專利名稱：獅源性dna的pcr檢測引物、試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獅的基因檢測方法。尤其是獅基因的實時熒光PCR檢測方法及其中所涉及的特異性引物和相關(guān)試劑盒。
背景技術(shù)：
地球上目前存在的食肉動物大概有11個科，而最有特點也最重要的就是貓 科動物。獅，俗稱獅子，就是一種生存在非洲和亞洲的大型貓科動物。獅屬于哺乳綱 (Mammalia)，食肉目(Carnivora)，貓科(Felidae)，豹屬(Panthera)，獅種(P. Ieo)。獅 種中約有13-14個亞種東北剛果獅(P. l.azandica)、安哥拉獅(P. 1. bleyenberghi)、 歐洲獅(P. 1. europaea)、剛果獅(P. 1. hollisteri)、德蘭 士瓦獅(P. 1. krugeri)、 巴巴里獅(P. 1. Ieo)、斑點獅(P. 1. maculatus)、馬賽獅(P. 1. massaicus)、開普 獅(P. 1. melanochaita)、東非獅(P. 1. nubica)、亞洲獅(P. 1. persica)、塞內(nèi)加爾獅 (P. 1. senegalensis)、索馬里獅(P. 1. someliensis)、喀啦哈里獅(P. 1. verneyi)。這其中， 歐洲獅、巴巴里獅、斑點獅、開普獅、喀啦哈里獅等五個亞種已經(jīng)在地球上絕跡，剩下的大部 份亞種都生活在薩哈拉沙漠南的非洲(Bauer et al，2008)。如同其他的大型貓科動物一樣，對獅子來說最大的危險就是人類的狩獵。由于人 類的大量獵殺，歐洲和非洲大陸的五個亞種已經(jīng)滅絕，亞洲獅則幾近滅亡?！耙吧鷦游锏姆?法交易已經(jīng)幾乎僅落后于毒品交易了”。為了保護珍貴瀕危物種，世界上的大部分國家都通 過法律手段禁止野生動物的捕殺與貿(mào)易。然而，因為巨大的經(jīng)濟利益驅(qū)動，還是有人鋌而走 險地進行珍貴瀕危物種相關(guān)制品的走私與貿(mào)易，還有人利用仿制品以次充好牟取暴利。所 以要有一種方法來鑒定獅源性的材料，如食品、藥品、皮毛等。在野生動物取證中的一個先進應(yīng)用，就是通過DNA分析來進行工作。目前國際上 應(yīng)用比較普遍的是PCR檢測方法，但檢測結(jié)果僅靠凝膠上的條帶大小判斷，如果產(chǎn)物條帶 較弱，很難通過肉眼得到準確的結(jié)果；而國內(nèi)對于該領(lǐng)域的研究幾乎未見報道。本研究采用 SYBR Green I實時熒光PCR檢測鑒定獅制品，通過檢測反應(yīng)體系中SYBR Green I熒光強 度，達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的，大大提高了 PCR檢測的靈敏度，同時具有實時、高效的 優(yōu)點，為海關(guān)、動植物檢疫以及動物保護組織提供了快速檢測鑒定獅制品的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于提供方便、快速、靈敏地定量檢測獅DNA的實時熒光PCR檢測 方法，以及檢測中所使用的包含特異性引物序列的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供獅DNA的實時熒光PCR檢測引物，它們是引物序列正向引物(SEQID NO. 1) 5' CAAACCTGAATGGTACTTCCTA 3'，反向引物(SEQID N0. 2) 5' AGATGGGTATTAGGATTAGAAGA 3'。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供獅DNA的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述的試劑盒包括檢測溶液，該檢測溶液中含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 μ M、反向引物10 μ M、 Rox Dye II (50X)；其中，所述的正向引物序列為SEQ IDN0. 1，反向引物序列為SEQ ID NO. 2。本發(fā)明進一步提供了利用上述試劑盒檢測獅DNA的PCR檢測方法，該方法使用上述試劑盒，包括如下步驟①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應(yīng)體系取2 μ 1步驟①制得的模板DNA溶液，加入上述試劑盒中的SYBR Premix Ex Taq(2X) 10 μ 1、正向引物0. 4 μ 1、反向引物0. 4 μ l、Rox Dye ΙΙ(50Χ)0. 