專利名稱：溶菌酶活力的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種測(cè)定溶菌酶活力的方法，具體涉及用MBTH法測(cè)定溶菌酶活 力的方法尤其涉及測(cè)定過(guò)程中關(guān)鍵參數(shù)的選擇。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme)主要來(lái)源于人、動(dòng)物、植物、微生物以及蛋清中，是一種專門作 用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，又稱細(xì)胞壁溶解酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶，全 稱為l，4-0-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷浮Ｋ且环N有效的抗菌劑，它能 切斷肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的0 _1，4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞 肽聚糖支架，在內(nèi)部滲透壓的作用下細(xì)胞脹裂開(kāi)，引起細(xì)菌裂解。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道檢測(cè)溶菌 酶的方法有多種，如瓊脂板擴(kuò)散法，比濁法，比色法，高效液相色譜法、瓊脂糖火箭電泳法、 共振散射光譜法等，其中比濁法是最常用的方法。比濁法以溶壁微球菌為底物，通過(guò)酶作用 前后吸光度的變化來(lái)體現(xiàn)酶活力的大小。該方法繁瑣，使用的溶壁微球菌懸液體系是由菌 體顆粒和緩沖液組成的固_液相分布的不均勻的不穩(wěn)定體系，在自然條件下該菌懸液也會(huì) 發(fā)生自身解體。菌懸液在反應(yīng)前預(yù)熱時(shí)間長(zhǎng)短，終止反應(yīng)時(shí)間的控制等都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影 響。在比濁法中，細(xì)胞壁中的肽聚糖被溶菌酶水解成可溶性的碎片，雖然可以使溶液對(duì)光的 吸收度減少，但仍有大量菌體懸浮在溶液中，由于菌體本身多方面的差異，故懸浮在溶液中 的持續(xù)時(shí)間不同，導(dǎo)致溶液對(duì)光的吸收度變化較大，給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)一定的誤差，從而限制 了它的使用。也有采用DNS法、鐵青化鉀法，以高脫乙酰度的殼聚糖為底物進(jìn)行溶菌酶的酶 活力測(cè)定，但是，這些方法靈敏度均不夠高，很難測(cè)到初速度，從而限制了其應(yīng)用。本發(fā)明選用化學(xué)結(jié)構(gòu)與肽聚糖結(jié)構(gòu)非常近似的半脫乙酰殼聚糖(脫乙酰度在 45% -55% )為溶菌酶的水解底物，以3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)為顯色劑來(lái)測(cè)定溶 菌酶的活力。該法不受低濃度醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液的干擾，對(duì)于不同聚合度的同類還 原糖，其還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)已有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種溶菌酶活力的測(cè)定方法，該方法采用3-甲 基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法來(lái)測(cè)定溶菌酶的活力。以下詳細(xì)介紹本發(fā)明一種溶菌酶活力的測(cè)定方法，A，制作用MBTH法測(cè)得的N_乙 酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測(cè)待測(cè)溶菌酶 水解半脫乙酰殼聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作 的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)溶菌 酶的酶解產(chǎn)物中在單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的含量，以此 來(lái)推算溶菌酶的活力。優(yōu)化地；上述步驟A的具體步驟是；作用MBTH法測(cè)得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度 值與其相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；分別取6-15組不同濃度(0-20 u g/mL)的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于 75-85°C水浴加熱15-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL，室溫冷卻后于波長(zhǎng)620-680nm 處測(cè)定N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡 萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；優(yōu)化地；上述步驟B的具體步驟是；用MBTH法檢測(cè)溶菌酶的活力；將半脫乙酰殼 聚糖溶液其濃度為4-10mg/mL，加入到錐形瓶中于25_40°C的水浴搖床中預(yù)熱8-12min，加 入預(yù)熱至相應(yīng)溫度的溶菌酶溶液進(jìn)行水解反應(yīng)，水解時(shí)間為60min以內(nèi)，取水解液2mL (可 在反應(yīng)過(guò)程中分時(shí)間段取樣檢測(cè))，迅速與2mL 0.5當(dāng)量的NaOH溶液充分混勻以終止反 應(yīng)，取1. 2mL加入到試管中(做三個(gè)平行樣)，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水浴加熱 15-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)620-680nm處測(cè)定吸光度值， 根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖的濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān) 系曲線確定待測(cè)溶菌酶的活力；溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng) 體系，每分鐘產(chǎn)生lnmol相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。其中 MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液 等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。優(yōu)化地；上述硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4 (S04) 2) 12H20,0. 5%氨基磺
