述其他氨基 糖甙類抗生素包括但不限于雙氫鏈霉素，慶大霉素，新霉素，巴龍霉素 和鏈霉素)，來自ISl的(3-內(nèi)酰胺酶，使大腸桿菌產(chǎn)生青霉素類耐藥(包 括但不限于氨千青霉素，羧芐青霉素，甲氧西林，青霉素N,青霉素O 和青霉素V)。其他可選擇基因序列包括但不限于編碼多肽的基因序列， 該多肽可以產(chǎn)生zeocin耐藥(Hegedus et al., 1998， Gene 207: 241-249 )。 其他可以應(yīng)用的抗生素是可以產(chǎn)生amphenicols如chloramphenicol耐藥 的基因，例如，可以應(yīng)用chloramphenicol轉(zhuǎn)酰酶(CAT)的編碼序列 (Eik脂nns et al., 1991, Gene 102: 93-98 )。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，應(yīng)該 指出，也可應(yīng)用其他非抗生素方法，用來篩選質(zhì)粒在細(xì)胞中的維持，例 如，可以應(yīng)用多種營養(yǎng)缺陷性標(biāo)記(見Sambrooketal., 1989, supra; Ausubel et al., s叩ra)。
5.2.1,3同源臂
載體的一個必需組分是兩個雙鏈DNA短區(qū)，這里又稱為"同源臂"。 在一個實施方案中，如圖l所示，兩個同源臂(以"A"和"B"代表) 與目標(biāo)耙DNA的側(cè)翼DNA序列(以"A，"和"B，"代表)同源，其中 一個臂與把DN A上游DNA序列同源，第二個臂與位于靶DN A下游的 序列同源。如這里所用，如果兩個雙鏈DNA分子具有相同的恒定區(qū)，可 以任選插入一個或多個差異堿基對，并能夠作為同源重組的底物，那么 它們是"同源的"。在一個優(yōu)選實施方案中，同源臂包括大約22-100 個堿基對或更多的連續(xù)堿基對，與目標(biāo)靶DNA的雙鏈側(cè)翼區(qū)相同。同源 區(qū)還可以插入 一 個或多個不同殘基，只要同源臂仍然能夠成為同源重組 的有效底物。在一個優(yōu)選實施方案中，為了使重組效率最優(yōu)化，同源臂 的長度大約為50個核苷酸，其中20 - 30 (如25)個連續(xù)堿基對序列相 同，沒有插入。盡管連續(xù)相同的區(qū)域可以更短(如，至少6， 8或10個 堿基對)，但應(yīng)用這種較短的連續(xù)相同區(qū)域，可以預(yù)見，重組效率可能 較低。例如，在一個實施方案中，連續(xù)相同區(qū)域的長度是6bp (Keimand
32Lark, 1990， J. Structural Biology 104: 97-106 )。同源臂的長度或其與耙 DNA側(cè)翼序列連續(xù)相同的長度沒有上限。
靶DNA側(cè)翼核苷酸序列在這里又稱為靶DNA "末端"。因此，一 個靶DNA有兩個末端，第一個末端和第二個末端。兩個同源臂相對于所 需插入序列的定向性必須與同源序列相對于靶DNA的定向性一致(見圖 1)，這樣，在同源臂和第一個、第二個靶DNA末端之間的重組，可以 將靶DNA插入到兩個同源臂之間，
兩個同源臂的序列可以根據(jù)實驗設(shè)計來選擇。在選擇同源臂時的唯 一限制是，該序列不應(yīng)在靶DNA內(nèi)出現(xiàn)超過一次，而且在同源重組反應(yīng) 期間，不應(yīng)在宿主細(xì)胞的其他地方出現(xiàn)。在這種情況下，在其他同源重 組事件的背景中，仍然可以獲得所需同源重組產(chǎn)物。在一個實施方案中， 同源臂序列是常用克隆載體的多接頭側(cè)翼序列，所述常用克隆栽體如 BAC， PAC, YAC (酵母人工染色體)，噬菌體克隆栽體如入EMBL或XGT 序列，phagemid,粘粒，pBR322, pGEM， pGEX, pET，桿狀病毒栽體，病 毒栽體如腺病毒載體和腺病毒相關(guān)病毒栽體。因此，可以應(yīng)用單一栽體 亞克隆任何在這些栽體中克隆的插入序列。含有這些同源臂的栽體對于 亞克隆插入序列特別有用，所述插入序列來自DNA文庫的陽性克隆，該 DNA文庫如BAC，PAC， YAC，粘粒或X庫。
在多個實施方案中，如下所迷，同源臂位于線性DNA分子的末端， 或者位于線性DNA分子之內(nèi)，或者位于環(huán)狀DNA質(zhì)粒栽體內(nèi)。
同源臂的定向性相對于它們與靶核苷酸序列的定向性一致。換句話 說，同源臂的方向，使所需DNA序列在重組發(fā)生后，插入到同源臂之間。 當(dāng)同源臂位于線性DNA末端時，插入DNA序列俘獲或插入到兩個同源 臂之間，并進(jìn)而形成一個環(huán)狀可復(fù)制質(zhì)粒。
5.2丄4銜接子塞核苷酸同源臂
在另一個實施方案中，同源臂的核苷酸序列與銜接子寡核苷酸的核 苷酸序列同源。兩個銜接子寡核苷酸的每一個都包括一個與一個同源臂 核苷酸序列同源的核苷酸序列，以及第二個與靶DNA兩個末端中的一個 同源的同源區(qū)域。銜接子寡核苷酸如圖1所示。栽體的同源臂以"A"和 "B"代表，與這些序列同源的銜接子寡核苷酸區(qū)域以"A，"和"B，"代 表。靶DNA的兩個末端以"C"和"D"代表，在銜接子寡核苷酸上與200910005085.1
之相應(yīng)的同源序列以"C，"和"D，"代表。在該實施方案中，由RecE/T 或Reda/p介導(dǎo)的在栽體同源臂、銜接子寡核苷酸同源區(qū)與靶基因側(cè)翼末 端之間發(fā)生的重組，使靶DNA插入或"俘獲"到栽體同源臂之間。
5.2.1.5構(gòu)建栽體
可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建線性片段或環(huán)狀載體(見 Sambrook et al.， 1989, supra; Ausubel et al.， supra) 例:6口，可以應(yīng)用合成 或重組DNA技術(shù)。在一個實施方案中，線性片段是通過PCR擴(kuò)增技術(shù) 制備的。在該方法中，合成的寡核苷酸在它們的5'端包括同源臂序列， 在它們的3'端包括PCR引物序列。然后應(yīng)用這些寡核苷酸作為PCR擴(kuò) 增反應(yīng)的引物，擴(kuò)增包括復(fù)制起點(diǎn)和可選擇基因標(biāo)記的DNA區(qū)域。在另 一個實施方案中，可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，使之包括兩個 適宜定向的同源臂，側(cè)翼包圍一個復(fù)制起點(diǎn)和一個可選擇基因標(biāo)記(見， 例如Methods in Enzymology， 1987， Volume 154， Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; and Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， New York )。然后，例如，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化，使 質(zhì)粒線性化。
在另一個實施方案中，例如，可以應(yīng)用下述方法構(gòu)建用于上面部分 5丄3的栽體DNA。合成兩個寡核苷酸，其中一個包括，從5，到3，， 一 個載體特異性限制性位點(diǎn)， 一個左側(cè)同源臂和一個PCR引物。另一個寡 核苷酸包括，從5，到3',相同的栽體特異性限制性位點(diǎn)， 一個SSRT， 一個右側(cè)同源臂和一個PCR引物。選擇兩個同源臂側(cè)翼包圍靶DNA。 SSRT是可以被任何位點(diǎn)特異性重組酶(SSR)如Cre, Flp， Kw或R重組 酶識別的位點(diǎn)。設(shè)計的合成寡核苷酸必須使兩個SSRTs在栽體中定向為 直接重復(fù)序列。兩個PCR引物被用來擴(kuò)增DNA模板，該模板包括一個 質(zhì)粒起點(diǎn)， 一個可選擇基因和在起點(diǎn)和可選擇基因間的相同SSRT。然后 應(yīng)用限制性酶酶切PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并通過連接有效環(huán)化，所述限制性酶 可以識別寡核苷酸5，末端包括的位點(diǎn)。然后應(yīng)用環(huán)狀產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 以擴(kuò)增、產(chǎn)生大量栽體。
在另一個實施方案中，線性片段可以通過采用具有可選擇標(biāo)記、起
34點(diǎn)和兩個克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒來構(gòu)建，然后將寡核苷酸同源臂克隆到每個克
隆位點(diǎn)中。然后應(yīng)用限制性酶酶切質(zhì)粒DNA,以產(chǎn)生由同源臂限定的線 性片段。該方法優(yōu)選用于構(gòu)建更復(fù)雜的質(zhì)粒一一例如，為了包括真核表 達(dá)元件，含有真核增強(qiáng)子和啟動子元件的質(zhì)粒。此外，其他序列元件也 可亞克隆到栽體上。
栽體還可以包括蛋白表達(dá)、操作或維持插入靶DNA所需的其他目標(biāo) 核苷酸序列。例如，在栽體的適宜位置，還可以包括啟動子序列，增強(qiáng) 子序列，翻譯序列如Shine和Dalgarno序列，轉(zhuǎn)錄因子識別位點(diǎn)，Kozak 共識序列，以及終止信號。在非細(xì)菌細(xì)胞，如在植物、昆蟲、酵母或哺 乳動物細(xì)胞中重組克隆，必須有其他序列元件，如種特異性復(fù)制起點(diǎn)， 轉(zhuǎn)錄、過程和翻譯信號。這些元件包括但不限于真核復(fù)制起點(diǎn)，增強(qiáng)子， 轉(zhuǎn)錄因子識別位點(diǎn)，CAT盒，或Pribnow盒。
在一個實施方案中，RecE/T和/或Redoc/(3或其他細(xì)菌重組酶是從細(xì) 胞的表達(dá)質(zhì)粒中重組制備的，所選栽體必須與下面部分5.2.3中所述的細(xì) 菌重組酶表達(dá)質(zhì)粒兼容。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚，在單一細(xì)胞中多個 質(zhì)粒表達(dá)所必須的兼容性需求。在原核細(xì)胞中增殖兩個或多個構(gòu)建物的 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，含有多個復(fù)制子的細(xì)胞，可 以應(yīng)用含有適宜兼容復(fù)制起點(diǎn)的栽體和獨(dú)立篩選系統(tǒng)來選擇并維持(見 Miller et al., 1992, supra; Sambrook et al.， 1989, supra)。
S.2.2細(xì)菌重組酶
本發(fā)明主要描述了關(guān)于RecE/T和/或Reda/(3的應(yīng)用。但是，經(jīng)驗豐 富的技術(shù)人員應(yīng)該很清楚，本發(fā)明同樣適用于其他細(xì)菌重組酶的應(yīng)用， 采用 一對同源雙鏈DNA分子作為底物，所述其他細(xì)菌重組酶具有介導(dǎo)同 源重組的能力。這里應(yīng)用的細(xì)菌重組酶是一種在細(xì)菌、或噬菌體或細(xì)菌 起點(diǎn)中內(nèi)源表達(dá)的重組酶，并具有介導(dǎo)同源重組的能力。在多個實施方 案中，細(xì)菌重組酶是RecE/T和/或Reda/(3重組酶。在另一個特定實施方 案中，啟動同源重組的功能等價系統(tǒng)包括來自噬菌體P22的erf蛋白。而 且，在本發(fā)明的應(yīng)用中，細(xì)菌重組酶的各別蛋白組分可以由其他功能組 分來取代。
這里應(yīng)用的"RecE，，和"RecT"首先指大腸桿菌，如大腸桿菌K12， 中的RecE或RecT。大腸桿菌RecE和RecT的核苷酸和氨基酸序列是眾所周知的(RecE， GenBank Accession No. M24905和SWISS-PROT Accession No. PI5033; RecT， GenBank Accession No. L23927和 SWISS-PROT Accession No. P33228 ) 。
"Reda"和"Red(3"指噬菌體入 編碼蛋白。Reda具有與RecE 5，到3'核酸外切酶相似的5，到3'核酸外切 酶活性，Red(3具有與RecT相似的DNA退火活性。這兩種人蛋白的核 苷酸和氨基酸序列也是眾所周知的(見GenBank Accession Nos. J02459; M17233 )。
經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員應(yīng)該很清楚，涉及RecE/T和/或Reda/p的參考 文獻(xiàn)也適用于RecE/T和Reda/f3聯(lián)合應(yīng)用的情況，除非有特別說明或有 上下文指示。在一個特定實施方案中，聯(lián)合應(yīng)用兩種酶復(fù)合物對于重組 效率具有協(xié)同作用。
可以應(yīng)用的重組酶還包括重組酶組分的等位基因變異體。例如，在 本發(fā)明RecE/T和Reda/(3重組系統(tǒng)中應(yīng)用的氨基酸序列還可以包括由 RecE， RecT， Reda或Redp的任何等位基因變異體編碼的氨基酸序列，只 要這些等位基因變異體是功能變異體，并至少在一定程度上具有同源重 組活性。這些等位基因變異體可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)(見，例如 Methods in Enzymology， 1987， volume 154， Academic Press; Sambrook et al., 1989， Molecular Cloning - A Laboratory Ma隠l， 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， New York)或蛋白進(jìn)化方法(Je,tus et al.， 1998， Curr. Opin. Biotechnol. 9: 534-548)進(jìn)行常規(guī)鑒定、制備。
通常情況下，編碼這些等位基因變異體的核苷酸應(yīng)該可以在中度嚴(yán) 格條件下(應(yīng)用，例如標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡雜交條件，最后在42'C用0.2 x SSC/0.1%SDS清洗；Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I， Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York， at p.2.10.3 )或高度嚴(yán)格條件下(應(yīng)用，例如標(biāo)準(zhǔn)Southern 印跡雜交條件，最后在68。C用0.1 x SSC/0.1%SDS清洗；Ausubel et al.， supra)，與編碼RecE， RecT， Reda或Red(3的互補(bǔ)序列雜交。
這里應(yīng)用的RecE, RecT, Reda或Re鄰還包括從嗟菌體或細(xì)胞中書亍 生的RecE, RecT， Reda或Red(3的同系化合物，所述噬菌體的宿主和所 迷細(xì)胞均是腸桿菌科的原核細(xì)胞。腸桿菌科的家族成員包括但不限于埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，檸檬酸細(xì)菌屬，克雷白桿菌屬以及變性菌屬。
這些RecE, RecT， Reda或Red(3的同系化合物通常由噬菌體基因組中的 基因編碼，該基因產(chǎn)物參與噬菌體生命周期中重組酶介導(dǎo)的過程，如在X 噬菌體生命周期中的Reda和Red(3。