4μ 1, 再加入滅菌超純水6.8 μ 1，使總體積20 μ 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR反應(yīng) 管中，5000r/min，離心 IOs ；③步驟②的反應(yīng)體系按下述條件進行實時熒光PCR檢測95"C /3s，一次循環(huán)；95°C /5s，66°C /34s, 40 次循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果?？煽康臋z測鑒定獅屬制品的反應(yīng)體系建立在合適的基因片段選擇上，所選的基因 必需種屬特異性強，但在物種內(nèi)變異性比較小。為了選擇一個合適的鑒定獅的基因片段，我 們使用了歐洲分子生物學實驗室的數(shù)據(jù)庫(gene databanks, EMBL)，比較其中足夠多的種 間數(shù)據(jù)。在一些侯選基因片段中，選擇了線粒體細胞色素b(Cyt b)基因片段。在互聯(lián)網(wǎng)上 數(shù)據(jù)比對的結(jié)果表明，這段基因序列有足夠的特異性可以滿足設(shè)計種屬特異性的引物對。 線粒體細胞色素b(Cyt b)基因片段在脊椎動物中有很高的變異性。本發(fā)明所設(shè)計的用來 定性檢測獅源物質(zhì)的引物，在獅血、獅肉樣品中可以出現(xiàn)特異性的SYBR Green I實時熒光 PCR擴增曲線，其他14種非獅源性樣品(虎、豹、熊、牛、羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿)SYBR Green I實時熒光PCR反應(yīng)中沒有出現(xiàn)擴增曲線。SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法是近年來應(yīng)用較為普遍的一種快速檢測方 法。它通過SYBR Green I熒光染料與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的增 力口，無需另外設(shè)計熒光探針(喬麗娟等，2009)。靈活性、通用性高是它的優(yōu)點，但是也意味 著專一性低，由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此DNA引物二聚體或其他非特異擴 增產(chǎn)物會對定量結(jié)果產(chǎn)生干擾(導致低Ct值)。同時也降低了反應(yīng)的專一性和可重復性。 因此本研究從引物設(shè)計和純化模板、PCR程序設(shè)計等方面進行了優(yōu)化。在PCR擴增中，模板 量以及退火溫度對PCR特異性擴增影響較大，所以本試驗中對模板量以及退火溫度分別設(shè) 梯度進行了摸索。在同等條件下盡量選擇較低的模板量、較高的退火溫度，優(yōu)化了 PCR反 應(yīng)，提高了引物特異性，克服了 SYBR Green I專一性低的缺點。獅DNA的另一種普通PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中包括一種檢測溶 液，該檢測溶液中含10XPCR緩沖液、lOymol/L正向引物、lOymol/L反向引物、10mmol/L dNTP、5U/y L Taq DNA 聚合酶；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID Ν0. 1，反向引物序列為SEQ ID N0. 2。使用普通PCR檢測試劑盒檢測獅DNA的普通PCR檢測方法，包括如下步驟①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應(yīng)體系取1步驟①制得的模板DNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液 6. 2 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積25 μ 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR反應(yīng)管中，混勻，5000r/min，離心IOs ；③步驟②的反應(yīng)體系按下述條件進行普通PCR檢測預(yù)變性94°C，3min；進入循環(huán)94°C變性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環(huán)；終止延伸72°C，7min；4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。