酸，0.5當(dāng)量鹽酸。優(yōu)化地；上述殼聚糖的脫乙酰度為50%。優(yōu)化地；上述半脫乙酰殼聚糖以50mM的丁二酸緩沖溶液或醋酸緩沖溶液為溶劑。優(yōu)化地；上述測(cè)定吸光度值的最佳波長(zhǎng)為655nm。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明用MBTH法對(duì)溶菌酶水解半脫乙酰殼聚糖后所產(chǎn)生的N-乙 酰氨基葡萄糖端基的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)以此來(lái)確定溶菌酶的活力；N-乙酰氨基葡萄糖以及低 聚半脫乙酰殼聚糖是溶菌酶水解的最終產(chǎn)物，因此對(duì)N-乙酰氨基葡萄糖端基含量檢測(cè)的 靈敏度直接決定著對(duì)溶菌酶活力檢測(cè)的靈敏度。該方法比比濁法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉。檢 測(cè)限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS 法和鐵氰化鉀法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 主要儀器水浴恒溫振蕩器，SHZ-82型，國(guó)華電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋， HH-4型，國(guó)華電器有限公司；數(shù)字酸度計(jì)，上海大普儀器有限公司；721可見(jiàn)光分光光度計(jì) 或，上海菁華科技儀器有限公司；溶菌酶，來(lái)源于蛋清，sigma;半脫乙酰殼聚糖，實(shí)驗(yàn)室自 制；移液器，F(xiàn)innpipette。溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 u g/mL)精確稱取干燥至恒質(zhì)量的N_乙酰氨基 葡萄糖0. 2000g,用50mM pH4. 0的醋酸緩沖溶液溶解、轉(zhuǎn)移并定容至100mL，配成2. 00mg/mL 的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中取lmL N-乙酰氨基葡萄糖溶液，如前法操作并定容至IOOmL,即得20 μ g/mL的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(S04)2) ·12Η20，0. 5%氨基磺酸，0.5當(dāng)量鹽酸。步驟Α，制作用MBTH法測(cè)得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì) 應(yīng)關(guān)系曲線；分別加入8組不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5當(dāng) 量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于80°C水浴加熱15-20min后趁熱加入硫酸 鐵銨試劑1. 2mL，室溫冷卻后于波長(zhǎng)655nm處測(cè)定N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每個(gè)濃 度做三個(gè)平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡萄糖溶液濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān) 系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B,用MBTH法檢測(cè)溶菌酶的活力；將9. 9mL半脫乙酰殼聚糖溶液其濃度為4mg/mL，pH值為4. 0，加入到錐形瓶中 于40°C的水浴搖床中預(yù)熱lOmin，加入待測(cè)的溶菌酶溶液0. ImL進(jìn)行水解反應(yīng)，為確定合 適的待測(cè)溶菌酶濃度可以將待測(cè)的溶菌酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個(gè)檢測(cè)，水解時(shí)間為 60min以內(nèi)，取水解液2mL(可在反應(yīng)過(guò)程中分時(shí)間段取樣檢測(cè))，迅速加入2mL 0. 5當(dāng)量的 NaOH溶液中(做三個(gè)平行樣)，混勻，取1. 2mL加入到試管中，再加入MBTH試劑0. 6mL于 75-85°C水浴加熱20-25min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)655nm處測(cè) 定吸光度值，根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)的溶菌酶的酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的 還原糖的量。溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生 Inmol相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位，從而根據(jù)酶活力定義來(lái)推算木 溶菌酶的活力。實(shí)施例2 主要儀器電熱恒溫水浴鍋，HH-4型，國(guó)華電器有限公司；數(shù)字酸度計(jì)，上海大普 儀器有限公司；UV2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；溶菌酶，來(lái) 源于蛋清，sigma ；半脫乙酰殼聚糖，實(shí)驗(yàn)室自制；移液器，F(xiàn)innpipette0溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μ g/mL)精確稱取干燥至恒質(zhì)量的N-乙酰氨基 葡萄糖0. 2000g,用50mM pH4. O的醋酸緩沖溶液溶解、轉(zhuǎn)移并定容至IOOmL,配成2. 00mg/mL 的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中取ImL N-乙酰氨基葡萄糖溶液，如前法操作并定容至 IOOmL,即得20 μ g/mL的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(S04)2) ·12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當(dāng)量鹽酸。步驟Α，制作用MBTH法測(cè)得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì) 應(yīng)關(guān)系曲線；分別加入8組不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5當(dāng) 量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于80°C水浴加熱15-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)655nm處測(cè)定N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每個(gè)濃 度做三個(gè)平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡萄糖溶液濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的關(guān) 系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；