RecE/T同系化合物可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)原核基因和重組DNA技術(shù)進(jìn)行常 身見鑒定、制備(見如，Sambrook et al.， supra, and Ausubel et al., supra)。 重組DNA可以通過克隆基因組或cDNA文庫，或通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲 得。例如，基因組文庫可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得，也可通過商 業(yè)渠道或非商業(yè)渠道獲得。然后應(yīng)用能夠與大腸桿菌recE或recT探針雜 交的核酸進(jìn)行篩檢(Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 72:3961 )，分離陽性克隆，并進(jìn)行序列分析。
在一個特定實施例中，RecE或RecT的同系化合物在鼠沙門氏傷寒 桿菌中常規(guī)鑒定。RecE和recT基因在大腸桿菌K-12中的性質(zhì)已經(jīng)非常 清楚，RecE ( GenBank Accession No. M24905和SWISS-PROT Accession No. P15033 )和RecT ( GenBank Accession No. L23927和SWISS-PROT Accession No. P33228 )的核苷酸和蛋白序列也已知(還見Bachmann, 1990: Microbiol. Rev. 54: 130-197; Rudd, 1992， in Miller， 1992， supra, pp. 2.3-2.43)?？梢詰?yīng)用鼠沙門氏傷寒桿菌的完整基因組粘?；蛉宋膸?。然 后在如上所述的雜交條件下，通過與大腸桿菌RecE或RecT探針雜交來 篩檢鼠沙門氏傷寒桿菌文庫。例如，由于兩個基因的同源性預(yù)期非常高， 因此優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)中等嚴(yán)格的雜交條件。
在一個實施方案中，這樣的條件包括含有DNA的濾器在含有6X SSC, 5XDenhart，s溶液，0.5 % SDS和100ug/ml變性鮭魚精子DNA的溶 液中，55'C預(yù)處理6小時。雜交在相同溶液中進(jìn)行，應(yīng)用的探針是5-20 x 10、pm"P標(biāo)記的。濾器在55。C的雜交混合物中孵育18-20小時，然 后用含有l(wèi)XSSC和0.r/。SDS的溶液，60'C清洗2次，30分鐘。然后將 濾器印跡干燥，暴露于X線片，放射自顯影?？梢詰?yīng)用的其他中等嚴(yán)格 條件是本領(lǐng)域眾所周知的。濾器的清洗是在37'C,應(yīng)用含有2XSSC, 0.1 。/。SDS的溶液，進(jìn)行1小時。隨后進(jìn)行的含有鼠沙門氏傷寒桿菌克隆的 分離、純化和特征分析可以按照本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行(見Ausubel et al., supra)。這些序列可以用來構(gòu)建本發(fā)明鼠沙門氏傷寒桿菌RecE/Ts。
此外，鼠沙門氏傷寒桿菌基因還可從鼠沙門氏傷寒桿菌mRNA中分
37離。mRNA可以從表達(dá)RecE或RecT蛋白的細(xì)胞中分離。通過逆轉(zhuǎn)錄 mRNA可以制備cDNA，然后應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行篩檢，如上述 篩檢基因組文庫的方法(見Ausubel et al.， supra ) 此外，recE或recT cDNA 還可應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，如RACE( cDNA末端的快速擴(kuò)增，Ausubel etal.,supra)，在該技術(shù)中，應(yīng)用兩個根椐大腸桿菌recE或recT序列設(shè) 計的引物"前導(dǎo)"引物的序列與大腸桿菌recE或recT mRNA的5，端 相同，"反向"引物與其3，端互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物可以通過序列分析進(jìn)行校 正，然后亞克隆，用于構(gòu)建本發(fā)明的RecE/T。這些cDNA序列也可應(yīng)用 本領(lǐng)域眾所周知的方法，用于分離鼠沙門氏傷寒桿菌基因組recE或recT 序歹寸(Sambrook et al.， 1989, supra; Ausubel et al., supra)。
編碼本發(fā)明RecE/T重組酶的核酸分子還可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾 所周知的重組和合成方法，進(jìn)行合成和/或構(gòu)建(見如，Sambrook etal., supra and Ausubel et al.， supra)。
如下所述，控制序列表達(dá)的能力對于應(yīng)用本發(fā)明方法是非常有益的， 這種序列表達(dá)的控制可以使表達(dá)能夠調(diào)節(jié)(如可誘導(dǎo))，并使表達(dá)水平 范圍非常寬。
核酸分子可以，例如在染色體外維持，如在質(zhì)粒、粘?；蚴删w上。 此外，核酸分子還可以應(yīng)用，例如噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)位，整合到染色體上， 如大腸桿菌染色體上。這樣，RecE/T編碼序列就可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，經(jīng) 工程學(xué)手段以高拷貝、低拷貝或單一拷貝存在于每個細(xì)胞中。也可應(yīng)用
多種不同的調(diào)控序列來驅(qū)動重組蛋白的表達(dá)。表達(dá)/菌林構(gòu)建的每一方面 都可操作，用以制備重組蛋白表達(dá)水平各異的細(xì)胞。應(yīng)該指出，重組蛋 白編碼序列在染色體上的單一拷貝還有其他優(yōu)勢，即這樣的配制使菌株 的構(gòu)建更加容易。
5.2.2.1蛋白表達(dá)
細(xì)菌重組酶在細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)或者是固 定的，或者是可誘導(dǎo)的。在一個優(yōu)選實施方案中，重組蛋白在細(xì)菌中表 達(dá)，最優(yōu)選在大腸桿菌中表達(dá)。例如，宿主細(xì)胞可以在其染色體上包括 recE和recT基因。內(nèi)源性表達(dá)RecE/T的大腸桿菌示例是已知的，例如 大腸桿菌sbcA菌抹(Zhang et al., 1998, supra)。此外，RecE/T還可從 非染色體DNA中重組表達(dá)，優(yōu)選在質(zhì)粒栽體上，如pBADET丫 ( Zhang etal., 1998， supra)或pGETrec (Narayanan et al., 1999， Gene Ther. 6: 442-447)。同樣，Reda/(3對于整合了人前噬菌體的菌抹可以是內(nèi)源性 的，也可以由質(zhì)粒表達(dá)，如pBADap丫 ( Muyrers et al,, 1999, supra)。可 以根椐標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建RecE/T和/或Reda/|3表達(dá)構(gòu)建物(見， 例:i口 Methods in Enzymology， 1987， volume 154， Academic Press; Sambrook et al.， 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， New York,每部文獻(xiàn)在此全文引入，作為參考)。
在一個實施方案中，RecE/T和/或Reda/p在大腸桿菌中由高拷貝質(zhì) 粒表達(dá)，所述高拷貝質(zhì)粒如含有Co舊l衍生性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，其示例 是本領(lǐng)域眾所周知的(見Sambrook etal.， 1989， supra;還見Miller, 1992， A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,及其引用的參考文獻(xiàn))，如pUC19及其衍生物(Yanisch-Perronetal., 1985， Gene 33: 103-119 )。
關(guān)于在不同表達(dá)水平進(jìn)行表達(dá)(調(diào)節(jié)的或固定的)調(diào)控的問題，本 領(lǐng)域技術(shù)人員知道很多這樣的調(diào)控序列。如下所述，產(chǎn)生寬范圍表達(dá)水 平的能力對于應(yīng)用本發(fā)明方法是有益的。這種表達(dá)可以通過固定以及調(diào) 控或誘導(dǎo)的形式實現(xiàn)。
通過應(yīng)用多種可誘導(dǎo)調(diào)控序列，可以實現(xiàn)不同表達(dá)水平的誘導(dǎo)表達(dá)。 在一個實施方案中，例如，這些多肽的編碼序列通過lacOP調(diào)控序列轉(zhuǎn) 錄時，應(yīng)用lacI基因及其誘導(dǎo)子IPTG可以產(chǎn)生RecE/T的可誘導(dǎo)、高水 平表達(dá)。
RecE和RecT可以通過不同啟動子表達(dá)，或者，recE和recT基因可 以在多順反子mRNA中通過單一啟動子表達(dá)。這些異源啟動子可以是可 誘導(dǎo)的，也可以是固定的。該表達(dá)優(yōu)選通過可誘導(dǎo)啟動子調(diào)控。不同表 達(dá)水平的可誘導(dǎo)表達(dá)可以通過多種可誘導(dǎo)調(diào)控序列實現(xiàn)。在一個實施方 案中，例如，這些多肽的編碼序列通過lacOP調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄時，應(yīng)用lad 基因及其誘導(dǎo)子IPTG可以產(chǎn)生RecE/T的可誘導(dǎo)、高水平表達(dá)。大量其 他可誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)也可應(yīng)用，它們對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周 知的。通過應(yīng)用不同強(qiáng)度的啟動子，RecE/T或Redot/p構(gòu)建物的表達(dá)水 平也可不同。誘導(dǎo)的araC啟動子，TET系統(tǒng)(Geissendorfer and Hillen， 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657-663 )，噬菌體人溫度的PL啟動子和可誘 導(dǎo)入抑制子CI857( Pirrotta， 1975， Nature 254: 114-117; Petrenko et al" 1989, Gene 78: 85-91 ) , trp啟動子和trp抑制子系統(tǒng)(Bennett et al., 1976, Proc. Natl, Acad. Sci USA 73: 2351-55; Wameetal，， 1986， Gene 46: 103-112)， lacUV5啟動子(Gilbert and Maxam, 1973， Proc. Natl, Acad. Sci USA 70: 1559-63 ) ， lpp (Nokamura et al.， 1982, J. Mol. Appl. Gen, 1: 289-299 ), T7基因-10啟動子，phoA(堿性磷酸酶)，recA (Horiietal.， 1980)以 及tac啟動子，可以通過色氨酸誘導(dǎo)的trp-lac融合啟動子(Amannetal.， 1983， Gene 25: 167-78),例如，都是常用的強(qiáng)啟動子，每種啟動子控制 的蛋白水平，都可累積達(dá)到細(xì)胞總蛋白的大約1-10%。如果需要更強(qiáng)的 啟動子，tac啟動子的強(qiáng)度大約比lacUV5強(qiáng)10倍，但會導(dǎo)致高水平基線 表達(dá)，因此，應(yīng)只用于需要過量表達(dá)的情況。如果需要更弱的啟動子， 其他細(xì)菌啟動子是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，麥芽糖、半乳糖或其他所 需啟動子(這些啟動子的序列可以通過Genbank獲得，(Burks et al.， 1991 Nucl. Acids Res. 19: 2227-2230 )
用于本文描述方法的細(xì)胞可以是含有RecE/T和/或Reda/p重組酶的 任何細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞。更優(yōu)選，宿主細(xì)胞 是腸細(xì)菌屬細(xì)胞。腸桿菌科的家族成員包括但不限于埃希氏菌屬，沙門 氏菌屬，檸檬酸細(xì)菌屬，克雷白桿菌屬以及變性菌屬。最優(yōu)選的宿主細(xì) 胞是大腸桿菌細(xì)胞。細(xì)胞可以來自任何生物體，包括但不限于酵母、蠅 類、鼠或人類細(xì)胞，只要這些細(xì)胞能夠經(jīng)工程學(xué)修飾表達(dá)適宜的重組酶。 重組酶優(yōu)選來自大腸桿菌的RecE/T重組酶，或者來自噬菌體人的Reda/(3 重組酶，或者是來自腸桿菌屬或腸桿菌屬噬菌體的RecE/T或Reda/(3重 組酶系統(tǒng)的功能等價物，這些系統(tǒng)可以介導(dǎo)同源序列區(qū)域之間的 重組。
表達(dá)RecE/T和/或Reda/p蛋白的細(xì)胞可以通過事先電賦能制備，并 儲存于-7(TC。
此外，本發(fā)明方法還可在其他任何能夠表達(dá)RecE/T和/或Reda/p的 細(xì)胞中進(jìn)行。例如，多種宿主栽體系統(tǒng)可以用來表達(dá)蛋白編碼序列。這 些包括但不限于病毒(如牛痘表達(dá)，腺病毒等)感染的哺乳動物細(xì)胞系 統(tǒng)，病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，微生物，例如含有酵母栽體的酵母，或者噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。 栽體的表達(dá)元件在其強(qiáng)度和特異性方面各不相同。根據(jù)應(yīng)用的宿主栽體 系統(tǒng)，可以選擇應(yīng)用任何一種適宜的轉(zhuǎn)錄、翻譯元件。在特定實施方案 中，表達(dá)RecE/T和/或Reda/(3基因，或者編碼RecE/T和/或Reda/p功 能活性部分的序列。在另 一個實施方案中，表達(dá)含有RecE/T和/或Reda/(3 蛋白功能區(qū)的RecE/T和/或Reda/(3片段。