本發(fā)明采用PCR檢測技術(shù)，對獅DNA進行鑒定。本發(fā)明分別采用SYBRGreen I實 時熒光PCR檢測方法和普通PCR檢測方法鑒定獅制品。SYBR GreenI實時熒光PCR檢測方 法通過檢測反應(yīng)體系中SYBR Green I熒光強度，達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的，大大提 高了 PCR檢測的靈敏度，同時具有實時、高效的優(yōu)點；普通PCR檢測方法，除具有高特異性、 靈敏性外，因其具有簡便易行、快速、成本低等的特點而更具有實用性。這兩種方法為海關(guān)、 動植物檢疫以及動物保護組織提供了快速檢測鑒定獅制品的有效途徑。


圖1獅源性成分SYBR Green I實時熒光PCR檢測特異性擴增曲線；圖2獅源性成分SYBR Green I實時熒光PCR熔解曲線；圖3獅源性成分SYBR Green I實時熒光PCR檢測靈敏度擴增曲線；圖4獅源性成分普通PCR檢測特異性擴增結(jié)果；圖5毛發(fā)中獅源性成分PCR檢測特異性擴增結(jié)果；圖6獅源性成分PCR檢測靈敏度擴增結(jié)果。
具體實施例方式下面為本發(fā)明的具體實施例，它對本發(fā)明技術(shù)方案的建立及其應(yīng)用作進一步的說 明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。若無特殊說明，本部分試驗所用亞洲獅血、亞洲獅肉、東非獅血、東北虎血、印支虎 血、孟加拉虎血、金錢豹血、雪豹血、黑熊血等樣品由大連森林動物園提供，牛骨粉、山羊骨 粉、豬骨粉、驢骨粉、兔骨粉、鹿骨粉、馬骨粉、狗骨粉等樣品為國家標準樣品；上述血液類試 驗樣品，采用Blood Genome DNAExtraction Kit試劑盒進行基因組DNA的提取，購自寶生物 工程(大連)有限公司，貨號D9081 ；其它組織類和骨粉類樣品采用動物源性植物飼料基因 組DNA提取試劑盒進行提取，購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號DP323-03 ；高速離 心機 centrifuge 5804 (Eppendorf 公司，德國)，實時熒光 PCR 擴增儀(ABI7500 Real-Time PCR System，美國)，普通PCR儀，(PE24000，美國)，核酸蛋白分析儀(Beckman而640)，恒 溫干燥箱(SANYO mov-213F, Japan)。實施例1獅DNA的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法的建立一、獅源性DNA的實時熒光PCR檢測引物的設(shè)計根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列并參考相關(guān)的文獻(Driscoll et al,2002 ；Burger etal,2004 ；Dubach et al，2005)，針對獅屬動物線粒體細胞色素b (Cyt b)基因設(shè)計特異性 引物，設(shè)計用于檢測的引物序列如下正向引物(SEQID NO. 1) 5' CAAACCTGAATGGTACTTCCTA 3'，
反向引物(SEQ ID NO. 2) 5' AGATGGGTATTAGGATTAGAAGA 3'。二、獅源性DNA的實時熒光PCR檢測試劑盒的構(gòu)建在獲得的上述特異性引物對的基礎(chǔ)上，設(shè)計用于獅DNA的實時熒光PCR檢測的試 劑盒，試劑盒包括檢測溶液，該檢測溶液中含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 μ M、 反向引物10 μ Μ、Rox Dye II(50X)；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID NO. 1，反向引物 序列為 SEQ ID NO. 2。三、獅DNA的實時熒光PCR檢測方法的建立1、DNA樣品的制備本實施例的DNA樣品制備方法參考《DNA及RNA基本實驗技術(shù)》(科學出版社， A.J.哈伍德主編，盛小禹等譯)，具體為(1)樣品制備獅肉樣品稱取約IOOg獅的肌肉組織，切碎，于120°C烘烤過夜，用組織研磨器研 磨成粉末狀。血液樣品每毫升血液樣品加入2mg的2%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝待用。骨粉樣品可直接用于DNA提取(2) DNA提取采用試劑盒提取法制備待測樣品DNA基因組血液類試驗樣品，采用Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒進行基因組DNA 的提取，購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D9081。