B,用MBTH法檢測(cè)溶菌酶的活力；將ImL半脫乙酰殼聚糖溶液其濃度為8mg/mL，pH值為4. 0，加入試管中于40°C的 水浴搖床中預(yù)熱lOmin，加入待測(cè)的已預(yù)熱至40°C的溶菌酶溶液ImL進(jìn)行水解反應(yīng)，為確定 合適的待測(cè)溶菌酶濃度可以將待測(cè)的溶菌酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個(gè)檢測(cè)，水解時(shí)間 為60min以內(nèi)，迅速加入2mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液充分混勻以終止反應(yīng)，從中取1. 2mL加 入到已有0. 6mL MBTH試劑的另一試管中，充分混勻，于75-85 °C水浴加熱20-25min后趁熱 加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)655nm處測(cè)定吸光度值，如法做三個(gè)平行樣， 根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系 曲線確定待測(cè)的溶菌酶的酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的量。 溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生Inmol相當(dāng)于 N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，從而根據(jù)酶活力定義來(lái)推算木溶菌酶的 活力。當(dāng)然，上述說(shuō)明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述操作，所有在本發(fā) 明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；A，制作用MBTH法測(cè)得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測(cè)待測(cè)溶菌酶水解半脫乙酰殼聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)的吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)溶菌酶的酶解產(chǎn)物中在單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的含量，以此來(lái)推算溶菌酶的活力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述步驟A的具體步驟 是；分別取6-15組具有不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 6mL,濃度范圍在0_20微 克/毫升之間，加入0. 6mL 0. 5當(dāng)量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于75-85°C 水浴加熱15-25min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng)620-680nm處測(cè)定 吸光度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；根據(jù)每組N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測(cè)得的吸光度值之 間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述步驟B的具體 步驟是；將殼聚糖_脫乙酰度在45% -55%的溶液其濃度為4-10mg/mL，加入到錐形瓶中于 40-50°C的水浴搖床中預(yù)熱8-12min，加入預(yù)熱至相應(yīng)溫度的溶菌酶溶液開(kāi)始水解反應(yīng)，水 解時(shí)間為60min以內(nèi)，取水解液2mL，可在反應(yīng)過(guò)程中分階段取樣，與2mL 0. 5當(dāng)量的NaOH 溶液迅速混合以終止反應(yīng)，從中取1. 2mL加入到試管中，做三個(gè)平行樣，再加入MBTH試劑 0. 6mL于75-85°C水浴加熱20-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長(zhǎng) 620-680nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)步驟A制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光 度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定酶解產(chǎn)物中所含有的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原 糖濃度，以此來(lái)推算溶菌酶的活力；溶菌酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反 應(yīng)體系每分鐘產(chǎn)生lnmol相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位；其中 MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液 等量混合即得，現(xiàn)用現(xiàn)配，一天內(nèi)有效。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述硫酸鐵銨試劑的制 法是 0. 5% (FeNH4(S04)2) 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5 當(dāng)量鹽酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述殼聚糖的脫乙酰度 為 50%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述殼聚糖溶液以50mM 的丁二酸或醋酸溶液為溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；上述測(cè)定吸光度值的最 佳波長(zhǎng)為655nm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種溶菌酶活力的測(cè)定方法，其特征是；A，制作用MBTH法測(cè)得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值與其相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B，用MBTH法檢測(cè)待測(cè)溶菌酶水解半脫乙酰殼聚糖后產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的N-乙酰氨基葡萄糖濃度與測(cè)得的相應(yīng)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)溶菌酶的酶解產(chǎn)物中在單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖的含量，以此來(lái)推算溶菌酶的活力。該方法測(cè)定N-乙酰氨基葡萄糖的檢測(cè)限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS法和鐵氰化鉀法。
文檔編號(hào)C12Q1/54GK101798590SQ20091001695
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者張永勤, 武強(qiáng), 王哲平 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)