將DNA片段插入栽體的任一種上迷方法都可用于構(gòu)建含有嵌合基 因的表達(dá)栽體，所述嵌合基因包括適宜的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控信號和蛋白編碼 序列。這些方法包括體外重組DNA和合成技術(shù)，以及體內(nèi)重組技術(shù)(基 因重組)。編碼RecE/T或Reda/(3蛋白或多肽片段的核酸序列的表達(dá)， 可以通過第二個核酸序列調(diào)控，這樣，RecE/T或Reda/p蛋白或多肽可 以在轉(zhuǎn)化了重組DNA分子的宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，ReeE/T或Reda/(3 蛋白的表達(dá)可以通過任何本領(lǐng)域已知的啟動子/增強(qiáng)子元件來調(diào)控?？捎?于調(diào)控RecE/T或Reda/|3表達(dá)的啟動子包括但不限于SV40早啟動子區(qū) 域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310 ), Rous肉瘤病毒3 ， 端長末端重復(fù)序列包括的啟動子(Yamamotoetal., 1980， Cell 22: 787-797)，皰滲病毒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子(Wagner etal.， 1981， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 ),金屬硫因基因調(diào)控序列 (Brinster et al.， 1982, Nature 296: 39-42 );植物表達(dá)栽體包括nopaline 合成酶啟動子區(qū)域(Her認(rèn)-Estrellaetal.， 1984， Nature 303: 209-213 )或 花椰菜嵌合病毒35S RNA啟動子(Gardner et al., 1981， Nucl. Acids Res. 9: 2871 )，以及光合成酶二磷酸核酮糖羧化酶啟動子(Herrera-Estrella et al.， 1984，Nature310: 115-120);來自酵母或其他真菌的啟動子元件，如Gal 4啟動子，ADC (乙醇脫氫酶)啟動子，PGK (磷酸甘油激酶)啟動子， 堿性磷酸酶啟動子，以及下述具有組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動物的動 物轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域在胰腺腺泡細(xì)胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因調(diào)控 區(qū)域(Swift et al.， 1984, Cell 38: 639-646; Omitz et al.， 1986， Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515 );在胰腺(3細(xì)胞中具有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)域(Hanahan， 1985， Nature 315: 115-122)，在淋巴細(xì)胞中具有活性的免疫球蛋白基因 調(diào)控區(qū)域(Grosschedl et al., 1984， Cell 38: 647-658; Adames et al.， 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al.， 1987, Mol. Cell. Biol. 7:
411436-1444)，在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中具有活性的鼠哺乳動物 腫瘤病毒調(diào)控區(qū)域(Lederetal., 1986, Cell 45: 485-495 )，在肝臟細(xì)胞中 具有活性的白蛋白基因調(diào)控區(qū)域(Pinkertetal., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276 )，在肝臟細(xì)胞中具有活性的甲胎蛋白基因調(diào)控區(qū)域(Krumlauf et al.， 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al.， 1987, Science 235: 53-58 );在肝臟細(xì)胞中具有活性的oc 1-抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)域(Kelsey etal.， 1987， Genes and Devel. 1: 161-171 )，在髓細(xì)胞中具有活性的|3球 蛋白基因調(diào)控區(qū)域(Mogrametal.， 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al.， 1986， Cell 46: 89-94);在腦少突細(xì)胞中具有活性的髄磷脂堿性蛋白 基因調(diào)控區(qū)域(Readheadetal.， 1987， Cell 48: 703-712);在骨骼肌中具 有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因調(diào)控區(qū)域(Sani, 1985, Nature 314: 283-286 )，以及在下丘腦具有活性的促性腺激素釋放激素基因調(diào)控區(qū)域 (Mason et al.， 1986， Science 234: 1372-1378 )。
在一個特定實施方案中，應(yīng)用的栽體包括一個與細(xì)菌重組酶(如 RecE或RecT)編碼核酸操作性相連的啟動子， 一個或多個復(fù)制起點(diǎn)， 并可任選一個或多個可選擇標(biāo)記(如抗生素耐藥基因)。
所選載體必須與上面部分5.2.1所述的栽體質(zhì)粒兼容。本領(lǐng)域技術(shù)人 員非常清楚，在單一細(xì)胞中維持多個質(zhì)粒所必須的兼容性需求。在原核 細(xì)胞中增殖兩個或多個構(gòu)建物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例 如，含有多個復(fù)制子的細(xì)胞，可以應(yīng)用含有適宜兼容復(fù)制起點(diǎn)的栽體和 獨(dú)立篩選系統(tǒng)來常規(guī)選擇并維持(見Miller et al.， 1992, supra; Sambrook etal.， 1989， supra)。
5,2.3宿主細(xì)胞
recE和recT和/或reda和redp基因產(chǎn)物的任何細(xì)胞，也可以是這些基因 能夠異源表達(dá)的任何細(xì)胞?？梢詰?yīng)用的可能細(xì)胞類型示例包括但不限于 原核真核細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母、植物、嚙齒類動物、鼠、人類、昆蟲或 哺乳動物細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在最優(yōu) 選實施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞?？梢詰?yīng)用的特定大腸桿菌菌 抹示例是JC 8679和JC 9604。 JC 8679和JC 9604的基因型是Sex ( Hfr， F+， F-，或F): F-JC 8679包括的變異recBC 21, recC 22， sbcA 23， thr-l，ara-14, leu B 6, DE (gpt-proA) 62， lacYl, tsx-33, gluV44 (AS), galK2(Oc), LAM-his-60， relA 1, rps L 31 (strR)， xyl A5, mtl-1, argE3 (Oc)和thi-1 。 JC 9604包括相同的變異，以及recA56變異。
在另一個實施方案中，應(yīng)用真核細(xì)胞作為本文描述的克隆和亞克隆 方法的宿主細(xì)胞。可以應(yīng)用任何表達(dá)或經(jīng)工程學(xué)修飾可以表達(dá)細(xì)菌重組 酶或其功能等價物的細(xì)胞?？梢詰?yīng)用來自人類、鼠、猴子或其他任何生 物體的細(xì)胞系。例如，用于本發(fā)明方法的非限制性細(xì)胞系示例包括CHO， VERO, BHK， HeLa, COS， MDCK, 293， 3T3以及WI38細(xì)胞。
多種宿主栽體系統(tǒng)都可用于導(dǎo)入或表達(dá)RecE/T，Redoc/p或其功能等 價系統(tǒng)的蛋白編碼序列。這些方法是本領(lǐng)域眾所周知的(見Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Intersdence, New York)。這些包括但不限于病毒(如牛痘表達(dá)， 腺病毒等)感染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)，病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲 細(xì)胞系統(tǒng)，微生物，例如含有酵母栽體的酵母，或者噬菌體、DNA、質(zhì) 粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。蛋白表達(dá)的方法也在上面部分5.2,2 中給予探討。
5.2.4把DNA
應(yīng)根據(jù)實驗設(shè)計選擇靶DNA,靶DNA可以是任意雙鏈DNA,其長 度可以只有l(wèi)個堿基對，也可以超過10萬個堿基對。在一個特定實施方 案中，耙DNA長度高達(dá)IOO， 125, 200或300 kb。在另一個特定實施方 案中，靶DNA含有25 - 100千堿基對，例如，與BAC栽體中存在的相 似。把DNAs的其他特定實施方案將在部分6的實施例中給予說明。靶 DNA可以存在于任何獨(dú)立復(fù)制的DNA分子上，例如^f旦不限于質(zhì)粒，BAC 或大腸桿菌染色體。靶DNA還可位于任意來源的DNA分子是，包括但 不限于來源于原核細(xì)胞、古細(xì)菌或真核細(xì)胞的DNA，或者來源于病毒、 噬菌體或合成體的DNA。例如，可以從下述來源獲得核酸序列人類， 豬，牛，貓，禽類，馬，犬，昆蟲(如果蠅)，無脊推動物(如C. elegans)， 植物等。DNA可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備(見，例如Sambrook， et al, 1989， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover (ed), 1985， DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd.， Oxford, U.K. Vol. I,II)。
5.3本發(fā)明的應(yīng)用方法 5,3.1將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞
任何已知將含有靶DNA的DNA制劑導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，均適用 于上述方法。這些方法在本領(lǐng)域已知，包括但不限于細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化，應(yīng) 用氯化4丐或銣制備功能細(xì)胞，應(yīng)用包衷于病毒顆粒中的靶DNA轉(zhuǎn)化 DNA。對于真核細(xì)胞，方法包括但不限于電轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染磷酸4丐沉淀的DNA 和病毒包裹。在一個優(yōu)選實施方案中，應(yīng)用電轉(zhuǎn)化。處理含有RecE/T或 Reda/(3蛋白的細(xì)胞，使之適用于標(biāo)準(zhǔn)方法的電轉(zhuǎn)化(見Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York )。優(yōu)選地，大約50ul標(biāo)準(zhǔn)電轉(zhuǎn)化功能細(xì)胞 制劑用于標(biāo)準(zhǔn)方法的電轉(zhuǎn)化。在需要轉(zhuǎn)化線性或環(huán)狀栽體的實驗中，優(yōu) 選應(yīng)用S0.3ug的栽體。在需要轉(zhuǎn)化含有靶DNA的DNA制劑的實驗中， 優(yōu)選應(yīng)用20.3ug。對于共轉(zhuǎn)化實驗，優(yōu)選在電轉(zhuǎn)化前混和DNAs。電轉(zhuǎn)化 后，優(yōu)選將細(xì)胞在培養(yǎng)基中稀釋，并在條件培養(yǎng)前孵育大約1.5小時，作 為復(fù)蘇期，所述條件能夠鑒別由可選擇標(biāo)記基因?qū)е碌谋硇透淖儭?br> 在應(yīng)用位點(diǎn)特異性重組或核酸內(nèi)切酶酶切栽體的實驗中，在制備電 轉(zhuǎn)化功能細(xì)胞之前，或者在電轉(zhuǎn)化后的復(fù)蘇期間，或者在鑒定可選擇標(biāo) 記的培養(yǎng)期間，可以誘導(dǎo)SSR或核酸內(nèi)切酶的表達(dá)，或者誘導(dǎo)SSR和核 酸內(nèi)切酶的聯(lián)合表達(dá)，或者誘導(dǎo)兩個SSR的聯(lián)合表達(dá)。
任選的表型改變是對一種抗生素的耐藥性，將細(xì)胞培養(yǎng)于含有相應(yīng) 抗生素的平板上。在這種情況下，過夜培養(yǎng)后顯示抗生素耐藥性的集落 主要含有所需亞克隆產(chǎn)物。
在另一個實施方案中，DNA通過轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA 業(yè)已包裝在噬菌體顆粒中。本領(lǐng)域已知P1或人噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)和包裝過程。 入包裝提取物可以通過商業(yè)渠道購買(例如，通過Promega, Madison, WI )。
5.3.2寡核苷酸
與本發(fā)明方法聯(lián)合應(yīng)用的寡核苷酸同源臂、引物和銜接子寡核苷酸 通常長度大約為10-ioo個核苷酸。在某些特定方面，寡核苷酸長度是 10個核苷酸，15個核苷酸，20個核苷酸，50個核苷酸，或者100個核苷酸，或者高達(dá)200個核苷酸。在優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸長度大約 為90個核苷酸。
寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行合成(例如，在 Applied Biosystems 392/394 DNA合成儀上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)亞磷酸胺化學(xué)合成)。 而且，合成試劑可以通過任一家供應(yīng)商獲得。
的任何方法合成，例如，應(yīng)用自動DNA合成儀(如可以通過商業(yè)渠道從 Biosearch, Applied Biosystems等購買)。作為示例，硫代磷酸寡核苷酸 可以通過Stein等的方法合成(1988， Nucl. Acids Res. 16， 3209 ),甲基磷 酸化寡核苷酸可以通過應(yīng)用控制孔玻璃多聚體支持物來制備(Sarin et al.， 1988， Proc. Natl. Acad， Sci. USA 85， 7448-7451 )等。
一個寡核苷酸可以包括至少 一個修飾堿基，只要這種修飾不會干擾 同源重組。例如，這些修飾包括但不限于5-氟尿嗜啶，5-溴尿嘧愛，5-氯尿嗜啶，5-碘尿嘧啶，次黃噪呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羥甲 基)尿嘧啶，5-羧甲氨甲基-2-硫尿嘧啶核苷，5-羧甲氨甲基尿嘧啶，雙氬 尿嘧啶，P-D-galactosylqueosine，次黃嘌呤核苷，N6-異戊烯腺噪呤，1-甲基鳥噪呤，1-甲基次黃噪呤核苷，2,2-二甲基烏嘌呤，2-甲基腺嘌呤， 2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-曱基胞嗜啶，N6-腺嘌呤，7-甲基烏嘌 呤，5-甲氨曱基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，P-D-mannosylqueosine ， 5，-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲硫-N6-異戊烯腺噪呤，尿嘧啶 -5-氧乙酸(v)，甲尿嗜啶，queosine， 2-硫胞嘧咬，5-甲基-2-硫尿嘧咬，2-硫尿嗜啶，4-疏尿嗜啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v), 5-甲基-2-疏尿嘧啶，3-(3-氨-3-N-2-羧丙基)尿嘧咬，以及2，6-二氨基嘌呤。