其它組織類和骨粉類樣品采用動 物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒進行提取，購自天根生化科技(北京)有限公司，貨 號 DP323-03。2、PCR 反應(yīng)取2ul待測樣品DNA溶液，加入用于獅DNA的實時熒光PCR檢測的試劑盒中的溶 液11. 2 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積20 μ 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR 反應(yīng)管中，5000r/min，離心IOs ；然后按下列參數(shù)進行PCR擴增95"C /3s，1 次循環(huán)；95°C /5s,66°C /34s,40 次循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。3、結(jié)果判斷空白對照無熒光增幅現(xiàn)象、無熔解曲線波峰；陰性對照無熒光增幅現(xiàn)象、無熔解曲線波峰；陰性結(jié)果表明樣品未檢出獅源性 成分。陽性對照有熒光增幅現(xiàn)象、有熔解曲線波峰；陽性結(jié)果表明樣品檢出獅源性成 分。否則，實驗視為無效；實施例2獅DNA的實時熒光PCR檢測方法特異性實驗采用實施例1的含有特異性引物的檢測試劑盒及檢測方法檢測獅DNA樣品。同時 檢測熊、牛等其它動物DNA樣品。以對方法的特異性進行評估。所列的17種血液、組織和骨粉類樣品的DNA進行SYBR Green I實時熒光PCR檢 測。獅種特異性檢測結(jié)果的SYBR Green I實時熒光PCR擴增曲線如圖1所示，熔解曲線 如圖2所示，圖1、圖2中1.亞洲獅肉，2.亞洲獅血，3.東非獅血，4.東北虎血，5.印支虎血，6.孟加拉虎血，7.金錢豹血，8.雪豹血，9.黑熊血，10.牛骨粉，11.羊骨粉，12.豬骨粉， 13.驢骨粉，14.兔骨粉，15.鹿骨粉，16.馬骨粉，17.狗骨粉，18.水。試驗結(jié)果顯示，獅種中 亞洲獅亞種的血液及肌肉組織DNA樣本，東非獅亞種的血液DNA樣本經(jīng)過SYBR GreenI實時 熒光PCR擴增，在19個循環(huán)后均出現(xiàn)特異性的實時擴增曲線，平均熔解溫度在84士0. 2°C。 而虎、豹、熊的6種血液DNA樣本，牛、羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿等8種哺乳動物骨粉DNA樣本 以及空白水對照的檢測結(jié)果在40個循環(huán)內(nèi)均沒有出現(xiàn)實時擴增曲線，也沒有出現(xiàn)熔解曲線的波峰，均可判斷為陰性結(jié)果。上述結(jié)果表明本試驗設(shè)計的SYBR Green I實時熒光PCR 引物可以特異性擴增檢測并鑒別獅源性成分，具有很好的特異性。實施例3獅DNA的實時熒光PCR檢測方法靈敏度實驗獅肉粉和牛肉骨粉系列百分比(100%,10%,1%,0.5%,0. 1%,0. 05%,0.01%,
0% )混合物，按照實施例1骨粉DNA提取方法進行混合物基因組DNA的提取。該系列的混 合物DNA用于進行檢測靈敏度分析。按照實施例1中SYBRGreen I實時熒光PCR擴增條件 進行試驗，結(jié)果如圖3所示，圖3中1. 100%獅肉粉，2. 10%獅肉粉，3. 獅肉粉，4. 0.5% 獅肉粉，5. 0. 獅肉粉，6. 0. 05%獅肉粉。試驗結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的擴增條件，可在含量為100%獅肉粉、10%獅肉粉、 獅肉粉、0.5%獅肉粉、0. 獅肉粉中擴增出特異性的SYBR Green I實時熒光PCR擴增
曲線。上述結(jié)果表明本試驗設(shè)計的SYBR Green I實時熒光PCR引物可以檢測出骨粉中 0. 含量的獅源性成分。實施例4獅DNA的普通PCR檢測試劑盒及檢測方法的建立一、獅源性DNA的普通PCR檢測引物的設(shè)計同實施例1。二、獅源性DNA的普通PCR檢測試劑盒的構(gòu)建在獲得的上述特異性引物對的基礎(chǔ)上，設(shè)計用于獅DNA的普通PCR檢測的試劑盒， 試劑盒包括檢測溶液，該檢測溶液中含10XPCR緩沖液、10 μ mol/L正向引物、10 μ mol/L 反向引物、ΙΟμπιοΙ/L dNTP、5U/yL Taq DNA聚合酶；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID NO. 1，反向引物序列為SEQ ID NO. 2。