寡核苷酸包括至少一個修飾的磷酸主干，只要這種修飾不會干擾同 源重組。這些修飾包括但不限于硫代磷酸酯，二疏代磷酸酯，疏代亞磷 酰胺，亞磷酰胺，亞磚酰二胺，曱基碳磷酸化合物，烷基磷酸三酯，以 及甲縮醛或其類似物。
5.3.3 DNA擴(kuò)增
可以應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)連同本發(fā)明，從某一來源(如，組 織樣本，基因組或cDNA文庫)擴(kuò)增所需序列。代表已知序列的寡核苷
45酸引物可以用作PCR引物。進(jìn)行典型的PCR需要應(yīng)用熱循環(huán)儀(如來自 Perkin-Elmer Cetus )和熱穩(wěn)定聚合酶(如Gene AmpTM牌的Taq聚合酶)。 待擴(kuò)增核酸模板包括但不限于任何物種的mRNA, cDNA或基因組DNA。 PCR擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域眾所周知的(見，例如美國專利號4,683,202, 4,683,195和4.889.818; Gyllenstein et al.， 1988, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 85， 7652-7656; Ochman et al.， 1988, Genetics 120， 621-623; Loh， et al.， 1989， Science 243， 217-220)。
5.4診斷應(yīng)用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明方法可用于探測、預(yù)后、診斷或監(jiān)測多種與異源或變異DNA 相關(guān)的感染、病況、疾病和功能紊亂，或監(jiān)測其治療情況。例如，如下 部分5.4.1所述，這些方法可以用于探測、預(yù)后、診斷或監(jiān)測多種感染和 疾病，如與病毒感染、細(xì)菌感染或原生動物、寄生蟲或其他已知病原體 感染有關(guān)的疾病。如下部分5.4.2所述，這些方法可以用于探測、預(yù)后、 診斷或監(jiān)測多種與變異DNA存在相關(guān)的感染、病況、疾病和功能紊亂，
如基因突變或單核苷酸多態(tài)性(SNP)。以診斷為目的的方法將在這里 給予詳盡闡述。
5,4,1探測異源DNA
上面描迷的本發(fā)明方法還可用于探測異源DNA,如在暴露于病原體 的患者中，探測源于病原體暴露而產(chǎn)生的病毒或細(xì)菌DNA?；颊呖赡艹?現(xiàn)也可能沒出現(xiàn)病原體感染癥狀，或與病原體存在相關(guān)的疾病或功能紊 亂。例如，在一個實施方案中，靶DNA樣本可以從患有或懷疑患有這種 疾病或感染的患者DNA中制備。設(shè)計并制備具有與異源靶DNA同源序 列的同源臂。然后應(yīng)用上面部分5.1所述任一方法，將樣本DNA導(dǎo)入表 達(dá)細(xì)菌重組酶并含有栽體DNA的大腸桿菌宿主細(xì)胞中。在另一個實施方 案中，銜接子寡核苷酸可以設(shè)計包括與栽體序列同源的第一個序列，以 及與異源乾DNA同源的第二個序列，其定向性細(xì)節(jié)如上面部分5.1所述。 這些銜接子寡核苷酸可以與樣本DNA和栽體DNA —起，共同轉(zhuǎn)染表達(dá) RecE/T或Reda/(3的大腸桿菌宿主細(xì)胞，也可以直接轉(zhuǎn)染已經(jīng)包括栽體 DNA和樣本DNA的細(xì)胞。然后如上面部分5.1所迷，將細(xì)胞在選擇培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，呈現(xiàn)選擇抗性的細(xì)胞可以用來分析適宜大小插入序列的存在。
46把DNA可以從患者或受試者的生物樣本中分離，例如但不限于全 血，血漿，血清，皮膚，唾液，尿液，淋巴液，活檢細(xì)胞，組織培養(yǎng)細(xì)
胞，培養(yǎng)基，也可以從非生物樣本中分離，如食物，水或其他材料。從 這些材料中制備DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見，如Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
例如，在一個實施方案中，需要探測或診斷一種病毒感染或疾病， 同源臂包括與已知病毒DNA的DNA序列同源的DNA序列。這些方法 可以用來探測、分離病毒DNA,其形式可以是病毒DNA鏈，也可以是 DNA或RNA病毒的DNA復(fù)制中間產(chǎn)物。
例如，在一個實施方案中，可以應(yīng)用同源臂直接確定DNA基因組或 DNA病毒的復(fù)制中間產(chǎn)物，所述同源臂序列被設(shè)計成與病毒序列同源， 這些DNA病毒包括但不限于乙型肝炎病毒，細(xì)小病毒如腺相關(guān)病毒和巨 細(xì)胞病毒，P叩ova病毒如乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒和SV40,腺病毒，皰 滲病毒如I型單純皰滲病毒(HSV-I) 、 II型單純皰滲病毒(HSV-II)和 EB病毒，以及痘病毒如痘癥(天花)和牛痘病毒。在另一個實施方案中， 可以應(yīng)用同源臂直接確定從DNA中間產(chǎn)物復(fù)制獲得的逆病毒RNA病毒 的復(fù)制中間產(chǎn)物，所述同源臂序列被設(shè)計成與病毒序列同源，這些RNA 病毒包括但不限于I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I) , II型人類免疫缺陷 病毒(HIV-II) , I型嗜人類T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-I) , II型嗜人類T 淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-II)。在另一個實施方案中，為了探測、分離從 RNA中間產(chǎn)物復(fù)制獲得的RNA病毒的基因組或復(fù)制中間產(chǎn)物，可以根 據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，分離RNA，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶將其轉(zhuǎn)錄成RNA 的cDNA拷貝。這些cDNA拷貝就可作為靶DNA來探測RNA病毒的存 在，所述RNA病毒如流感病毒，麻滲病毒，狂犬病病毒，Sendai病毒， 細(xì)小核糖核酸病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒，鼻病毒，呼腸病毒， 披膜病毒如風(fēng)滲病毒(德國麻滲)和Semliki森林病毒，蟲媒病毒，以及 甲型肝炎病毒。
在另一個優(yōu)選實施方案中，需要診斷或探測細(xì)菌感染，同源臂包括 與已知細(xì)菌DNA序列同源的DNA序列。例如，在一個實施方案中，同 源臂DNA序列可以與病原細(xì)菌的cDNA或基因組DNA同源，所述細(xì)菌 包括但不限于釀膿鏈球菌，肺炎鏈球菌，淋病奈瑟球菌，腦膜炎奈瑟球菌，白喉棒狀桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌，破傷 風(fēng)梭狀芽胞桿菌，流感嗜血桿菌，肺炎克雷白桿菌，臭鼻克雷白桿菌， 鼻硬結(jié)克雷白桿菌，金黃色葡萄球菌，霍亂弧菌，大腸桿菌，綠膿桿菌，
胚胎彎曲桿菌，空腸彎曲桿菌，嗜水氣單胞菌，cereus桿菌，遲鈍愛德 華菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結(jié)核耶爾森氏菌， 志賀痢疾桿菌，弗氏志賀菌，宋內(nèi)志賀菌，鼠傷寒沙門氏菌，梅毒螺旋 體，極細(xì)密螺旋體，品他病密螺旋體，奮森氏疏螺旋體，出血性黃疽鉤 端螺旋體，結(jié)核分支桿菌，鼠弓形體，卡氏肺囊蟲，土拉弗朗西斯菌， 流產(chǎn)布魯氏菌，豬布魯氏菌，馬爾他布魯氏菌，Mycoplasma spp.,惠蟲 熱立克次體，Chlamydia spp.，以及幽門螺旋桿菌。
在另一個實施方案中，同源臂DNA序列可以與病原性真菌的cDNA 或基因組DNA同源，所述真菌包括但不限于Coccidioidesimmitis，煙曲 霉，白色念珠菌，皮炎芽生菌，新型隱球菌，以及莢膜組織胞漿菌。
在另一個優(yōu)選實施方案中，需要診斷或探測原生動物感染，同源臂 可以包括與已知原生動物DNA序列同源的DNA序列。例如，這些同源 臂DNA序列可以與任何已知原生動物的cDNA或基因組DNA同源。特 別感興趣的病原性原生動物如Entomoeba histolytica, 口腔毛滴蟲，人毛 滴蟲，陰道毛滴蟲，岡比亞錐蟲，羅德西亞錐蟲，克氏錐蟲，熱帶利什 曼原蟲，巴西利什曼原蟲，肺炎肺嚢蟲，間日癡原蟲，惡性癡原蟲，以 及三日疾原蟲。
在另一個優(yōu)選實施方案中，需要診斷或探測寄生蟲感染，同源臂可 以包括與已知寄生蟲DNA序列同源的DNA序列。例如，這些同源臂DNA 序列可以與任何已知寄生蟲的cDNA或基因組DNA同源，這些寄生蟲包 括，例如蠕蟲，包括蟯蟲，毛首鞭蟲，蛔蟲，旋毛蟲，糞類圓線蟲，日 本血吸蟲，曼氏血吸蟲，埃及血吸蟲以及鉤蟲。
5.4,2在細(xì)胞DNA中診斷突變和多態(tài)性
本發(fā)明方法還可用于在患者樣本中分離、探測遺傳紊亂，并預(yù)后、 診斷或監(jiān)測與變異DNA相關(guān)的多種病況、疾病和功能紊亂，所述變異 DNA如基因突變或單核普酸多態(tài)性(SNP)，以及探測罹患某種疾病或 功能紊亂的遺傳傾向性。
例如，在一個實施方案中，靶DNA樣本可以從患有或懷疑患有某種
48遺傳性疾病或功能紊亂的患者樣本DNA中分離制備。在一個優(yōu)選實施方 案中，設(shè)計并制備含有同源臂的栽體，并導(dǎo)入表達(dá)細(xì)菌重組酶如RecE/T 和/或Redot/[3的大腸桿菌宿主細(xì)胞中，所述同源臂的序列與特定目標(biāo)基因 或目標(biāo)基因組區(qū)域同源。然后將樣本DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在另一個實施 方案中，設(shè)計的銜接子寡核苷酸包括與栽體序列同源的第一個序列，以 及與目標(biāo)靶基因DNA同源的第二個序列，其定向性細(xì)節(jié)如上面部分5.1 所述。在一個優(yōu)選實施方案中，這些銜接子寡核苷酸可以與樣本DNA — 起，共同轉(zhuǎn)染表達(dá)RecE/T和/或Redot/(3并含有栽體DNA的大腸桿菌宿主 細(xì)胞。此外，還可應(yīng)用上面部分5.1詳細(xì)描述的任何其他用于同源重組克 隆的方法。然后如上面部分5.1所述，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，分析抗 選擇細(xì)胞中適宜大小插入序列的存在。然后通過本領(lǐng)域眾所周知的限制 性分析或序列分析技術(shù)，分析DNA中目標(biāo)突變或DNA變異體的存在(見， ，H口 Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
在另 一個實施方案中，同源臂或銜接子寡核苷酸可以包括目標(biāo)基因 突變或DNA多態(tài)性序列。在該實施方案中，只有樣本DNA包括該突變 時，重組才會發(fā)生。該方法可用于診斷性篩檢大規(guī)模樣本中的特定突變 或DNA多態(tài)性，因為只有包括這一特定突變的細(xì)胞才會對選擇具有抗 性。
耙DNA可以從任何DNA樣本中獲得，如基因組DNA， cDNA或線 粒體DNA。例如，在一個實施方案中，粑DNA可以是人類染色體的一 個區(qū)域。在另一個實施方案中，靶DNA是混和形式，例如從眾多目標(biāo)受 試者中獲得的基因組DNA混和物，所述目標(biāo)受試者如罹患某一特定功能 紊亂的患者。這樣的靶DNA可以從生物樣本中分離，例如但不限于全血， 血漿，血清，皮膚，唾液，尿液，淋巴液，活檢細(xì)胞，組織培養(yǎng)細(xì)胞， 培養(yǎng)基，也可以從非生物樣本中分離，如食物，水或其他材料。從這些 材料中制備DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見，如Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。
可以應(yīng)用該方法檢測的遺傳性功能紊亂的非限制性示例包括與遺傳 性疾病相關(guān)的突變和SNPs，如與乳腺癌相關(guān)的Brca-l，與囊性纖維化、Tay-Sachs病、鐮狀細(xì)胞性貧血、血友病、動脈硬化、糖尿病、白血病、 前列腺癌及其他腫瘤、以及肥胖相關(guān)的突變。這些遺傳性疾病還包括退 行性、非退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病，帕金森氏病，肌萎縮性 脊髓側(cè)索硬化，Huntington's病，Wilson's病，脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)， Friedreich's共濟(jì)失調(diào)和其他共濟(jì)失調(diào)，(月元)病毒性疾病包括 Creutzfeldt-Jakob病，齒狀核紅核pallidoluysian萎縮，海綿腦病，肌強(qiáng)直 性萎縮，抑郁，精神分裂以及癲癇。遺傳性疾病還可能包括代謝性疾病， 例如，^氐血糖或苯丙酮尿癥。還包括心血管疾病和病況，這些疾病的非 限制性示例包括動脈硬化，心肌梗塞和高血壓。本發(fā)明還可用來探測、 診斷萊姆病，結(jié)核和性傳播疾病。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明同源重組克隆方法可用于檢測一種疾 病或功能紊亂的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。例如，靶DNA可以從罹患某種功能紊亂的 患者樣本中分離，所迷功能紊亂的遺傳學(xué)基礎(chǔ)尚不知曉。在另一個實施
方案中，該克隆方法可用于在一群已知或懷疑患有某種功能紊亂的患者 中，分離已知或懷疑與該疾病或功能紊亂相關(guān)的染色體區(qū)域。然后，應(yīng) 用本領(lǐng)域眾所周知的變異DNA繪圖技術(shù)，如限制性片段長度多態(tài)性或其 他SNP探測技術(shù)，可以進(jìn)一步分離、分析獲得的DNA，探測基因突變或 多態(tài)性的存在(見如，Nikiforovetal.， 1997年10月21日授予的美國專 利號5，679,524; Mcintosh et al.， 1998年12月30日備案的PCT publication WO 98/59066; Goeletetal.， 1995年5月U日備案的PCT publication WO 95/12607; Wang et al., 1998， Science 280: 1077-1082; Tyagi et al., 1998， Nature Biotechnol. 16: 49-53; Chen et al., 1998， Genome Res. 8: 549-556; Pastinen et al.， 1996, Clin. Chem. 42: 1391-1397; Chen et al.， 1997， Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10756-10761; Shuber et al.， 1997， Hum. Mol. Gen. 6: 337-347; Liu et al., 1997， Genome Res. 7: 389-398; Livak et al., 1995, Nature Genet 9: 341-342; Day and Humphries, 1994, Amial. Biochem. 222: 389-395 )。