三、獅DNA的普通PCR檢測方法的建立1、DNA樣品的制備本實施例的DNA樣品制備方法參考《DNA及RNA基本實驗技術(shù)》(科學出版社， A.J.哈伍德主編，盛小禹等譯)，具體為(1)樣品制備獅肉樣品稱取約IOOg獅的肌肉組織，切碎，于120°C烘烤過夜，用組織研磨器研 磨成粉末狀。血液樣品血液樣品加入2%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝待用。骨粉樣品可直接用于DNA的提取。(2) DNA 提取血液類試驗樣品，采用Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒進行基因組DNA 的提取，購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D9081。其它組織類和骨粉類樣品采用動 物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒進行提取，購自天根生化科技(北京)有限公司，貨 號 DP323-03。
2、PCR 反應(yīng)取2ul待測樣品DNA溶液，加入用于獅DNA的普通PCR檢測的試劑盒中的溶液 6. 2 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積25 μ 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR反應(yīng) 管中，5000r/min，離心IOs ；然后按下列參數(shù)進行PCR擴增預(yù)變性94°C，3min；進入循環(huán)94°C變性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環(huán)；終止延伸72°C，7min；4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。3、結(jié)果判斷以IOObp marker為對比，在目標片段大小處出現(xiàn)特異性擴增條帶為陽性，沒有特 異性擴增條帶為陰性。實施例5獅DNA的普通PCR檢測方法對肌肉和血液樣品中DNA的特異性實驗采用實施例4的含有特異性引物的檢測試劑盒及檢測方法檢測獅DNA樣品。同 時檢測熊、牛等其它動物DNA樣品，以對方法的特異性進行評估，結(jié)果如圖4所示，圖4中 M-IOObp marker 1.亞洲獅肉，2.亞洲獅血，3.亞洲獅毛，4.東非獅血，5.東北虎血，6.印 支虎血，7.孟加拉虎血，8.金錢豹血，9.雪豹血，10.黑熊血，11.牛骨粉，12.羊骨粉，13.豬 骨粉，14.驢骨粉，15.兔骨粉，16.鹿骨粉，17.馬骨粉，18.狗骨粉，19.水。試驗結(jié)果顯示，獅種中亞洲獅亞種的血液、肌肉組織和毛發(fā)DNA樣本，東非獅亞種 的血液DNA樣本經(jīng)過PCR擴增，得到陽性擴增產(chǎn)物。而虎、豹、熊的6種血液DNA樣本，牛、 羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿等8種哺乳動物骨粉DNA樣本以及空白水對照的檢測結(jié)果均為陰性 結(jié)果。上述結(jié)果表明本發(fā)明所設(shè)計引物為獅DNA的特異性擴增引物，而且對來自于不同個 體和不同組織的DNA具有同樣的擴增效果。實施例6獅DNA的普通PCR檢測方法對毛干中DNA的特異性實驗對亞洲獅、東北虎、金錢豹、波斯貓脫落毛發(fā)進行DNA提取和擴增，實驗結(jié)果如圖5 所示，圖5中:M. IOObp marker 1.東北虎毛，2.金錢豹毛，3.波斯貓毛，4.亞洲獅毛。圖 5顯示僅亞洲獅樣本出現(xiàn)特異性的擴增條帶，而東北虎、金錢豹和波斯貓的毛發(fā)檢測結(jié)果均 為陰性。上述結(jié)果可證明引物僅對獅特異。實施例7獅DNA的普通PCR檢測方法靈敏度實驗將制備的獅肉粉和牛肉骨粉系列百分比(100%，10%，1%，0. 5%，0. )混合物，按照實施例4中的骨粉DNA提取方法進行混合物基因組DNA的提取。該系列的混合物 DNA用于進行檢測靈敏度分析。按照實施例4提供的PCR擴增條件進行試驗，結(jié)果如圖6所 示，圖 6 中:M. IOObp marker 1. H2O, 2. 100%獅肉粉，3. 10%獅肉粉，4. 獅肉粉，5. 0. 5% 獅肉粉，6. 0. 獅肉粉。試驗結(jié)果顯示，使用實施例4中的擴增條件，可在含量為100%獅肉粉、10%獅肉 粉、獅肉粉、0.5%獅肉粉中擴增出特異性的PCR擴增條帶。上述結(jié)果表明本試驗設(shè)計 的特異性PCR引物可以檢測出骨粉中0. 5%含量的獅源性成分。