目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)相關(guān)性靶功能紊亂的非限制性示例包括譯喘，關(guān)節(jié)炎， 銀屑病，excema，過敏，耐藥，藥物毒性以及腫瘤，例如但不限于人類 肉瘤和癌癥，如纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤， 脊索瘤，血管肉瘤，內(nèi)皮肉瘤，淋巴血管肉瘤，淋巴血管內(nèi)皮肉瘤，滑 膜瘤，間皮瘤，Ewing，s腫瘤，平滑肌肉瘤，對黃紋肌肉瘤，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀上皮細(xì)胞癌，基底細(xì)胞癌，腺癌， 汗腺癌，脂肪腺癌，乳頭癌，乳頭腺癌，嚢腺癌，髓樣癌，支氣管癌，
腎癌，肝細(xì)胞瘤，膽管癌，絨毛膜癌，精原細(xì)胞瘤，胚胎性癌，Wilm's 腫瘤，宮頸癌，睪丸腫瘤，肺癌，小細(xì)胞肺癌，膀胱癌，表皮癌，神經(jīng) 膠質(zhì)瘤，星型細(xì)胞瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，顱咽管瘤，室鼓膜瘤，松果體 瘤，成血管細(xì)胞瘤，聽神經(jīng)瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，腦膜瘤，黑色素 瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；白血病，如急性淋巴細(xì)胞白血病 和急性髓細(xì)胞白血病(成髓細(xì)胞白血病，前髄細(xì)胞白血病，髓單核細(xì)胞 白血病，單核細(xì)胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(慢性髄細(xì)胞(粒 細(xì)胞)白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)，多發(fā)性骨髄瘤，Waldenstrom's 巨球蛋白血癥，以及重鏈病。該同源重組克隆方法還可進(jìn)一步用于診斷、 探測異常差異，以及診斷,限患自身免疫性疾病的患者，所述自身免疫性 疾病包括但不限于胰島素依賴性糖尿病，多發(fā)性硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡， Sjogren's綜合征，硬皮病，多肌炎，慢性活動性肝炎，混和性結(jié)締組織 病，原發(fā)性膽汁性肝硬化，有害的貧血，自身免疫性甲狀腺炎，特發(fā)性 Addison's病，白癜風(fēng)，麩質(zhì)敏感性腸病，Graves病，重癥肌無力，自身 免疫性中性粒細(xì)胞減少癥，特發(fā)性血小板減少性紫癜，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎， 肝硬化，尋常性天皰瘡，自身免疫性不育，Goodpasture's病，大皰性類 天皰疳，盤狀狼疫，潰瘍性結(jié)腸炎，以及dense deposit病。
同源重組克隆方法還可用于分離、診斷、探測與疾病無關(guān)的DNA突 變、改變、變異和SNPs。非限制性示例包括在非編碼基因組序列中出現(xiàn) 的DNA突變、改變、變異和SNPs,或者與人類不同血型相關(guān)的DNA突 變、改變、變異和SNPs。
在本發(fā)明一個優(yōu)選方面中，本發(fā)明方法可以具體用于分離、探測、 診斷、預(yù)后或監(jiān)測人類DNA突變、改變、變異和SNPs。但是，應(yīng)該理 解，這里描迷的方法還可用于分離、探測、診斷、預(yù)后或監(jiān)測其他哺乳 動物疾病，例如，農(nóng)用動物包括牛、馬、羊、山羊和豬，居家寵物包括 貓和狗，以及植物包括農(nóng)作物和園藝植物。
5,5試刑盒
本發(fā)明還提供了可以使本文描述的同源重組克隆和亞克隆方法更易 于應(yīng)用的試劑盒。在一個實施方案中，提供的試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽 體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在載體DNA鏈上，從5，到3',以 下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個同源臂；這樣， 第 一條栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈 上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈上的笫二個同源臂的核苷 酸序列與第 一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源；以及b)含有 細(xì)菌重組酶的細(xì)胞。該細(xì)胞可以內(nèi)源性表達(dá)該重組酶，也可以重組表達(dá) 該重組酶。
在另一個實施方案中，提供了用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的 試劑盒，該試劑盒包括一個或多個容器a)用于定向克隆或亞克隆目標(biāo) 靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂， 在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制 起點(diǎn)，以及第二個同源臂，這樣，第一條載體DNA鏈上的第一個同源臂 的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的第二個 末端核苷酸序列同源；b)第 一個雙鏈寡核苷酸，含有第 一個寡核苷酸DNA 鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第一個序列和第二個序列，所述 第 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源， 第二個核普酸序列與靶DNA鏈的第一個末端核苷酸序列同源；c)第二個 寡核苷酸，含有第二個寡核普酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有 第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第三個核苷酸序列與栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核普酸序列同源，第四個核苷酸序列與靶 DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及d)含有細(xì)菌重組酶蛋白，如 RecE/T和/或Redoc/p蛋白的細(xì)胞。在一個特定實施方案中，細(xì)胞是大腸 桿菌細(xì)胞。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明提供的試劑盒包括一個或多個容器 a)用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包 括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在載體DNA鏈上，從5，到3',以下述 順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個同源臂，這樣，笫一 條栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶DNA鏈上的 第一個末端序列同源，第一條栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序 列與第 一條靶DNA鏈上的第二個末端核苷酸序列同源；b)第一個雙鏈寡
52酸DNA鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含 有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列，所述第一個核苷酸序列與 載體DNA鏈上的第 一 個同源臂的核普酸序列同源，第二個核苷酸序列與 粑DNA鏈的第一個末端核普酸序列同源；以及c)第二個寡核苷酸，含有 第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序 列和第四個核苷酸序列，所述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二 個同源臂的核苷酸序列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末 端核苷酸序列同源。
在多個特定實施方案中，試劑盒的靶DNA可以是細(xì)菌、病毒、寄生 蟲、原生動物或病原DNA。在其他特定實施方案中，試劑盒耙DNA可 以包括已知或懷疑與某一功能紊亂或疾病相關(guān)的基因突變或多態(tài)性。在 另一個特定實施方案中，銜接子寡核苷酸序列或栽體同源臂序列與基于 BAC, PAC，入，質(zhì)?；験AC的克隆栽體同源。
6.實施例克隆和亞克隆RecE/T和Reda/B
在本部分給出的實施例描述了應(yīng)用本發(fā)明同源重組方法，成功克隆、
亞克隆的多個實驗。還顯示了亞克隆方法的不同手段。特別需要指出的 是， 一個實施例成功克隆了比前述任何插入片段都大的片段一一從大約 150 kb的BAC栽體中定向亞克隆了 25 kb的DNA片段。
6.1,方法和材料
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增線性DNA片段。從pACYC177擴(kuò)增1972 bp的pl5A起點(diǎn)和卡那霉素耐藥基因(來自Tn903 ) 。 pl5A起點(diǎn)允許該 質(zhì)?；蛑亟M體可以在細(xì)胞中與攜帶Co氾l兼容組起點(diǎn)的質(zhì)粒共同存在。 從pACYC184擴(kuò)增1934 bp的氯霉素(來自Tn9 )耐藥基因和pl5A起點(diǎn)。
用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸包括，在其3'端，作為pACYC質(zhì)粒引物 的18-30核苷酸序列，以及5，端，與靶DNA側(cè)翼區(qū)同源的50 - 60個核 苷酸延伸序列。對于較長的寡核苷酸，應(yīng)用的PCR反應(yīng)退火溫度是62 'C。通過應(yīng)用QIAGEN PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，并 用dH20洗脫。通過應(yīng)用DpnI消化PCR產(chǎn)物，去除才莫板DNA。消化后， 應(yīng)用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，然后再次懸浮于dH20中，濃度為0.5ug/ul。
53通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備電轉(zhuǎn)化功能細(xì)胞。簡而言之，過夜培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)
用含有適宜抗生素的LB培養(yǎng)基稀釋100倍。生長到最佳密度，0D6W= 0.25 -0.4的大腸桿菌細(xì)胞在冰上冷凍15分鐘。然后在-5。C以7，000rpm離心 細(xì)菌細(xì)胞10分鐘。用10%的水凍甘油再懸沉淀的細(xì)菌細(xì)胞，然后在-5 。C以7,000rpm離心IO分鐘，以產(chǎn)生沉淀。以冰凍10%甘油清洗、再離 心3次后，以等細(xì)胞體積的水凍10%甘油懸浮細(xì)胞沉淀。將功能細(xì)胞以 50ul等分存于eppendorf管，放入液氮冷凍，存于-70'C。
應(yīng)用質(zhì)粒pBAD-ET丫或pBAD-oc^的實馬全包括應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法將這些 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中，然后在添加了 0.2%葡萄糖、50ug/ml氨千 青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，直至生長到飽和，然后應(yīng)用添加了 50ug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物IOO倍，并繼續(xù)生長到OD600 為0.15。然后添加L-阿拉伯糖至終濃度為0.1%。在細(xì)胞生長到OD6oo為 0.25-0.4后,在冰上冷凍15分鐘。
^脊化
將lul的DNA溶液(包括大約20.5ug的共轉(zhuǎn)化DNA，或者大約^:0.3ug 的載體DNA，為細(xì)胞提供錨定靶，或者大約20.5ug的DNA，含有細(xì)胞錨 定栽體的靶基因)與功能細(xì)胞混和。將細(xì)胞、DNA混合物轉(zhuǎn)移到水凍小 杯中。應(yīng)用Bio-Rad基因脈沖儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，設(shè)置為25uFD， 2.3 kV,脈 沖對照設(shè)置為200 ohms。電轉(zhuǎn)化后，加入LB培養(yǎng)基(1 ml)。細(xì)胞在 37。C搖動孵育1 - 1.5小時，然后接種到含有與載體可選擇標(biāo)記基因相應(yīng) 的抗生素平板上。
6.2結(jié)果
表1總結(jié)了 6個實驗的結(jié)果，在這6個實驗中，應(yīng)用不同來源的 RecE/T或Reda/(3表達(dá)亞克隆了不同目標(biāo)靶DNA區(qū)域。笫一列以"ET" 表達(dá)開頭，是指RecE/T或Redoc/(3來源，如表所示，其來源可以是大腸 桿菌宿主JC8679或JC9604的內(nèi)源性RecE/T,也可以是源于質(zhì)粒 pBADa(3丫的pBAD-recE/T。第二列指示所用大腸桿菌宿主。第三列指示 靶基因。在第一個實驗中，大腸桿菌染色體上的recE/T基因在大腸桿菌菌林 JC8679中亞克隆，該菌林中RecE/T的表達(dá)是固定的。這可以通過圖2 概括的策略實現(xiàn)。設(shè)計、合成的寡核苷酸具有以下序列 5 ， -TTCCTCTGTATTAACCGGGGAATACAGTGTAATCGATAATTCAGA GGAATAGCTCGAGTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3，(序列1) 和
5 ， -CAGCAATGTCATCGAGCTG AG ACTTACTG AT ACCGGG ACCCGCGT GGTAATTCTCGAGTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3 ，(序列2 ) 來擴(kuò)增pACYC177上的pl5A復(fù)制起點(diǎn)和Tn903卡那霉素耐藥基因。該 實驗結(jié)果概括于表1的第一行。表1.
ET表達(dá)大腸桿菌宿主靶基因集落總數(shù)正確％ ( 18)
內(nèi)源性JC8679大腸桿菌染色體54089
recE/T上的recE/T
內(nèi)源性JC8679大腸桿菌染色體76094
recE/T上的lacZ
內(nèi)源性JC9604大腸桿菌染色體2卯100
recE/T上的lacZ
pBAD-recJC5519高拷貝質(zhì)粒上的〉3,000100
E/T慶大霉素
pBAD-apy訓(xùn)Ol大腸桿菌染色體 上的lacZ37094
pBAD-a(3丫HS996BAC中mAF4的 內(nèi)含子316083
在第二個實驗中，大腸桿菌染色體上的lacZ基因在大腸桿菌菌林JC8679 中亞克隆，該菌林中RecE/T的表達(dá)是固定的。這可以通過圖2概括的策 略實現(xiàn)。載體通過PCR技術(shù)進(jìn)行制備，PCR中所用寡核苷酸具有如下序 列
5 ， -TC A AC ATT A AATGTGAGCGAGT A AC AACCCGTCGG ATTCTCCGTG GGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAG T-3，(序歹'j3)
和
555 ， -TCAGGGGAA AACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGG ATTG A TGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3'(序歹") 來擴(kuò)增pACYC177上的pl5A復(fù)制起點(diǎn)和Tn903卡那霉素耐藥基因。該 實驗結(jié)果概括于表1的第二行。
在第三個實驗中，大腸桿菌染色體上的lacZ基因在大腸桿菌菌林 JC9604中亞克隆，該菌林中RecE/T的表達(dá)是固定的。這可以通過圖2 概括的策略實現(xiàn)。栽體通過PCR技術(shù)進(jìn)行制備，PCR中所用寡核苷酸具 有如下序列
5 ， -TC A AC ATTAAATGTGAGCGAGTAAC AACCCGTCGG ATTCTCCGTG GGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT G-3，(序列5) 和
5 ， -TC AGGGG AAAACCTT ATTTATC AGCCGGAAAACCTACCGGATTG A TGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3'(序歹')6 ) 來擴(kuò)增pACYC177上的pl5A復(fù)制起點(diǎn)和Tn903卡那霉素耐藥基因。該 實驗結(jié)果概括于表1的第三行。
在第四個實驗中，位于高拷貝質(zhì)粒pFastBACl (Gibco)上的慶大霉 素基因通過圖3概括的策略，在大腸桿菌菌林JC5519中亞克隆。在 pBAD-recE/T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JC5519后，通過該質(zhì)粒表達(dá)RecE/T，并在制備 功能細(xì)胞前，應(yīng)用阿拉伯糖誘導(dǎo)。栽體通過PCR技術(shù)進(jìn)行制備，PCR中 所用寡核苷酸具有如下序列
5 ，曙TGC ACTTTG ATATCG ACCC A AGTACCGCC ACCTAAC AATTCGTTC AAGCCGAGGATCCTTAATAAGATCATCTTCTGAGATCGTTTTGG-3， (序列7)
和
5' -TGC ATT AC AGTTT ACGAACCG AAC AGGCTTATGTC A ACTGGGTTC GTGCCTTCAGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3， (序列8)
來擴(kuò)增pACYC177上的pl5A復(fù)制起點(diǎn)和Tn903卡那霉素耐藥基因，將 PCR產(chǎn)物與BamHI消化的pFastBACl混和，共轉(zhuǎn)化，并接種于含有慶大
霉素和卡那霉素的平板上。
在第五個實驗中，位于大腸桿菌染色體上的lacZ基因通過圖2概括的策略，在大腸桿菌菌株HBIOI中亞克隆。在pBAD-recE/T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 HB101后，通過該質(zhì)粒表達(dá)RecE/T，并在制備功能細(xì)胞前，應(yīng)用阿拉伯 糖誘導(dǎo)。栽體通過PCR技術(shù)進(jìn)行制備，PCR中所用寡核苷酸具有如下序 列
5 ，畫TCAAC ATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCTTATTCTCCGTG GGAACAAACGGGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT G-3，(序列9) 和
5，-TCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGA TGGTAGGGATCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCG-3，(序歹'j 10) 來擴(kuò)增pACYC177上的pl5A復(fù)制起點(diǎn)和Tn903卡那霉素耐藥基因 該 實驗結(jié)果概括于表1的第五行。
在第六個實驗中，攜帶鼠AF4基因的大約150kbBAC克隆的25kb 區(qū)域通過圖3概括的策略，在大腸桿菌菌抹HS996中亞克隆。在 pBAD-recE/T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HS996后，通過該質(zhì)粒表達(dá)RecE/T,并在制備功 能細(xì)胞前，應(yīng)用阿拉伯糖誘導(dǎo)。栽體通過PCR技術(shù)進(jìn)行制備，PCR中所 用寡核苷酸具有如下序列
5'-TGTAGCTGAGCCCAGGGGCAAGGCTGCTTTGTACCAGCCTGCTGT CTGCGGGGGCATCACCTGGAATTCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGA TCGTTTTGG-3，(序列U )
和
5 ， -TGGGTGTC AACCTC AGGCTTTCTC ACACGC AAT AC AGGTAGGGAC TTGCACCCCTACACACCGAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCA TCAAATG-3，(序歹ij 12)
來擴(kuò)增pACYC177上的pl5A復(fù)制起點(diǎn)和Tn903卡那霉素耐藥基因。PCR 產(chǎn)物與0.5ug純化BACDNA混和，然后共轉(zhuǎn)化，該實驗結(jié)果概括于表1 的第六行。圖6顯示的是溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠，顯示了應(yīng)用EcoRI 消化的DNA,該DNA分離自9個來自mAF4 BAC實驗的獨(dú)立集落(泳 道l-9)，對照是應(yīng)用EcoRI消化的起始栽體(泳道IO)。
在第七個實驗中，應(yīng)用圖7概括的策略，克隆了含有來自酵母菌林 MGD 353-13D的氨卡青霉素耐藥基因的基因組DNA區(qū)域。如圖A所示， 含有pl5A復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段，其側(cè)翼是98或102bp的同源臂，所述同源臂指向酵母菌株MGD 353-13D中的氨節(jié)青霉素耐藥基因側(cè)翼區(qū) 域的98或102bps。應(yīng)用大腸桿菌菌林JC5519, Redot/(3的表達(dá)由質(zhì)粒 pBADot(3Y-TET提供，然后，在制備功能細(xì)胞前，應(yīng)用阿拉伯糖誘導(dǎo)。
pBADa(3丫-TET是pBADaPY的衍生物，其中，氨千青霉素耐藥基因被四 環(huán)素耐藥基因所取代?？寺≡泽w通過PCR技術(shù)進(jìn)行制備，PCR中所用寡 核苷酸具有如下序列
5' -TCTTTTACTTTC ACC AGCGTTTCTGGGTG AGC AAAAACAGGAAGG CAAAATGCCGCAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAAT ACTCATAACACCCCTTGTATTAC丁GTTTATGTAAGCAGACAG-3，(序 列13)
和
5'-TCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATG GATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTA AGCATTGGTAATTAA丁AAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGG-3' (序列14)
來擴(kuò)增pACYC177上的pl5A復(fù)制起點(diǎn)。PCR產(chǎn)物與4ug Ncol消化的 MGD 353-13D酵母基因組DNA混和，然后共轉(zhuǎn)化包括Reda/(3表達(dá)的 JC5519， Reda/(3表達(dá)來自pBADa(3丫，在37。C、 L-肉湯中培養(yǎng)90分鐘復(fù) 蘇期后，接種于含有氨千青霉素的平板。通過氨千青霉素耐藥選擇鑒定 克隆。共有18個克隆進(jìn)行了 DNA分析。圖7B顯示了 IO個正確克隆的 溴化乙啶染色凝膠。
這里描述的實施例說明，RecE/T和Reda/(3同源重組克隆方法可以 將多種環(huán)狀靶基因成功克隆到大腸桿菌染色體上，所述環(huán)狀靶基因從高 拷貝質(zhì)粒到低拷貝較大靶基因(BAC)。
7.栽體重復(fù)序列和磷酸化對克隆效率的影響
本部分給予的實施例描述了應(yīng)用RecE/T或Reda/(3介導(dǎo)的同源重組 ("ET克隆")技術(shù)進(jìn)行高效克隆和亞克隆的最佳條件。特別是如圖8 所示，去除載體中的重復(fù)序列可以改善克隆效率。相反，在線性栽體末 端出現(xiàn)的5'磷酸化對ET克隆的效率影響卻很小。
首先，在下述實驗中檢測了重復(fù)序列對克隆效率的影響。如圖8所 示，作為克隆栽體的線性栽體包括pl5A復(fù)制起點(diǎn)，氯霉素耐藥基因(Cm，) ， PCR擴(kuò)增線性栽體所需的核苷酸序列(圖8中以斜體代表)， 大腸桿菌lacZ基因的側(cè)翼同源臂，以及在線性栽體兩端存在的不同長度 的末端重復(fù)序列(以黑體代表)。將線性栽體轉(zhuǎn)化到表達(dá)pBADReda/p
(Zhang et al.， 1998, Nat. Genet. 20: 123-128 )的JC8679(內(nèi)源性ET; Clark, 1974, Genetics, 78， 259-271 )或JC5519( WUletts and Clark, 1969, J. Bacteril. 100: 231-239)中。圖8表中顯示了應(yīng)用指示寡核苷酸PCR擴(kuò)增線性栽體 后，在ET亞克隆后，LB平板(含有50ug/ml的氯霉素)上含有的集落 數(shù)量。其中18個集落進(jìn)行了限制性消化。用正確重組體數(shù)量除以總集落 數(shù)量得出重組效率。因此，末端重復(fù)〉6個核苷酸可以顯著降低￡丁亞克 隆效率。所有背景集落都含有再連接的線性栽體。
還檢測了磷酸化對重組效率的影響，結(jié)果如圖8所示。應(yīng)用T4DNA 激酶和Y-ATP使線性栽體末端磷酸化。如圖8最后一列所示，沒有觀察 到對ET亞克隆或栽體再連接的影響。
該實施例顯示，在線性栽體末端或在同源臂與栽體必需元件之間存 在的重復(fù)序列，導(dǎo)致的重組可以顯著降低ET克隆和亞克隆效率，所示必 需元件即復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，同源 克隆栽體序列在編碼復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記序列的外部，不包括任何S5 個堿基的直接重復(fù)序列。
8, RecE/T和Reda/B克隆和亞克隆的其他實施例
本部分給出的實施例描述了其他實驗，這些實驗顯示應(yīng)用RecE/T或 Reda/(3介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，成功進(jìn)行克隆和亞克隆的方法。
義應(yīng)^f肅涼J:
如上所述，"ET功能宿主"是指能夠表達(dá)RecE/T和/或Reda/|3的 任何大腸桿菌細(xì)胞。這可以通過多種途經(jīng)實現(xiàn)，如(i)內(nèi)源性表達(dá)RecE/T 或Reda/p的菌林，或者(ii)通過外源導(dǎo)入質(zhì)粒表達(dá)RecE/T或Reda/f3的
和YZ2二00、1)的質(zhì)粒表i栽體的構(gòu)建。ET功能宿主'的其他變異體和示例 見Murphy et al., 2000， Gene 246: 321-330; Yu et al.， 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 5978-5983; and Datsenko and Wanner, 2000， Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6640-6645。在第一類中，應(yīng)用的兩個菌林?jǐn)y帶sbcA突變，因此在RecAX JC 9604; Gillen et al,， 1981， J. Bacteriology 145: 521-532 )或RecA十(JC8679; Gillen etal.， supra)背景下內(nèi)源性表達(dá)RecE/RecT。應(yīng)用這些菌抹的優(yōu)勢在于， 它們可以直接應(yīng)用，不必為使該菌林具有ET克隆功能而首先導(dǎo)入一個質(zhì) 粒。缺點(diǎn)在于RecE和RecT在克隆全過程中始終固定表達(dá)，特別是在 RecA+背景下，增加了分子內(nèi)不欲重組的風(fēng)險。第二個缺點(diǎn)在于，這些 JC菌林未經(jīng)修飾用于克隆和增殖宿主。它們包括完整的活性限制/修飾系 統(tǒng)，因此大大降低了大分子如BACs導(dǎo)入這些宿主的效率。
選擇內(nèi)源性表達(dá)RecE/T或Reda/p的宿主菌林，還是導(dǎo)入質(zhì)粒表達(dá) RecE/T或Reda/(3的宿主菌林，有賴于環(huán)狀靶序列的性質(zhì)。無論選擇哪 種策略，制備品質(zhì)優(yōu)良的功能細(xì)胞都是至關(guān)重要的。如果宿主菌林缺乏 內(nèi)源性ET克隆潛能，該菌林必須首先轉(zhuǎn)化pBAD-a(3丫或pBAD-ETY。獲 得的菌林必須應(yīng)用終濃度為0.1 %的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)生長，然后準(zhǔn)備電轉(zhuǎn) 化。依椐經(jīng)驗，細(xì)胞的最佳收獲點(diǎn)是OD咖大約為0.35，特別是當(dāng)靶序 列是大DNA底物時。如果細(xì)胞的OD6oo大于0.5,就不應(yīng)該應(yīng)用了。最 佳導(dǎo)入時間大約為1小時。必須應(yīng)用電轉(zhuǎn)化，因為沒有發(fā)現(xiàn)其他DNA導(dǎo) 入方法能發(fā)揮作用。制備品質(zhì)良好的電轉(zhuǎn)化細(xì)胞對于獲得ET重組體是至 關(guān)重要的。在制備電轉(zhuǎn)化功能細(xì)胞期間，所有步驟均需在水上或預(yù)冷的 小桶、轉(zhuǎn)子上進(jìn)行。將電轉(zhuǎn)化功能細(xì)胞高度濃縮對于OD6o。-0.35時收 獲的250ml培養(yǎng)物，我們常規(guī)制備成不超過10等分的功能細(xì)胞，每等分 50ul。獲得的轉(zhuǎn)化效率大大依賴于所用宿主菌林，但典型的變異大約為 109cfu/ug。關(guān)于如何制備電轉(zhuǎn)化功能細(xì)胞和如何進(jìn)行電轉(zhuǎn)化的詳細(xì)實驗 流程可以從以下網(wǎng)址獲得
http:〃www. embl-heiddberg.de/ExternalInfo/stewart/index.html。
如圖9A所示，構(gòu)建質(zhì)粒pR6K/BAD-a(3"Ktet),使BAC宿主菌抹HS996 (Invitrogen)具有進(jìn)行ET重組的能力。該質(zhì)?；趐BAD24骨架 (Guzman et al.， 1995， J Bacteriol 177: 4121-4130 ) 。 Redot (或RecE)由 L-阿拉伯糖可誘導(dǎo)pBAD啟動子誘導(dǎo)表達(dá)，Red(3(或RecT)由固定EM-7 啟動子i秀導(dǎo)表達(dá)。RecT相對于RecE，或Red(3相對于Reda的過量表達(dá)， 可以增加ET克隆的效率(以選擇平板上的集落數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn))。最后，該 質(zhì)粒固定表達(dá)Red丫蛋白，在這種情況下，該蛋白的表達(dá)由固定Tn5啟動 子誘導(dǎo)，所迷啟動子對于抑制最常應(yīng)用的宿主菌林中存在的RecBCD酶活性是必須的(Murphy, 1991， J. Bacteriology 173: 5808- 5821 )。如果不 使其失活，RecBAD會完全抑制ET克隆，其原因可能是該酶的核酸外切 酶活性使線性DNA在有機(jī)會重組前就被降解。因此，pBAD-a(3y(tet)組 成了一個移動系統(tǒng)，可以將可調(diào)節(jié)ET克隆特性通過轉(zhuǎn)化傳遞到接受宿主 菌林中。假設(shè)RecE或Reda的表達(dá)具有誘導(dǎo)性，為使重組發(fā)生，RecE/T 和Reda/p系統(tǒng)中兩個組分同時表達(dá)的絕對需求也得到滿足，重組窗的限 制就是阿拉伯糖誘導(dǎo)時間和最不穩(wěn)定組分的半衰期。將這些因素綜合考 慮，并結(jié)合最常用的宿主是recA，當(dāng)然宿主也可以是recBC或recBC — 的擬表型(取決于Redy的表達(dá))，這意味著不欲分子內(nèi)重組發(fā)生的風(fēng)險 顯著降低。pBAD-a(3丫(tet)的另 一個有用特征是當(dāng)這些質(zhì)粒在培養(yǎng)期間沒 有被選擇時，它們傾向于迅速消失。這可能是由于Redy的固定表達(dá)，也 會依賴宿主細(xì)胞的其他因素發(fā)生變化，例如RecBCD的存在。