權(quán)利要求
獅源性DNA的實時熒光PCR檢測引物，其特征在于引物序列正向引物(SEQ ID NO.1)5′CAAACCTGAATGGTACTTCCTA 3′，反向引物(SEQ ID NO.2)5′AGATGGGTATTAGGATTAGAAGA 3′。
2.獅源性DNA的實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中包括一種檢測溶 液，該檢測溶液中含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 μ M、反向引物10 μ M、Rox Dye II(50X)；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID NO. 1，反向引物序列為SEQ ID NO. 2。
3.獅源性DNA的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于使用權(quán)利要求2所述的試劑盒，包 括如下步驟①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應(yīng)體系取2μ1步驟①制得的模板DNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液11. 2 μ 1， 再加入滅菌超純水至總體積20 μ 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL實時熒光PCR反應(yīng)管中， 5000r/min，離心 IOs ；③步驟②的反應(yīng)體系按下述條件進行實時熒光PCR檢測950C /3s，1 次循環(huán)；950C /5s,66°C /34s，40 次循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。
4.獅源性DNA的普通PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中包括一種檢測溶液，該檢 測溶液中含10父？0 緩沖液、1(^!1101/1正向引物、10 μ mol/L反向引物、IOm mol/L dNTP、 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶；其中，所述的正向引物序列為SEQ ID NO. 1，反向引物序列為SEQ ID NO. 2。
5.獅源性DNA的普通PCR檢測方法，其特征在于使用權(quán)利要求4所述的試劑盒，包括如 下步驟①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；②反應(yīng)體系取1μ 1步驟①制得的模板DNA溶液，加入權(quán)利要求4所述試劑盒中的溶 液6. 2 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積25 μ 1 ；將以上各組分加入至0. 2mL PCR反應(yīng)管中， 混勻，5000r/min，離心 IOs ；③步驟②的反應(yīng)體系按下述條件進行普通PCR檢測預(yù)變性:94°C,3min ；進入循環(huán)94°C變性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循環(huán)；終止延伸:72°C,7min ；4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
獅源性DNA的PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法，本發(fā)明分別建立了實時熒光PCR檢測和普通PCR檢測對獅源性DNA的檢測引物、試劑盒以及檢測方法。引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；基于此，本發(fā)明公開了包含上述引物的獅源性DNA的實時熒光PCR檢測試劑盒及相應(yīng)檢測方法和普通PCR檢測試劑盒及相應(yīng)檢測方法。本發(fā)明的引物特異性強，檢測試劑盒及方法簡便易用，結(jié)果準確，具有很高的特異性和靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK101845509SQ201010203018
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者徐君怡, 曹際娟 申請人:徐君怡;曹際娟