pR6K/BAD-ot|3Y的復(fù)制需要R6K起點(diǎn)和Pir-l 16蛋白(Metcalf et al., 1994， Gene 138， 1-7 ) 。 pR6K/BAD/aP丫攜帶來自pJP5603的R6K起點(diǎn) (Penfold and Pemberton， 1992， Gene 118: 145-6)，在細(xì)菌中控制R6K ori 質(zhì)粒復(fù)制的pir-U6復(fù)制子基因，以及來自pBR322的四環(huán)素耐藥基因tet。 Pir-116是一個拷貝突變體，允許含有R6K起點(diǎn)的質(zhì)粒在大腸桿菌菌林中 以超過每細(xì)胞200拷貝的量存在。pir-116基因來從大腸桿菌菌林 BW3647,通過PCR擴(kuò)增，并在lacZ啟動子后克隆。
為了制備pR6K/BAD/aP丫，將R6K起點(diǎn)、pir-l 16和tet通過ET重組 導(dǎo)入pBAD-a(3y ( Muyrers et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27: 1555-1557 )，置換原來存在于pBAD-aP丫上的Co舊l起點(diǎn)和氨千青霉素 耐藥基因。同樣制備pR6K/BAD/ETV和pR6K/BAD/recT?；赗6K的任 何質(zhì)粒相較于基于Co舊l的親本質(zhì)粒，拷貝數(shù)大約高2倍。在標(biāo)準(zhǔn)BAC 亞克隆練習(xí)中并行比較pR6K/BAD/a(3丫和pBAD-a(3丫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于R6K 的質(zhì)粒工作效率更高(見圖9B)。在這些pR6K質(zhì)粒中存在的R6K復(fù)制 系統(tǒng)不含任何與其他復(fù)制起點(diǎn)顯著同源的序列，所述其他復(fù)制起點(diǎn)包括 pl5a和Co舊l。而且，基于R6K的質(zhì)粒與其他任何復(fù)制起點(diǎn)兼容。因此， 如ColEl和pl5A的復(fù)制起點(diǎn)可以包括在用于ET亞克隆的線性栽體中。
圖10顯示了亞克隆一個19kb的片段，該片段包括BAC上AF-4基
61因的外顯子2和3。首先，將pR6K/BAD-a(3y轉(zhuǎn)化到攜帶BAC的菌抹中。 隨后，在含有15ug/ml四環(huán)素和12.5ug/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)這 些轉(zhuǎn)化菌抹。應(yīng)用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)生長細(xì)胞1小時，然后制備電轉(zhuǎn)化功 能細(xì)胞。這些細(xì)胞通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入線性栽體，所示栽體包括pl5A復(fù)制起 點(diǎn)和氨千青霉素耐藥基因，(3-內(nèi)酰胺酶(bla)，其側(cè)翼為兩個長度為50 個核苷酸的同源臂，可以指導(dǎo)AF-4BAC上的靶DNA同源重組。在含有 50ug/ml氨千青霉素的LB平板上生長后，收獲重組體。
如圖10B所示，選擇5個獨(dú)立集落進(jìn)行分析。從5個獨(dú)立集落中制 備DNA，然后應(yīng)用HindII消化，并在溴化乙啶染色凝膠上進(jìn)行分析。 HindIII消化的正確集落和線性栽體以及1 kb DNA階梯(Gibco BRL)作 為標(biāo)記。正確亞克隆通過DNA序列分析進(jìn)行確認(rèn)。
如圖11實驗所示，基因組DNA還可作為革巴DNA的直接來源。在該 實驗中，線性栽體包括ColEl起點(diǎn)和卡那霉素耐藥基因(kan)，其側(cè)翼 為同源臂，可以指導(dǎo)發(fā)生于大腸桿菌染色體上lacI/lacZ位點(diǎn)的重組(見 圖11A)。基因組DNA分離自大腸桿菌，并經(jīng)XhoI消化，預(yù)先線性化。 混和線性載體和預(yù)線性化的基因組DNA，共同電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入內(nèi)源性表達(dá) RecE/RecT的YZ2000。通過在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板上選擇， 獲得含有l(wèi)acl和lacZ基因、ColEl起點(diǎn)和kan的所需亞克隆。如圖11B 所示，16個獨(dú)立集落的限制性分析發(fā)現(xiàn)，含有正確產(chǎn)物(泳道1 - 16)。 泳道17為線性栽體，泳道M是作為標(biāo)記的1 kbDNA階梯(Gibco BRL )。
另一個成功ET重組克隆示例如圖12所示。在該實驗中，通過應(yīng)用 同源臂克隆栽體，在鼠ES細(xì)胞基因組DNA中直接克隆片段。如概括了 克隆策略的圖12A所示，來自鼠ES細(xì)胞基因組DNA的新霉素耐藥基因 (neo)作為靶DNA。線性栽體包括ColEl復(fù)制起點(diǎn)和氯霉素耐藥基因 Cm，，其側(cè)翼為兩個臂，與Tn5-neo基因同源。所需鼠ES細(xì)胞系可以通 過轉(zhuǎn)染包括Tn5-neo的片段制備，所迷片段在PGK啟動子控制下，并加 polyA尾。從G418耐藥集落中分離基因組DNA，并用針剪切，通過苯酚 /氯仿抽提，創(chuàng)建大約20-40 kb的線性片段。
通過共同電轉(zhuǎn)化線性栽體和剪切的基因組DNA，將其導(dǎo)入JC8679 的衍生物YZ2000 (Clark， supra)，進(jìn)行ET克隆，在YZ2000中，降解
62異源甲基化DNA的限制性系統(tǒng)由于去除了 mcrA, mcrBC， hsdRMS和mrr 基因而部分削弱。由于過量表達(dá)RecT可以顯著增加整體ET重組效率， 因此應(yīng)用pR6K/BAD/recT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YZ2000。攜帶pR6K/BAD/recT的 YZ2000，在收獲前1小時應(yīng)用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，然后應(yīng)用0.5ug線性載 體和5.0ug剪切鼠ES細(xì)胞基因組DNA共同電轉(zhuǎn)化。在含有50ug/ml氯 霉素的LB平板上平均收獲25 - 35個集落。在含有50ug/ml卡那霉素的 平板上再次增殖這些集落，通過Tn5-neo表達(dá)法測試的30個集落中發(fā)現(xiàn) 有6個生長。在圖12部分B中，對卡那霉素耐藥集落的限制性分析顯示， 所有6個測試集落都是正確的(泳道2-7)。假陽性限制性圖i普如泳道 1所示，該集落在有氯霉素的情況下可以生長，但在卡那霉素存在的情況 下無法生長。所有這些假陽性集落都包括再連接的栽體。
圖13顯示了 一個聯(lián)合ET亞克隆和克隆的實驗。線性栽體包括ColEl 復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素耐藥基因Km'。線性載體的每個末端都包括BstZ171 位點(diǎn)和2個同源臂。在線性栽體末端存在的同源臂(在圖13中以小方框 表示)與人噬菌體靶DNA同源。第二套同源臂(在圖13中以大方框表示) 與大腸桿菌染色體上的lacI-lacZ基因同源。
在第一步亞克隆中，線性載體與線性化人噬菌體靶DNA共同電轉(zhuǎn)化 到具有ET特性的大腸桿菌菌抹JC8679AlacZ中。該步驟導(dǎo)致6.7kb的入 DNA片段亞克隆到線性栽體上，該片段包括exo, bet，gam，rexA和c1857 基因，進(jìn)而產(chǎn)生pYZN/入-PR。下一步ET重組應(yīng)用一個新的線性栽體， 該載體包括由突變laxP位點(diǎn)(laxP*， Araki et al., 1997， Nucleic Acids Research, 25: 868-872)側(cè)翼包繞的氯霉素耐藥基因cat,以及與 pYZN/ i-PR上人DNA同源的末端臂。該線性栽體與pYZN/入-PR —起， 共同電轉(zhuǎn)化到具有ET特性的大腸桿菌菌林JC8679AlacZ中，導(dǎo)致 pYZN/X-PR/Cm的形成。通過BstZ171消化，該質(zhì)粒釋放含有cat的人DNA 片段，該片段由與lacI-lacZ同源的兩個末端臂側(cè)翼包繞。該片段用于定 位大腸桿菌菌林JC5519 ( Willetts and Clark, 1969, J Bacteriol， 100: 231-239 )的染色體，該菌林表達(dá)來自pBADRecE/T的RecE和RecT( Zhang etal.， 1998, Nature Genetics 20: 123-128) 。 ET重組后，在存在20ug/ml 氯霉素的情況下選擇生長，產(chǎn)生YZ2001/Cm菌株。通過應(yīng)用706-Cre質(zhì) 粒，去除cat基因，產(chǎn)生YZ2001,所述質(zhì)粒與705-Cre不同的是，它攜 帶四環(huán)素耐藥基因(tet)而非氯霉素耐藥基因，如文獻(xiàn)所述(Buchholz etal.， 1996， Nucleic Acids Research, 24: 3118-3119)。因此，YZ2001攜帶 6.7 kb的X DNA片段(exo…-c1857 )，以及染色體上的突變laxP位點(diǎn)。 由于YZ2001/Cm允許人基因exo， bet和gam的熱誘導(dǎo)表達(dá)，因此具有條 件ET特性。例如，可以應(yīng)用相似的策略制備敲除構(gòu)建物或進(jìn)行BAC修 飾。
因此，上面給予的實施例顯示了幾種應(yīng)用RecE/T和Reda/(3介導(dǎo)的 同源重組技術(shù)成功克隆和亞克隆的方法。
這里公開的特定實施方案不應(yīng)限制本發(fā)明和權(quán)利要求的范圍，因為 這些實施方案是為了舉例說明本發(fā)明的幾個方面。任何等價實施方案都 應(yīng)該屬于本發(fā)明范疇。實際上，通過前面的描述，除了本文已經(jīng)顯示或 描述的修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕而易舉地對本發(fā)明進(jìn)行多種其他修 飾。這些修飾也應(yīng)該屬于后面權(quán)利要求的范疇。在本申請文件中，引用 了很多參考文獻(xiàn)，每篇文獻(xiàn)的內(nèi)容均在此全文引入，作為本申請文件的 參考。
權(quán)利要求
1.一種將雙鏈靶DNA導(dǎo)入載體的方法，包括培養(yǎng)表達(dá)功能性重組酶的細(xì)菌，所述細(xì)菌細(xì)胞包括(a)靶DNA，含有第一個雙鏈末端和第二個雙鏈末端，以及(b)載體DNA，在載體DNA鏈上以下述順序含有(i)第一個雙鏈同源臂(ii)復(fù)制起點(diǎn)，以及(iii)第二個雙鏈同源臂，這樣，載體DNA鏈的第一個同源臂序列與靶DNA鏈的第一個末端序列同源，載體DNA鏈的第二個同源臂序列與靶DNA鏈的第二個末端序列同源，這樣，靶DNA可以在同源臂之間插入載體DNA中。
2. 制備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體導(dǎo)入細(xì)胞，所述細(xì)胞含有雙鏈靶DNA，并表達(dá)細(xì)菌 重組酶，所述栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA 鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)的 一條鏈，以及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上， 從3，到5'，以下迷順序存在第一個末端，耙DNA序列，以及 第二個末端；這樣，栽體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一 個末端序列同源，栽體DNA鏈上的笫二個同源臂序列與靶DNA 鏈上的第二個末端序列同源；以及b) 將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
3. 制備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，所述 細(xì)胞含有雙鏈靶DNA，并表達(dá)細(xì)菌重組酶， 所迷栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個雙鏈同源臂，在栽體DNA鏈 上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以 及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端，在靶DNA 鏈上，從3，到5，，以下列順序存在第一個末端，靶DNA序列， 以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列， 所述第一個核普酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端核苷 酸序列同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序， 從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的笫二個末端核苷酸序列 同源；以及b) 將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
4. 制備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈靶DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞，所述細(xì)胞含有一個栽體，并表 達(dá)細(xì)菌重組酶，所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端，在靶DNA 鏈上，從3，到5',以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列， 以及第二個末端；所述栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第 二個同源臂；這樣，栽體DNA鏈上的第 一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一 個末端序列同源，載體DNA鏈上的第二個同源臂序列與靶DNA 鏈上的第二個末端序列同源；以及b) 將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
5. 制備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈靶DNA分子以及第一個、第二個雙鏈寡核苷酸導(dǎo)入細(xì) 胞，所述細(xì)胞含有一個載體，并表達(dá)細(xì)菌重組酶，所述靶DNA 含有一個把DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上，從3，到5'， 以下述順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及第二個末端； 所迷第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列， 所述第一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷 酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端核苷 酸序列同源；所迷第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下迷順序，從3，到5，含有笫三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列 同源；并且所述栽體含有一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第 二個同源臂；以及 b) 將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
6. 制備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體和雙鏈靶DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)菌重組酶的細(xì)胞，所述栽體含有 一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上， 從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第 二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個末端，在靶DNA鏈上， 從3，到5，，以下迷順序存在第一個末端，靶DNA序列，以及 第二個末端；這樣栽體DNA鏈上的第一個同源臂序列與靶DNA鏈上的第一個 末端核苷酸序列同源，栽體DNA鏈上的第二個同源臂核苷酸序 列與把DNA鏈上的笫二個末端序列同源；以及b) 將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
7. 制備重組DNA分子的方法，包括a) 將雙鏈栽體，雙鏈靶DNA分子，以及第一個、第二個雙鏈寡 核苷酸導(dǎo)入表達(dá)細(xì)菌重組酶的細(xì)胞，所述栽體含有 一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個雙鏈同源臂，在栽體DNA鏈 上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以 及第二個同源臂；所述靶DNA含有一個靶DNA序列和兩個雙鏈末端，在靶DNA 鏈上，從3，到5'，以下迷順序存在第一個末端，靶DNA序歹L 以及第二個末端；所述第一個寡核苷酸含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以下述 順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序列， 所述笫 一個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端序列 同源；所述第二個寡核苷酸含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所述第 三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列 同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列 同源；以及b) 將細(xì)胞置于可以發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組的條件下。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點(diǎn)特異性重組酶的核苷酸序列，栽體進(jìn)一步包括位點(diǎn)特異 性重組酶識別的第一個和第二個識別位點(diǎn)，第一個識別位點(diǎn)位于第一 個和第二個同源臂的外部，第二個位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)位于第 一個和第二個同源臂的內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或進(jìn)行之后，誘導(dǎo)位 點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點(diǎn)特異性重組酶的核苷酸序列，栽體進(jìn)一步包括位點(diǎn)特異 性重組酶識別的第 一 個和第二個識別位點(diǎn)，第 一 個識別位點(diǎn)位于第一 個和第二個同源臂的外部，第二個位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)位于第 一個和第二個同源臂的內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或進(jìn)行之后，誘導(dǎo)位 點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)。
10. 權(quán)利要求6的方法，其中宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶的核苷酸序列，栽體進(jìn)一步包括位點(diǎn) 特異性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于第一個和第二個同源臂的 內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或進(jìn)行之后，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性核苷內(nèi)切酶的 表達(dá)。
11. 權(quán)利要求7的方法，其中宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括一個與啟動子操作性相 連的編碼位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶的核苷酸序列，栽體進(jìn)一步包括位點(diǎn) 特異性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于第一個和第二個同源臂的 內(nèi)部；在步驟b)進(jìn)行期間或進(jìn)行之后，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性核苷內(nèi)切酶的 表達(dá)。
12. 權(quán)利要求2- 11任一項的方法，其中栽體還進(jìn)一步包括一個可選擇標(biāo) 記，位于第一個和笫二個同源臂的外部，這樣，在栽體DNA鏈上，從5，到3'，栽體可以下述兩種順序含有i)第一個同源臂，可選擇標(biāo) 記，復(fù)制起點(diǎn)和第二個同源臂，或ii)第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，可選 擇標(biāo)記和第二個同源臂。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中可選擇標(biāo)記可以將抗生素耐藥性傳遞給含有 該載體的細(xì)胞。
14. 權(quán)利要求2- 11任一項的方法，其中細(xì)菌重組酶是RecE/T或Reda/{3 重組酶，或RecE/T和Reda/p兩種重組酶。
15. 權(quán)利要求2- 11任一項的方法，其中細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
16. 權(quán)利要求2- 11任一項的方法，其中細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
17. 權(quán)利要求2- 11任一項的方法，其中細(xì)胞是重組表達(dá)RecE/T和/或 Reda/(3重組酶的真核細(xì)胞。
18. 權(quán)利要求2 - 11任一項的方法，該方法還進(jìn)一步包括分離重組DNA 分子，所述重組DNA分子含有插入到栽體中的靶DNA。
19. 用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，所迷栽體 包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3'，以 下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)和第二個同源臂；這樣第一 條栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列與第 一條靶DNA鏈的 第一個末端序列同源，第 一條栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷 酸序列與第 一條靶DNA鏈的第二個末端序列同源。
20. 權(quán)利要求19的栽體，其中復(fù)制起點(diǎn)是細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)。
21. 權(quán)利要求19的栽體，其中復(fù)制起點(diǎn)在大腸桿菌中發(fā)揮作用。
22. 權(quán)利要求19的栽體，其中復(fù)制起點(diǎn)在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮作用。
23. 含有雙鏈DNA栽體的細(xì)胞，該栽體用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶 DNA分子，包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在載體DNA鏈上，從 5，到3，，以下迷順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)和第二個同源臂； 這樣第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸序列與第一條靶 DNA鏈的第一個末端序列同源，第一條栽體DNA鏈上的第二個同源 臂的核苷酸序列與第 一 條靶DNA鏈的第二個末端序列同源。
24. 權(quán)利要求23的細(xì)胞，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
25. 用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，包括一個或多個容器 a) 用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3，，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個 同源臂；這樣，第一條栽體DNA鏈上的第一個同源臂的核苷酸 序列與第 一條靶DNA鏈上的第 一個末端序列同源，第 一條栽體 DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸序列與第 一 條把DNA鏈上的 第二個末端核苷酸序列同源；以及b) 含有細(xì)菌重組酶的細(xì)胞。
26. 權(quán)利要求25的試劑盒，其中同源臂的序列與基于BAC, PAC,人，質(zhì) ?；験AC的克隆栽體同源。
27. 權(quán)利要求25的試劑盒，其中第一個和第二個雙鏈寡核苷酸具有的核苷 酸序列與基于BAC, PAC,人，質(zhì)粒或YAC的克隆栽體同源。
28. 用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，包括一個或多個容器a) 用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該 栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5， 到3'，以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個 同源臂；和b) 第一個雙鏈寡核苷酸，含有笫一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以 下述順序，從3，到5，含有第一個序列和第二個序列，所述第一 個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一個同源臂的核苷酸序列同 源，第二個核普酸序列與靶DNA鏈的第 一個末端核苷酸序列同 源；c) 第二個雙鏈寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順 序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所 述第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的笫二個同源臂的核苷酸 序列同源，第四個核苷酸序列與靶DNA鏈的第二個末端核苷酸序列同源；以及d) 含有細(xì)菌重組酶的細(xì)胞。
29. 權(quán)利要求25或28的試劑盒，其中細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
30. 權(quán)利要求25或28的試劑盒，其中細(xì)胞是具有攝取DNA能力的凍存 細(xì)胞。
31. 用于定向克隆或亞克隆靶DNA分子的試劑盒，包括一個或多個容器 a) 用于定向克隆或亞克隆目標(biāo)靶DNA分子的雙鏈DNA栽體，該栽體包括一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個同源臂，在栽體DNA鏈上，從5，到3',以下述順序存在第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，以及第二個 同源臂；b) 第一個雙鏈寡核苷酸，含有第一個寡核苷酸DNA鏈，該鏈以 下述順序，從3，到5，含有第一個核苷酸序列和第二個核苷酸序 歹i，所述第 一 個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第 一 個同源臂的 核苷酸序列同源，第二個核苷酸序列與把DNA鏈的第 一 個末端 核苷酸序列同源；以及c) 第二個雙鏈寡核苷酸，含有第二個寡核苷酸鏈，該鏈以下述順 序，從3，到5，含有第三個核苷酸序列和第四個核苷酸序列，所 迷第三個核苷酸序列與栽體DNA鏈上的第二個同源臂的核苷酸 序列同源，第四個序列與靶DNA鏈的第二個末端核普酸序列同 源。
32. 權(quán)利要求25, 28或31的試劑盒，其中DNA栽體是經(jīng)純化處理的。
33. 權(quán)利要求28或31的試劑盒，其中DNA栽體、第一個雙鏈寡核苷酸 和第二個雙鏈寡核苷酸均是經(jīng)純化處理的。
34. 權(quán)利要求25， 28或31的試劑盒，其中靶DNA分子包括細(xì)菌、病毒、 寄生蟲或原生動物DNA。
35. 權(quán)利要求25， 28或31的試劑盒，其中靶DNA分子包括已知或懷疑 與某種功能紊亂或疾病相關(guān)的基因突變或多態(tài)性。
36. 權(quán)利要求25 - 29任一項的試劑盒，其中細(xì)菌重組酶是RecE/T或 Reda/(3重組酶，或者是RecE/T和Reda/p兩種重組酶。
37. 權(quán)利要求2-ll任一項的方法，其中靶DNA在發(fā)生基因突變時，已 知或懷疑與某種功能紊亂或疾病相關(guān)。
38，權(quán)利要求2-11任一項的方法，其中靶DNA是細(xì)菌、病毒、寄生蟲 或原生動物DNA。
39. 權(quán)利要求2， 4， 6， 8或IO的方法，該方法還進(jìn)一步包括探測重組DNA 分子，所迷重組DNA分子包括插入到栽體中的靶DNA。
40. 權(quán)利要求3， 5， 7, 9或11的方法，該方法還進(jìn)一步包括探測重組DNA 分子，所述重組DNA分子包括插入到栽體中的靶DNA。
41. 探測感染物質(zhì)存在的方法，包括實施權(quán)利要求39的方法，其中耙DNA 來自懷疑罹患感染性疾病的患者，并且，第二個和第四個核苷酸序列 與感染物質(zhì)DNA中存在的序列同源。
42. 探測感染物質(zhì)存在的方法，包括實施權(quán)利要求40的方法，其中把DNA 來自懷疑罹患感染性疾病的患者，并且，第一個和第二個同源臂序列 與感染物質(zhì)DNA中存在的序列同源。
43. 權(quán)利要求41或42的方法，其中感染物質(zhì)是病毒、細(xì)菌、原生動物、 真菌或寄生蟲。
44. 探測遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態(tài)性特征存在的方法，包括實 施權(quán)利要求39的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺傳性病況、疾 病、功能紊亂或多態(tài)性特征的患者，而且，第一個同源臂的序列與已 知或懷疑與所述遺傳性病況、疾病、功能紊亂或多態(tài)性特征相關(guān)的位 點(diǎn)上游序列同源，第二個同源臂的序列與已知或懷疑與所述遺傳性病 況、疾病、功能紊亂或多態(tài)性特征相關(guān)的位點(diǎn)下游序列同源。
45. 探測遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態(tài)性特征存在的 方法，包括實施權(quán)利要求40的方法，其中，靶DNA源自懷疑患有遺 傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功能紊亂或多態(tài)性特征的患者，而且， 第一個雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾 病、遺傳性功能紊亂或多態(tài)性特征相關(guān)的位點(diǎn)上游序列同源，第二個 雙鏈寡核苷酸序列與已知或懷疑與所述遺傳性病況、遺傳性疾病、遺 傳性功能紊亂或多態(tài)性特征相關(guān)的位點(diǎn)下游序列同源。
46. 權(quán)利要求44或45的方法，其中遺傳性病況、遺傳性疾病、遺傳性功 能紊亂或多態(tài)性特征使患者具有罹患腫瘤，哮喘，關(guān)節(jié)炎，耐藥，藥 物毒性，或神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)精神、代謝、肌肉、心血管或皮膚病況、 疾病或功能紊亂的傾向性。
47. 權(quán)利要求19的栽體，其中栽體還進(jìn)一步包括一個位于第一個和第二個 同源臂外部的可選擇標(biāo)記，這樣，在栽體DNA鏈上，從5，到3',栽 體可以下述兩種順序含有i)笫一個同源臂，可選擇標(biāo)記，復(fù)制起點(diǎn) 和第二個同源臂，或ii)第一個同源臂，復(fù)制起點(diǎn)，可選擇標(biāo)記和第二個同源臂。
48. 權(quán)利要求47的栽體，其中栽體序列在復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記的5，端 或3，端均不包括一個或多個直接重復(fù)序列，所述直接重復(fù)序列包括至 少25個核苷酸堿基對。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用同源重組定向克隆和亞克隆的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及應(yīng)用細(xì)菌重組酶介導(dǎo)的同源重組技術(shù)進(jìn)行DNA亞克隆的方法和組合物。本發(fā)明涉及克隆的方法，含有用作克隆載體的多核苷酸的組合物，含有所述多核苷酸組合物的細(xì)胞，以及由細(xì)菌重組酶介導(dǎo)的克隆試劑盒，所述重組酶如RecE/T和Redα/β。
文檔編號C12N1/21GK101492694SQ20091000508
公開日2009年7月29日 申請日期2000年7月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月9日
發(fā)明者F·A·斯圖爾特, J·P·P·穆伊雷爾斯, Y·張 申請人:歐洲分子生物學(xué)實驗室